專利名稱：區(qū)分犬瘟熱病毒疫苗株和野毒株的一段序列和一個酶切位點的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種區(qū)分犬瘟熱病毒疫苗株和野毒株的一段序列和一個酶切 位點，是融合反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)和限制性內(nèi)切酶分析(RFLP) 兩種常規(guī)分子生物學(xué)鑒定檢測方法的發(fā)明，選擇特異的核酸片段和一種限制 性內(nèi)切酶，有效地鑒別犬瘟熱病毒的接種疫苗株和感染野毒株。
背景技術(shù)：
中和試驗、免疫熒光抗體技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附測定等方法已經(jīng)在犬瘟熱 的診斷中發(fā)揮了作用。另外，電鏡診斷法與上述方法相比較，其檢出率有顯 著的一致性。雖然上述方法取得了一定的效果，但有的耗時較長，有的敏感
性、特異性或準確性較差，不能及時確診。近年來，隨著核酸雜交、PCR等技 術(shù)的應(yīng)用，犬瘟熱的診斷也進入了分子生物學(xué)階段。核酸探針、原位雜交、 RT-PCR以及基因序列分析等方法建立之后，就可對病料中是否含有CDV特異 性核酸進行鑒定，從而提高了犬瘟熱診斷的準確性、敏感性和特異性。盡管 目前犬瘟熱疫苗滅活苗可以保護大多數(shù)免疫動物不被感染發(fā)病，但也存在野 毒感染發(fā)病的危險。由于疫苗在動物體內(nèi)存在一定的半衰期，臨床上發(fā)病初 期檢測疫苗免疫動物時，檢測到的犬瘟熱病毒是疫苗殘存還是感染野毒，還 難以確定，從而沒有更好的治療和綜合防治措施。因此，區(qū)分疫苗株和野毒 株就顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種區(qū)分犬瘟熱病毒疫苗株和野毒株的一段序列 和一個酶切位點，有效區(qū)分犬瘟熱病毒疫苗株和野毒株，為毛皮動物的養(yǎng)殖 提供獸醫(yī)技術(shù)保證。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的區(qū)分犬瘟熱病毒疫苗株和野毒株的一 段序列和一個酶切位點，其特征在于:在CDV犬瘟熱結(jié)構(gòu)蛋白核蛋白NP基因
的372-1200位之間，設(shè)計引物(Pl: 5 (TTCTG AGGCA GATGA GTTCT TC 3， P2: 5 'CTTGG ATGCT ATTTC TGACA CT 3，) RT-PCR擴增特異性片段829bp， 并進行BaraHI RFLP分析，可以通過擴增片段的酶切圖譜的條帶數(shù)目來確定所 檢測到的CDV屬于疫苗株還是野毒株；酶切NP基因目的片段，瓊脂糖凝膠電 泳得到675bp和153bp 2條帶者為疫苗株，得到455bp、 22。bp和153bp 3條 帶者為野毒株。
本發(fā)明的積極效果是鑒定方法簡單，準確率和效率都很高；河北肅寧 某狐貍養(yǎng)殖場送檢的發(fā)病狐貍，我們檢測犬瘟熱陽性，利用該方法擴增到目
的片段829bp片段，并進行RFLP分析，得出該場狐貍感染了野毒，此過程在
6個小時內(nèi)完成。建議他們隔離發(fā)病動物，緊急接種犬瘟熱疫苗，病情得到了
很好控制。后來我們進一步用核酸測序的方法驗證該擴增序列確實為CDV NP
基因中我們選擇的目的序列，并且在預(yù)計位點處有預(yù)期分析的酶切位點?，F(xiàn)
在已經(jīng)有此種實例23例，其中5個國內(nèi)外使用的疫苗株，18個不同地區(qū)臨床
感染野毒實例。選擇5個疫苗株及有代表性的5個野毒株列舉測序結(jié)果，見
序列表。根據(jù)我們選擇的序列和酶切位點，可在送檢病料當天6小時內(nèi)得出
結(jié)果，確定動物體內(nèi)檢測到的犬瘟熱病毒類型。


圖1為區(qū)別犬瘟熱疫苗株和野毒株的擴增片段電泳圖，野毒株來自 2005-2007年間收集的部分犬瘟熱陽性組織病料，疫苗株為收集的國內(nèi)外臨床 上使用的疫苗株；1、 19為100bp Ladder DNAMarker; 2 14為擴增病料結(jié) 果，其中2、 3、 4、 5、 7、 9、 12為犬瘟熱陽性；15 18為收集的國內(nèi)外犬瘟
熱疫苗株擴增條帶。
圖2為區(qū)別犬瘟熱疫苗株和野毒株的擴增片段的酶切鑒定電泳圖，M為
lOObp Ladder DNA Marker; 1 4為發(fā)病臟器中擴增的829bp目的片段RFLP
分析結(jié)果，得到3條帶455bp、 220bp和153bp，屬于CDV野毒株；5 8
為收集的幾種國內(nèi)外犬瘟熱疫苗株擴增的目的產(chǎn)物RFLP分析結(jié)果，得到2
條帶675bp和153bp。
具體實施例方式
下面實施例對本發(fā)明做進一步的描述 實施例1:
1 、引物的設(shè)計與合成
設(shè)計合成一對引物P1: 5 'TTCTGAGGCAGATGAGTTCTTC3'， P2: 5 'CTTGG ATGCT ATTTC TGACA CT 3，，預(yù)期擴增目的片段大小為829bp。將特產(chǎn)研究所 疫苗株CDV3株中CDVNP基因829片段擴增。
2 、病毒RNA制備采用invitrogen公司的Trizol試劑提取RNA。主要步
驟為(1)無菌取發(fā)病動物的內(nèi)臟或血液，內(nèi)臟要加l: l的PBS進行研磨；
(2)取250 u 1研磨懸液先后加入750 ii 1 Trizol和200 u 1氯仿，劇烈振蕩 混勻15s， 4°C 14000 rpm離心15min。 (3)取出上清轉(zhuǎn)移至一個新的離心管 中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫沉淀10分鐘，4°C 14000 rpm離心 lOmin。 (4)倒去液體，加入lml 75 °/。乙醇；顛倒幾次，8500 rpm離心5min。 (5)棄去上清，用濾紙沾干殘留部分，室溫晾干，DEPC水溶解沉淀。得到的 RNA可直接用于RT-PCR反應(yīng)，也可保存于-7(TC備用。 3、 RT-PCR反應(yīng)
RT: 20ul反轉(zhuǎn)錄體系中，反轉(zhuǎn)錄引物P21ul， RNA5ul， 70。C加熱10min， 冰浴10min;再加入5倍PCR buffer 4u 1， 2. 5mmol/L dNTP 2ii 1， RNasin
0. 5 yl， AMV反轉(zhuǎn)錄酶1 u 1， DEPC H20 6. 5 u 1，充分混合后離心，經(jīng)42。C60min， 95。C滅活A(yù)MV反轉(zhuǎn)錄酶，立即于冰上冷卻，進入PCR。
PCR:反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5ul， lO倍PCRbuffer 5u 1， 2. 5腿ol/L dNTP4 u 1， Pl、 P2各1 P 1 ， rTaq DNA Polymerase 1 u 1 ，加水補足50 u 1 。優(yōu)化PCR循環(huán)參 數(shù)，確定PCR的最佳反應(yīng)程序為94°C 45s， 51.6°C 45s， 72°C 45s， 30 個循環(huán)后，72°。延伸5min。取5 u 1 PCR產(chǎn)物，以100bp Ladder作對照，進 行1. 2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。
4、 RFLP鑒定
將擴增得到的片段經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳回收純化，進行酶切反應(yīng)，20ii體系 中包含2tx 1 10Xbuffer, 1 U 1 BamHI限審l上性內(nèi)切酶，6ylPCR產(chǎn)物，llul 滅菌去離子水?；靹颍?7。C水浴5小時，加入1/10的10倍Loading buffer, 瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。判定檢測的樣品病毒所屬類型，2條帶為疫苗株。
5、 目的片段驗證測序
根據(jù)上述方法經(jīng)測序在下列序列表中標注的BamHI位于153位，為內(nèi)切酶。
CAAgGAGGAAGCTCAGCTAGTGTCAGAAATAGCATCCAAG
實施例2:
1 、引物的設(shè)計與合成
設(shè)計合成一對引物P1: 5 (TTCTGAGGCAGATGAGTTCTTC3，， P2: 5 'CTTGG ATGCT ATTTC TGACA CT 3，，預(yù)期擴增目的片段大小為829bp。將法國維克公 司聯(lián)苗中Ondersterpoort株中CDVNP基因829片段擴增。
2 、病毒RNA制備采用invitrogen公司的Trizol試劑提取RNA。主要步
驟為(1)無菌取發(fā)病動物的內(nèi)臟或血液，內(nèi)臟要加l: 1的PBS進行研磨；
(2)取250ul研磨懸液先后加入750ul Trizol和200 ul氯仿，劇烈振蕩 混勻15s， 4°C 14000 rpm離心15min。 (3)取出上清轉(zhuǎn)移至一個新的離心管 中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫沉淀10分鐘，4°C 14000 rpm離心 10min。 (4)倒去液體，加入lml 75 %乙醇；顛倒幾次，8500 rpm離心5min。 (5)棄去上清，用濾紙沾干殘留部分，室溫晾干，DEPC水溶解沉淀。得到的 RNA可直接用于RT-PCR反應(yīng)，也可保存于-70。C備用。 3、 RT-PCR反應(yīng)
RT: 20ul反轉(zhuǎn)錄體系中，反轉(zhuǎn)錄引物P2 1ul， RNA5ul， 7(TC加熱10min， 冰浴10min;再加入5倍PCR buffer 4u 1， 2. 5mmol/L dNTP 1， RNaisn 0. 5 li 1， AMV反轉(zhuǎn)錄酶1 u 1， DEPC H20 6. 5 u 1，充分混合后離心，經(jīng)42。C60min， 95。C滅活A(yù)MV反轉(zhuǎn)錄酶，立即于冰上冷卻，進入PCR。
PCR:反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5ul， 10倍PCRbuffer 5ul， 2. 5mmol/L dNTP4u 1， Pl、 P2各1 u 1 ， rTaq DNA Polymerase 1 u 1 ，加水補足50 u 1 。優(yōu)化PCR循環(huán)參 數(shù)，確定PCR的最佳反應(yīng)程序為94°C 45s， 51.6°C 45s， 72°C 45s， 30個循環(huán)后，72。C延伸5min。取5 y 1 PCR產(chǎn)物，以100bp Ladder作對照，進 行1. 2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。
4、 RFLP鑒定
將擴增得到的片段經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳回收純化，進行酶切反應(yīng)，20p 體系中包含.* 2ul 10Xbuffer， 1 y 1 BamHI限制性內(nèi)切酶，6ul PCR產(chǎn)物， 11 u 1滅菌去離子水?；靹颍?7。C水浴1 1. 5小時，加入1/10的10倍Loading buffer,瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。判定檢測的樣品病毒所屬類型，2條帶為 疫苗株。
5、 目的片段驗證測序
根據(jù)上述方法經(jīng)測序在下列序列表中標注的BamHI位于153位，為內(nèi)切酶。
CAAGGAGGAAGCTCAGCTAGTGTCAGAAATAGCATCCAAG
實施例3:
1、引物的設(shè)計與合成
設(shè)計合成一對引物P1: <formula>formula see original document page 9</formula>，預(yù)期擴增目的片段大小為829bp。將來自河北昌黎貉 HCL07株中CDVNP基因829片段擴增。
2 、病毒RNA制備采用invitrogen公司的Trizol試劑提取RNA。主要步
驟為(1)無菌取發(fā)病動物的內(nèi)臟或血液，內(nèi)臟要加l: 1的PBS進行研磨；
(2)取250^1研磨懸液先后加入750ul Trizol和200 ul氯仿，劇烈振蕩 混勻15s， 4°C 14000 rpm離心15min。 (3)取出上清轉(zhuǎn)移至一個新的離心管 中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫沉淀10分鐘，4°C 14000 rpm離心 10min。 (4)倒去液體，加入lml 75 %乙醇；真頁倒幾次，8500 rpm離心5min。 (5)棄去上清，用濾紙沾千殘留部分，室溫晾干，DEPC水溶解沉淀。得到的 RNA可直接用于RT-PCR反應(yīng)，也可保存于-70。C備用。
3、 RT-PCR反應(yīng)
RT: 20iU反轉(zhuǎn)錄體系中，反轉(zhuǎn)錄引物P2 1ul， RNA5ul， 7(TC加熱10min， 冰浴10rain;再加入5倍PCR buffer 4u 1， 2. 5畫1/L dNTP 2u 1， RNaisn 0. 5 u 1， AMV反轉(zhuǎn)錄酶1 u 1， DEPC H20 6. 5 ii 1，充分混合后離心，經(jīng)42。C60min， 95。C滅活A(yù)MV反轉(zhuǎn)錄酶，立即于冰上冷卻，進入PCR。
PCR:反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5pl， lO倍PCRbuffer 5u 1， 2. 5mmol/L dNTP4u 1， Pl、 P2各1 ti 1， rTaq DNA Polymerase 1 u 1，加水補足50 y 1。優(yōu)化PCR循環(huán)參 數(shù)，確定PCR的最佳反應(yīng)程序為94°C 45s， 51.6°C 45s， 72°C 45s， 30 個循環(huán)后，72。C延伸5min。取5u 1 PCR產(chǎn)物，以lOObp Ladder作對照，進 行1. 2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。
4、 RFLP鑒定
將擴增得到的片段經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳回收純化，進行酶切反應(yīng)，20
體系中包含2ul 10Xbuffer， lul BamHI限制性內(nèi)切酶，6 n 1 PCR產(chǎn)物， 11 U 1滅菌去離子水?；靹颍?7。C水浴1 1. 5小時，加入1/10的10倍Loading buffer,瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。判定檢測的樣品病毒所屬類型，3條帶 為野毒株。
5、目的片段驗證測序
根據(jù)上述方法經(jīng)測序在下列序列表中標注的BamHI位于153位和608位為內(nèi)切酶。
AGGAAGAGGCTCAGCTAGTGTCAGAAATAGCATCCAAG
實施例4:
引物的設(shè)計與合成
設(shè)計合成一對引物P1: 5 'TTCTGAGGCAGATGAGTTCTTC3，， P2: 5 'CTTGG
ATGCT ATTTC TGACA CT 3，，預(yù)期擴增目的片段大小為829bp。將河北肅寧狐 貍HSN07株中CDVNP基因829片段擴增。
2 、病毒RNA制備采用invitrogen公司的Trizol試劑提取RNA。主要步 驟為(1)無菌取發(fā)病動物的內(nèi)臟或血液，內(nèi)臟要加l: l的PBS進行研磨；
(2)取250ixl研磨懸液先后加入750 ii 1 Trizol和200u 1氯仿，劇烈振蕩 混勻15s， 4°C 14000 rpm離心15min。 (3)取出上清轉(zhuǎn)移至一個新的離心管 中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫沉淀10分鐘，4°C14000 rpm離心 10min。 (4)倒去液體，加入lml 75 %乙醇；顛倒幾次，8500 rpm離心5min。 (5)棄去上清，用濾紙沾干殘留部分，室溫晾干，DEPC水溶解沉淀。得到的 RNA可直接用于RT-PCR反應(yīng)，也可保存于-7(TC備用。
3、 RT-PCR反應(yīng)
RT: 20Pl反轉(zhuǎn)錄體系中，反轉(zhuǎn)錄引物P2 1ul， RNA5ul， 7(TC加熱10min， 冰浴10min;再加入5倍PCR buffer 1， 2. 5mmol/L dNTP 1， RNaisn 0. 5 ii 1， AMV反轉(zhuǎn)錄酶1 li 1， DEPC H20 6. 5 ii 1，充分混合后離心，經(jīng)42。C60min， 95"滅活A(yù)MV反轉(zhuǎn)錄酶，立即于冰上冷卻，進入PCR。
PCR:反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5ti1， 10倍PCRbuffer 5ix 1， 2. 5mmol/L dNTP4 u 1， Pl、 P2各1 u 1 ， rTaq DNA Polymerase 1 p 1 ，加水補足50 u 1 。優(yōu)化PCR循環(huán)參 數(shù)，確定PCR的最佳反應(yīng)程序為94°C 45s， 51.6°C 45s， 72°C 45s， 30 個循環(huán)后，72。C延伸5min。取5ulPCR產(chǎn)物，以100bp Ladder作對照，進 行1. 2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。
4、 RFLP鑒定
將擴增得到的片段經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳回收純化，進行酶切反應(yīng)，20ii 體系中包含2ul 10Xbuffer, 1 y 1 BamHI限制性內(nèi)切酶，6ulPCR產(chǎn)物， 11 " 1滅菌去離子水。混勻，37。C水浴1 1. 5小時，加入1/10的10倍Loading buffer,瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。判定檢測的樣品病毒所屬類型，3條帶
為野毒株。
5、目的片段驗證測序
根據(jù)上述方法經(jīng)測序在下列序列表中標注的BamHI位于153位608位為內(nèi)切 酶。
GAAGAGGCTCAGCTAGTGTCAGAAATAGCATCCAAG
權(quán)利要求
1、區(qū)分犬瘟熱病毒疫苗株和野毒株的一段序列和一個酶切位點，其特征在于在CDV犬瘟熱結(jié)構(gòu)蛋白核蛋白NP基因的372-1200位之間，設(shè)計引物P15‘TTCTG AGGCA GATGA GTTCT TC 3’，P25‘CTTGGATGCT ATTTC TGACA CT 3’RT-PCR擴增特異性片段829bp，PCR擴增的目的片段可以被特異核酸位點BamHI切成2個或者3個片段，從而鑒別犬瘟熱病毒疫苗株和野毒株。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的區(qū)分犬瘟熱病毒疫苗株和野毒株的一 段序列和一個酶切位點，其特征在于所選擇的特異核酸位點位于選擇 的目的核酸片段的疫苗株為153位或野毒株為153位和608位。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l、 2所述的區(qū)分犬瘟熱病毒疫苗株和野毒株的 一段序列和一個酶切位點，其特征在于所述的PCR擴增的目的片段可 以被特異核酸位點BamHI切成的疫苗株2個片段大小為675bp和 153bp，野毒株3個片段大小為455bp、 220bp和153bp。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種區(qū)分犬瘟熱病毒疫苗株和野毒株的一段序列和一個酶切位點，融合反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)和限制性內(nèi)切酶分析(RFLP)兩種分子生物學(xué)檢測方法，選擇CDV NP基因，設(shè)計特異引物擴增829bp，再利用BamHI RFLP處理該片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳判定，通過片段的數(shù)目鑒別動物體內(nèi)檢測到的犬瘟熱病毒屬于接種的疫苗株還是感染了野毒，電泳得到675bp和153bp 2條片段為疫苗株，得到455bp、220bp和153bp 3條片段為野毒株。有效區(qū)分犬瘟熱病毒疫苗株和野毒株，為毛皮動物的養(yǎng)殖提供獸醫(yī)技術(shù)保證。
文檔編號C12Q1/68GK101376909SQ20071005602
公開日2009年3月4日 申請日期2007年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月31日
發(fā)明者威 吳, 張海玲, 柴秀麗, 王鳳雪, 羅國良, 邵西群, 閆喜軍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所