一種構建犬瘟熱病毒反向遺傳系統(tǒng)的方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種構建犬瘟熱病毒反向遺傳系統(tǒng)的方法，本發(fā)明中引物設計充分考慮到在構建質粒FA、FB和FC時要保證各段基因開放閱讀框的完整性，尤其是質粒FB含有完整H基因和F基因，H和F基因是CDV主演的研究內容，對毒力和免疫原性有重要影響，質粒FB的構建為本發(fā)明在以后使用中對CDV主要研究內容的基因操作提供了便利，此外個各引物和酶切位點的選擇也是基于這方面的考慮，可以將各主要基因片段完整酶切替換等基因克隆操作。總之，本方法中通過間質粒FA、FB和FC的構建相比有方法大量減少了基因克隆的次數(shù)，位后期不同目的用途提供了便利條件。
【專利說明】一種構建犬瘍熱病毒反向遺傳系統(tǒng)的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于病源微生物基因組學研究【技術領域】，具體涉及一種構建犬瘟熱病毒反向遺傳系統(tǒng)的方法。
【背景技術】
[0002]犬痕熱是由犬痕熱病毒(Canine Distemper Virus,CDV)感染引起的,具有高度接觸性、致死性的急性敗血癥。CDV在副粘病毒家族中與麻疹病毒、牛瘟病毒同屬麻疹病毒屬，是副粘病毒科中一個血清學上密切相關的屬，宿主特異性卻各自不相同。犬瘟熱病毒感染犬可導致隱性感染，有腸道癥狀，或有呼吸道癥狀，有時伴有中樞神經系統(tǒng)癥狀。神經癥狀也可能是犬瘟熱感染的晚期表現(xiàn)。
[0003]犬瘟熱病毒基因組是不分節(jié)段RNA病毒全長15690bp，在自然界分離的病毒基因長度上存在高度一致性，并遵循六堿基原則。其3’ -端和5’ -端分別是先導序列和尾隨序列，它們在調芐基因復制和轉錄中起作用，5’-端的非編碼區(qū)可能含有核衣殼化起始位點和編碼反基因3’ -端 復制啟動子。犬瘟熱病毒自3’ -端至5’ -端非重疊方式表達6個結構蛋白分別為核衣殼蛋白(Nucleocapsidprotein, NP)、磷蛋白(Phosphoprotein, PP)、基質蛋白(Matrix protein, MP)、融合蛋白(Fusion protein, FP)、血凝素蛋白(Haemagglutininprotein, HP)和大蛋白(RNA-dependent RNA-polymerase protein, LP)
[0004]反向遺傳學技術已廣泛應用于病毒學研究的各個領域，極大地推動了病毒學基礎與應用研究的快速發(fā)展。病毒反向遺傳操作系統(tǒng)借助真核質粒使載體上的病毒cNDA在細胞內產生有活性的DNA/RNA片段，通常DNA和一部分RNA具有感染性可以產生病毒，另外一些RNA病毒需要病毒蛋白結合產生病毒。
[0005]在早期的CDV拯救系統(tǒng)使用能夠產生RNA聚合酶的拯救細胞或表達RNA聚合酶痘病毒感染，載體含有T7RNA聚合酶啟動子來產生病毒RNA。隨著技術發(fā)展和研究深入，犬瘟熱病毒廣泛采用的拯救系統(tǒng)主要使用真核表達載體，兩端分別加丁型肝炎核酶(Hdv Rz)和錘頭核酶(Ham Rz)的全基因，再構建表達N、P和L蛋白的輔助質粒，共轉染細胞以后產生核糖核蛋白復合物(RNP)進入細胞復制周期，產生CDV。這一方法首先在狂犬病毒上應用，這是首個應用此方法的負鏈RNA病毒，隨后廣泛用于其它負鏈RNA病毒，如正粘病毒、副粘病毒等。但副粘病毒科基因長度較長，通常在15k左右，所以隨后的CDV拯救都是分6-10段擴增病毒基因片段逐段連接。例如GASSEN(Establishment of a Rescue System forCanine Distemper Virus)在2000文章中方法為例,作者選擇12個酶切位點分11個片段擴增⑶V基因包含兩段核酶序列連接如T載體，然后逐段酶切連接入pEMC或pBS SK II載體，該方法構建感染性克隆需要進行11次亞克隆以獲得完整基因。，極易在構建的過程中發(fā)生錯誤，且耗時長導致效率低下。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種構建犬瘟熱病毒反向遺傳系統(tǒng)的方法，本發(fā)明的方法可以快速的構建CDV感染性克隆，方便后期操作，從而彌補現(xiàn)有技術的不足。
[0007]本發(fā)明首先提供一種構建CDV反向遺傳全基因載體的方法，包括如下的步驟:
[0008]I)首先設計用于擴增CDV基因組不同片段的9對引物，引物的序列信息如下:
[0009]
【權利要求】
1.一種構建CDV反向遺傳全基因載體的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步驟: I)首先設計用于擴增CDV基因組不同片段的9對引物，引物的序列信息如下:
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的HamRz pUHdv Rz pUHdv Rz p2的引物序列信息如下:
3.一種構建犬瘟熱病毒反向遺傳系統(tǒng)的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步驟 1)用引物N-f、N-r擴增片段N、用引物P-f、P-r擴增片段P和用引物L-fa-r擴增片段L，雙酶切連入pVAX2構成輔助質粒pVAX-N、pVAX-P和pVAX_L ;其中引物的序列信息如下:
【文檔編號】C12N15/63GK103981202SQ201410257546
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年6月11日 優(yōu)先權日:2014年6月11日
【發(fā)明者】單虎, 蔣文明, 杜翔, 黃娟, 楊瑞梅, 張傳美, 秦志華 申請人:青島農業(yè)大學