犬瘟熱病毒與犬副流感病毒雙重rt-pcr檢測(cè)及其專用引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種犬瘟熱病毒和犬副流感病毒的雙重RT-PCR檢測(cè)及其專用引物。本發(fā)明提供了檢測(cè)病毒的專用引物，包括引物對(duì)A和引物對(duì)B，所述引物對(duì)A包括引物1和引物2，所述引物對(duì)B包括引物3和引物4，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的犬瘟熱病毒和犬副流感病毒的雙重RT-PCR檢測(cè)專用引物敏感性好，最低能檢測(cè)到RNA含量約為1×10-3ng/μL，其靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于1ng/μL的靈敏度。本發(fā)明的雙重RT-PCR檢測(cè)方法，簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、高效，具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】犬瘟熱病毒與犬副流感病毒雙重RT-PCR檢測(cè)及其專用引物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種犬瘟熱病毒與犬副流感病毒雙重RT-PCR檢測(cè)及其專用引物；屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]犬瘟熱病毒(⑶V)與犬副流感病毒(CPIV)的RT-PCR檢測(cè)方法是目前快速檢測(cè)這兩種病原的常用方法，被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室病原診斷，與病毒分離的方法相比較，RT-PCR方法診斷更快速簡(jiǎn)便，病毒分離相對(duì)來說時(shí)間太長，在臨床上不利于快速診斷，所以目前病毒病的實(shí)驗(yàn)室診斷主要應(yīng)用PCR/RT-PCR方法。目前有一些⑶V的RT-PCR試劑盒已經(jīng)商品化并投入臨床應(yīng)用，但是，單獨(dú)檢測(cè)CPIV和一次性檢測(cè)⑶V與CPIV的RT-PCR方法尚沒有商品化試劑盒。
[0003]目前毛皮動(dòng)物病多病毒混合感染相當(dāng)嚴(yán)重。商品化的⑶V、CPIV的RT-PCR試劑盒都是單項(xiàng)RT-PCR，1個(gè)試劑盒1次試驗(yàn)僅能檢測(cè)一種病毒，對(duì)于混合感染了⑶V、CPIV的同份毛皮動(dòng)物病料要確診病原就需要2種試劑盒并且要做2次RT-PCR實(shí)驗(yàn)，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且檢測(cè)成本也較高，既不經(jīng)濟(jì)也不快捷?？堤┰凇秳?dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展》2013年、第9期、62-65頁，公開了 3對(duì)引物；能分別用于特異擴(kuò)增犬瘟熱病毒F基因、犬細(xì)小病毒VP2基因和犬副流感病毒F基因上的目的片段。通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立同時(shí)擴(kuò)增⑶V (740bp)、CPV(419bp)和CPIV (559bp)的多重PCR方法。但是這三對(duì)引物對(duì)CDV、CPV、CPIV3種病毒的最低核酸檢測(cè)量為lng/ μ L;其靈敏性差。

【發(fā)明內(nèi)容】

·[0004]本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種能單獨(dú)或/和同時(shí)檢測(cè)⑶V和CPIV、且靈敏度高的專用引物；所述CDV為犬瘟熱病毒，CPIV為犬副流感病毒。
[0005]本發(fā)明提供的專用引物，包括引物對(duì)Α和/或引物對(duì)Β，
所述引物對(duì)A包括引物1和引物2，
所述引物對(duì)B包括引物3和引物4，
所述引物1、引物2、引物3、引物4的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列
3、序列4。
[0006]上述專用引物，所述引物對(duì)A能檢測(cè)檢測(cè)⑶V，所述引物對(duì)B能檢測(cè)CPIV ;引物對(duì)A和引物對(duì)B同時(shí)使用能單獨(dú)或同時(shí)檢測(cè)CDV和CPIV。
[0007]上述專用引物，可以是引物對(duì)A ;也可以是引物對(duì)B ;還可以是，由引物對(duì)A和引物對(duì)B組成；
所述引物對(duì)A由引物1和引物2組成，
所述引物對(duì)B由引物3和引物4組成；
所述引物1、引物2、引物3、引物4的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4。
[0008]所述引物對(duì)A和所述引物對(duì)B可獨(dú)立包裝。
[0009]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種能單獨(dú)或同時(shí)檢測(cè)⑶V和CPIV的RT-PCR試劑。
[0010]本發(fā)明的RT-PCR試劑，包含上述專用引物。
[0011]上述RT-PCR試劑，可以是，由上述專用引物、dNTP、DNA聚合酶、M-MLV、RNaseInhibitor和PCR緩沖液組成。
[0012]所述dNTP為脫氧核糖核苷三磷酸，M-MLV為一種鼠白血病逆轉(zhuǎn)錄酶，RNaseInhibitor為RNA酶抑制劑。 [0013]上述RT-PCR試劑中，
所述專用引物中各引物的終濃度均為0.4μΜ ；
所述dNTP的終濃度均為0.4mM ；
所述DNA聚合酶的終濃度均0.05 υ/μ?;
所述M-MLV的終濃度為2U/^L ；
所述 RNase Inhibitor 的終濃度為 3.2U/KL。
[0014]所述終濃度是指在25PL RT-PCR反應(yīng)體系中的最終濃度。
[0015]所述dNTP、DNA聚合酶和PCR緩沖液購自天根生化科技有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為ET101。
[0016]所述M-MLV、RNase Inhibitor購自寶生物工程有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為2641A、2313A。
[0017]上述RT-PCR試劑，能單獨(dú)或同時(shí)檢測(cè)⑶V和CPIV。
[0018]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種能單獨(dú)或同時(shí)檢測(cè)⑶V和CPIV的RT-PCR試劑盒。
[0019]一種RT-PCR試劑盒，含有上述RT-PCR試劑。
[0020]上述RT-PCR試劑盒能單獨(dú)或同時(shí)檢測(cè)⑶V和CPIV。
[0021]所述專用引物、RT-PCR試劑或RT-PCR試劑盒在檢測(cè)病毒或制備檢測(cè)病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述病毒具體為如下2種病毒中的至少一種:犬瘟熱病毒和犬副流感病毒。
[0022]本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣本病毒的方法。
[0023]一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣本病毒的方法，包括如下步驟:
用所述專用引物、RT-PCR試劑或RT-PCR試劑盒中的引物對(duì)A和引物對(duì)B對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；用瓊脂糖凝膠電泳或測(cè)序法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，若得到大小為593bp的RT-PCR產(chǎn)物，則樣本中含有或候選含有犬瘟熱病毒；
若得到大小為1530bp的RT-PCR產(chǎn)物，則樣本中含有或候選含有犬副流感病毒；
本方法用于非診斷和治療目的。
[0024]上述方法中，若同時(shí)得到大小為593bp的RT-PCR產(chǎn)物和大小為1530bp的RT-PCR產(chǎn)物，則樣本中含有或候選含有犬瘟熱病毒和犬副流感病毒。
[0025]所述593bp的RT-PCR產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列5 ；
所述1530bp的RT-PCR產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列6 ；
所述RT-PCR擴(kuò)增中，以待測(cè)樣本的基因組RNA為模板。
[0026]所述RT-PCR擴(kuò)增的退火溫度為53°C -58°C，所述RT-PCR擴(kuò)增的退火溫度具體為55。。。
[0027]有益效果
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明提供的專用引物、RT-PCR試劑、RT-PCR試劑盒或檢測(cè)方法，一次反應(yīng)能同時(shí)檢測(cè)出CDV和CPIV兩種病毒；SCDV和CPIV兩種病毒的檢測(cè)提供了新的檢測(cè)方法。所用2對(duì)引物特異性較好，引物相互之間有較低的同源性及互補(bǔ)性；所述引物敏感性好最低能檢測(cè)到RNA含量約為1 X 10_3ng/uL，其靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前最低能檢測(cè)到RNA含量約為lng/^L的靈敏度。所述的雙重RT-PCR方法簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、高效，而且還大大節(jié)約了檢測(cè)成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為CDV、CPIV雙重RT-PCR以及單項(xiàng)RT-PCR電泳圖結(jié)果；
圖 1 中，M:2000bp DNA Marker 1_3:CDV+CPIV CDV CPIV ；
圖2為CDV、CPIV雙重RT-PCR特異性電泳圖結(jié)果；
圖 2 中，M:2000bp DNA Marker 1-5:CDV CSFV PRRSV BVDV CPIV，7-11:CPIV CSFVPRRSV BVDV CDV , 12-16:CDV CPIV CSFV PRRSV BVDV ;
圖3，圖4為CDV、CPIV雙重RT-PCR敏感性電泳圖結(jié)果;
圖 3 中，M:2000bp DNA Marker 1-6:CDV+CPIV 濃度 10'10'10'10'10'10-6 ；7:陰性對(duì)照；
圖 4 中，M:2000bp DNA Marker 1-6:CPIV 濃度 10'10'10'10'10'10-6 ；
8-13:CDV 濃度 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 ；7 和 14:陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0030]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0031]實(shí)施例1
犬瘟熱病毒(⑶V)和犬副流感病毒(CPIV)的雙重RT-PCR檢測(cè)方法構(gòu)建
1、引物設(shè)計(jì)
在 GenBank 中查出 CDV (Genbank 號(hào) AF112189)、CPIV (Genbank 號(hào) EF543648)
的部分已知序列。對(duì)病毒各基因區(qū)進(jìn)行同源性分析，分別選取CDV的Η基因，CPIV的ΝΡ基因?yàn)楦鞑《緮U(kuò)增的靶序列。利用Primer Premier 5對(duì)上述保守區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，對(duì)設(shè)計(jì)出來的2種病毒引物利用DNAstar進(jìn)行引物二聚體分析，以避免引物之間形成穩(wěn)定的引物二聚體。選出擴(kuò)增序列為⑶V(593bp)、CPIV(1530bp)的如下2對(duì)引物，并對(duì)每對(duì)引物擴(kuò)增序列的同源性或互補(bǔ)性進(jìn)行分析。避免它們之間有較高的同源性或互補(bǔ)性，從而確定2種病毒的雙重RT-PCR引物如下:
引物對(duì)A:
引物 1:5’ -GGATTATTATGAAAGCCCACT-3’(序列 1)；
引物 2:5’ -GGTTTAATTCAATCGTCGGTA-3’(序列 2)；
引物對(duì)B:
引物 3:5’ -AAATGTCA TCCGTGCTTAAAGC-3’ (序列 3)引物 4: 5’ -TGTCTAGATGTCAAGATCACCCAGT-3’(序列 4)；
2、RT-PCR反應(yīng)條件優(yōu)化
分別提取犬瘟熱病毒(CDV)和犬副流感病毒(CPIV)的基因組RNA。
[0032]犬痕熱病毒(CDV,Canine distemper virus)記載在 Sequence analysis andexpression of the attachment and fusion proteins of canine distemper viruswild-type strain A75/17, Cherpillod, P., Beck, K., Zurbriggen, A.and ffittek, R.,《J.Virol.)), 1999年，第73期，公眾可從山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心獲得；
犬副流感病毒(CPIV, Canine parainfluenza virus)記載在RT-PCR檢測(cè)CPIV方法的建立與應(yīng)用，簡(jiǎn)子健，馬素貞，劉騰飛，翟少華，趙森，《新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)》，2011年，第48期，新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，公眾可從山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心獲得；
分別以⑶V基因組RNA、CPIV基因組RNA和⑶V+CPIV混合基因組RNA (體積比為1:1)為模板，均以引物對(duì)A和引物對(duì)B混合作為引物，按照如下體系和程序進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增:RT-PCR擴(kuò)增體系25yL: 10 X PCR Buffer (Mg2+ Plus) 2.5μ?(天根生化科技有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為ΕΤ101)，上下游混合引物:引物對(duì)分別為引物對(duì)A 0.5μ? (引物1和引物2濃度均為20μΜ，終濃度各為0.4μΜ)、引物對(duì)Β 0.5μ? (引物3和引物4濃度均為20μΜ，終濃度各為
0.4μΜ), RNA 模板 2μ?，dNTPs (各 10 mM) 1 μ? (終濃度 0.4 mM), Taq 酶(5U/^L) 0.25μ?或(2.5U/>L) 0.5μ? (終濃度 0.05 V/μ?), M-MLV (10000U) 0.5μ? (終濃度 2υ/μ?)，RNaseInhibitor (40U/>L) 2μ?(終濃度 3.2U/^L)，最后用水補(bǔ)充至 25μ?。
[0033]優(yōu)化后的程序?yàn)?50°C，反轉(zhuǎn)錄30min，；94°C，預(yù)變性2min ;94°C變性45s，55°C退火lmin,72°C延伸lmin,32個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min,4°C保存。
[0034]結(jié)果如圖1所示，其中1為CDV+CPIV基因組RNA的RT-PCR產(chǎn)物(1530bp和593bp), 2為CDV基因組RNA的RT-PCR產(chǎn)物(593bp)，3為CPIV基因組RNA的RT-PCR產(chǎn)物(1530bp)；-為陰性對(duì)照(即模板為ddH20)，沒有得到任何產(chǎn)物。
[0035]分別將上述RT-PCR產(chǎn)物送去測(cè)序，結(jié)果為:
593bp的RT-PCR產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列5(CDV的Genbank號(hào)的AF112189的第1328-1922位核苷酸)；
1530bp的RT-PCR產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列6(CPIV的Genbank號(hào)EF543648第60-1589位核苷酸)。
[0036]因此，RT-PCR產(chǎn)物通過測(cè)序，其序列與GenBank中查出⑶V和CPIV的已知序列比較，證實(shí)是目的基因。
[0037]3、特異性檢測(cè)
分別檢測(cè)上述 涉及的RT-PCR反應(yīng)的引物對(duì)A、引物對(duì)B的特異性，方法如下:
1)引物對(duì)A特異性
分別提取PRRSV (豬繁殖與呼吸綜合征病毒)、CSFV(豬瘟病毒)、BVDV(牛病毒性腹瀉病毒)的RNA ；
豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV, Porcine r印roductive and respiratory syndromevirus)記載在高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學(xué)分析，童光志，周艷君，郝曉芳，田志軍，仇華吉，彭金美，安同慶，中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007年05，公眾可從山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心獲得；豬瘟病毒(CSFV, Classic swine fever virus)記載在豬瘟病毒GSLZ株的分離與鑒定，何小兵，賈懷杰，陳國華，房永祥，李玩生，曾爽，景志忠，《中國獸醫(yī)科學(xué)》，2011年，第2期，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室甘肅省動(dòng)物寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，公眾可從山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心獲得；
牛病毒性腹?寫病毒(BVDV, Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus)記載在牛病毒性腹瀉病毒BVDV-JL株的分離與鑒定，張淑琴，郭利，冷雪，張亭亭，吳永旺，武華，《中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)》，2011年03期，公眾可從山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心獲得；
分別以PRRSV的RNA、CSFV的RNA、BVDV的RNA、CDV基因組RNA、CPIV基因組RNA為模板，以引物對(duì)A為引物，按照上述步驟2中的RT-PCR體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖2的1-5所示，其中1為CDV，2為PRRSV，3為CSFV，4為BVDV，5為CPIV，-為陰性對(duì)照(即模板為ddH20);可以看出，只有CDV有593bp目的條帶，未見其他非特異性帶，說明引物對(duì)A特異性高。
[0038]分別以PRRSV 的 RNA、CSFV 的 RNA、BVDV 的 RNA、CDV 基因組 RNA、CPIV 基因組 RNA為模板，以引物對(duì)B為引物，按照上述步驟2中的RT-PCR體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖2的7-11所示，其中7為CPIV，8為PRRSV，9為CSFV，10為BVDV, 11為CDV，-為陰性對(duì)照(即模板為ddH20);可以看出，只有CPIV有1530bp目的條帶，未見其他非特異性帶，說明引物對(duì)B特異性高。
[0039]分別以PRRSV 的 RNA、CSFV 的 RNA、BVDV 的 RNA、CDV 基因組 RNA、CPIV 基因組 RNA為模板，以引物對(duì)A和引物對(duì)B為引物，按照上述步驟2中的RT-PCR體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖 2 的 12-16 所示，其中 12 為 CDV，13 為 CPIV，14 為 PRRSV，15 為 CSFV，16 為 BVDV，-為陰性對(duì)照(即模板為ddH20);可以看出，只有⑶V有593bp目的條帶、CPIV有1530bp目的條帶，未見其他非特異性帶，說明引物對(duì)A和引物對(duì)B同時(shí)作用時(shí)，其特異性高。
[0040]4、敏感性檢測(cè)
通過分光光度計(jì)測(cè)濃度，測(cè)得由步驟2得到的CDV基因RNA的濃度為12ng/^L，由步驟2得到的CPIV基因RNA的濃度為15ng/^L。
[0041]分別將⑶V基因RNA和CPIV基因RNA進(jìn)行10倍系列稀釋后分別作為模板，以引物對(duì)A、B為引物，按照步驟2的體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增。
[0042]結(jié)果見圖4所示，1-7分別為PCV II基因DNA的1(^-107倍稀釋的模板；8_14分別為PPV基因DNA的lO1-lO7倍稀釋的模板；15-21分別為PRV基因DNA的1(^-107倍稀釋的模板；可以看出，無論哪種模板，濃度稀釋至10_4的模板有比較清晰地目的條帶，濃度稀釋至10_5的模板有比較弱的目的條帶，濃度稀釋至10_6及以上的模板已完全看不到目的條帶。
[0043]將由步驟2得到的⑶V基因RNA和CPIV基因RNA混合(體積比為1:1 )，將混合后RNA進(jìn)行10倍系列稀釋后分別作為模板，以引物對(duì)A、B為引物，按照步驟2的體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增。
[0044]結(jié)果見圖3所示，其中1-9分別為混合后的DNA的1(^-109倍稀釋的模板，可以看出，濃度稀釋至10_4的模板有比較清晰地目的條帶，濃度稀釋至10_5的模板有比較弱的目的條帶，濃度稀釋至10_6及以上的模板已完全看不到目的條帶。
[0045]實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的雙重RT-PCR可以檢測(cè)到⑶V基因RNA的最小濃度為1.2X l(T3ng/>L，CPIV基因RNA的最小濃度為1.5X l(T3ng/>L。而雙重RT-PCR的敏感性與單項(xiàng)RT-PCR的敏感性無明顯差別。
[0046]5、重復(fù)性
對(duì)⑶V、CPIV雙重RT-PCR方法進(jìn)行多次重復(fù)試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定。
[0047]6、樣本檢測(cè)
對(duì)106份臨床疑似病料(山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心附設(shè)獸醫(yī)院門診送檢的病死毛皮動(dòng)物肝、肺、腦組織混合樣品(質(zhì)量比約為1:1:1)進(jìn)行檢測(cè)，具體如下:
提取106份臨床疑似病料的基因組RNA (編號(hào)為1-106)，用引物對(duì)A和B作為引物，按照步驟2的體系和程序進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，
得到593bp的RT-PCR產(chǎn)物(序列表中的序列5)為⑶V陽性；
得到1530bp的RT-PCR產(chǎn)物(序列表中的序列6)為CPIV陽性；
得到593bp和1530bp的為CDV和CPIV陽性；
均沒有593bp和1530bp的為CDV和CPIV陰性；
結(jié)果如下:
編號(hào)為1-87的得到593bp的RT-PCR產(chǎn)物(序列表中的序列5)為CDV陽性(共87份)；編號(hào)為88-95的得到1530bp的RT-PCR產(chǎn)物(序列表中的序列6)為CPIV陽性(共8
`份)；
編號(hào)為96-99的得到593bp和1530bp的為CDV和CPIV陽性(共4份)；
編號(hào)為100-106的均沒有593bp或1530bp的擴(kuò)增，說明沒有感染⑶V和CPIV中的任一種。
[0048]采用商品CDV檢測(cè)試劑盒(北京世紀(jì)元亨)對(duì)上述106份樣品進(jìn)行⑶V單項(xiàng)RT-PCR，結(jié)果與本發(fā)明上述的結(jié)果一致，比對(duì)結(jié)果符合率為100%。
【權(quán)利要求】
1.一種專用引物，其特征在于，包括引物對(duì)A和/或引物對(duì)B;所述引物對(duì)A包括引物1和引物2，所述引物對(duì)B包括引物3和引物4，所述引物1、引物2、引物3、引物4的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的專用引物，其特征在于，所述引物對(duì)A能檢測(cè)檢測(cè)CDV，所述引物對(duì)B能檢測(cè)CPIV。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的專用引物，其特征在于，為引物對(duì)A;或者為引物對(duì)B。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的專用引物，其特征在于，由引物對(duì)A和引物對(duì)B組成。
5.—種RT-PCR試劑，其特征在于，包含權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的專用引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的RT-PCR試劑，其特征在于，還包含dNTP、DNA聚合酶、M-MLV、RNase Inhibitor 和 PCR 緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的RT-PCR試劑，其特征在于RT-PCR試劑中，所述專用引物中各引物的終濃度均為0.4μΜ ；所述dNTP的終 濃度均為0.4mM ；所述DNA聚合酶的終濃度均0.05 υ/μ?;所述M-MLV的終濃度為2U/^L ；所述 RNase Inhibitor 的終濃度為 3.2U/M-L ；所述終濃度是指在25PL RT-PCR反應(yīng)體系中的最終濃度。
8.一種RT-PCR試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求5-7中任意一項(xiàng)所述的RT-PCR試劑。
9.一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣本病毒的方法，包括如下步驟:用權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的專用引物、權(quán)利要求4-6中任意一項(xiàng)所述的RT-PCR試劑或權(quán)利要求7所述的RT-PCR試劑盒中的引物對(duì)A和引物對(duì)B對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；用瓊脂糖凝膠電泳或測(cè)序法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物；擴(kuò)增產(chǎn)物大小為593bp，則樣本中含有或候選含有犬瘟熱病毒；擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1530bp，則樣本中含有或候選含有犬副流感病毒；本方法用于非診斷和治療目的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，RT-PCR擴(kuò)增的退火溫度為53°C-58°C。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103667537SQ201310694619
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2014年1月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月14日
【發(fā)明者】王貴升, 田夫林, 王金寶, 尹斐斐, 陳靜, 徐鴻, 李玉杰 申請(qǐng)人:山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心