流感病毒疫苗及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供的是流感血細(xì)胞凝集素多肽，包括嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽和包含修飾的糖基化位點(diǎn)和非天然的糖基化位點(diǎn)的流感血細(xì)胞凝集素多肽，包含它們的組合物，包含它們的疫苗及它們的使用方法。
【專利說明】流感病毒疫苗及其應(yīng)用
[0001]本申請要求美國臨時(shí)申請?zhí)?1/536,924(申請日為2011年9月20日)、美國臨時(shí)申請?zhí)?1/565,899(申請日為2011年12月I日)、美國臨時(shí)申請?zhí)?1/607，526(申請日為2012年3月6日)、美國臨時(shí)申請?zhí)?1/648,525(申請日為2012年5月17日)、美國臨時(shí)申請?zhí)?1/670，108 (申請日為2012年7月10日)和美國臨時(shí)申請?zhí)?1/684，481 (申請日為2012年8月17日)的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，所述美國臨時(shí)申請以其整體并入本文作為參考。
[0002]本發(fā)明是在政府資助下完成的，資助號為A1070469、A1086061和HHSN266200700010C，資助獎(jiǎng)金由美國國家衛(wèi)生研究院(the Nat1nal Institutes ofHealth)提供。美國政府在本發(fā)明中具有一定的權(quán)利。
[0003]1.引言
[0004]本文提供的是流感血細(xì)胞凝集素多肽(flu hemagglutinin polypeptides),例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽，和包含它們的組合物、包含它們的疫苗及其使用方法。
[0005]2.背景
[0006]流感病毒流感病毒是有包膜的RNA病毒，屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(Palese 和 Shaw(2007)Orthomyxoviridae:The Viruses and Their Replicat1n (正粘病毒科:病毒及其復(fù)制)，第5版，F(xiàn)ields’ Virology,由B.N.Fields, D.M.Knipe和P.M.Howley 編著，Wolters Kluwer Health/Lippincott ffilliams&ffilkins, Philadelphia，USA，pl647-1689)。甲型流感病毒的天然宿主主要是禽類，但是甲型流感病毒(包括禽類來源的那些)也可以在人類和其它動(dòng)物宿主(蝙蝠、犬、豬、馬、海洋哺乳動(dòng)物和鼬科動(dòng)物)中感染并引起疾病。例如，在亞洲流行的H5N1禽類甲型流感病毒已經(jīng)在中國和印度尼西亞的豬中發(fā)現(xiàn)，并將其宿主范圍擴(kuò)展至包括貓、豹和虎，貓、豹和虎通常被認(rèn)為對甲型流感不敏感(CIDRAP-Avian Influenza:Agricultural and Wildlife Considerat1ns)。動(dòng)物中流感病毒感染的發(fā)生可以潛在地產(chǎn)生人類大流行性流感毒株。
[0007]甲型流感病毒和乙型流感病毒是主要的人類病原體，引起呼吸系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重范圍從亞臨床感染到可能導(dǎo)致死亡的原發(fā)性病毒性肺炎。感染的臨床效果由于流感毒株的毒力和宿主的暴露情況、病史、年齡和免疫狀況而不同。由于相對高的攻擊率，季節(jié)性流感引起的累計(jì)發(fā)病率和死亡率是相當(dāng)高的。在正常的季節(jié)里，在全球范圍內(nèi)，流感可以引起300萬到500萬病例的嚴(yán)重疾病和高達(dá)500，000例死亡(World HealthOrganizat1n (2003) Inf luenza: Overview ；March2003 (世界衛(wèi)生組織(2003)流感:綜述；2003年3月))。在美國，流感病毒每年感染估計(jì)10-15%的人口(Glezen和Couch RB(1978)Interpandemic influenza in the Houston area, 1974-76 (1974-76 年休斯頓地區(qū)大流行間的流感).Ν Engl J Med298:587-592 ;Fox 等人(1982) Influenza virus infect1nsin Seattle families, 1975-1979.11.Pattern of infect1n in invaded householdsand relat1n of age and pr1r antibody to occurrence of infect1n and relatedillneSS(1975-1979年西雅圖家庭中的流感病毒感染。I1.侵入家庭的感染模式及年齡和現(xiàn)有抗體與發(fā)生感染和相關(guān)疾病的關(guān)系).Am J Epidem1l 116:228-242)并與每年大約 30，OOO 例死亡有關(guān)(Thompson Wff 等人(2003)Mortality Associated with Influenzaand Respiratory Syncytial Virus in the United States (在美國與流感病毒和呼吸道合胞病毒相關(guān)的死亡率).JAMA289:179-186 ；Belshe (2007) Translat1nal researchon vaccines:1nfluenza as an example (對疫苗的翻譯研究:用流感作為實(shí)例).ClinPharmacol Ther82:745-749)。
[0008]除了每年的流行病以外，流感病毒還是罕見的大流行的起因。例如，甲型流感病毒可以引起大流行，例如在1918年、1957年、1968年和2009年發(fā)生的大流行。由于缺乏預(yù)先形成的針對主要病毒抗原血細(xì)胞凝集素(hemagglutinin, HA)的免疫力，因此大流行的流感可以在一年內(nèi)影響超過50%的人口并經(jīng)常引起比流行性流感更嚴(yán)重的疾病。一個(gè)經(jīng)典型的實(shí)例是1918年的大流行，在1918年估計(jì)有5千萬到I億人死亡(Johnson和Mueller (2002)Updating the Accounts:Global Mortality of thel918_1920 “Spanish”InfluenzaPandemic Bulletin of the History of Medicine76:105-115)。由于 1990 年代后期高致病性禽類H5N1 流感病毒的出現(xiàn)(Claas等人(1998)Human influenza A H5Nlvirus relatedto a highly pathogenic avian influenza virus (與高致病性禽流感病毒相關(guān)的人類甲型流感病毒H5N1).Lancet351:472-7)，因此人們擔(dān)心它可能是下一個(gè)引起大流行的病毒。再者，H7和H9毒株均是新的大流行的候選毒株，因?yàn)檫@些毒株偶爾會(huì)感染人類。
[0009]免受流感病毒感染的一種有效方式是通過免疫接種；然而，當(dāng)前的免疫接種方法依賴于實(shí)現(xiàn)流行毒株與包含在疫苗中的分離毒株之間的良好匹配。由于多種因素的組合，這樣一種匹配常常是很難達(dá)到的。首先，流感病毒持續(xù)地發(fā)生變化:每3-5年甲型流感病毒的優(yōu)勢毒株就會(huì)被經(jīng)歷了充分的抗原性漂移(antigenic drift)以逃避現(xiàn)有的抗體應(yīng)答的變異毒株所代替。因此，疫苗制劑中包含的分離毒株必須基于世界衛(wèi)生組織(WHO)協(xié)作中心的密切監(jiān)視結(jié)果而每年進(jìn)行篩選。其次，為了使得疫苗生產(chǎn)和分布具有足夠的時(shí)間，毒株必須在流感季節(jié)來臨之前大約六個(gè)月進(jìn)行篩選。疫苗毒株篩選委員會(huì)(the vaccinestrain select1n committee)的預(yù)報(bào)經(jīng)常是不準(zhǔn)確的,這導(dǎo)致疫苗接種效果明顯降低。
[0010]甲型流感病毒的新亞型進(jìn)入人群的可能性也顯示了對當(dāng)前疫苗接種策略的重大挑戰(zhàn)。由于預(yù)報(bào)流感病毒的哪種亞型和毒株將會(huì)引起下一次大流行是不可能的，因此目前的毒株特異性方法不能用于制備大流行性流感疫苗。
[0011]3.概沭
[0012]本文提供的是誘導(dǎo)針對流感病毒的保守的HA干結(jié)構(gòu)域(stem domain)(本文中有時(shí)稱之為“莖”結(jié)構(gòu)域(“stalk” domain))的交叉保護(hù)性免疫應(yīng)答的流感血細(xì)胞凝集素(HA)多肽。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及具有展示對所述莖是異源的球狀HA頭的穩(wěn)定HA莖的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽(即本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)的設(shè)計(jì)和構(gòu)建體。設(shè)計(jì)用來進(jìn)行接種的HA免疫原共享所述HA莖區(qū)域但在其球狀頭有高度多樣性。這樣的構(gòu)建體經(jīng)工程改造成為誘發(fā)針對保守HA莖的高度強(qiáng)效和廣泛中和抗體的疫苗制劑，例如活的流感病毒、殺死的流感病毒、病毒/病毒樣顆粒(“VLPs”)、亞單位疫苗、裂解疫苗等。這樣的“通用”疫苗可用于誘導(dǎo)和/或加強(qiáng)流感病毒亞型間的交叉保護(hù)性免疫應(yīng)答。
[0013]作為背景，針對流感病毒的中和抗體靶向HA糖蛋白并且阻止參與病毒進(jìn)入的結(jié)合步驟或融合步驟。中和抗體的兩個(gè)基礎(chǔ)亞組(subset)由暴露于流感病毒激發(fā):針對毒株-特異性球狀頭(在流感病毒的各種不同毒株和亞型間是非保守的結(jié)構(gòu)域)的那些和針對HA糖蛋白的高度保守的干的那些。非保守的HA球狀頭攜帶免疫優(yōu)勢表位(immunodominant epitope)。雖然不受理論的束縛,但是一般認(rèn)為毒株-特異性抗球狀頭抗體比抗干抗體更強(qiáng)效，因此解釋了用目前疫苗感染所賦予的大部分毒株-特異性免疫力。
[0014]本發(fā)明部分地基于發(fā)明人的關(guān)于激發(fā)針對HA干的高度強(qiáng)效和廣泛中和抗體的流感病毒疫苗的合理設(shè)計(jì)策略。在這一方面，設(shè)計(jì)出嵌合HA免疫原來共享來自先前暴露/接種的相對非常保守的莖結(jié)構(gòu)域，但含有異源HA球狀頭一優(yōu)選對預(yù)定接種是原初的(naive)HA球狀頭。對這種構(gòu)建體的暴露應(yīng)當(dāng)主要是加強(qiáng)針對保守HA干的抗體。用這種保守的HA干和變化的球狀頭重復(fù)免疫應(yīng)當(dāng)誘導(dǎo)穩(wěn)固的針對HA的共同干區(qū)域的交叉中和抗體。
[0015]當(dāng)設(shè)計(jì)嵌合的HA構(gòu)建體時(shí),應(yīng)當(dāng)小心維護(hù)所得蛋白的穩(wěn)定性。在這一方面,建議使在圖1中標(biāo)識為Ap和Aq的半胱氨酸殘基得以維持，由于它們對HA莖的穩(wěn)定性有貢獻(xiàn)，如下文第5.1節(jié)更詳細(xì)論述的。對于最佳穩(wěn)定性，優(yōu)選HA球狀結(jié)構(gòu)域作為整體(介于Ap和Aq半胱氨酸殘基之間，如圖1所示)進(jìn)行“調(diào)換(swap) ”，因?yàn)樗脴?gòu)象將與天然結(jié)構(gòu)最密切。換句話說，在第5.1.2節(jié)中提及的“接頭(linker)”可以是異源HA的整個(gè)球狀頭結(jié)構(gòu)域。
[0016]代之以“調(diào)換出(swapping out) ”HA莖的天然球狀頭，所述球狀頭可以通過改變對HA球狀頭表位有貢獻(xiàn)的環(huán)(loops)而制成對保守的莖是異源的。這種方法對于產(chǎn)生針對保守莖的所需免疫應(yīng)答也可能不起作用，除非改變的球狀頭被設(shè)計(jì)成與天然球狀HA頭有巨大不同一尤其是當(dāng)使用群體被暴露的HA。盡管如此，這樣的改變可以例如通過改變對HA球狀頭表位有貢獻(xiàn)的五個(gè)環(huán)中的大部分來完成。在一個(gè)有用的方法中，所有的五個(gè)環(huán)均可以被改變?？蛇x地，或另外，五個(gè)環(huán)中的表位可以通過將糖基化位點(diǎn)引入到球狀頭結(jié)構(gòu)域中而遮蔽。
[0017]用于疫苗接種的構(gòu)建體可以有利地被設(shè)計(jì)成用于待接種疫苗的特殊對象/群體。有三種流感亞型在有人類生活的今天已暴露:亞型H1、H2和H3。H2亞型的流感病毒已在1968年從人群中消失，而Hl和H3亞型的流感病毒直到今天持續(xù)在人群中存在。結(jié)果，在1968年之前出生的活到今天的成人很可能已暴露了 H1、H2和H3亞型中的每一種。相反，在1968年之后出生的活到今天的成人很可能僅暴露于Hl和H3亞型。
[0018]因此，在對成人實(shí)施接種疫苗的多個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述嵌合的流感血細(xì)胞凝集素多肽不具有來自亞型Hl、H2或H3的流感病毒的HA的球狀頭結(jié)構(gòu)域，但是的確具有來自這三種亞型之一的HA的干結(jié)構(gòu)域。所述異源球狀頭可選自任何非Hl、非H2或非H3亞型的HA。另外，使用H1/H2干在一個(gè)方面和H3干在另一個(gè)方面制備的分開的嵌合構(gòu)建體可能有益地用于疫苗接種程序一HI和H2亞型是共享保守莖結(jié)構(gòu)域的組IHA亞型(GrouplHAsubtype);而H3是其莖結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上不同于組I莖的組2亞型(Group2subtype)。Hl和H3構(gòu)建體的應(yīng)用將會(huì)確保產(chǎn)生/加強(qiáng)針對每一種干結(jié)構(gòu)域的免疫應(yīng)答。用這樣的嵌合的流感血細(xì)胞凝集素多肽免疫成人對象將加強(qiáng)所述對象的記憶免疫應(yīng)答，導(dǎo)致有交叉反應(yīng)性的廣泛中和抗干結(jié)構(gòu)域抗體的大規(guī)模產(chǎn)生，從而在所述對象中提供對流感病毒的長期持續(xù)的免疫力。
[0019]尚未暴露的嬰兒對所有的流感病毒亞型當(dāng)然是原初的(丨iai've).,結(jié)果，可以構(gòu)建各式各樣的HA干/球狀頭組合用于嬰兒的疫苗中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以給原初嬰兒接種用組I (HI或H2)或組2(H3)毒株的HA莖和來自異源毒株(即非H1、非取和/或非H3毒株)的球狀頭制備的構(gòu)建體。對于各HA莖的三種不同的嵌合HA構(gòu)建體可以有利地用于三次序貫疫苗接種以誘導(dǎo)交叉保護(hù)性應(yīng)答。
[0020]用于疫苗接種的嵌合的流感血細(xì)胞凝集素多肽也可以有利地設(shè)計(jì)成在對象中有效地激發(fā)針對HA干結(jié)構(gòu)域的高度強(qiáng)效和廣泛中和抗體，即在這些多肽中添加或修飾糖基化位點(diǎn)。相信所述HA球狀頭結(jié)構(gòu)域和干結(jié)構(gòu)域的糖基化可以遮蔽抗原性位點(diǎn)，從而允許流感病毒逃避對象體內(nèi)的免疫應(yīng)答。在流感病毒HA多肽的上下文中，然而，所述嵌合的流感血細(xì)胞凝集素多肽的干結(jié)構(gòu)域里面的糖基化可以阻礙或防止針對這個(gè)因糖基化而被屏蔽的結(jié)構(gòu)域里面的抗原性區(qū)域的所需免疫應(yīng)答。因此，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述嵌合的流感血細(xì)胞凝集素多肽包含破壞聚糖與干結(jié)構(gòu)域結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)，從而使用于激發(fā)免疫應(yīng)答的干結(jié)構(gòu)域更可及。為了進(jìn)一步增加干結(jié)構(gòu)域的免疫原性，所述構(gòu)建體可以在所述球狀頭結(jié)構(gòu)域中還包含非天然存在的糖基化位點(diǎn)，當(dāng)被糖基化時(shí)，屏蔽了在球狀頭結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)的免疫優(yōu)勢抗原性區(qū)域免于激發(fā)免疫應(yīng)答。非天然存在的糖基化位點(diǎn)的一個(gè)實(shí)例是將糖基化位點(diǎn)添加到一種亞型的流感病毒HA的球狀頭結(jié)構(gòu)域上，其中所述糖基化位點(diǎn)天然存在于另一種亞型的流感病毒HA的球狀頭結(jié)構(gòu)域中。非天然存在的糖基化位點(diǎn)的另一個(gè)實(shí)例是將糖基化位點(diǎn)添加到來自一種毒株的流感病毒HA的球狀頭結(jié)構(gòu)域上，其中所述糖基化位點(diǎn)天然存在于來自流感病毒的另一種毒株的HA的球狀頭中。非天然存在的糖基化位點(diǎn)的又一個(gè)實(shí)例是將糖基化位點(diǎn)添加到來自一種毒株的HA的球狀頭上，其中所述糖基化位點(diǎn)并不天然存在于來自流感病毒的另一種亞型或毒株的HA的球狀頭中。盡管不受任何具體操作理論的束縛，但是相信在球狀頭結(jié)構(gòu)域中的額外糖基化將增加對保守干結(jié)構(gòu)域的免疫應(yīng)答，同時(shí)減少對球狀頭結(jié)構(gòu)域的免疫應(yīng)答。
[0021]應(yīng)當(dāng)理解，本文描述的嵌合的流感血細(xì)胞凝集素多肽的應(yīng)用是有利的，因?yàn)?i)所述多肽是十分穩(wěn)定的(鑒于具有完整的球狀頭結(jié)構(gòu)域)和(ii)給予所述多肽的對象的免疫系統(tǒng)先前未曾暴露于所述嵌合的流感血細(xì)胞凝集素的球狀頭結(jié)構(gòu)域，但是已暴露于所述嵌合的流感血細(xì)胞凝集素的干結(jié)構(gòu)域的保守表位。
[0022]在另一個(gè)方面，本文提供的是包含干結(jié)構(gòu)域的流感HA多肽(例如，流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽和非嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)，所述干結(jié)構(gòu)域包含破壞聚糖與干結(jié)構(gòu)域結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)。
[0023]在另一個(gè)方面，本文提供的是包含球狀頭結(jié)構(gòu)域的流感HA多肽(例如，流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽和非嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)，所述球狀頭結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)或多個(gè)非天然存在的糖基化位點(diǎn)。
[0024]在又一個(gè)方面，本文提供的是包含(I)干結(jié)構(gòu)域和⑵球狀頭結(jié)構(gòu)域的流感HA多肽(例如，流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽和非嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)，所述干結(jié)構(gòu)域包含破壞聚糖與干結(jié)構(gòu)域結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)，所述球狀頭結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)或多個(gè)非天然存在的糖基化位點(diǎn)。
[0025]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含HA干結(jié)構(gòu)域和HA球狀頭結(jié)構(gòu)域的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽，其中:(I)所述HA球狀頭結(jié)構(gòu)域?qū)λ鯤A干結(jié)構(gòu)域是異源的；和(2)所述HA干結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)，其中所述修飾的糖基化位點(diǎn)包含對破壞/干擾聚糖與干結(jié)構(gòu)域中的糖基化位點(diǎn)結(jié)合的糖基化位點(diǎn)的修飾。在多個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述修飾的糖基化位點(diǎn)包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位點(diǎn)的修飾，和其中Xaa是任意氨基酸。在某些實(shí)施方案中，所述HA球狀頭結(jié)構(gòu)域還包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的一個(gè)或多個(gè)非天然存在的糖基化位點(diǎn)，其中Xaa是任意氨基酸。
[0026]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的是包含HA干結(jié)構(gòu)域和HA球狀頭結(jié)構(gòu)域的非嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽，其中:(I)所述HA球狀頭結(jié)構(gòu)域與所述HA干結(jié)構(gòu)域同源，和(2)所述HA干結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)，其中所述修飾的糖基化位點(diǎn)包含對破壞/干擾聚糖與所述干結(jié)構(gòu)域中的糖基化位點(diǎn)結(jié)合的糖基化位點(diǎn)的修飾。在多個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述修飾的糖基化位點(diǎn)包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位點(diǎn)的修飾，其中所述修飾破壞聚糖附著到所述修飾的糖基化位點(diǎn)的能力，其中Xaa是任意氨基酸。
[0027]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的是包含流感血細(xì)胞凝集素HAl結(jié)構(gòu)域的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)干結(jié)構(gòu)域多肽，所述HAl結(jié)構(gòu)域包含按以下順序連接的各成分:HAlN-端干區(qū)段共價(jià)連接于1-50個(gè)異源殘基的接頭，所述接頭又共價(jià)連接于HAlC-端短干區(qū)段(HAlC-terminal short stem segment);所述HAl結(jié)構(gòu)域與流感血細(xì)胞凝集素HA2結(jié)構(gòu)域以三級或四級締合(tertiary or quaternary associat1n),其中所述流感病毒HA干結(jié)構(gòu)域多肽結(jié)構(gòu)域還包含一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)，其中所述修飾的糖基化位點(diǎn)包含對破壞/干擾聚糖與所述干結(jié)構(gòu)域中的糖基化位點(diǎn)結(jié)合的糖基化位點(diǎn)的修飾。在多個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述修飾的糖基化位點(diǎn)包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位點(diǎn)的修飾，其中所述修飾破壞聚糖附著到所述修飾的糖基化位點(diǎn)的能力，和其中Xaa是任意氨基酸。
[0028]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的是包含流感血細(xì)胞凝集素HAl結(jié)構(gòu)域的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)干結(jié)構(gòu)域多肽，所述HAl結(jié)構(gòu)域包含按以下順序連接的各成分:HAlN-端長干區(qū)段(HAlN-terminal long stem segment)共價(jià)連接于1-50個(gè)異源殘基的接頭，所述接頭又共價(jià)連接于HAlC-端長干區(qū)段；所述HAl結(jié)構(gòu)域與流感血細(xì)胞凝集素HA2結(jié)構(gòu)域以三級或四級締合，其中所述流感病毒HA干結(jié)構(gòu)域多肽結(jié)構(gòu)域還包含一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)，其中所述修飾的糖基化位點(diǎn)包含對破壞/干擾聚糖與所述干結(jié)構(gòu)域中的糖基化位點(diǎn)結(jié)合的糖基化位點(diǎn)的修飾。在多個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述修飾的糖基化位點(diǎn)包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位點(diǎn)的修飾,其中所述修飾破壞聚糖附著到所述修飾的糖基化位點(diǎn)的能力，和其中Xaa是任意氨基酸。
[0029]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的是包含流感血細(xì)胞凝集素HAl結(jié)構(gòu)域的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)干結(jié)構(gòu)域多肽，所述HAl結(jié)構(gòu)域包含按以下順序連接的各成分:HAlN-端干區(qū)段共價(jià)連接于1-50個(gè)異源殘基的接頭，所述接頭又共價(jià)連接于HAlC-端干區(qū)段；所述HAl結(jié)構(gòu)域與流感血細(xì)胞凝集素HA2結(jié)構(gòu)域以三級或四級締合，其中所述流感病毒HA干結(jié)構(gòu)域多肽結(jié)構(gòu)域還包含一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)，其中所述修飾的糖基化位點(diǎn)包含對破壞/干擾聚糖與所述干結(jié)構(gòu)域中的糖基化位點(diǎn)結(jié)合的糖基化位點(diǎn)的修飾。在多個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述修飾的糖基化位點(diǎn)包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位點(diǎn)的修飾，其中所述修飾破壞聚糖附著到所述修飾的糖基化位點(diǎn)的能力，和其中Xaa是任意氨基酸。
[0030]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的是包含流感血細(xì)胞凝集素HAl結(jié)構(gòu)域的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)干結(jié)構(gòu)域多肽，所述HAl結(jié)構(gòu)域包含按以下順序連接的各成分:HAlN-端干區(qū)段、1-50個(gè)異源殘基的第一接頭、HAl中間干區(qū)段、1-50個(gè)異源殘基的第二接頭和HAlC-端干區(qū)段；所述HAl結(jié)構(gòu)域與流感血細(xì)胞凝集素HA2結(jié)構(gòu)域以三級或四級締合，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)干結(jié)構(gòu)域多肽結(jié)構(gòu)域還包含一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)，其中所述修飾的糖基化位點(diǎn)包含對破壞/干擾聚糖與所述干結(jié)構(gòu)域中的糖基化位點(diǎn)結(jié)合的糖基化位點(diǎn)的修飾。在多個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述修飾的糖基化位點(diǎn)包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位點(diǎn)的修飾,其中所述修飾破壞聚糖附著到所述修飾的糖基化位點(diǎn)的能力，和其中Xaa是任意氨基酸。
[0031]本發(fā)明通過工作實(shí)施例(例如，第6節(jié)，實(shí)施例)予以舉例說明，這些工作實(shí)施例尤其證明了包含HA干并展示異源HA頭的嵌合流感HA多肽的構(gòu)建，及來自這種與抗干結(jié)構(gòu)域和頭結(jié)構(gòu)域二者的抗體起交叉反應(yīng)的多肽的穩(wěn)定的嵌合的HA蛋白的產(chǎn)生。這些工作實(shí)施例也舉例說明了這樣的構(gòu)建體在產(chǎn)生在對象中針對流感病毒的多種不同毒株和亞型的保護(hù)性免疫應(yīng)答中的應(yīng)用，即，所述實(shí)施例證明了本文描述的嵌合的流感HA多肽可以用作通用流感疫苗。另外，這些工作實(shí)施例(例如，第6.11節(jié)，實(shí)施例11)證明了包含具有一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)的HA干結(jié)構(gòu)域和/或具有一個(gè)或多個(gè)非天然存在的糖基化位點(diǎn)的HA球狀頭結(jié)構(gòu)域的流感HA多肽的構(gòu)建，其中所述修飾的糖基化位點(diǎn)是對破壞聚糖附著到糖基化位點(diǎn)的能力的一個(gè)或多個(gè)天然存在的糖基化位點(diǎn)的修飾。這些工作實(shí)施例(參見第6.11節(jié)，實(shí)施例11)也證明了這些流感HA多肽激發(fā)對流感病毒的保守莖結(jié)構(gòu)域的免疫應(yīng)答增加的能力。
[0032]3.1 術(shù)語
[0033]術(shù)語“約(about) ”或“近似(approximate) ”，當(dāng)參照氨基酸位置使用時(shí)是指序列中的特定氨基酸位置或在該氨基酸位置的五、四、三、二或一個(gè)殘基以內(nèi)的任意氨基酸，或以N-端方向或以C-端方向。
[0034]如本文所用的，術(shù)語“約”或“近似地”當(dāng)與數(shù)字連用時(shí)是指參考數(shù)值的1%、5%或10 %以內(nèi)的任意數(shù)值。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語“約”包括所記載的準(zhǔn)確數(shù)值。
[0035]術(shù)語“氨基酸序列同一性”是指一對比對的氨基酸序列之間的同一性或相似性的程度，通常用百分?jǐn)?shù)表示。百分比同一性是候選序列中的這樣的氨基酸殘基的百分比，所述氨基酸殘基在序列比對并且如果需要的話引入空位(gap)以實(shí)現(xiàn)最大百分比序列同源性之后，與肽中的對應(yīng)氨基酸殘基是相同的(即，在比對中給定位置的氨基酸殘基是相同的殘基)或相似的(即，在比對中給定位置的氨基酸取代是保守性取代，如下文所論述)。序列同源性，包括序列同一性和相似性百分比，可以利用本領(lǐng)域公知的序列比對技術(shù)來確定，優(yōu)選為該目的設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)算法，用所述計(jì)算機(jī)算法的默認(rèn)參數(shù)或包含它們的軟件包。計(jì)算機(jī)算法和摻入這樣的算法的軟件包的非限制性實(shí)例包括以下。BLAST家族的程序例舉了一個(gè)特別的，非限制性的用于比較兩個(gè)序列的數(shù)學(xué)算法的實(shí)例(例如，Karlin&Altschul, 1990, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:2264-2268 (修改為 Karlin&Altschul, 1993, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-5877)，Altschul等人，1990，J.Mol.B1l.215:403-410，(描述了 NBLAST 和 XBLAST)，Altschul 等人，1997，Nucleic Acids Res.25:3389-3402 (描述了 Gapped BLAST 和 PS1-Blast)。另一個(gè)特別的實(shí)例是Myers和Miller的算法(1988CAB10S4:11-17)，該算法摻入到ALIGN程序(2.0版本)并且可作為GCG序列比對軟件包的組成部分獲得。另一個(gè)特別的實(shí)例是FASTA程序(Pearson ff.R.和 Lipman D.J., Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 85:2444-2448, 1988)，可作為威斯康辛序列分析包(the Wisconsin Sequence Analysis Package)的組成部分獲得。另外的實(shí)例包括BESTFIT，BESTFIT使用Smith和Waterman的“局部同源性(localhomology) ” 算法(Advances in Applied Mathematics, 2:482-489，1981)以找出兩個(gè)序列間的相似性最佳單個(gè)區(qū)域，在待比較的兩個(gè)序列長度不同時(shí)更優(yōu)選；和GAP，GAP將兩個(gè)序列根據(jù)Neddleman和Wunsch的算法(J.Mol.B1l.48:443-354，1970)找到“最大相似性(maximum similarity) ”來進(jìn)行比對,并且當(dāng)這兩個(gè)序列長度大概相同并且被期望在整個(gè)長度內(nèi)比對時(shí)更優(yōu)選。
[0036]“保守取代”是指某一類的一個(gè)氨基酸被同一類的另一個(gè)氨基酸置換。在多個(gè)特別的實(shí)施方案中，保守取代不改變多肽的結(jié)構(gòu)或功能或者它們二者。以保守取代為目的的氨基酸種類包括疏水性氨基酸(Met、Ala、Val、Leu、Ile)、中性親水性氨基酸(Cys、Ser、Thr)、酸性氨基酸(Asp、Glu)、堿性氨基酸(Asn、Gln、His、Lys、Arg)、構(gòu)象破壞者(conformat1ndisrupters) (Gly> Pro)和芳族氨基酸(Trp、Tyr、Phe)。
[0037]如本文所用的，術(shù)語“片段(fragment) ”在核酸序列的上下文中是指包含來自母本序列(parent sequence)的連續(xù)核苷酸的一部分的核苷酸序列。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，該術(shù)語是指來自母本序列的5至15、5至25、10至30、15至30、10至60、25至100、150至300個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該術(shù)語是指母本序列的至少 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、150、175、200、250、275、300、325、350、375、400、425、450 或 475 個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。
[0038]如本文所用的，術(shù)語“片段”在氨基酸序列的上下文中是指包含來自母本序列的連續(xù)氨基酸殘基的一部分的氨基酸序列。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，該術(shù)語是指來自母本序列的2至30、5至30、10至60、25至100、150至300個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該術(shù)語是指母本序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、
55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、150、175 或 200 個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列。
[0039]如本文所用的，術(shù)語“疾病(disease) ”和“紊亂(disorder) ”可互換使用，是指對象的病癥(condit1n)。在有些實(shí)施方案中，所述病癥是病毒性感染。在多個(gè)具體的實(shí)施方案中，術(shù)語“疾病”是指細(xì)胞或?qū)ο笾杏捎诓《镜拇嬖谒碌牟±韺W(xué)狀態(tài)，或者細(xì)胞或?qū)ο蟊徊《厩忠u所致的病理學(xué)狀態(tài)。在某些實(shí)施方案中，所述病癥是對象的疾病，其嚴(yán)重程度因給予免疫原性組合物而在對象體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答而降低。
[0040]如本文所用的，術(shù)語“有效量”在將某種療法給予對象的上下文中是指具有預(yù)防效果和/或治療效果的療法的量。在某些實(shí)施方案中，“有效量”在將某種療法給予對象的上下文中是指足以實(shí)現(xiàn)下述效果中的一、二、三、四個(gè)或四個(gè)以上的療法的量:(i)減輕或緩解流感病毒感染、疾病或與其相關(guān)的癥狀的嚴(yán)重程度；(ii)縮短流感病毒感染、疾病或與其相關(guān)的癥狀的持續(xù)時(shí)間；(iii)阻止流感病毒感染、疾病或與其相關(guān)的癥狀的進(jìn)程；(iv)引起流感病毒感染、疾病或與其相關(guān)的癥狀的消退；(V)防止流感病毒感染、疾病或與其相關(guān)的癥狀的發(fā)展或發(fā)作；(vi)防止流感病毒感染、疾病或與其相關(guān)的癥狀的復(fù)發(fā)；(vii)減少或防止流感病毒從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞、從一個(gè)組織到另一個(gè)組織或者從一個(gè)器官到另一個(gè)器官的傳播；(ix)防止或減少流感病毒從一個(gè)對象到另一個(gè)對象的傳播；(χ)減少與流感病毒感染相關(guān)的器官衰竭；(Xi)減少對象住院；(xii)縮短住院的時(shí)間；(xiii)增加患有流感病毒感染或與其相關(guān)的疾病的生存時(shí)間；(xiv)消除流感病毒感染或與其相關(guān)的疾?。?XV)抑制或減少流感病毒復(fù)制；(xvi)抑制或減少流感病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞；(xviii)抑制或減少流感病毒基因組的復(fù)制；(xix)抑制或減少流感病毒蛋白的合成；(XX)抑制或減少流感病毒顆粒的裝配；(xxi)抑制或減少流感病毒顆粒從宿主細(xì)胞中的釋放；(xxii)降低流感病毒滴度；和/或(xxiii)增強(qiáng)或提高另一種療法的預(yù)防效果或治療效果。
[0041]在某些實(shí)施方案中，所述有效量并不導(dǎo)致完全保護(hù)免于患上流感病毒疾病，但是可以導(dǎo)致與未治療的對象相比，流感病毒的滴度降低或數(shù)量減少。在某些實(shí)施方案中，所述有效量導(dǎo)致相對于未治療的對象，流感病毒的滴度有0.5倍、I倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、15 倍、20 倍、25 倍、50 倍、75 倍、100 倍、125 倍、150 倍、175 倍、200 倍、300 倍、400 倍、500倍、750倍或1，000倍或更高倍數(shù)的減少。在有些實(shí)施方案中，所述有效量導(dǎo)致流感病毒的滴度相對于未治療的對象減少近似Ilog或更高、近似21ogs或更高、近似31ogs或更高、近似41ogs或更高、近似51ogs或更高、近似61ogs或更高、近似71ogs或更高、近似81ogs或更高、近似91ogs或更高、近似1logs或更高，I至31ogs、l至51ogs、l至81ogs、I 至 91ogs、2 至 101ogs、2 至 51ogs、2 至 71ogs、21ogs 至 81ogs、2 至 91ogs、2 至 101ogs3 至51ogs、3 至 71ogs、3 至 81ogs、3 至 91ogs、4 至 61ogs、4 至 81ogs、4 至 91ogs、5 至 61ogs、5至 71ogs、5 至 81ogs、5 至 91ogs、6 至 71ogs、6 至 81ogs、6 至 91ogs、7 至 81ogs、7 至 91ogs或8至91ogs。降低流感病毒的滴度、數(shù)量或總負(fù)擔(dān)的益處包括但不限于感染癥狀的嚴(yán)重性更低、感染癥狀更少和與感染相關(guān)的疾病的病程縮短。
[0042]如本文所用的，術(shù)語“流感血細(xì)胞凝集素多肽(flu hemagglutininpolypeptide) ”和“流感HA多肽(flu HA polypeptide) ”是指(i)本文公開的嵌合的流感血細(xì)胞凝集素(HA)多肽；和(ii)本文公開的包含流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域和/或流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域的多肽或其片段中的任一個(gè)，其中任一個(gè)所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)；所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)或多個(gè)非天然存在的糖基化位點(diǎn)；或它們二者。流感HA多肽包括但不限于嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽、非嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽、流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽和流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感HA多肽是嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽，其包含在所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域中破壞聚糖與干結(jié)構(gòu)域結(jié)合的任何一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)；包含一個(gè)或多個(gè)非天然存在的糖基化位點(diǎn)的流感病毒血細(xì)胞凝集素球狀頭結(jié)構(gòu)域；或它們二者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感HA多肽是(流感病毒的任何毒株、亞型或型的或來自流感病毒的任何毒株、亞型或型的)流感血細(xì)胞凝集素多肽，其包含在所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域中破壞聚糖與干結(jié)構(gòu)域結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)，包含一個(gè)或多個(gè)非天然存在的糖基化位點(diǎn)的流感病毒血細(xì)胞凝集素球狀頭結(jié)構(gòu)域；或它們二者。參見例如，實(shí)施例11，參見下文關(guān)于這樣的流感多肽。
[0043]“血細(xì)胞凝集素(Hemagglutinin) ”和“HA”是指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何血細(xì)胞凝集素。在某些實(shí)施方案中，所述血細(xì)胞凝集素是流感血細(xì)胞凝集素，例如甲型流感血細(xì)胞凝集素、乙型流感血細(xì)胞凝集素或丙型流感血細(xì)胞凝集素。典型的血細(xì)胞凝集素包含本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的結(jié)構(gòu)域，包括信號肽(本文中任選的)、干結(jié)構(gòu)域、球狀頭結(jié)構(gòu)域、胞腔結(jié)構(gòu)域(luminal domain)(本文中任選的)、跨膜結(jié)構(gòu)域(本文中任選的)和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(本文中任選的)。在某些實(shí)施方案中，血細(xì)胞凝集素由一條多肽鏈組成，例如HA0。在某些實(shí)施方案中，血細(xì)胞凝集素由超過一條多肽鏈呈四級締合組成，例如HAl和HA2。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，未成熟的HAO可能被切割以釋放信號肽(近似20個(gè)氨基酸)得到成熟的血細(xì)胞凝集素ΗΑ0。血細(xì)胞凝集素HAO可能在另一個(gè)位點(diǎn)被切割以得到HAl多肽(近似320個(gè)氨基酸，包括球狀頭結(jié)構(gòu)域和一部分干結(jié)構(gòu)域)和HA2多肽(近似220個(gè)氨基酸，包括干結(jié)構(gòu)域的剩余部分、胞腔結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域)。在某些實(shí)施方案中，血細(xì)胞凝集素包含信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，血細(xì)胞凝集素缺少信號肽，也就是說，所述血細(xì)胞凝集素是成熟的血細(xì)胞凝集素。在某些實(shí)施方案中，血細(xì)胞凝集素缺少跨膜結(jié)構(gòu)域或細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或它們二者。如本文所用的，術(shù)語“血細(xì)胞凝集素”和“HA”包括經(jīng)翻譯后加工修飾的血細(xì)胞凝集素多肽，所述翻譯后加工例如信號肽切除、二硫鍵形成、糖基化(例如N-連接的糖基化)、蛋白酶切割和脂質(zhì)修飾(例如S-棕櫚?；?。
[0044]如本文所用的，術(shù)語“嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽(chimeric influenzavirus hemagglutinin polypeptide) ”、“嵌合的流感病毒HA多肽”、“嵌合的血細(xì)胞凝集素多肽”和“嵌合的流感血細(xì)胞凝集素多肽”是指包含流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域和流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域的流感血細(xì)胞凝集素，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域?qū)λ隽鞲胁《狙?xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域來說是異源的。在某些實(shí)施方案中，所述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域是來自與所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域不同的流感病毒的毒株或亞型。在某些實(shí)施方案中，在本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的上下文中，異源流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域是指與同源頭(即，在正常情況下與所述嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的干結(jié)構(gòu)域締合的頭結(jié)構(gòu)域)有至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少5_10%、至少10-15%、至少10-20%、至少15-20%或至少20-25%不相同的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，這樣一種差異可以使用本領(lǐng)域已知的和本文描述的方法來測量，例如，比較頭結(jié)構(gòu)域的序列同一性或序列同源性。在某些實(shí)施方案中，在本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的上下文中，異源流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域是指這樣的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭:在血細(xì)胞凝集抑制測定中，導(dǎo)致產(chǎn)生相對于針對同源頭(即，在正常情況下將與所述嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的干結(jié)構(gòu)域締合的頭結(jié)構(gòu)域)產(chǎn)生的抗血清的血細(xì)胞凝集抑制滴度，血細(xì)胞凝集抑制滴度有至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少6倍減少的抗血清。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，這樣一種差異可以使用本領(lǐng)域已知的和本文描述的方法來測量(參見例如，第5.14節(jié)，參見下文)。
[0045]“HA1N-端干區(qū)段(HAlN-terminal stem segment) ”是指對應(yīng)于流感血細(xì)胞凝集素HAl多肽的干結(jié)構(gòu)域的氨基端部分的多肽區(qū)段。在某些實(shí)施方案中，HAlN-端干區(qū)段由大致對應(yīng)于HAl結(jié)構(gòu)域的氨基酸HA I 直到Ap的氨基酸殘基組成。HAI N-Ui是HAl的N-端氨基酸，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的。Ap是HAlN-端干區(qū)段中的半胱氨酸殘基，該半胱氨酸殘基與HAlC-端干區(qū)段中的半胱氨酸殘基形成或能夠形成二硫鍵。殘基Ap在圖1中在甲型流感血細(xì)胞凝集素多肽中被標(biāo)識出來。本文描述了示例性的HAlN-端干區(qū)段。在某些實(shí)施方案中，HAlN-端干區(qū)段由大致對應(yīng)于來自H3血細(xì)胞凝集素的HAl的1_52位氨基酸的氨基酸殘基組成。需要注意的是，在這個(gè)編號系統(tǒng)中，I指的是成熟的HAO蛋白的N-端氨基酸，其中信號肽已經(jīng)被移除。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地識別出對應(yīng)于其它流感HA多肽的HAlN-端干區(qū)段的氨基酸殘基，例如對應(yīng)于來自Hl血細(xì)胞凝集素的HAl的HAlN-端干區(qū)段的氨基酸殘基(參見例如圖1)。
[0046]"HAlC-端干區(qū)段”是指對應(yīng)于流感血細(xì)胞凝集素HAl多肽的干結(jié)構(gòu)域的羧基端部分的多肽區(qū)段。在某些實(shí)施方案中，HAlC-端干區(qū)段由大致對應(yīng)于HAl結(jié)構(gòu)域的氨基酸Aq直到HAI 的氨基酸殘基組成。HAI Cl是HAl結(jié)構(gòu)域的C-端氨基酸，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的。殘基Aq在圖1中在甲型流感血細(xì)胞凝集素多肽中被標(biāo)識出來。本文描述了示例性的HAlC-端干區(qū)段。在某些實(shí)施方案中，HAlC-端干區(qū)段由大致對應(yīng)于來自H3血細(xì)胞凝集素的HAl的277-346位氨基酸的氨基酸殘基組成。需要注意的是，在這個(gè)編號系統(tǒng)中，I指的是成熟的HAO蛋白的N-端氨基酸，其中信號肽已經(jīng)被移除。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地識別出對應(yīng)于其它流感HA多肽的HAlC-端干區(qū)段的氨基酸殘基，例如對應(yīng)于來自Hl血細(xì)胞凝集素的HAl的HAlC-端干區(qū)段的氨基酸殘基(參見例如圖1)。
[0047]"HAlC-端短干區(qū)段”是指對應(yīng)于流感血細(xì)胞凝集素HAl多肽的干結(jié)構(gòu)域的羧基端部分的多肽區(qū)段。在某些實(shí)施方案中，HAlC-端短干區(qū)段由大致對應(yīng)于HAl結(jié)構(gòu)域的氨基酸Bq直到HAlc,的氨基酸殘基組成。殘基Bq在圖1中在甲型流感血細(xì)胞凝集素多肽中被標(biāo)識出來。本文描述了示例性的HAlC-端短干區(qū)段。在某些實(shí)施方案中，HAlC-端短干區(qū)段由大致對應(yīng)于來自H3血細(xì)胞凝集素的HAl的305-346位氨基酸的氨基酸殘基組成。需要注意的是，在這個(gè)編號系統(tǒng)中，I指的是成熟的HAO蛋白的N-端氨基酸，其中信號肽已經(jīng)被移除。
[0048]"HAlN-端長干區(qū)段”是指對應(yīng)于流感血細(xì)胞凝集素HAl多肽的干結(jié)構(gòu)域的氨基端部分的多肽區(qū)段。在某些實(shí)施方案中，HAlN-端長干區(qū)段由大致對應(yīng)于HAl結(jié)構(gòu)域的氨基酸HAI N:-:.;:.直到Cp的氨基酸殘基組成。Cp是HAlN-端長干區(qū)段中的半胱氨酸殘基，該半胱氨酸殘基連接到或能夠連接到HAlC-端長干區(qū)段中的丙氨酸殘基上。殘基Cp在圖1中在甲型流感血細(xì)胞凝集素多肽中被標(biāo)識出來。本文描述了示例性的HAlN-端長干區(qū)段。在某些實(shí)施方案中，HAlN-端長干區(qū)段由大致對應(yīng)于來自H3血細(xì)胞凝集素的HAl的1_97位氨基酸的氨基酸殘基組成。需要注意的是，在這個(gè)編號系統(tǒng)中，I指的是成熟的HAO蛋白的N-端氨基酸，其中信號肽已經(jīng)被移除。
[0049]“HA1C-端長干區(qū)段(HAlC-terminal long stem segment) ” 是指對應(yīng)于流感血細(xì)胞凝集素HAl多肽的干結(jié)構(gòu)域的羧基端部分的多肽區(qū)段。在某些實(shí)施方案中，HAlC-端長干區(qū)段由大致對應(yīng)于HAl結(jié)構(gòu)域的氨基酸Cq直到HAlc,的氨基酸殘基組成。Cq是HAlC-端長干區(qū)段中的丙氨酸殘基，該丙氨酸殘基連接到或能夠連接到HAlN-端長干區(qū)段中的胱氨酸殘基上。殘基Cq在圖1在甲型流感血細(xì)胞凝集素多肽中被標(biāo)識出來。本文描述了示例性的HAlC-端長干區(qū)段。在某些實(shí)施方案中，HAlC-端長干區(qū)段由大致對應(yīng)于來自H3血細(xì)胞凝集素的HAl的252-346位氨基酸的氨基酸殘基組成。需要注意的是，在這個(gè)編號系統(tǒng)中，I指的是成熟的HAO蛋白的N-端氨基酸，其中信號肽已經(jīng)被移除。
[0050]“HA2”是指對應(yīng)于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的流感血細(xì)胞凝集素多肽的HA2結(jié)構(gòu)域的多肽結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，HA2由干結(jié)構(gòu)域、胞腔結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成(參見例如，Scheiffle等人，2007，EMBO J.16(18):5501-5508,其全部內(nèi)容以引用方式結(jié)合于本文作為參考)。在某些實(shí)施方案中，HA2由干結(jié)構(gòu)域、胞腔結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域組成。在某些實(shí)施方案中，HA2由干結(jié)構(gòu)域和胞腔結(jié)構(gòu)域組成；在這樣的實(shí)施方案中，所述HA2可能是可溶的。在某些實(shí)施方案中，HA2由干結(jié)構(gòu)域組成；在這樣的實(shí)施方案中，所述HA2可能是可溶的。
[0051 ] 如本文所用的，術(shù)語“異源的”在多肽、核酸或病毒的上下文中分別是指這樣的多肽、核酸或病毒:在正常情況下在自然界中不存在或在正常情況下在自然界中并不與感興趣的多肽、核酸或病毒天然相關(guān)聯(lián)。例如，“異源多肽”可以指來源于不同病毒的多肽，例如，不同的流感毒株或亞型或無親緣關(guān)系的(unrelated)病毒或不同的種。在多個(gè)具體的實(shí)施方案中，當(dāng)在本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素的球狀頭結(jié)構(gòu)域的上下文中，術(shù)語異源是指與流感HA干結(jié)構(gòu)域締合的流感HA球狀頭結(jié)構(gòu)域，已發(fā)現(xiàn)在正常情況下流感HA干結(jié)構(gòu)域并不與之締合(例如，HA的頭結(jié)構(gòu)域和干結(jié)構(gòu)域在一起的情況在自然界中并不存在)。如上所述的，在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素的異源的流感HA球狀頭結(jié)構(gòu)域與所述血細(xì)胞凝集素的同源性頭(即，在正常情況下與所述嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的干結(jié)構(gòu)域締合的頭結(jié)構(gòu)域)有至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少5-10%、至少10-15%、至少10-20%、至少15-20%或至少20-25%不相同。
[0052]如本文所用的，術(shù)語“組合”在將兩種或兩種以上的療法給予對象的上下文中是指使用超過一種療法(例如，超過一種預(yù)防劑和/或治療劑)。術(shù)語“組合”的使用并不限制將療法給予對象的順序。例如，第一療法(例如，第一預(yù)防劑或治療劑)可以在將第二療法給予對象之前(例如，之前5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、I小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、I周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同時(shí)或之后(例如，之后5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、I小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、I周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)給予。
[0053]如本文所用的，術(shù)語“感染”意指細(xì)胞或?qū)ο蟊徊《厩忠u，病毒在細(xì)胞或?qū)ο笾械姆敝澈?或存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，感染是“活動(dòng)性”感染，即其中病毒正在細(xì)胞或?qū)ο笾袕?fù)制的感染。這樣一種感染以病毒已從被病毒最初感染的細(xì)胞、組織和/或器官擴(kuò)散到其它的細(xì)胞、組織和/或器官為特征。感染也可以是潛伏感染，即其中病毒不復(fù)制的感染。在某些實(shí)施方案中，感染是指在細(xì)胞或?qū)ο笾杏捎诓《镜拇嬖诨蛘哂捎诩?xì)胞或?qū)ο蟊徊《厩忠u所致的病理學(xué)狀態(tài)。
[0054]如本文所用的，術(shù)語“流感病毒疾病”是指在細(xì)胞或?qū)ο笾杏捎诹鞲胁《?例如甲型流感病毒或乙型流感病毒)的存在或者由于細(xì)胞或?qū)ο蟊涣鞲胁《厩忠u所致的病理學(xué)狀態(tài)。在多個(gè)具體的實(shí)施方案中，該術(shù)語是指由流感病毒引起的呼吸性疾患。
[0055]如本文所用的，短語“ IFN缺陷型系統(tǒng)”或“ IFN-缺陷型底物”是指這樣的細(xì)胞、細(xì)胞系和動(dòng)物(例如豬、小鼠、雞、火雞、兔、大鼠等)等系統(tǒng):其不產(chǎn)生IFN或產(chǎn)生低水平的IFN(即，在相同的條件下，當(dāng)與能產(chǎn)生IFN(IFN-competent)的系統(tǒng)相比時(shí)，IFN表達(dá)降低 5-10%、10-2020-30 30-4040-5050-6060-70 70-8080-90%或更多)，對IFN不應(yīng)答或以較低效率應(yīng)答和/或在由IFN誘導(dǎo)的一個(gè)或多個(gè)抗病毒基因的活性中是有缺陷的。
[0056]如本文所用的，數(shù)字術(shù)語“l(fā)og”是指logl。。
[0057]如本文所用的，術(shù)語“修飾的糖基化位點(diǎn)”是指在流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽中已通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸的添加、取代或缺失而修飾的天然存在的糖基化位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，所述修飾的糖基化位點(diǎn)不能夠結(jié)合聚糖。在某些實(shí)施方案中，所述修飾的糖基化位點(diǎn)破壞或干擾修飾的糖基化位點(diǎn)上的糖基化。在某些實(shí)施方案中，所述修飾的糖基化位點(diǎn)不干擾本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒HA多肽)的正確折疊。在某些實(shí)施方案中，所述修飾的糖基化位點(diǎn)包含具有氨基酸基序(motif)Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位點(diǎn)的修飾，其中Xaa是任意氨基酸。在多個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述修飾的糖基化位點(diǎn)包含在具有氨基酸基序Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，其中Xaa是任意氨基酸。
[0058]如本文所用的，短語“感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infect1n) ”或“MOI ”是每個(gè)被感染的細(xì)胞中感染性病毒顆粒的平均數(shù)。把相加的感染性病毒顆粒數(shù)((加起來的ml)xPFU/ml)除以相加的細(xì)胞數(shù)((加起來的ml) χ細(xì)胞/ml)得出Μ0Ι。
[0059]如本文所用的，術(shù)語“非嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽”是指這樣的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽:其包含來自相同的亞型或毒株的HA干結(jié)構(gòu)域和HA頭結(jié)構(gòu)域，和其中所述多肽包含一個(gè)或多個(gè)非天然存在的糖基化位點(diǎn)(如在第5.4.2節(jié)中所論述，參見下文)和/或一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)(如在第5.4.1節(jié)中所論述，參見下文)。在某些實(shí)施方案中，所述非嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽包含來自相同的流感病毒亞型的HA干結(jié)構(gòu)域和HA球狀頭結(jié)構(gòu)域。在多個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒亞型是Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16 或 H17 亞型。在某些實(shí)施方案中，所述非嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽包含來自相同的流感病毒毒株的HA干結(jié)構(gòu)域和HA球狀頭結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述流感病毒毒株是A/Netherlands/602/2009。
[0060]如本文所用的，術(shù)語“非天然存在的糖基化位點(diǎn)”是指位于特殊的球狀頭結(jié)構(gòu)域里面任何氨基酸位置上的糖基化位點(diǎn)，其中相對于特殊的HA亞型或毒株，天然存在的糖基化位點(diǎn)是不存在的。非天然存在的糖基化位點(diǎn)的一個(gè)實(shí)例是糖基化位點(diǎn)添加到一種亞型的流感病毒血細(xì)胞凝集素的球狀頭結(jié)構(gòu)域，其中所述糖基化天然存在于來自另一種亞型的流感病毒血細(xì)胞凝集素的球狀頭結(jié)構(gòu)域。非天然存在的糖基化的另一個(gè)實(shí)例是糖基化位點(diǎn)添加到來自一種毒株的流感病毒血細(xì)胞凝集素的球狀頭結(jié)構(gòu)域，其中所述糖基化位點(diǎn)天然存在于來自另一種流感病毒毒株的血細(xì)胞凝集素的球狀頭。非天然存在的糖基化位點(diǎn)的又一個(gè)實(shí)例是糖基化位點(diǎn)添加到來自一種毒株的流感病毒血細(xì)胞凝集素的球狀頭結(jié)構(gòu)域，其中所述糖基化位點(diǎn)并不天然存在于來自流感病毒的另一種亞型或毒株的血細(xì)胞凝集素的球狀頭。在多個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非天然存在的糖基化位點(diǎn)具有氨基酸基序Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys，其中Xaa是任意氨基酸，或者，在某些實(shí)施方案中，其中Xaa是Pro除外的任意氨基酸。
[0061]如本文所用的，術(shù)語“核酸”意在包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如，mRNA)和DNA的類似物或使用核苷酸類似物產(chǎn)生的RNA。所述核酸可以是單鏈或雙鏈的。
[0062]“多肽”是指氨基酸通過酰胺鍵連接而成的多聚體，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的。如本文所用的，該術(shù)語可以指通過共價(jià)酰胺鍵連接而成的單條多肽鏈。該術(shù)語也可以指通過非共價(jià)相互作用例如離子接觸、氫鍵、范德華接觸(Van der Waals contacts)和疏水接觸締合而成的多條多肽鏈。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，該術(shù)語包括已被修飾過的多肽，例如通過翻譯后加工，例如信號肽切除、二硫鍵形成、糖基化(例如N-連接的糖基化)、蛋白酶切割和脂質(zhì)修飾(例如S-棕櫚?；?。
[0063]如本文所用的，術(shù)語“預(yù)防”在將一種或多種療法給予對象以預(yù)防流感病毒疾病的上下文中是指由于給予一種療法或多種療法的組合所導(dǎo)致的預(yù)防效果/有益效果中的一種或多種。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，術(shù)語“預(yù)防”在將一種或多種療法給予對象以預(yù)防流感病毒疾病的上下文中是指由于給予一種療法或多種療法的組合所導(dǎo)致的下述效果中的一種或多種:(i)抑制流感病毒疾病或其癥狀的發(fā)展或發(fā)作；(ii)抑制流感病毒疾病或與其相關(guān)的癥狀的復(fù)發(fā)；和(iii)減少或抑制流感病毒感染和/或復(fù)制。
[0064]如本文所用的，術(shù)語“純化的”和“分離的”當(dāng)在從天然來源例如細(xì)胞中獲得的多肽(包括抗體)的上下文中使用時(shí)是指這樣的多肽:其基本上不含來自天然來源的污染物質(zhì)，例如土壤顆粒、礦物質(zhì)、來自環(huán)境的化學(xué)物質(zhì)和/或來自天然來源的細(xì)胞材料，例如但不限于細(xì)胞中存在的細(xì)胞碎片、細(xì)胞壁物質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞器、大團(tuán)核酸、碳水化合物、蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)。因此，被分離出來的多肽包括具有小于約30%、20%、10%、5%、2%或1% (以干重計(jì))的細(xì)胞材料和/或污染物質(zhì)的多肽制備物。如本文所用的，術(shù)語“純化的”和“分離的”當(dāng)在經(jīng)化學(xué)合成獲得的多肽(包括抗體)的上下文中使用時(shí)是指這樣的多肽:其基本上不含化學(xué)前體或合成多肽所涉及的其它化學(xué)物質(zhì)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，流感HA多肽(例如，流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽、流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽、嵌合的流感血細(xì)胞凝集素多肽和/或非嵌合的流感血細(xì)胞凝集素多肽)是化學(xué)合成的。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽、流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽和/或嵌合的流感血細(xì)胞凝集素多肽是分離的。
[0065]如本文所用的，術(shù)語“復(fù)制”、“病毒的復(fù)制”和“病毒復(fù)制”在病毒的上下文中是指病毒生命周期的一個(gè)或多個(gè)階段、或全部階段，其導(dǎo)致病毒的繁殖。病毒生命周期的步驟包括但不限于病毒附著到宿主細(xì)胞表面、穿透或進(jìn)入宿主細(xì)胞(例如，通過受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞或膜融合)、脫殼(其中病毒衣殼被病毒酶或宿主酶脫去并降解從而釋放病毒基因組核酸的過程)、基因組復(fù)制、合成病毒信使RNA(mRNA)、病毒蛋白合成和用于基因組復(fù)制的病毒核糖核蛋白復(fù)合體的裝配、病毒顆粒的裝配、病毒蛋白的翻譯后修飾以及從宿主細(xì)胞中通過細(xì)胞裂解或出芽而釋放，以及獲取含有包埋的病毒糖蛋白的磷脂包膜。在有些實(shí)施方案中，術(shù)語“復(fù)制”、“病毒的復(fù)制”和“病毒復(fù)制”是指病毒基因組的復(fù)制。在其它的實(shí)施方案中，術(shù)語“復(fù)制”、“病毒的復(fù)制”和“病毒復(fù)制”是指病毒蛋白的合成。
[0066]如本文所用的，術(shù)語“干結(jié)構(gòu)域多肽”和“流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽”是指血細(xì)胞凝集素多肽的衍生物，例如工程衍生物，其包含一個(gè)或多個(gè)構(gòu)成血細(xì)胞凝集素的干結(jié)構(gòu)域的多肽鏈。干結(jié)構(gòu)域多肽可以是單條多肽鏈、兩條多肽鏈或更多條多肽鏈。典型地，干結(jié)構(gòu)域多肽是單條多肽鏈(即，對應(yīng)于血細(xì)胞凝集素HAO多肽的干結(jié)構(gòu)域)或兩條多肽鏈(即，對應(yīng)于與血細(xì)胞凝集素HA2多肽締合的血細(xì)胞凝集素HAl多肽的干結(jié)構(gòu)域)。在某些實(shí)施方案中，干結(jié)構(gòu)域多肽來源于流感血細(xì)胞凝集素。在多個(gè)具體的實(shí)施方案中，干結(jié)構(gòu)域多肽來源于Hl或H3流感病毒血細(xì)胞凝集素。工程干結(jié)構(gòu)域多肽可包含如下所述的一個(gè)或多個(gè)接頭。
[0067]如本文所用的，術(shù)語“流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽”、“流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域”、“HA球狀頭結(jié)構(gòu)域”和“HA頭結(jié)構(gòu)域”是指流感血細(xì)胞凝集素多肽的球狀頭結(jié)構(gòu)域。流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽或流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域可包含已知的(例如野生型)流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域或由其組成或者可包含已知的(例如野生型)流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域的衍生物(例如工程衍生物)或由其組成。
[0068]如本文所用的，術(shù)語“對象(subject)”或“患者(patient) ”可互換使用，是指動(dòng)物(例如，鳥類、爬行動(dòng)物和哺乳動(dòng)物)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，對象是鳥類。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對象是哺乳動(dòng)物，包括非靈長類動(dòng)物(例如，駱駝、驢、斑馬、牛、豬、馬、山羊、綿羊、貓、狗、大鼠和小鼠)和靈長類動(dòng)物(例如，猴、黑猩猩和人)。在某些實(shí)施方案中，對象是非人動(dòng)物。在有些實(shí)施方案中，對象是農(nóng)場動(dòng)物或?qū)櫸?。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對象是人。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對象是人類嬰兒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對象是人類兒童。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對象是人類成人。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對象是老年人。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對象是早產(chǎn)的人類嬰兒。
[0069]如本文所用的，術(shù)語“早產(chǎn)的人類嬰兒”是指在少于37周的妊娠期出生的人類嬰兒。
[0070]如本文所用的，術(shù)語“人類嬰兒”是指剛出生的到I周歲的人。
[0071]如本文所用的，術(shù)語“人類兒童”是指I周歲到18周歲的人。
[0072]如本文所用的，術(shù)語“人類成人”是指18歲或18歲以上的人。
[0073]如本文所用的，術(shù)語“老年人”是指65歲或65歲以上的人。
[0074]術(shù)語“三級結(jié)構(gòu)”和“四級結(jié)構(gòu)”具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的含義。三級結(jié)構(gòu)是指單條多肽鏈的三維結(jié)構(gòu)。四級結(jié)構(gòu)是指具有多條多肽鏈的多肽的三維結(jié)構(gòu)。
[0075]如本文所用的，術(shù)語“季節(jié)性流感病毒毒株(seasonal influenza virusstrain) ”是指以季節(jié)為基礎(chǔ)被暴露的對象群體的流感病毒的毒株。在多個(gè)具體的實(shí)施方案中，術(shù)語季節(jié)性流感病毒毒株是指甲型流感病毒的毒株。在多個(gè)具體的實(shí)施方案中，術(shù)語季節(jié)性流感病毒毒株是指屬于Hl或H3亞型(S卩，目前在人對象群體中持續(xù)存在的兩種亞型)的流感病毒的毒株。在其它的實(shí)施方案中，術(shù)語季節(jié)性流感病毒毒株是指乙型流感病毒的毒株。
[0076]如本文所用的，術(shù)語“療法”可以指可用于預(yù)防或治療病毒性感染或與其相關(guān)的疾病或癥狀的任選方案、方法、化合物、組合物、制劑和/或藥劑(agent(s))。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語“療法”可以指可用于治療或預(yù)防本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的病毒性感染或與其相關(guān)的疾病或癥狀的生物學(xué)療法、支持性療法和/或其它療法。在有些實(shí)施方案中，術(shù)語“療法”是指(i)編碼流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)的核酸，(ii)流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)，或(iii)包含編碼流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)的核酸或包含流感HA多肽的載體或組合物。在有些實(shí)施方案中，術(shù)語“療法”是指與嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽特異性結(jié)合的抗體。
[0077]如本文所用的，術(shù)語“治療”是指將一種或多種療法給予對象以治療流感病毒疾病或感染而獲得一種療法或多種療法的組合的有益效果或治療效果的情況。在多個(gè)具體的實(shí)施方案中，這樣的術(shù)語是指由于給予一種療法或多種療法的組合所導(dǎo)致的下述效果中的一、二、三、四、五種或五種以上:(i)減輕或緩解流感病毒感染或與其相關(guān)的疾病或癥狀的嚴(yán)重程度；(ii)縮短流感病毒感染或與其相關(guān)的疾病或癥狀的持續(xù)時(shí)間；(iii)引起流感病毒感染或與其相關(guān)的疾病或癥狀的消退；(iv)降低流感病毒的滴度；(V)減少與流感病毒感染或與其相關(guān)的疾病相關(guān)的器官裳竭；(vi)減少對象住院；(vii)縮短住院的時(shí)間；(viii)增加對象的生存時(shí)間；(ix)消除流感病毒感染或與其相關(guān)的疾病或癥狀；(χ)抑制流感病毒感染或與其相關(guān)的疾病或癥狀的進(jìn)程；(Xi)防止流感病毒從一個(gè)細(xì)胞、組織、器官或?qū)ο蟮搅硪粋€(gè)細(xì)胞、組織、器官或?qū)ο蟮膫鞑ィ?Xii)抑制或減少流感病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞；(xiii)抑制或減少流感病毒基因組的復(fù)制；(xiv)抑制或減少流感病毒蛋白的合成；(xv)抑制或減少流感病毒顆粒從宿主細(xì)胞中的釋放；和/或(xvi)增強(qiáng)或提高另一種療法的治療效果。
[0078]如本文所用的，在有些實(shí)施方案中，短語“野生型”在病毒的上下文中是指疾病的大流行(prevalent)、自然地流行和產(chǎn)生典型爆發(fā)的病毒類型。在其它的實(shí)施方案中，術(shù)語“野生型”在病毒的上下文中是指親代病毒。
[0079]4.附圖簡沭
[0080]圖1表示甲型流感病毒血細(xì)胞凝集素的16種亞型的代表性序列(分別為SEQ IDN0S: 1-16)通過CLUSTALW進(jìn)行的序列比對。稱為Ap的殘基是HAlN-端干區(qū)段的半胱氨酸殘基，該半胱氨酸殘基與HAlC-端干區(qū)段中的稱為Aq的殘基一半胱氨酸殘基形成或能夠形成二硫鍵。稱為B,的殘基代表本文描述的HAlC-端短干區(qū)段的近似N-端氨基酸。稱為Cq的殘基代表本文描述的HAlC-端長干區(qū)段的近似N-端氨基酸。稱為Cp的殘基代表本文描述的HAlN-端長干區(qū)段的近似C-端氨基酸。
[0081]圖2 表示與甲型流感 HK68-H3N2(SEQ ID NO: 3)和 PR8-H1N1 (SEQ ID NO:1)血細(xì)胞凝集素比對的乙型流感病毒血細(xì)胞凝集素(SEQ ID NO:558)的代表性序列通過CLUSTALW進(jìn)行的序列比對。
[0082]圖3表示乙型流感病毒血細(xì)胞凝集素(SEQ ID NO: 17)的序列表，標(biāo)注了構(gòu)成多種本文描述的N-端和C-端干區(qū)段和中間干區(qū)段的邊界的氨基酸。
[0083]圖4提供甲型流感HA干結(jié)構(gòu)域多肽的推定結(jié)構(gòu)，基于HK68-H3N2血細(xì)胞凝集素蛋白。圖4A提供甲型流感HA干結(jié)構(gòu)域多肽的推定結(jié)構(gòu)，基于HK68-H3N2血細(xì)胞凝集素蛋白、HAlN-端干區(qū)段SEQ ID NO: 36和C-端干區(qū)段SEQ ID NO: 52。圖4B提供甲型流感HA短干結(jié)構(gòu)域多肽的推定結(jié)構(gòu)，基于HK68-H3N2血細(xì)胞凝集素蛋白、HAlN-端干區(qū)段SEQ ID NO: 36和C-端短干區(qū)段SEQ ID N0:352。圖4C提供甲型流感HA長干結(jié)構(gòu)域多肽的推定結(jié)構(gòu)，基于HK68-H3N2血細(xì)胞凝集素蛋白、HAlN-端長干區(qū)段SEQ ID NO:417和C-端長干區(qū)段SEQID NO:433。
[0084]圖5提供甲型流感HA干結(jié)構(gòu)域多肽的推定結(jié)構(gòu)，基于PR8-H1N1血細(xì)胞凝集素蛋白。圖5A提供甲型流感HA干結(jié)構(gòu)域多肽的推定結(jié)構(gòu)，基于PR8-H1N1血細(xì)胞凝集素蛋白、HAlN-端干區(qū)段SEQ ID NO: 18和C-端干區(qū)段SEQ ID N0:34。圖5B提供甲型流感HA短干結(jié)構(gòu)域多肽的推定結(jié)構(gòu)，基于HAlN-端干區(qū)段SEQ ID NO: 18和C-端短干區(qū)段SEQ IDNO: 350。圖5C提供甲型流感HA長干結(jié)構(gòu)域多肽的推定結(jié)構(gòu)，基于PR8-H1N1血細(xì)胞凝集素蛋白、HAlN-端長干區(qū)段SEQ ID NO:414和C-端長干區(qū)段SEQ ID NO:430。
[0085]圖6提供乙型流感HA干結(jié)構(gòu)域多肽的推定結(jié)構(gòu)。圖6A提供基于B/HongKong/8/73血細(xì)胞凝集素蛋白的部分無頭的HA分子，其中HA的HAl結(jié)構(gòu)域的前94個(gè)氨基酸被保留(SEQ ID NO: 550)，并且其中Cys94通過接頭橋的方式直接連接到HAl結(jié)構(gòu)域的Cysl43上(SEQ ID N0:553)。圖6B描繪基于B/Hong Kong/8/73血細(xì)胞凝集素蛋白的部分無頭的HA分子，其中HA的HAl結(jié)構(gòu)域的前178個(gè)氨基酸被保留(SEQ ID NO: 551)，并且其中Cysl78通過接頭橋的方式直接連接到HAl結(jié)構(gòu)域的Cys272上(SEQ ID NO: 554)。圖6C描繪基于B/Hong Kong/8/73血細(xì)胞凝集素蛋白的無頭的HA分子，其中HA的HAl結(jié)構(gòu)域的前94個(gè)氨基酸被保留(SEQ ID NO: 555)，并且其中Cys94通過接頭橋的方式直接連接到HAl結(jié)構(gòu)域的Cysl43上。而且，HAl結(jié)構(gòu)域的氨基酸143至178也被保留(SEQ ID NO:556)，并且Cysl78通過接頭橋的方式直接連接到HAl結(jié)構(gòu)域的Cys272上(SEQ ID NO: 557)。圖6D描繪基于B/Hong Kong/8/73血細(xì)胞凝集素蛋白的無頭的HA分子，其中HA的HAl結(jié)構(gòu)域的前54個(gè)氨基酸被保留(SEQ ID NO: 552)，并且其中Cys54通過接頭橋的方式直接連接到HAl 結(jié)構(gòu)域的 Cys272 上(SEQ ID NO:554)。
[0086]圖7提供具有保守的Hl莖結(jié)構(gòu)域和來自截然不同的亞型HAs的不同球狀頭結(jié)構(gòu)域的嵌合HAs的示意圖。
[0087]圖8提供一種新的流感疫苗和診斷工具平臺(tái)以誘導(dǎo)和分析抗體和反應(yīng)性血清。A)嵌合HAs的表達(dá)。由A/PR8/34HA的莖結(jié)構(gòu)域和A/California/4/09的球狀頭結(jié)構(gòu)域組成的嵌合HAs (嵌合的HA)以及野生型HAs (PR8-HA和CAL09-HA)和GFP對照在293T細(xì)胞中被表達(dá)。頂上的蛋白質(zhì)印跡用PR8-特異性抗體(PY102)探測，而下面的印跡用對Cal09有特異性的抗體(39C2)探測。B)在A中表達(dá)的HA構(gòu)建體的示意圖。嵌合的HA由A/PR/8/34HA莖結(jié)構(gòu)域和2009A/California/04/09球狀頭結(jié)構(gòu)域組成。
[0088]圖9提供嵌合HAs的示意圖。A)嵌合HA的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。球狀頭可以方便地在二硫鍵Cys52-Cys277發(fā)生交換。B)序貫給予由完全保守的莖結(jié)構(gòu)域和變化的球狀頭結(jié)構(gòu)域組成的嵌合HAs的致敏一加強(qiáng)方案。
[0089]圖10描述了具有HlHA的莖和H3HA的球狀頭的嵌合HA的產(chǎn)生。由A/PR8/34HA的莖結(jié)構(gòu)域和HK/68的球狀頭結(jié)構(gòu)域組成的嵌合HA (嵌合的H3)以及野生型HAs (PR8-HA和HK68HA)在293T細(xì)胞中被表達(dá)。頂上的蛋白質(zhì)印跡用PR8-特異性抗體探測，而下面的印跡用對H3有特異性的抗體探測。
[0090]圖 11 描繪 A/Hong Kong/1/1968 (H3)、A/Perth/16/2009 (H3)、A/PR/8/34 (HI)、A/Cal/4/09(Hl)、A/Viet Nam/1203/04 (H5)和 A/mallard/Alberta/24/01 (H7)的血細(xì)胞凝集素蛋白序列的序列比較。Cys52和Cys272氨基酸殘基是特化的(基于H3編號)。黑色陰影部分表示保守的氨基酸。黑色波浪線代表HAs的球狀頭區(qū)域。標(biāo)出了 HAl和HA2的起始點(diǎn)。
[0091]圖12描繪嵌合的血細(xì)胞凝集素的示意圖。(A)嵌合的PR8-CH1HA的構(gòu)建圖。嵌合的HA通過調(diào)換位于A/PR/8/34 (HI) HA的Cys52和Cys277之間的球狀頭結(jié)構(gòu)域與A/California/4/09 (HI)HA的球狀頭結(jié)構(gòu)域來構(gòu)建。所得的嵌合的HA具有A/PR8/34(H1)HA的莖區(qū)域與A/California/4/09 (Hl)HA的球狀頭結(jié)構(gòu)域，命名為PR8-cHl。(B)不同的野生型和嵌合的HAs的折疊結(jié)構(gòu)的示意圖，例如野生型PR8HA、嵌合的PR8_cHlHA、嵌合的PR8-cH5HA、野生型Perth HA和嵌合的Perth_cH7HA (從左到右)。全長HA結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)下載:PR8HA(PDB ID1RU7)和 Perth HA (由 HK68HA 表示，PDB ID1MQN)。最終的圖像用 PyMol (Delano Scientific)產(chǎn)生。
[0092]圖13描繪嵌合的HA構(gòu)建體的表面表達(dá)和功能性分析。㈧嵌合的HA構(gòu)建體的表面表達(dá)在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中進(jìn)行了評估。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)時(shí)，293T細(xì)胞用胰蛋白酶消化，嵌合的HA蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)通過流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry)進(jìn)行分析。在頂上的圖中，將模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(左邊有陰影的區(qū)域)與用PR8HA(右邊)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或用PR8-CH1 (右邊)或PR8-cH5(右邊)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行比較。在底下的圖中，將模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(左邊有陰影的區(qū)域)與用Perth和Perth-CH7構(gòu)建體(右邊)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行比較。
(B)用表達(dá)嵌合HAs的編碼螢光素酶的假-顆粒來感染MDCK細(xì)胞。在螢光素酶測定中產(chǎn)生的相對光單位(relative light unit, RLU)表示表達(dá)嵌合HAs的假-顆粒能夠進(jìn)入細(xì)胞。
[0093]圖14描述了攜帶嵌合血細(xì)胞凝集素的重組病毒的產(chǎn)生。(A)重組病毒的蛋白質(zhì)印跡分析。制備出來自模擬感染的MDCK細(xì)胞或用指定病毒以MOI為2感染的MDCK細(xì)胞的提取物(16hpi)并用以下抗體探測:抗A/PR8/HA(H1) (PY102)、抗A/Cal/09/HA (HI)(29C1)、抗 A/VN/HA(H5) (M08)、抗 H3/HA (12D1)、抗 H7 (NR-3125)、抗 A/NP (HT103)和作為內(nèi)部上樣對照的抗GAPDH。(B)用重組病毒感染的MDCK細(xì)胞的免疫熒光分析，使用以下抗體:抗 A/NP (HT103)、抗 A/H1HA (6F12)、抗 A/PR8/HA (PY102)、抗 A/Cal/09/HA (29C1)、抗 A/VN/HA(M08)、抗 H3/HA(12D1)和抗 A/H7 病毒(NR-3152)。
[0094]圖15描述了重組病毒的生長動(dòng)力學(xué)和空斑表型。(A)1日齡含胚雞蛋用野生型病毒或重組病毒以每只蛋10pfu感染，感染后監(jiān)測病毒生長達(dá)72小時(shí)。(B)重組病毒的空斑表型通過空斑測定進(jìn)行了評價(jià)。MDCK細(xì)胞用野生型病毒或重組病毒感染并在感染后48小時(shí)進(jìn)行免疫染色以揭示出使用針對A/NP(HT103)的抗體空斑表型。
[0095]圖16描繪用嵌合的H6血細(xì)胞凝集素轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的免疫熒光分析。293T細(xì)胞用I μ g的表達(dá)嵌合的H6血細(xì)胞凝集素的PCAGGS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。將來自接受DNA(A)、Cal/09感染(B)、DNA和Cal/09感染(C)或Cal/09裂解疫苗(D)的動(dòng)物的血清加入到被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中并在與Alexa Fluor594_綴合的抗小鼠IgG孵育之后通過突光顯微鏡術(shù)來顯現(xiàn)。
[0096]圖17證明DNA致敏(prime)和嵌合的病毒加強(qiáng)對用致死性流感病毒攻擊來攻擊的動(dòng)物賦予保護(hù)作用。動(dòng)物或用單獨(dú)的DNA、單獨(dú)的嵌合的H9病毒、DNA致敏和嵌合的H9病毒加強(qiáng)或用滅活PR8病毒進(jìn)行處理。然后，小鼠用5x104PFU的PR8病毒攻擊,鼻內(nèi)滴注，監(jiān)測動(dòng)物的體重達(dá)14天。
[0097]圖18證明如ELISA確定的莖特異性抗體與抗cH6蛋白的反應(yīng)性。
[0098]圖19描繪具有干結(jié)構(gòu)域和球狀頭結(jié)構(gòu)域的A/PR/8/34H1血細(xì)胞凝集素三聚體的結(jié)構(gòu)。所述血細(xì)胞凝集素三聚體被描述為無聚糖(A)，呈野生型形式，有聚糖結(jié)構(gòu)(B)和呈突變體形式，其中聚糖結(jié)構(gòu)從莖結(jié)構(gòu)域中取出再添加到球狀頭結(jié)構(gòu)域上(C)。
[0099]圖20描繪A/PR/8/34(PR8)和A/HK/1/68 (HK68)血細(xì)胞凝集素(HA)的序列。構(gòu)成干結(jié)構(gòu)域的氨基酸加框。構(gòu)成莖結(jié)構(gòu)域和球狀頭結(jié)構(gòu)域之間的邊界的半胱氨酸(“C”)是在構(gòu)成干結(jié)構(gòu)域的氨基酸的第一個(gè)盒子之后且在構(gòu)成干結(jié)構(gòu)域的氨基酸的第二個(gè)盒子之前顯示的那些。剩余的氨基酸(非盒子內(nèi)的氨基酸，不包括在構(gòu)成干結(jié)構(gòu)域的氨基酸的第一個(gè)盒子之后且在構(gòu)成干結(jié)構(gòu)域的氨基酸的第二個(gè)盒子之前存在的半胱氨酸)是構(gòu)成球狀頭結(jié)構(gòu)域的那些。天然存在的糖基化位點(diǎn)用對應(yīng)于球狀頭結(jié)構(gòu)域的氨基酸段中的加深的字體表示?？缒そY(jié)構(gòu)域和胞外結(jié)構(gòu)域由在各序列末端氨基酸突出序列段表示。標(biāo)出了為了破壞聚糖與干結(jié)構(gòu)域結(jié)合而突變的糖基化位點(diǎn)；這些包括下列序列:NNST、NVT、NSS、NGT (在 HA PR8 中)和 NST、NGT、NAT、NGS、NGT (在 HA HK68 中)。
[0100]圖21描繪畫出流感血細(xì)胞凝集素(Hl)的單體的球狀頭結(jié)構(gòu)域上免疫優(yōu)勢抗原性位點(diǎn)的示意圖(A)。將非天然存在的糖基化位點(diǎn)引入到A/Pr/8/34Hl血細(xì)胞凝集素的抗原性位點(diǎn)中的示例性突變(B)。這些非天然存在的糖基化位點(diǎn)由氨基酸基序N-Xaa-S/T表示，其中Xaa可以是任意氨基酸。
[0101]圖22描繪在人Hl亞型的HA中隨時(shí)間獲取糖基化位點(diǎn)(至多且包括2009H1N1病毒和其它2009流感病毒)。自1918年起和在2009年HlNl大流行的病毒新出現(xiàn)之前在人類中流行的季節(jié)性HlNl毒株的HAl中的抗原性位點(diǎn)的氨基酸比對⑷。為了簡便，用選擇出的原型的(prototypical)參考毒株和從流感研究數(shù)據(jù)庫(the Influenza ResearchDatabase)和流感病毒資源數(shù)據(jù)庫(the Influenza Virus Resource Database)(登錄號在方法中列出)獲得的疫苗毒株作了比對。對應(yīng)于該年度缺少分離株序列或者由于可獲得的序列很少引起的不清楚的原型(prototype)序列的年份沒有顯示。有陰影的區(qū)域描繪在頂上列出的已知抗原性位點(diǎn)。在命名為1、2和3的區(qū)域中的加框的內(nèi)容代表保守的糖基化；在命名為4、5、6和7的區(qū)域中的加框的內(nèi)容代表隨時(shí)間出現(xiàn)的糖基化。時(shí)間線描繪獲取HA蛋白的球狀頭中的糖基化的年份(B)。編號表示最下面顯示的特定年份出現(xiàn)的糖基化位點(diǎn)的氨基酸位置。箭頭指示整個(gè)時(shí)間一直存在的糖基化位點(diǎn)，而圓圈代表消失的特定糖基化位點(diǎn)。不連續(xù)的線顯示在HlNl在人類中沒有流行期間的時(shí)間周期。各糖基化的特定位置的結(jié)構(gòu)表示，因?yàn)樗鼈儚?918年到2009ρΗ1Ν1病毒新出現(xiàn)而隨時(shí)間出現(xiàn)(C)。HA表示為構(gòu)成HA三聚體分子的帶(ribbons)。位置指的是Hl命名(71、142、144、172和177分別對應(yīng)于 H3 編號 58、128、130、158 和 163)。
[0102]圖23描繪HA糖基化突變型2009ρΗ1Ν1病毒的表型表征。在MDCK細(xì)胞中拯救的A/Netherlands/602/2009HA糖基化突變型病毒的空斑大小表型(A)。從以MOI為5感染12小時(shí)的MDCK細(xì)胞中獲得的全細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)印跡分析(B)。裂解液在非還原條件下電泳，并用針對缺少Hl的PR8病毒產(chǎn)生的兔多克隆抗體3851來檢測印跡，其已通過酸和DTT處理去除。以MOI為0.001感染的分化人氣管支氣管上皮細(xì)胞中被拯救病毒的生長動(dòng)力學(xué)
(C)。在MDCK細(xì)胞中，通過標(biāo)準(zhǔn)空斑測定顯示的對各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行了病毒滴定。
[0103]圖24顯示在HA中具有額外糖基化的2009ρΗ1Ν1病毒在小鼠和雪貂中是減毒的。(A - E)9周齡C57B/6雌性小鼠用Neth/09糖基化突變病毒感染。每種重組病毒η = 5小鼠的組用指定病毒劑量經(jīng)鼻內(nèi)(1.n.)感染。體重代表各組的平均值，誤差棒表示各時(shí)間點(diǎn)上的標(biāo)準(zhǔn)偏差(s.d.)。(F)來自用各突變型病毒IXlO3Pfu感染的小鼠的肺的滴度在感染后(p.1.)第2天(圓圈)、第3天(方塊)和第7天(三角)獲得，如所顯示的。黑色棒表示與rNeth/09WT病毒相比，在各時(shí)間點(diǎn)每個(gè)組2只(箭頭)或3只小鼠的平均病毒滴度。(G)在用指定病毒感染的雪貂(每組η = 3)中的體重變化。重量表示為平均值，而誤差棒代表各時(shí)間點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差(s.d.)。(H)每隔一天從(G)中顯示的雪貂中獲得的鼻洗滌液中的病毒滴度。(I)來自在用指定病毒感染后第3天(3p.1.)的雪貂(η = 3)的組織中的病毒負(fù)荷。數(shù)值如在(F)中表示。雪貂的體重的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異用威氏配對檢驗(yàn)(ffilcoxon-matched pairs test)來估算(G)。
[0104]圖25描繪在Tx/91的HA中含有糖基化缺失的病毒表現(xiàn)出在小鼠中的毒力增加并且對2009ρΗ1Ν1毒株有交叉保護(hù)作用。攜帶野生型或糖基化缺失突變型A/Texas/36/1991HAs的重組甲型流感病毒和來自PR8 (病毒是rPR87: 1Τχ/91ΗΑ)的剩余7個(gè)基因的表型表征。(A)從用相應(yīng)糖基化缺失突變型病毒以MOI為5感染12小時(shí)的MDCK細(xì)胞獲得的裂解液的蛋白質(zhì)印跡分析。裂解液在非還原條件下電泳，并用多克隆3951抗體來檢測印跡。(B)用顯示的各病毒IXlO4Pfu感染的8周齡C57B/6雌性小鼠。小鼠每組η = 5的平均體重。而誤差棒代表各時(shí)間點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差(s.d.)。(C)允許在(B)中感染的小鼠發(fā)生血清轉(zhuǎn)化27天，在此時(shí)它們用100LD50的Neth/09攻擊。體重代表具有其相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)偏差(s.d.)的各組的平均值。(D)百分存活率對于小鼠在(C)中顯示。運(yùn)用斯圖登氏t-檢驗(yàn)(student’ s t_test)來確定體重減輕方面的顯著性,并運(yùn)用對數(shù)秩檢驗(yàn)(log-rank test)來評價(jià)存活率結(jié)果的顯著性(*P〈0.05)。
[0105]圖26描繪嵌合的HA(cHA)蛋白(A)和在MDCK細(xì)胞中的cHA表達(dá)⑶的示意圖表示。嵌合的HA(cHA)蛋白和重組嵌合的病毒。(A)cHAs的示意圖表示。球狀頭結(jié)構(gòu)域被定義為介于殘基C52和C277 (H3編號)之間的間插氨基酸序列。使用這個(gè)二硫鍵作為頭和莖之間的劃界，在異源莖的頂上引入外部(exotic)HA頭。莖結(jié)構(gòu)域被定義為HAl和HA2亞單位的剩余部分。CT，細(xì)胞質(zhì)尾；SP，信號肽；TM，跨膜結(jié)構(gòu)域。全長HA結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)下載:PR8 (HI) HA (PDB ID1RU7)和 A/guinea fowl/Hong Kong/WF10/99HA[由 A/swine/Hong Kong/9/98 (H9 ；PDB ID1JSD)表不]。最后的圖像用 PyMol (Delano Scientific)產(chǎn)生。因?yàn)镠6HA的結(jié)構(gòu)沒有被公開，所以，對于cH6/l構(gòu)建體使用PR8HA的頭折疊的圖像。(B)用免疫熒光證實(shí)cHA的表達(dá)。MDCK細(xì)胞用WT PR8或CH9/1N3病毒感染，或者對它們進(jìn)行模擬感染。用對PR8病毒的頭和莖有特異性的抗體以及具有H9反應(yīng)性的抗體來證實(shí)cHA表達(dá)。(放大倍數(shù)比例尺:40X)。
[0106]圖27顯示用大流行的HlNl病毒感染的成人患者具有對HA莖具有反應(yīng)性的中和抗體的高滴度。PHlNl感染的成人(η = 9)、未用ρΗΙΝΙ感染的兒童(η = 5)和未用ρΗΙΝΙ病毒感染的成人(η = 11)的血清與cH6/l蛋白的反應(yīng)性，㈧，cH9/l蛋白；(B)，用ΗΑ2蛋白的LAH (抗LAH抗體用作陽性對照);(C)，Η5ΗΑ蛋白(針對Η5ΗΑ產(chǎn)生的小鼠多克隆血清用作陽性對照和pan-H3抗體12D1用作陰性對照)；⑶(13)或H3HA蛋白(12D1用作陽性對照和用針對H5HA產(chǎn)生的小鼠多克隆血清用作陰性對照)；(E)。所有結(jié)果通過ELISA來評價(jià)；數(shù)據(jù)點(diǎn)代表具有SE的平均滴度或合并樣品的反應(yīng)性。
[0107]圖28顯示用大流行的HlNl病毒感染的成人患者具有對HA莖有特異性的中和抗體的高滴度(A和B)。來自ρΗΙΝΙ感染的成人(η = 14)的血清和未用ρΗΙΝΙ感染的成人(η = 5)的血清獨(dú)立地合并，將來自兩個(gè)合并物的總IgG純化。使用CH9/1N3病毒用空斑減少測定評價(jià)莖抗體的中和能力。數(shù)據(jù)點(diǎn)代表兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值和SE?？瞻哂每功?抗體G1-26進(jìn)行免疫染色。(B)顯示連同頂上一起顯示的血清的四個(gè)稀釋度的空斑減少。(C)假型顆粒中和測定測量人純化的IgG制劑的中和抗體活性(來自ρΗΙΝΙ感染的成人的血清和未用ρΗΙΝΙ感染的成人的血清)?？偟腎gG濃度為50、10和2 μ g/mL。作為陽性對照，使用莖-特異性單克隆抗體6F12。
[0108]圖29顯示CH6/1和cH9/l蛋白的表達(dá)和功能。A) 2 μ g cH6/l和cH9/l蛋白的考馬斯藍(lán)凝膠(Coomasie gel)。Μ,分子量標(biāo)記蛋白。(B)表達(dá)cHA蛋白的桿狀病毒的蛋白質(zhì)印跡分析。第I泳道，cH6/l蛋白；第2泳道，cH9/l蛋白；第3泳道，WT PR8HA ;第4泳道，WT H3HA。用已知與PR8病毒(兔多克隆抗HA2)或H3病毒(小鼠mAbl2Dl)的莖和H6 (山羊多克隆抗H6)或H9病毒(小鼠mAb G1-26)的球狀頭有反應(yīng)的抗體對印跡進(jìn)行探測來證實(shí)表達(dá)cHAs的桿狀病毒的身份。mAbl2Dl與HAO和HA2 二者起反應(yīng)(H3蛋白制劑是經(jīng)切割的，導(dǎo)致有兩條截然不同的條帶)。(C) CH9/1N3重配病毒(reassortant virus)的空斑測定。重配的CH9/1N3病毒空斑表型與由WT PR8病毒產(chǎn)生的空斑類似。空斑用PY102和抗H9抗體G1-26進(jìn)行免疫染色。
[0109]圖30顯示針對流感病毒HA的莖的單克隆抗體結(jié)合并中和cHAs。(A)用莖抗體C179來通過ELISA測試對cH6/l桿狀病毒表達(dá)的蛋白的反應(yīng)性。C179以劑量依賴性方式與cH9/l反應(yīng)。(B)用莖抗體C179來通過ELISA測試對cH9/l桿狀病毒表達(dá)的蛋白的反應(yīng)性。C179以劑量依賴性方式與cH9/l反應(yīng)(C和D)?？贵w6F12中和CH9/1N3病毒復(fù)制。用6F12來通過空斑減少測定評價(jià)莖-特異性單克隆抗體中和CH9/1N3病毒的能力。D顯示使用mAb6F12的五個(gè)稀釋度(100、20、4、0.8和0.16 μ g/mL)，cH9/lN3病毒的空斑減少。空斑用抗H9抗體G1-26進(jìn)行免疫染色。
[0110]圖31描繪嵌合的血細(xì)胞凝集素的示意圖。圖31A顯示野生型和cHl/Ι病毒的示意圖。嵌合的HA通過調(diào)換位于PR8 (Hl)HA的Cys52和Cys277之間的球狀頭結(jié)構(gòu)域及A/California/4/09 (HI) HA的球狀頭結(jié)構(gòu)域來構(gòu)建。所得到的嵌合的HA具有A/PR8/34(H1)HA的莖區(qū)域與A/California/4/09 (Hl)HA的球狀頭結(jié)構(gòu)域并被命名為cHl/1。圖31B顯示不同的野生型和嵌合的HAs的折疊結(jié)構(gòu)的理論示意圖。從左到右:野生型PR8HA，嵌合的cHl/lHA，嵌合的 CH5/1HA，野生型 Perth HA，嵌合的 cH7/3HA，和嵌合的 cH5/3HA。
[0111]圖32描繪比較在這項(xiàng)研究中使用的在H1、H3、H5和H7HAS之間的氨基酸同一性。運(yùn)用ClustalW計(jì)算氨基酸同一性百分比(不包括信號肽)。對于全長HA以及球狀頭結(jié)構(gòu)域和莖結(jié)構(gòu)域，將氨基酸同一性百分比進(jìn)行比較。灰色棒表示100%同一性。
[0112]圖33顯示嵌合的HA構(gòu)建體的表面表達(dá)。嵌合的HA構(gòu)建體的表面表達(dá)在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或被感染的細(xì)胞中進(jìn)行了評估。在轉(zhuǎn)染后48時(shí)，293T細(xì)胞用胰蛋白酶消化，通過流式細(xì)胞術(shù)分析嵌合的HA蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)。在頂上的圖中，將模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(灰色)與用PR8HA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(黑色線)或用cHl/Ι (黑色線)或cH5/l (黑色線)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行比較。在位于中心的圖中，將模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(灰色)與用Perth/09、cH7/3(黑色線)和cH5/3構(gòu)建體(黑色線)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行比較。在底下的圖中，MDCK細(xì)胞用表達(dá)Perth/09、cH7/3和cH5/3的重組病毒感染。在感染后12小時(shí)，使用流式細(xì)胞術(shù)分析不同HAs的細(xì)胞表面表達(dá)。
[0113]圖34證明嵌合的HAs進(jìn)入MDCK細(xì)胞的能力。用編碼螢光素酶的表達(dá)嵌合的HAs的假顆粒來轉(zhuǎn)導(dǎo)MDCK細(xì)胞。在螢光素酶測定中產(chǎn)生的相對光單位(RLU)表示表達(dá)嵌合的HAs的假顆粒能夠進(jìn)入細(xì)胞。
[0114]圖35顯示用表達(dá)重組cHA的病毒感染的細(xì)胞的蛋白質(zhì)印跡分析。制備來自模擬感染或用指定病毒以MOI為2感染的MDCK細(xì)胞的提取物并在感染后16小時(shí)(16hpi)時(shí)用抗體探測:抗 A/PR8/HA(H1) (PY102)、抗 A/Cal/09/HA (HI) (29E3)、抗 A/VN/HA (H5) (mAb#8)、抗 H3/HA (12D1)、抗 H7 (NR-3152)、抗 A/NP (HT103)和作為上樣對照的抗 GAPDH。
[0115]圖36描繪使用以下抗體的用重組病毒感染的MDCK細(xì)胞的免疫熒光分析:抗A/NP(HT103)、抗 A/H1HA(6F12)、抗 A/PR8/HA(PY102)、抗 A/Cal/09/HA(29E3)、抗 A/VN/HA(mAb#8)、抗H3/HA(12Dl)和抗 A/H7 病毒(NR-3152)。
[0116]圖37描繪野生型和重組病毒的生長動(dòng)力學(xué)和空斑表型。(A)1日齡含胚雞蛋用每只蛋10pfu的野生型或重組病毒感染，感染后監(jiān)測病毒生長達(dá)72小時(shí)。數(shù)據(jù)點(diǎn)代表實(shí)驗(yàn)重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。(B)重組病毒的空斑表型通過空斑測定來評價(jià)。MDCK細(xì)胞用野生型或重組病毒感染。在感染后48小時(shí)將細(xì)胞固定并進(jìn)行免疫染色以揭示出使用針對A/NP(HT103)的抗體的空斑表型。
[0117]圖38描繪莖-特異性單克隆抗體中和表達(dá)cHA的病毒和假型顆粒。mAb (KB2)中和表達(dá)cHA的病毒或假型顆粒的能力通過空斑減少測定或假型顆粒抑制測定來評價(jià)。MDCK細(xì)胞用表達(dá)cHA的病毒或假型顆粒在指定量(ug/mL)的mAb存在下或無抗體的情況下進(jìn)行感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)。用空斑形成或螢光素酶活性作為讀出數(shù)(readout)以確定被mAb抑制的程度。mAb以劑量依賴性方式中和cHl/Ι (黑色框)和cH5/l (黑色三角形)病毒復(fù)制，在濃度高過100ug/mL時(shí)有100%抑制。數(shù)據(jù)點(diǎn)代表實(shí)驗(yàn)重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。(B)mAb也以劑量依賴性方式抑制cHl/Ι (黑色框)和CH5/1 (黑色三角形)假型顆粒的進(jìn)入，高過4ug/mL時(shí)有完全抑制。數(shù)據(jù)點(diǎn)代表實(shí)驗(yàn)重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。假型抑制測定獨(dú)立地進(jìn)行。
[0118]圖39證明NJ/76疫苗接受者在Cal/09接種之前升高抗HA莖抗體。對來自NJ/76疫苗接種者(η = 20)和年齡匹配的對照對象(η = 15)的血清的系列稀釋液通過ELISA測試其對A) CH6/1HA或B)NC/99HA的反應(yīng)性，并計(jì)算出IgG終點(diǎn)效價(jià)。由于可獲得血清的數(shù)量有限，對于合并的NJ/76疫苗接種者(N = 5)和對照對象(η = 7)，測定了針對C)cH6/l和D)NC/99的Cal/09接種前的IgG終點(diǎn)效價(jià)。各合并物由來自各組的所有個(gè)體組成，這些個(gè)體的Cal/09接種前后樣品均可獲得。進(jìn)行了不成對斯圖登T檢驗(yàn)(Unpaired Student1^^〖8)，雙尾？-值〈0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。N.D.=未檢測。N.S=沒有顯著性。*統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
[0119]圖40證明NJ/76疫苗接受者在Cal/09接種之前升高針對Cal/09的HAI效價(jià)。A)對于來自針對Cal/09和France/76的NJ/76疫苗接種者(η = 5)和對照對象(η = 7)的Cal/09接種前合并的血清樣品，使用cRBCs測定了 HAI效價(jià)。B)也用對應(yīng)于在各合并物中的個(gè)體對象的血清樣品進(jìn)行了針對Cal/09的HAI測定，以便確保合并的結(jié)果對作為一個(gè)整體的組有代表性。進(jìn)行了不成對斯圖登T檢驗(yàn)，雙尾P-值〈0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。N.D.=未檢測。*統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
[0120]圖41證明NJ/76和Cal/09疫苗加強(qiáng)廣泛-中和抗體。使用經(jīng)過TPCK-胰蛋白酶處理的、在Cal/09接種前后從NJ/76疫苗接種者(η = 5)和對照對象(η = 7)采集的合并血清樣品，在針對A)cH5/lN3和B) Cal/09病毒的MDCK上進(jìn)行了微中和測定。感染后，細(xì)胞用抗NP抗體和HRP-綴合的第二抗體染色。中和效價(jià)被定義為導(dǎo)致特殊信號有至少50%減少的最低的血清稀釋度。
[0121]圖42證明用cHA構(gòu)建體序貫接種激發(fā)HA莖-特異性抗體并提供保護(hù)免于致死性攻擊。小鼠用20yg的cH9/l蛋白加上佐劑鼻內(nèi)和腹膜內(nèi)給予來致敏。三周后，小鼠用20yg cH6/l蛋白加上佐劑鼻內(nèi)和腹膜內(nèi)給予來加強(qiáng)。作為對照，使用BSA或給定的滅活FMl病毒(肌內(nèi))使小鼠以類似的方式致敏和加強(qiáng)。在最后一次用5LD50的A/FortMonmouth/1/1947 (FMl)病毒接種后三周，將動(dòng)物放血和攻擊。(A)ELISA板用CH5/1N1病毒包被以評價(jià)通過接種疫苗激發(fā)的莖反應(yīng)性的程度。(B)每天給小鼠稱重達(dá)14天以評價(jià)免于攻擊的保護(hù)作用。(C)描繪攻擊后存活率的Kaplan Meier曲線。接種過cH9/l+cH6/l疫苗的小鼠在統(tǒng)計(jì)學(xué)上其存活率高于BSA對照(P =.0003)。
[0122]圖43證明用CH6/1接種激發(fā)介導(dǎo)保護(hù)免于CH9/1N1病毒攻擊的莖-特異性免疫力。給動(dòng)物接種YAM-HA病毒以便模擬用流感病毒的先前感染或接種疫苗抵抗流感病毒。三周后，給動(dòng)物經(jīng)鼻內(nèi)和腹膜內(nèi)接種含有佐劑的CH6/1或BSA。給對照動(dòng)物接種野生型B/Yamagata/16/1988和以類似的方式接種BSA或給定的滅活CH9/1N1病毒(肌內(nèi))。接種后三周，給動(dòng)物放血后用250LD5(icH9/1N1病毒攻擊。(A)給動(dòng)物稱重達(dá)8天以評價(jià)免于攻擊的保護(hù)作用。在第3-5天，YAM-HA+CH6/1動(dòng)物證明了與YAM-HA+BSA群組(cohort)相比，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有較少的體重減輕(p〈.05)。(B)描繪存活率的Kaplan Meier曲線。統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異的存活率在YAM-HA+CH6/1組與YAM-HA+BSA群組(p =.038)以及原初的動(dòng)物和WTYAM+BSA動(dòng)物(p〈.0001)相比時(shí)見到了。YAM-HA+BSA群組的存活率與WT-YAM+BSA群組的存活率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P = 0.058)。(C) ELISA板用CH5/1N1病毒包被以評價(jià)通過接種疫苗激發(fā)的莖反應(yīng)性的程度。(D)描繪了使用CH5/1病毒進(jìn)行空斑減少測定的結(jié)果。(E)給動(dòng)物接種疫苗、放血和收獲總的IgG進(jìn)行基于H5的假顆粒進(jìn)入抑制測定。評價(jià)抑制百分比作為與對照相比螢光素酶表達(dá)的減少。
[0123]圖44證明用cH6/l接種保護(hù)小鼠免于致死性H5流感病毒攻擊。給動(dòng)物接種YAM-HA病毒以便模擬用流感病毒的先前感染或接種疫苗抵抗流感病毒。三周后，給動(dòng)物經(jīng)鼻內(nèi)和腹膜內(nèi)接種含有佐劑的cH6/l或BSA。給對照動(dòng)物接種野生型B/Yamagata/16/1988和以類似的方式接種BSA或給定滅活CH5/1N1病毒(肌內(nèi))。給動(dòng)物放血后用1LD5tl的在PR8背景中的2:6H5重配子攻擊(參見例如，Steel等人，2009，J Virol83:1742-1753)。(A)描繪存活率的Kaplan Meier曲線。當(dāng)比較YAM_HA+cH6/l組與YAM-HA+BSA群組時(shí)，存活率中的差異接近有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P =.06)。(B)存活時(shí)間的長度在接種YAM-HA和接種cH6/l的動(dòng)物中平均長于接種BSA(P = 0.037)的動(dòng)物以及原初的動(dòng)物和WT YAM/BS對照(p〈0.001)。(C)ELISA板用CH5/1N1病毒包被以便評價(jià)通過接種疫苗激發(fā)的莖反應(yīng)性的程度。將1:50血清稀釋度對％最大體重減輕作圖。有一個(gè)值被確定為異常值并從分析中略去。對于線性回歸，R2 = 0.56和P =.02。
[0124]圖45證明接種cHA激發(fā)介導(dǎo)免于HlNl病毒攻擊的保護(hù)作用的莖-特異性免疫力。(A-F)動(dòng)物用編碼cH9/l的DNA致敏，然后接種cH6/l，再用cH5/l可溶性蛋白(η =10)或BSA(η = 5)加強(qiáng)，同時(shí)陽性對照小鼠接受滅活病毒(肌內(nèi))(η = 5)。㈧給動(dòng)物接種FMl病毒并用其攻擊；每天給小鼠稱重，隨時(shí)間的體重減輕表示為初始體重的百分比的變化。(B)描述在(A)中被攻擊小鼠存活率的曲線。(C)給動(dòng)物接種ρΗΙΝΙ病毒并用其攻擊；每天給小鼠稱重，隨時(shí)間的體重減輕表示為初始體重的百分比的變化。(D)描述在(C)中被攻擊小鼠存活率的曲線。(E)給動(dòng)物接種PR8病毒并用其攻擊；每天給小鼠稱重，隨時(shí)間的體重減輕表示為初始體重的百分比的變化。(F)描述在(E)中被攻擊小鼠存活率的曲線。(G)對來自如以上在A-F中和以下在H-1中所述接種的和用5LD5(i的A/FM/1/1947(A、B)、1LD50 的 A/Netherland/602/2009 (C, D)或 5LD50 的 A/PR/8/1934 (E、F、H、I)攻擊的動(dòng)物的血清的HlHA的反應(yīng)性。(H)給動(dòng)物如以上在A-F(方塊，η = 4)中所述接種或是原初的(三角形，η = 3),同時(shí)陽性對照小鼠接受滅活PR8病毒(肌內(nèi))(X標(biāo)記，η = 5)。⑶8Τ細(xì)胞在用PR8病毒攻擊之前被耗竭。每天給小鼠稱重，隨時(shí)間的體重減輕表示為初始體重的百分比的變化。(I)描述在(H)中被攻擊小鼠存活率的曲線。(J)給動(dòng)物如對A-F所述接種。總的IgG純化出來用于基于Η2的假顆粒進(jìn)入抑制測定。評價(jià)抑制百分比作為與對照相比螢光素酶表達(dá)的減少。用Fab片段CR6261作為陽性對照。
[0125]圖46證明血細(xì)胞凝集素莖抗體在重復(fù)感染后產(chǎn)生。動(dòng)物用14PFU的A/California/04/09 (Cal09)、A/New Caledonia/20/99 (NC99)或 A/SolomonIslands/3/06 (S106)病毒感染。感染后四周從小鼠收獲血清，并使用cH6/l蛋白，通過ELISA測定血細(xì)胞凝集素莖-特異性抗體。
[0126]圖47證明血細(xì)胞凝集素莖抗體在對流感病毒第二次暴露之后被加強(qiáng)。動(dòng)物用14PFU的NC99感染，然后四周后用15或16PFU的S106病毒或13或14PFU的Cal09病毒加強(qiáng)。第二次感染后四周從小鼠收獲血清，并使用CH6/1蛋白，通過ELISA測定血細(xì)胞凝集素莖-特異性抗體。包括了圖46中顯示的對于僅接受NC99病毒一次接種的動(dòng)物的數(shù)值用作比較。
[0127]圖48證明來自序貫感染的小鼠的血清保護(hù)原初動(dòng)物免于致死性H5病毒攻擊。動(dòng)物用14PFU的NC99感染，然后四周后用16PFU的S106或14PFU的Cal09病毒加強(qiáng)。從這些動(dòng)物收集的血清經(jīng)腹膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到用致死劑量的重組H5病毒攻擊過的原初動(dòng)物中。來自僅經(jīng)歷一次NC99感染的動(dòng)物的血清的動(dòng)物對攻擊沒有保護(hù)作用并且死亡，其動(dòng)力學(xué)類似于對照。來自暴露于NC99和S106病毒的動(dòng)物的血清對60 %的被攻擊動(dòng)物有保護(hù)作用，而來自用NC99和Cal09病毒感染的動(dòng)物的血清對80 %的被攻擊小鼠有保護(hù)作用免于死亡。NC99-S106組和NC99-Cal09組之間的存活率是類似的(P = 0.575)，而與僅NC99的組相比的存活率中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(NC99-S106對NC99p = 0.018，NC99_Cal09對NC99p =0.0023)。
[0128]圖49證明流感病毒糖基化突變體被表達(dá)和被適當(dāng)糖基化。293T細(xì)胞用野生型A/PR/8/34HA病毒(PR8)或具有在PR8頭結(jié)構(gòu)域中引入的糖基化位點(diǎn)的和/或通過突變從PR8莖結(jié)構(gòu)域去除的糖基化位點(diǎn)的PR8構(gòu)建體轉(zhuǎn)染。用NR-4539抗甲型流感病毒HA2抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析并用抗小鼠辣根過氧化物酶綴合的第二抗體來顯現(xiàn)。具有引入的糖基化位點(diǎn)的突變型病毒蛋白相對于野生型PR8以較高分子量遷移；具有消除的糖基化位點(diǎn)的突變型病毒蛋白相對于野生型PR8以較低分子量遷移。所有突變型病毒蛋白均以預(yù)期分子量遷移，表明聚糖已在有關(guān)糖基化位點(diǎn)上在體外被成功添加或消除。對于突變體42-1、42-4和42-5指出了弓丨入的糖基化位點(diǎn)的位點(diǎn)。
[0129]圖50證明在PR8中糖基化位點(diǎn)的添加和糖基化位點(diǎn)的消除對病毒蛋白的表達(dá)或它們折疊成正確構(gòu)象的能力無影響。293T細(xì)胞用野生型PR8或PR8或cH5/l血細(xì)胞凝集素的糖基化突變體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，將細(xì)胞固定，用適當(dāng)?shù)目诡^結(jié)構(gòu)域(PY102)或抗莖結(jié)構(gòu)域(KB2、C179和6F12)抗體染色，并與熒光驢抗小鼠抗體一起孵育。熒光反應(yīng)性用倒置熒光顯微鏡來顯現(xiàn)。(A)在PR8的頭結(jié)構(gòu)域中引入糖基化位點(diǎn)不影響病毒蛋白表達(dá)或莖抗體(6F12)結(jié)合。(B)其中糖基化位點(diǎn)已被引入到頭結(jié)構(gòu)域中的病毒蛋白的免疫熒光染色降低了抗頭抗體結(jié)合，表明頭結(jié)構(gòu)域的過度糖基化遮蔽了抗體結(jié)合位點(diǎn)。在結(jié)合莖結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象表位的抗莖結(jié)構(gòu)域抗體的結(jié)合中沒有變化，表明病毒突變體被正確折疊。(C)使用抗頭和抗莖特異性抗體，具有引入到頭結(jié)構(gòu)域中的糖基化位點(diǎn)和從莖結(jié)構(gòu)域中消除糖基化位點(diǎn)的PR8病毒突變體的免疫熒光證明了所述蛋白被表達(dá)且被正確折疊。觀察到與野生型PR8相比，抗莖抗體與突變構(gòu)建體的莖結(jié)構(gòu)域結(jié)合的能力沒有差異，在所述突變構(gòu)建體中糖基化位點(diǎn)被引入到頭結(jié)構(gòu)域(42-1、42-4和42-5)中和從莖結(jié)構(gòu)域(Λ 33/289)中去除。
[0130]圖51證明可結(jié)合唾液酸化(sialylated)受體的病毒糖基化突變體和有活力的突變型病毒拯救。將被轉(zhuǎn)染細(xì)胞與神經(jīng)氨酸酶(唾液酸酶)一起于37°C孵育I小時(shí)，然后與2%雞紅細(xì)胞懸液一起孵育。將貼壁的紅細(xì)胞裂解，在540nm下測量裂解液的吸光度。為了拯救甲型流感突變型病毒，293T細(xì)胞用8種pDZ PR8拯救質(zhì)粒各I μ g共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，將含病毒的上清液接種到8日齡含胚雞蛋中。在37°C孵育2天之后收獲尿囊液，通過雞紅細(xì)胞的血細(xì)胞凝集和通過在MDCK細(xì)胞中的空斑形成測定病毒的存在。結(jié)合雞紅細(xì)胞的甲型流感莖病毒突變體Λ 289、Λ 483和Λ 33/289能夠被拯救。
[0131]圖52.野生型HA和表達(dá)構(gòu)建體的示意圖。(A)未裂解的全長流感病毒血細(xì)胞凝集素。信號肽是最左邊的組分，HA胞外結(jié)構(gòu)域是中間的組分，跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域是最右邊的組分。(B)具有三聚化結(jié)構(gòu)域的表達(dá)構(gòu)建體?？缒そY(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域用凝血酶切割位點(diǎn)(自左邊起的第三種組分)、Τ4三聚化結(jié)構(gòu)域(自左邊起的第四種組分)和六組氨酸標(biāo)簽^xhis標(biāo)簽，自左邊起的第五種組分)在位置V503(H3編號)調(diào)換。(C)無三聚化結(jié)構(gòu)域的表達(dá)構(gòu)建體?？缒そY(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域用六組氨酸標(biāo)簽(6xhis標(biāo)簽，最右邊的組分)分別在氨基酸位置509 (H1、H2和H5)或508 (H3) (H3編號)調(diào)換。
[0132]圖53.三聚化結(jié)構(gòu)域的引入影響重組HAs中寡聚體的穩(wěn)定性和形成。(A)通過還原性、變性SDS-PAGE分析有無三聚化結(jié)構(gòu)域的重組HAs。被表達(dá)的有三聚化結(jié)構(gòu)域的重組HAs (+)顯示比被表達(dá)的無三聚化結(jié)構(gòu)域的HAs (-)的穩(wěn)定性高。未裂解的HA(HAO)和裂解產(chǎn)物(HAl/降解產(chǎn)物；HA2)用箭頭指出。(B)交聯(lián)HAs的還原性、變性SDS-PAGE分析。HA的不同種(species)在印跡中標(biāo)出。高分子多聚體用H表示,三聚體用T表示,二聚體用D表示，單體用M表示。(C)左圖(框1-4):來自用抗六組氨酸-標(biāo)簽抗體探測的B的被還原、被變性和被交聯(lián)的組IHAs的蛋白質(zhì)印跡分析。右圖(最右邊的框):在SDS-PAGE上分析的對照(IgG)用BS3交聯(lián)。不同的種(完全抗體、重鏈、輕鏈)用箭頭指出。標(biāo)記分子條帶的分子量在各圖的左邊標(biāo)出。
[0133]圖54.莖-反應(yīng)性抗體與重組PR8 (Hl)和Cal09 (Hl)HAs的結(jié)合。(A)莖-反應(yīng)性抗體C179、CR6261和6F12和頭-反應(yīng)性抗體PY102和PR8抗血清與無(無T4三聚化結(jié)構(gòu)域,黑色線)或有(有T4三聚化結(jié)構(gòu)域，紅色線)三聚化結(jié)構(gòu)域的重組可溶性PR8HA的結(jié)合。(B)莖-反應(yīng)性抗體C179、CR6261和6F12和頭-反應(yīng)性抗體7B2和Cal09抗血清與無(無T4三聚化結(jié)構(gòu)域，黑色線)或有(有T4三聚化結(jié)構(gòu)域，紅色線)三聚化結(jié)構(gòu)域的重組可溶性Cal09HA的結(jié)合。
[0134]圖55.莖-反應(yīng)性抗體與重組JAP57(H2)和VN04(H5)HAs的結(jié)合。(A)莖-反應(yīng)性抗體C179和CR6261和頭-反應(yīng)性抗體8F8和H2抗血清與無(無T4三聚化結(jié)構(gòu)域，黑色線)或有(有T4三聚化結(jié)構(gòu)域，紅色線)三聚化結(jié)構(gòu)域的重組可溶性JAP57HA的結(jié)合。(B)莖-反應(yīng)性抗體C179和CR6261和頭-反應(yīng)性抗體mAb#8和H5抗血清與無(無T4三聚化結(jié)構(gòu)域，黑色線)或有(有T4三聚化結(jié)構(gòu)域，紅色線)三聚化結(jié)構(gòu)域的重組可溶性VN04HA的結(jié)合。
[0135]圖56.莖-反應(yīng)性抗體與組2HAs的結(jié)合。(A)莖-反應(yīng)性抗體12D1和CR8020和頭-反應(yīng)性抗體XY102和H3抗血清與無(無T4三聚化結(jié)構(gòu)域、黑色線)或有(有T4三聚化結(jié)構(gòu)域，紅色線)三聚化結(jié)構(gòu)域的重組可溶性HK68HA的結(jié)合。(B)莖-反應(yīng)性抗體12D1和CR8020和H3抗血清與無(無T4三聚化結(jié)構(gòu)域，黑色線)或有(有T4三聚化結(jié)構(gòu)域，紅色線)三聚化結(jié)構(gòu)域的重組可溶性Wisc05HA的結(jié)合。
[0136]5.詳述
[0137]本發(fā)明涉及流感血細(xì)胞凝集素(HA)病毒免疫原(即，流感HA多肽)，其誘導(dǎo)針對流感病毒的保守HA干結(jié)構(gòu)域(本文中有時(shí)稱之為“莖(stalk)”結(jié)構(gòu)域)的交叉保護(hù)性免疫應(yīng)答。
[0138]在一個(gè)方面，本文提供的是嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽。這樣的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽包含HA干結(jié)構(gòu)域，HA干結(jié)構(gòu)域展示出對所述干結(jié)構(gòu)域異源的球狀HA頭結(jié)構(gòu)域。設(shè)計(jì)用于疫苗接種的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽共享HA相同干結(jié)構(gòu)域但在其球狀頭有高度多樣性。這樣的構(gòu)建體經(jīng)工程改造成為誘發(fā)針對保守HA干的高度強(qiáng)效和廣泛中和抗體的疫苗制劑，例如活的流感病毒、殺死的流感病毒、病毒樣顆粒(“VLPs”)、亞單位疫苗、裂解疫苗等。這樣的“通用”疫苗可用于誘導(dǎo)和/或加強(qiáng)流感病毒亞型間的交叉保護(hù)性免疫應(yīng)答。
[0139]作為背景，針對流感病毒的中和抗體靶向HA糖蛋白并且阻止參與病毒進(jìn)入的結(jié)合步驟或融合步驟。中和抗體的兩個(gè)基礎(chǔ)亞組由暴露于流感病毒激發(fā):針對毒株-特異性球狀頭(在流感病毒的各種不同毒株和亞型間是非保守的結(jié)構(gòu)域)的那些和針對HA糖蛋白的高度保守的干的那些。非保守的HA球狀頭攜帶免疫優(yōu)勢表位-毒株-特異性抗球狀頭抗體一般被認(rèn)為比抗干抗體特異性更強(qiáng)效，因此解釋了用目前疫苗感染所賦予的大部分毒株-特異性免疫力。
[0140]本文公開的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽部分地基于發(fā)明人的關(guān)于激發(fā)針對HA干的高度強(qiáng)效和廣泛中和抗體的流感病毒疫苗的合理設(shè)計(jì)策略。在這一方面，設(shè)計(jì)出嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽共享來自先前暴露/接種的相對非常保守的干結(jié)構(gòu)域，但含有異源HA球狀頭結(jié)構(gòu)域一優(yōu)選對預(yù)定接種是原初的HA球狀頭結(jié)構(gòu)域。對這種構(gòu)建體的暴露應(yīng)當(dāng)主要是加強(qiáng)針對保守HA干的抗體。用這種保守的HA干和變化的球狀頭重復(fù)免疫應(yīng)當(dāng)誘導(dǎo)穩(wěn)固的針對HA的共同干區(qū)域的交叉中和抗體。
[0141]當(dāng)設(shè)計(jì)嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽時(shí)，應(yīng)當(dāng)小心維護(hù)所得蛋白的穩(wěn)定性。在這一方面，建議使在圖1中標(biāo)識為Ap和Aq的半胱氨酸殘基得以維持，因?yàn)樗鼈儗A莖的穩(wěn)定性有貢獻(xiàn),如下文第5.1節(jié)更詳細(xì)論述的。對于最佳穩(wěn)定性，優(yōu)選HA球狀結(jié)構(gòu)域作為整體(介于Ap和Aq半胱氨酸殘基之間，如圖1所示)進(jìn)行“調(diào)換(swap)”，由于所得構(gòu)象將與天然結(jié)構(gòu)最密切。換句話說，在第5.1.2節(jié)中提及的“接頭”可以是異源HA的整個(gè)球狀頭結(jié)構(gòu)域。
[0142]代之以“調(diào)換出(swapping out) ”HA莖的天然球狀頭，所述球狀頭可以通過改變對HA球狀頭表位有貢獻(xiàn)的環(huán)而制成對保守的莖是異源的。這種方法對于產(chǎn)生針對保守莖的所需免疫應(yīng)答也可能不起作用，除非改變的球狀頭被設(shè)計(jì)成與天然球狀HA頭有巨大不同一尤其是當(dāng)使用群體被暴露的HA。盡管如此，這樣的改變可以例如通過改變對HA球狀頭表位有貢獻(xiàn)的五個(gè)環(huán)中的大部分來完成。在一個(gè)有用的方法中，所有的五個(gè)環(huán)均可以被改變。
[0143]用于疫苗接種的構(gòu)建體可以有利地被設(shè)計(jì)成用于待接種疫苗的特殊對象/群體。有三種流感亞型在有人類生活的今天已暴露:亞型H1、H2和H3。H2亞型的流感病毒已在1968年從人群中消失，而Hl和H3亞型的流感病毒直到今天持續(xù)在人群中存在。結(jié)果，在1968年之前出生的活到今天的成人很可能已暴露了 H1、H2和H3亞型中的每一種。相反，在1968年之后出生的活到今天的成人僅暴露于Hl和H3亞型。
[0144]因此，在對成人實(shí)施接種疫苗的多個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述嵌合的流感血細(xì)胞凝集素多肽不具有來自亞型Hl、H2或H3的流感病毒的HA的球狀頭結(jié)構(gòu)域，但是的確具有來自這三種亞型之一的HA的干結(jié)構(gòu)域。所述異源球狀頭可選自任何非Hl、非H2或非H3亞型的HA。另外，使用H1/H2干在一個(gè)方面和H3在另一個(gè)方面制備的分開的嵌合構(gòu)建體干可有益地用于疫苗接種程序一HI和H2亞型是共享保守莖結(jié)構(gòu)域的組IHA亞型；而H3在結(jié)構(gòu)上不同于組I莖的組2亞型。Hl和H3構(gòu)建體的應(yīng)用將會(huì)確保產(chǎn)生/加強(qiáng)針對每一種干結(jié)構(gòu)域的免疫應(yīng)答。用這樣的嵌合的流感血細(xì)胞凝集素多肽免疫成人對象將加強(qiáng)所述對象的記憶免疫應(yīng)答，導(dǎo)致有交叉反應(yīng)性的廣泛中和抗干結(jié)構(gòu)域抗體的大規(guī)模產(chǎn)生，從而在所述對象中提供對流感病毒的長期持續(xù)的免疫力。
[0145]尚未暴露的嬰兒對所有的流感病毒亞型當(dāng)然是原初的。結(jié)果，可以構(gòu)建各式各樣的HA干/球狀頭組合用于嬰兒的疫苗中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以給原初嬰兒接種用組I (Hl或H2)或組2(H3)毒株的HA莖和來自異源毒株(即非H1、非H2和/或非H3毒株)的球狀頭制備的構(gòu)建體。對于各HA莖的三種不同的嵌合HA構(gòu)建體可以有利地用于三次序貫疫苗接種以誘導(dǎo)交叉保護(hù)性應(yīng)答。
[0146]應(yīng)當(dāng)理解，本文描述的嵌合的流感血細(xì)胞凝集素多肽的應(yīng)用是有利的，因?yàn)?i)所述多肽是十分穩(wěn)定的(鑒于具有完整的球狀頭結(jié)構(gòu)域)和(ii)給予所述多肽的對象的免疫系統(tǒng)先前未曾暴露于所述嵌合的流感血細(xì)胞凝集素的球狀頭結(jié)構(gòu)域，但是已暴露于所述嵌合的流感血細(xì)胞凝集素的干結(jié)構(gòu)域的保守表位。
[0147]所述嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽通過工作實(shí)施例(例如，第6.2節(jié))予以舉例說明，這些工作實(shí)施例證明了包含HA干和展示異源HA頭的嵌合的流感HA多肽的構(gòu)建，及來自這種與抗所述干結(jié)構(gòu)域和所述頭結(jié)構(gòu)域二者的抗體起交叉反應(yīng)的多肽的穩(wěn)定的嵌合的HA蛋白的產(chǎn)生。
[0148]在一個(gè)方面，本文提供的是包含流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽和流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的(例如，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽和所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽均來源于不同的流感病毒血細(xì)胞凝集素亞型)。本文提供的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽可以通過將流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽(參見第5.2節(jié))與流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽(第5.3節(jié))組合來產(chǎn)生。也就是說，利用本發(fā)明的原理，本文描述的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽(參見第5.1.1節(jié)，參見下文)和本文描述的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽(第5.1.2節(jié)，參見下文)可以進(jìn)行混合并匹配從而產(chǎn)生嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽。
[0149]在另一個(gè)方面，本文提供的是包含一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)和/或一個(gè)或多個(gè)非天然存在的糖基化位點(diǎn)的流感血細(xì)胞凝集素(HA)多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽，流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)干結(jié)構(gòu)域多肽)。如圖20A和圖20B所示，野生型血細(xì)胞凝集素的糖基化發(fā)生在球狀頭結(jié)構(gòu)域和干結(jié)構(gòu)域二者之中。相信在這些結(jié)構(gòu)域里面的糖基化可以遮蔽抗原性區(qū)域，從而允許流感病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)應(yīng)答。例如，已知季節(jié)性流感病毒毒株(例如,HlNl和H3N2)在球狀頭結(jié)構(gòu)域的免疫優(yōu)勢抗原性區(qū)域中隨時(shí)間獲得額外的糖基化位點(diǎn)。在本文描述的流感病毒HA多肽的上下文中，然而，所述多肽的干結(jié)構(gòu)域里面的糖基化可以阻礙或防止針對在這個(gè)結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)的保守抗原性區(qū)域的所需免疫應(yīng)答。參見圖19C。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的是包含具有至少一個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)的干結(jié)構(gòu)域的流感HA多肽，其中所述修飾的糖基化位點(diǎn)，其中所述修飾破壞聚糖附著到所述修飾的糖基化位點(diǎn)的能力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的是包含HA球狀頭結(jié)構(gòu)域的流感HA多肽，其中所述HA球狀頭結(jié)構(gòu)域包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的至少一個(gè)非天然存在的糖基化位點(diǎn),和其中Xaa是任意氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感HA多肽包含(I)包含一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)的干結(jié)構(gòu)域，其中所述修飾的糖基化位點(diǎn)包含天然存在的糖基化位點(diǎn)的修飾，其中所述修飾破壞聚糖附著到所述修飾的糖基化位點(diǎn)的能力；和(2)包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的一個(gè)或多個(gè)非天然存在的糖基化位點(diǎn)的HA球狀頭結(jié)構(gòu)域，其中Xaa是任意氨基酸。在多個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感HA多肽的干結(jié)構(gòu)域中的修飾的糖基化位點(diǎn)包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位點(diǎn)的修飾,其中Xaa是任意氨基酸。
[0150]雖然不受任何具體操作理論的束縛，但是相信針對本文提供的流感病毒HA多肽的干結(jié)構(gòu)域里面的保守抗原性區(qū)域的免疫應(yīng)答可以通過以在該位點(diǎn)上破壞糖基化(即，聚糖的附著)的方式修飾干結(jié)構(gòu)域里面的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)來增加。另外，還相信通過在這些免疫優(yōu)勢區(qū)域中添加一個(gè)或多個(gè)非天然存在的糖基化位點(diǎn)來遮蔽HA球狀頭結(jié)構(gòu)域的免疫優(yōu)勢抗原性區(qū)域也可以增加在干結(jié)構(gòu)域里面保守的亞免疫優(yōu)勢抗原性區(qū)域的免疫原性。
[0151]在另一個(gè)方面，本文提供的是使用本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)預(yù)防和/或治療和/或免疫針對對象的流感病毒疾病和/或感染的方法，即，所述流感HA多肽可用于給對象實(shí)施接種以抵抗流感病毒疾病或感染或治療罹患流感病毒疾病或感染的對象。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用所述流感HA多肽的方法是用于預(yù)防對象的流感病毒疾病，包括給予對象有效量的流感HA多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用所述流感HA多肽的方法是用于治療對象的流感病毒疾病和/或感染，包括給予對象有效量的流感HA多肽。在又一個(gè)實(shí)施方案中，使用所述流感HA多肽的方法是用于免疫以抵抗對象的流感病毒疾病和/或感染。
[0152]在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的是經(jīng)工程改造以表達(dá)本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)中的一種或多種的流感病毒。這樣的病毒可以用作針對流感病毒的疫苗，例如，表達(dá)本文的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽)中的一種或多種的本文提供的流感病毒可以用于亞單位疫苗、裂解疫苗、滅活疫苗和/或活的減毒病毒疫苗。
[0153]在某些實(shí)施方案中，經(jīng)工程改造以表達(dá)本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽)中的一種或多種的流感病毒包含神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase, NA)或其片段,所述神經(jīng)氨酸酶(NA)或其片段來自與流感HA多肽的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽來源相同的來源(例如，流感病毒毒株或亞型)。在某些實(shí)施方案中，經(jīng)工程改造以表達(dá)所述流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽)中的一種或多種的流感病毒包含來自與所述流感HA多肽的球狀頭結(jié)構(gòu)域和/或干結(jié)構(gòu)域不同的流感病毒毒株的神經(jīng)氨酸酶。在某些實(shí)施方案中，經(jīng)工程改造以表達(dá)所述流感HA多肽中的一種或多種的流感病毒包含相對于由經(jīng)工程改造以表達(dá)所述流感HA多肽中的一種或多種的流感病毒編碼的其它蛋白，來自不同的流感病毒的神經(jīng)氨酸酶。
[0154]在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的是編碼本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)的核酸(參見例如，第5.5節(jié)，參見下文)。
[0155]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的是含有編碼本文描述的流感HA多肽的核酸的載體，例如表達(dá)載體(參見例如，第5.6節(jié),參見下文)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中,所述載體是質(zhì)粒載體。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述載體是病毒載體(參見例如，第5.7和5.8節(jié)，參見下文)，例如流感病毒載體，其中已將本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽)摻入到包含經(jīng)工程改造以表達(dá)嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的基因組的病毒體(vir1ns)或流感病毒載體中。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述載體是細(xì)菌載體(參見例如，第5.10節(jié)，參見下文)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述載體是桿狀病毒。本文提供的載體可以被設(shè)計(jì)成使用原核細(xì)胞(例如，細(xì)菌)或真核細(xì)胞(例如，昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、藻類細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)表達(dá)嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽。因此，本文也提供的是包含本文提供的載體并且能夠產(chǎn)生本文描述的一種或多種流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)的細(xì)胞(即，原核細(xì)胞和真核細(xì)胞)。
[0156]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的是其中摻入了本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)的病毒樣顆粒(VLPs)和病毒體(參見第5.9節(jié)，參見下文)。
[0157]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的是包含本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)中的一種或多種和/或本文描述的核酸、載體、VLPs、細(xì)菌或病毒體中的一種或多種的組合物(參見例如，第5.14節(jié))。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的組合物包含本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的組合物包含編碼本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)的核酸。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的組合物包含表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含編碼本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)的核酸。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的組合物包含具有經(jīng)工程改造以表達(dá)本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)的基因組的流感病毒或非流感病毒。
[0158]在某些實(shí)施方案中，將一種或多種本文描述的流感HA多肽(參見例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽，第5.1節(jié)，參見下文)或其組合物和/或本文描述的核酸、載體、VLPs或病毒體中的一種或多種給予對象以給對象實(shí)施免疫以抵抗流感病毒的多種毒株或亞型。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述給藥足以在所述個(gè)體中產(chǎn)生針對任何一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、1、十二、十三、十四、十五、十六或十七種已知的甲型流感血細(xì)胞凝集素亞型或以后鑒定的甲型流感血細(xì)胞凝集素亞型的宿主免疫應(yīng)答。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述給藥足以在所述個(gè)體中產(chǎn)生針對現(xiàn)在已知的以后鑒定的任何乙型流感血細(xì)胞凝集素亞型的宿主免疫應(yīng)答。
[0159]在某些實(shí)施方案中，將一種或多種本文描述的流感HA多肽(參見例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽，參見第5.1節(jié)，參見下文)或其組合物和/或本文描述的核酸、載體、VLPs或病毒體中的一種或多種作為單次劑量給予對象一次。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述對象是人類兒童。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述對象是人類成人。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述對象是老年人。在某些實(shí)施方案中，首先將本文描述的流感HA多肽或本文描述的組合物核酸、載體、VLP、或病毒體作為單次劑量給予對象，然后，在3到6周后，第二次給予本文描述的流感HA多肽或本文描述的組合物核酸、載體、VLP或病毒體。
[0160]在某些實(shí)施方案中，將一種或多種本文描述的流感HA多肽(參見例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)或其組合物和/或本文描述的核酸、載體、VLPs或病毒體中的一種或多種作為單次劑量給予對象，然后，在3到6周后，給予第二次劑量。其中第一次劑量中使用的所述流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域是來自與第二次劑量中使用的所述流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域不同的毒株或亞型。在某些實(shí)施方案中，可以在第二次接種之后按6到12個(gè)月間隔時(shí)間給予對象多次加強(qiáng)接種。在某些實(shí)施方案中，加強(qiáng)接種中使用的所述流感HA多肽的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域是來自與第一次和第二次劑量中使用的所述流感HA多肽的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域不同的毒株或亞型。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述對象是人類兒童。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述對象是人類成人。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述對象是老年人。
[0161]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，對于對人類嬰兒的給藥，將本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)(參見例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽，第5.1節(jié)，參見下文)或其組合物和/或本文描述的核酸、載體、VLPs或病毒體中的一種或多種的兩次劑量給予嬰兒，其中第一次劑量中使用的所述流感HA多肽的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域是來自與第二次劑量中使用的所述流感HA多肽的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域不同的毒株或亞型。
[0162]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，對于對人類嬰兒的給藥，將流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽，第5.1節(jié)，參見下文)或其組合物和/或本文描述的核酸、載體、VLPs或病毒體中的一種或多種的三次劑量給予嬰兒，其中第一次、第二次和第三次劑量中使用的所述流感HA多肽的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域是來自流感病毒的不同的毒株或亞型。
[0163]在另一個(gè)方面，本文提供的是給對象實(shí)施免疫以抵抗流感病毒疾病或感染的方法，包括使所述對象暴露于對象對其是原初的流感病毒的血細(xì)胞凝集素，即，所述對象之前未曾暴露于所述流感病毒和/或所述流感病毒的血細(xì)胞凝集素。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述血細(xì)胞凝集素是本文描述的流感HA多肽。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述血細(xì)胞凝集素是嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽。
[0164]在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的是給對象實(shí)施免疫以抵抗流感病毒疾病或感染的方法，包括給予所述對象一種或多種流感病毒，其中所述一種或多種流感病毒中的每一種都包含對象對其是原初的血細(xì)胞凝集素多肽，即，所述對象之前未曾暴露于所述的一種或多種流感病毒。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述的一種或多種流感病毒是亞型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、HlU H12、H13、H14、H15、H16 和 / 或 H17 的流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述方法包括⑴亞型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 或 H17 的流感病毒的第一次給藥和(ii)亞型 H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16或H17的流感病毒的第二次給藥，其中第一次給藥的流感病毒屬于與第二次給藥的流感病毒不同的亞型。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述方法包括(i)亞型 H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16 或 H17 的流感病毒的第一次給藥；(ii) MMH2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16*H17 的流感病毒的第二次給藥；和(iii)亞型 H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16或H17的流感病毒的第三次給藥，其中第一次、第二次和第三次給藥的流感病毒屬于不同的亞型。
[0165]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的是給對象實(shí)施免疫以抵抗流感病毒疾病或感染的方法，包括給予所述對象對象對其是原初的一種或多種流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽，即，所述對象之前未曾暴露于所述的一種或多種流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽。在某些實(shí)施方案中，對象對其是原初的所述一種或多種流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽是在組合物(例如，包含疫苗的組合物)中。在某些實(shí)施方案中，對象對其是原初的一種或多種流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽是在載體(例如流感病毒載體)中。在某些實(shí)施方案中，對象對其是原初的一種或多種流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽是在VLP中。在某些實(shí)施方案中，對象對其是原初的一種或多種流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽是在病毒體中。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述一種或多種流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽是來自亞型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16和/或H17的流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述方法包括⑴亞型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的第一次給藥和(ii)亞型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的第二次給藥，其中第一次給藥的所述流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽屬于與第二次給藥的所述流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽不同的亞型。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述方法包括(i)亞型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16 或 H17 的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的第一次給藥；(ii) MMH2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16 或H17的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的第二次給藥；和(iii)亞型!12、!14、冊、冊、!17、!18、!19、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16*H17的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的第三次給藥，其中第一次、第二次和第三次給藥的所述流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽是來自不同的流感病毒亞型。
[0166]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的是給對象實(shí)施免疫以抵抗流感病毒疾病或感染的方法，包括(i)使所述對象致敏，即通過給予所述對象來自某種流感亞型(例如，Hl血細(xì)胞凝集素)的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽(或編碼所述血細(xì)胞凝集素多肽的核酸、表達(dá)所述血細(xì)胞凝集素多肽的病毒、表達(dá)所述血細(xì)胞凝集素多肽的VLP，等等)，再過一段時(shí)間周期后，和(ii)所述對象用本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)(或編碼所述流感HA多肽的核酸、表達(dá)所述流感HA多肽的病毒、表達(dá)所述流感HA多肽的VLP，等等)來加強(qiáng)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感HA多肽是嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素HA多肽，其包含對象對其是原初的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽(或其部分)和與在步驟(i)的致敏過程中使用的血細(xì)胞凝集素多肽中的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽相同或相似(例如，來自相同的流感病毒毒株或亞型)的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽(或其部分)。在某些實(shí)施方案中，所述對象可以給予第二次加強(qiáng)接種，包括相同或不同的本文描述的流感HA多肽(polypetpide)(或編碼所述流感HA多肽的核酸、表達(dá)所述流感HA多肽的病毒、表達(dá)所述流感HA多肽的VLP，等等)的第二次給藥。在某些實(shí)施方案中，所述對象可以給予第三次加強(qiáng)接種，包括本文描述的相同或不同的流感HA多肽(或編碼所述流感HA多肽的核酸、表達(dá)所述流感HA多肽的病毒、表達(dá)所述流感HA多肽的VLP，等等)的第三次給藥。在某些實(shí)施方案中，在所述對象的致敏和加強(qiáng)之間或在多次加強(qiáng)之間(如果給予超過一次加強(qiáng)接種的話)的時(shí)間周期可以例如是I周、2周、3周、4周、I個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月或更長時(shí)間。在某些實(shí)施方案中，在所述對象的致敏和加強(qiáng)之間(或在第一次和第二次加強(qiáng)之間)的時(shí)間周期可以例如范圍為3-5天、7-10天、7-14天、14-21天、14-28天、21-28天、21天至I個(gè)月、I個(gè)月至2個(gè)月、I個(gè)月至3個(gè)月、2個(gè)月至3個(gè)月、2個(gè)月至4個(gè)月或4個(gè)月至6個(gè)月。
[0167]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的是給對象實(shí)施免疫以抵抗流感病毒疾病或感染的方法，包括(i)使所述對象致敏，即通過給予所述對象來自某種流感亞型(例如，Hl血細(xì)胞凝集素)的無頭的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽(即流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽或編碼所述血細(xì)胞凝集素多肽的核酸、表達(dá)所述血細(xì)胞凝集素多肽的病毒、表達(dá)所述血細(xì)胞凝集素多肽的VLP，等等)(例如本文描述的那些)，再過一段時(shí)間周期后，和(ii)所述對象用本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)(或編碼所述流感HA多肽的核酸、表達(dá)所述流感HA多肽的病毒、表達(dá)所述流感HA多肽的VLP，等等)加強(qiáng)接種。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感HA多肽是嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽，其包含對象對其是原初的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽(或其部分)和與在步驟
(i)的致敏過程中使用的無頭的血細(xì)胞凝集素多肽(即流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽)中的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽相同或相似(例如，來自相同的流感病毒毒株或亞型)的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽(或其部分)。在某些實(shí)施方案中，所述對象可以給予第二次加強(qiáng)接種，包括相同或不同的本文描述的流感HA多肽(或編碼所述流感HA多肽的核酸、表達(dá)所述流感HA多肽的病毒、表達(dá)所述流感HA多肽的VLP，等等)的第二次給藥。在某些實(shí)施方案中，所述對象可以給予第三次加強(qiáng)接種，包括相同或不同的本文描述的流感HA多肽(或編碼所述流感HA多肽的核酸、表達(dá)所述流感HA多肽的病毒、表達(dá)所述流感HA多肽的VLP，等等)的第三次給藥。在多個(gè)具體的實(shí)施方案中，第二次和/或第三次加強(qiáng)接種中使用的流感HA多肽(其在多個(gè)具體的實(shí)施方案中是嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)包含與無頭的HA的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽相同或相似的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽并且可以包含或不包含不同的頭。在某些實(shí)施方案中，在所述對象的致敏和加強(qiáng)之間或在多次加強(qiáng)之間(如果給予超過一次加強(qiáng)接種的話)的時(shí)間周期可以例如是I周、2周、3周、4周、I個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月或更長時(shí)間。在某些實(shí)施方案中，在所述對象的致敏和加強(qiáng)之間(或在第一次和第二次加強(qiáng)之間)的時(shí)間周期可以例如范圍為3-5天、7-10天、7-14天、14-21天、14-28天、21-28天、21天至I個(gè)月、I個(gè)月至2個(gè)月、I個(gè)月至3個(gè)月、2個(gè)月至3個(gè)月、2個(gè)月至4個(gè)月或4個(gè)月至6個(gè)月。
[0168]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的是給對象實(shí)施免疫以抵抗流感病毒疾病或感染的方法，包括(i)使所述對象致敏，即通過給予所述對象第一種本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)(或編碼所述流感HA多肽的核酸、表達(dá)所述流感HA多肽的病毒、表達(dá)所述流感HA多肽的VLP，等等)，再過一段時(shí)間周期后，和(ii)所述對象用第二種本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)(或編碼所述流感HA多肽的核酸、表達(dá)所述流感HA多肽的病毒、表達(dá)所述流感HA多肽的VLP，等等)來加強(qiáng)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述第二種流感HA多肽是嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽，其包含對象對其是原初的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽(或其部分)和與在步驟(i)的致敏過程中使用的第一種嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽相同或相似(例如，來自相同的流感病毒毒株或亞型)的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽(或其部分)。在某些實(shí)施方案中，所述對象可以給予第二次加強(qiáng)接種，包括第一種或第二種本文描述的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)或不同的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)(或編碼所述流感HA多肽的核酸、表達(dá)所述流感HA多肽的病毒、表達(dá)所述流感HA多肽的VLP，等等)的第二次給藥。在某些實(shí)施方案中，所述對象可以給予第三次加強(qiáng)接種，包括與之前給予相同的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)或本文描述的不同的流感HA多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)(或編碼所述流感HA多肽的核酸、表達(dá)所述流感HA多肽的病毒、表達(dá)所述流感HA多肽的VLP，等等)中的一種的給藥。在多個(gè)具體的實(shí)施方案中，第二次和/或第三次加強(qiáng)接種中使用的流感HA多肽是嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽，其包含與第一種流感HA多肽(其在多個(gè)具體的實(shí)施方案中是嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽相同或相似的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽并且可以包含或不包含不同的頭。在某些實(shí)施方案中，在所述對象的致敏和加強(qiáng)之間或在多次加強(qiáng)之間(如果給予超過一次加強(qiáng)接種的話)的時(shí)間周期可以例如是I周、2周、3周、4周、I個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月或更長時(shí)間。在某些實(shí)施方案中，在所述對象的致敏和加強(qiáng)之間(或在第一次和第二次加強(qiáng)之間)的時(shí)間周期可以例如范圍為3-5天、7-10天、7-14天、14-21天、14-28天、21-28天、21天至I個(gè)月、I個(gè)月至2個(gè)月、I個(gè)月至3個(gè)月、2個(gè)月至3個(gè)月、2個(gè)月至4個(gè)月或4個(gè)月至6個(gè)月。
[0169]5.1嵌合的流感病毒血■細(xì)胞凝集素多肽
[0170]本文提供的是包含流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽和流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽或由其組成的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的(例如，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽和所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來源于不同的流感病毒血細(xì)胞凝集素亞型)。在下文第5.2節(jié)中描述了流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽。在下文第5.3節(jié)中描述了能夠形成穩(wěn)定的無頭的干結(jié)構(gòu)域的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽。
[0171]全長的流感血細(xì)胞凝集素典型地包含HAl結(jié)構(gòu)域和HA2結(jié)構(gòu)域。所述干結(jié)構(gòu)域由HAl結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)區(qū)段和HA2結(jié)構(gòu)域的大部分或全部形成。HAl結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)區(qū)段在一級序列中被球狀頭結(jié)構(gòu)域(參見例如，在圖1中命名為Ap和Aq的殘基之間的氨基酸殘基)分隔開。在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽維持這樣一種結(jié)構(gòu)。也就是說，在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽包含由HAl結(jié)構(gòu)域和HA2結(jié)構(gòu)域組成的穩(wěn)定的干結(jié)構(gòu)和將HAl結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)區(qū)段分隔開的球狀頭結(jié)構(gòu)域(在一級序列中)。其中所述球狀頭結(jié)構(gòu)域?qū)τ蒆Al結(jié)構(gòu)域和HA2結(jié)構(gòu)域的其它區(qū)段形成的干結(jié)構(gòu)域是異源的。
[0172]在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽包含(i)和(ii)或由(i)和(ii)組成:(i)本文描述的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽(參見例如，第5.1.2節(jié)，參見下文)或來自流感病毒的任何已知的毒株或亞型的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽(例如，任何野生型流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽，例如下文第
5.4節(jié)描述的流感病毒的血細(xì)胞凝集素的干結(jié)構(gòu)域)和(ii)本文描述的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽(參見例如，第5.2和5.4.2節(jié)，參見下文)或來自流感病毒的任何已知的毒株或亞型的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽(例如，任何野生型流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽)，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的，和其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是甲型流感病毒亞型Hl或H3的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽。
[0173]在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽包含(i)和(ii)或由(i)和(ii)組成:(i)本文描述的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽(參見例如，第5.3和5.4.1節(jié)，參見下文)或來自流感病毒的任何已知的毒株或亞型的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽(例如，任何野生型流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽)和(ii)本文描述的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽(參見例如，第5.2和5.4.2節(jié)，參見下文)或來自流感病毒的任何已知的毒株或亞型的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽(例如，任何野生型流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽)，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的，和其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是甲型流感病毒亞型H2的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽。
[0174]在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽包含(i)和(ii)或由(i)和(ii)組成:(i)本文描述的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽(參見例如，第5.3和5.4.1節(jié)，參見下文)或來自流感病毒的任何已知的毒株或亞型的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽(例如，任何野生型流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽)和(ii)本文描述的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽(參見例如，第5.2和5.4.2節(jié)，參見下文)或來自流感病毒的任何已知的毒株或亞型的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽(例如，任何野生型流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽)，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的，和其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是甲型流感病毒亞型H5的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽。
[0175]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)組成的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽:(i)本文描述的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽(參見例如，第5.3和5.4.1節(jié)，參見下文)或來自流感病毒的任何已知的毒株或亞型的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽(例如，任何野生型流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽)和(ii)來自甲型流感病毒亞型111、!12、!13、!14、冊、冊、!17、!18、!19、!110、!111、!112、!113、H14、H15、H16或H17的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的。
[0176]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)組成的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽:(i)本文描述的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽(參見例如，第5.3和5.4.1節(jié)，參見下文)或來自流感病毒的任何已知的毒株或亞型的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽(例如，任何野生型流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽)和(?)來自甲型流感病毒亞型財(cái)，冊、!17、!18、!19、!110、!111、!112、!113、!114、!115、H16或H17的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的。
[0177]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)組成的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽:(i)本文描述的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽(參見例如，第5.3和5.4.1節(jié)，參見下文)或來自流感病毒的任何已知的毒株或亞型的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽(例如，任何野生型流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽)和(ii)來自禽流感病毒亞型Hl、H2或H3的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的。
[0178]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)組成的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽:(i)本文描述的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽(參見例如，第5.3和5.4.1節(jié)，參見下文)或來自流感病毒的任何已知的毒株或亞型的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽(例如，任何野生型流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽)和(ii)來自馬流感病毒亞型H3的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的。
[0179]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)組成的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽:(i)來自亞型Hl的甲型流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽和Qi)來自亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16或H17的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型Hl、H2或H3的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H5的甲型流感病毒。
[0180]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含(i)和(ii)或由(i)和(ii)組成的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽:(i)來自亞型H3的甲型流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽和Qi)來自亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型H4、H7、H10、H14或H15的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H1、H2或H3的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H5的甲型流感病毒。
[0181]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含(i)和(ii)或由(i)和(ii)組成的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽:(i)來自亞型H2的甲型流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽和Qi)來自亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H1、H2或H3的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H5的甲型流感病毒。
[0182]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)組成的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽:(i)來自亞型111、!12、!13、!14、冊、冊、!17、!18、!19、!110、Hl1、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽和(ii)來自乙型流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的。
[0183]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含(i)和(ii)或由(i)和(ii)組成的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽:(i)來自乙型流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽和 Qi)來自亞型 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16 或 H17 的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型Hl、H2或H3的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H5的甲型流感病毒。
[0184]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含(i)和(ii)或由(i)和(ii)組成的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽:(i)來自乙型流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽和(ii)來自乙型流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的。
[0185]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)組成的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽:(i)來自甲型流感病毒A/California/7/2009 (HI)的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽和(ii)來自亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型H5、H6、H8、H9、Hll、H12、H13或H16的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型Hl的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H2的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H3的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H5的甲型流感病毒。
[0186]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)組成的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽:(i)來自甲型流感病毒A/California/7/2009 (HI)的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽和(ii)來自亞型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hl1、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型H4的甲型流感病毒。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型H5的甲型流感病毒。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型H6的甲型流感病毒。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型H7的甲型流感病毒。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型HS的甲型流感病毒。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型H9的甲型流感病毒。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型HlO的甲型流感病毒。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型Hll的甲型流感病毒。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型H12的甲型流感病毒。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型H13的甲型流感病毒。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型H14的甲型流感病毒。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型H15的甲型流感病毒。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型H16的甲型流感病毒。
[0187]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)組成的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽:(i)來自甲型流感病毒A/Brisbane/59/2007-like (Hl)的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽和(ii)來自亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 或 H17 的甲型流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型H5、H6、H8、H9、Hll、H12、H13或H16的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型Hl的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H2的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H3的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H5的甲型流感病毒。
[0188]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和
(ii)組成的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽:(i)來自甲型流感病毒A/SouthCarolina/1918 (HI)的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽和(ii)來自亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 或 H17 的甲型流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型H5、H6、H8、H9、Hll、H12、H13或H16的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型Hl的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H2的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H3的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H5的甲型流感病毒。
[0189]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)組成的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽:(i)來自甲型流感病毒A/USSR/92/1977(Hl)的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽和(ii)來自亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型冊、冊、!18、!19、!111、!112、!113或!116的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型Hl的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H2的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H3的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H5的甲型流感病毒。
[0190]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)組成的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽:(i)來自甲型流感病毒A/California/04/2009 (HI)的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽和(ii)來自亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型冊、冊、!18、!19、!111、!112、!113或!116的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型Hl的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H2的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H3的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H5的甲型流感病毒。
[0191]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含(i)和(ii)或由(i)和(ii)組成的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽:(i)來自甲型流感病毒A/Perth/16/2009 (H3)的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽和(ii)來自亞型!11、!12、!13、!14、冊、冊、!17、!18、!19、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型財(cái)、!17、!110、!114或!115的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽(polyp tide)是來自亞型H5的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽(polyp tide)是來自A/Viet Nam/1203/04(H5)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型H7的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽(polyp tide)是來自A/Alberta/24/01 (H7)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型Hl的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H2的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H3的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H5的甲型流感病毒。
[0192]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)組成的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽:(i)來自甲型流感病毒A/Brisbane/10/2007-like (H3)的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽和(ii)來自亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 或 H17 的甲型流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型H4、H7、H10、H14或H15的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型Hl的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H2的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H3的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H5的甲型流感病毒。
[0193]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含(i)和(ii)或由(i)和(ii)組成的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽:(i)來自甲型流感病毒A/Hong Kong/1/1968 (H3)的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽和(ii)來自亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型財(cái)、!17、!110、!114或!115的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型Hl的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H2的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H3的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H5的甲型流感病毒。
[0194]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)組成的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽:(i)來自甲型流感病毒A/California/1/1988 (H3)的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽和(ii)來自亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型財(cái)、!17、!110、!114或!115的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型Hl的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H2的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H3的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H5的甲型流感病毒。
[0195]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含(i)和(ii)或由(i)和(ii)組成的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽:(i)來自甲型流感病毒A/Ann Arbor/6/60 (H2)的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽和(ii)來自亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型財(cái)、!17、!110、!114或!115的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型Hl的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H2的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H3的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H5的甲型流感病毒。
[0196]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含⑴和(ii)或由⑴和(ii)組成的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽:(i)來自甲型流感病毒A/Puerto Rico/8/1934 (HI)的流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽和(ii)來自亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16或H17的甲型流感病毒的流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型H1、H2、H4、H5、H6、H7、H9、H10、H14或H15的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型Hl、H2、H5、H6或H9的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型Hl的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H2的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H3的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽不是來自亞型H5的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型H5的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽(polyptide)是來自A/Viet Nam/1203/04(H5)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型H6的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自A/mallard/Sweden/81/02 (H6)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自亞型H9的甲型流感病毒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是來自A/guineafowl/Hong Kong/ffF10/99(H9)。
[0197]在某些實(shí)施方案中，本文提供的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽包含流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽和流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽對所述流感病毒血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的，和其中所述嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽具有呈以下順序的一級結(jié)構(gòu)=HAlN-端干區(qū)段、流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽、HAlC-端干區(qū)段和HA2。本文提供的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的一級序列可以由單條多肽構(gòu)成，或者它可以由多條多肽構(gòu)成。典型地，單條多肽通過本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為合適的任何技術(shù)來表達(dá)。
[0198]在某些實(shí)施方案中，本文提供的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽是單體的。在某些實(shí)施方案中，本文提供的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽是多聚體的。在某些實(shí)施方案中，本文提供的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽是三聚體的。
[0199]在某些實(shí)施方案中，本文提供的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽包含信號肽。典型地，信號肽在多肽表達(dá)和翻譯期間或之后被切除以產(chǎn)生成熟的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽。在某些實(shí)施方案中，本文也提供的是缺少信號肽的成熟的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽。在其中本文提供的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽包含信號肽的多個(gè)實(shí)施方案中，所述信號肽可基于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何流感病毒信號肽。在某些實(shí)施方案中，所述信號肽基于甲型流感信號肽。在某些實(shí)施方案中，所述信號肽基于選自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 和 H17 的甲型流感血細(xì)胞凝集素的信號肽。在某些實(shí)施方案中，所述信號肽可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為有用的任何信號肽。在某些實(shí)施方案中，所述信號肽選自SEQ ID N0S: 18-33。
[0200]在某些實(shí)施方案中，本文提供的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽包含胞腔結(jié)構(gòu)域。在其中本文提供的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽包含胞腔結(jié)構(gòu)域的多個(gè)實(shí)施方案中，所述胞腔結(jié)構(gòu)域可基于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何流感胞腔結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述胞腔結(jié)構(gòu)域基于甲型流感胞腔結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述胞腔結(jié)構(gòu)域基于選自 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16 和 H17 的甲型流感血細(xì)胞凝集素的胞腔結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述胞腔結(jié)構(gòu)域可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為有用的任何胞腔結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述胞腔結(jié)構(gòu)域選自SEQ ID N0S:98-113。在某些實(shí)施方案中，所述胞腔結(jié)構(gòu)域是來自與所述干結(jié)構(gòu)域相同的血細(xì)胞凝集素。在某些實(shí)施方案中，所述胞腔結(jié)構(gòu)域是來自與所述干結(jié)構(gòu)域HA2亞單位相同的流感病毒毒株或亞型。
[0201]在某些實(shí)施方案中，本文提供的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽包含跨膜結(jié)構(gòu)域。在其中本文提供的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽包含跨膜結(jié)構(gòu)域的多個(gè)實(shí)施方案中，所述跨膜結(jié)構(gòu)域可基于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何流感跨膜結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述跨膜結(jié)構(gòu)域基于甲型流感跨膜結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述跨膜結(jié)構(gòu)域基于選自 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16 和 H17 的甲型流感血細(xì)胞凝集素的跨膜結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述跨膜結(jié)構(gòu)域可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為有用的任何跨膜結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述跨膜結(jié)構(gòu)域選自SEQ ID N0S: 114-129.在某些實(shí)施方案中，所述跨膜結(jié)構(gòu)域是來自與所述干結(jié)構(gòu)域相同的血細(xì)胞凝集素。在某些實(shí)施方案中，所述跨膜結(jié)構(gòu)域是來自與所述干結(jié)構(gòu)域HA2亞單位相同的流感病毒毒株或亞型。
[0202]在某些實(shí)施方案中，本文提供的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在其中本文提供的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的多個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域可基于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何流感細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域基于甲型流感細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域基于選自 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 和H17的甲型流感血細(xì)胞凝集素的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為有用的任何細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域選自SEQ ID N0S: 130-145。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域是來自與所述干結(jié)構(gòu)域相同的血細(xì)胞凝集素。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域是來自與所述干結(jié)構(gòu)域HA2亞單位相同的流感病毒毒株或亞型。
[0203]在某些實(shí)施方案中，本文提供的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽中的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)是修飾的(例如，通過氨基酸添加、缺失或取代)。在多個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)是修飾的使得這些位點(diǎn)上的糖基化在多肽的加工和成熟期間將不會(huì)發(fā)生。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，流感HA典型地包含一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)(例如Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys,其中Xaa是任意氨基酸或Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys,或者,在某些實(shí)施方案中，其中Xaa是Pro除外的任意氨基酸)。在某些實(shí)施方案中，所述修飾的糖基化位點(diǎn)位于所述嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的干結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，在糖基化位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基用破壞所述糖基化位點(diǎn)的氨基酸殘基保守取代。在某些實(shí)施方案中，在糖基化位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基用破壞所述糖基化位點(diǎn)的任意氨基酸殘基取代。在某些實(shí)施方案中，在糖基化位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)天冬酰胺殘基用丙氨酸取代。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，H3血細(xì)胞凝集素的位置38上的天冬酰胺被改變成丙氨酸。在某些實(shí)施方案中，所述嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽在其球狀頭結(jié)構(gòu)域中包含一個(gè)或多個(gè)非天然存在的糖基化位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，所述嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽包含一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)和/或非天然存在的糖基化位點(diǎn)，如在第5.4節(jié)中所論述的，參見下文。
[0204]在某些實(shí)施方案中，本文提供的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽能夠形成與天然流感血細(xì)胞凝集素的三維結(jié)構(gòu)類似的三維結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)的相似性可基于本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為合適的任何技術(shù)來評估。舉例來說，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽與識別天然流感血細(xì)胞凝集素的中和抗體或抗血清例如在非變性條件下的反應(yīng)可表明結(jié)構(gòu)相似性。有用的中和抗體或抗血清描述于例如Sui等人，2009, Nat.Struct.Mol.B1l.16 (3):265-273, Ekiert 等人,February26, 2009, Science[D01:10.1126/science.1171491]，和 Kashyap 等人，2008，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA105 (16): 5986-5991，其文本內(nèi)容以其整體并入本文作為參考。在某些實(shí)施方案中，所述抗體或抗血清是與由血細(xì)胞凝集素的三級或四級結(jié)構(gòu)形成的非連續(xù)表位(即，在一級序列中是不連續(xù))反應(yīng)的抗體或抗血清。
[0205]在某些實(shí)施方案中，本文提供的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽還包含一個(gè)或多個(gè)多肽結(jié)構(gòu)域。有用的多肽結(jié)構(gòu)域包括促進(jìn)多肽的純化、折疊和部分多肽切除的結(jié)構(gòu)域。例如，His 標(biāo)簽(His-His-His-His-His-His, SEQ ID NO: 166)、FLAG 表位或其它純化標(biāo)簽可以促進(jìn)本文提供的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的純化。在有些實(shí)施方案中，所述His 標(biāo)簽具有序列(His)n，其中 η 為 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大。來自噬菌體T4fibritin的折疊結(jié)構(gòu)域或三聚化結(jié)構(gòu)域可促進(jìn)本文提供的多肽的三聚化。在有些實(shí)施方案中，所述三聚化結(jié)構(gòu)域包含野生型GCMpII三聚化七個(gè)重復(fù)或修飾的GCMpII三聚化七個(gè)重復(fù),允許形成三聚體的或四聚體的卷曲螺旋,參見例如，Weldon等人，2010，PLoS0NE5(9):el2466。所述折疊結(jié)構(gòu)域可以具有本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何折疊序列(參見例如，Papanikolopoulou 等人,2004, J.B1l.Chem.279 (10): 8991-8998,其文本以其整體并入本文作為參考。實(shí)例包括GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ IDNO: 167)。折疊結(jié)構(gòu)域可用于促進(jìn)本文提供的可溶性多肽的三聚化。切割位點(diǎn)可以用于促進(jìn)一部分多肽的裂解，例如純化標(biāo)簽或折疊結(jié)構(gòu)域或它們二者的裂解。有用的切割位點(diǎn)包括凝血酶切割位點(diǎn)，例如具有序列LVPRGSP (SEQ ID NO: 168)的位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，所述切割位點(diǎn)是被煙草蝕斑病毒(TEV)蛋白酶識別的切割位點(diǎn)(例如，氨基酸序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser))。
[0206]在某些實(shí)施方案中，所述嵌合的流感血細(xì)胞凝集素血細(xì)胞凝集素多肽是可溶性多肽，例如在下文實(shí)施例6和9中描述的那些。
[0207]在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽維持在圖1中在流感血細(xì)胞凝集素多肽中被標(biāo)識為Ap和Aq的半胱氨酸殘基，即在圖1中在流感血細(xì)胞凝集素多肽中被標(biāo)識為A1^P Aq的半胱氨酸殘基在本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽中被保留下來。因此，在某些實(shí)施方案中，在本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的一級序列中:(i)流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽的N-端區(qū)段結(jié)束于在圖1中標(biāo)識為Ap的半胱氨酸殘基，(ii)流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽的C-端區(qū)段起始于在圖1中標(biāo)識為Aq的半胱氨酸殘基；和(iii)流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽(其對所述流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的)是介于流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽的N-端區(qū)段和C-端區(qū)段之間。流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽在下文第5.1.2節(jié)有詳細(xì)描述。
[0208]在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的HAlN-端干區(qū)段并不精確地結(jié)束于Ap (例如，來自H3血細(xì)胞凝集素的HAl亞單位的Cys52),但是結(jié)束于在序列和結(jié)構(gòu)靠近Ap的殘基。例如，在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的 HAlN-端干區(qū)段結(jié)束于 A"、Ap_2、Ap_3、Ap_4、Ap_5、Ap_6、Ap_7、Ap_8、Ap_9、Ap_1(1、Ap-11、Ap_12> Ap_13> Ap_14> Ap_15> Ap_16> Ap_17> Ap_18> Ap_19> Ap_2o > Ap_21、Ap_22 > Ap_23、Ap_23> Ap_24、Ap_25 > Ap_26、Ap-27、Ap_28、Ap_29、Ap_3(i。在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的HAlN-端干區(qū)段在Alri至

Ap-3、Ap-3 至 Ap-5、Ap_5 至 Ap—8、Ap—8 至



Ap-1O、Ap-1o MAp
-15、Ap-15 至 V20、
Ap_20至Ap_3。、Ap_30至Ap_4。的范圍內(nèi)結(jié)束。例如，在AP_1C)結(jié)束的HAlN-端干區(qū)段將結(jié)束于H3血細(xì)胞凝集素的Lys42。在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的 HAlN- ?而干區(qū)段結(jié)束于 Αρ+1、Αρ+2 λ Αρ+3λ Αρ+4λ Αρ+5、Αρ+6、Αρ+7、Αρ+8、Αρ+9、Αρ+1。、Αρ+11、Αρ+12 λ Αρ+13、Αρ+?4、Αρ+15、Αρ+16、Αρ+17λ Αρ+18、Αρ+19、Αρ+20、Αρ+21、Αρ+22、Αρ+23、Αρ+24、Αρ+25、Αρ+26、Αρ+27、Αρ+28、Αρ+29、Αρ+30、Αρ+3?、Αρ+32、Αρ+33、Αρ+34 λ Αρ+35、Αρ+36 λ Αρ+37 λ Αρ+38、Αρ+39 λ Αρ+4ο ο 在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的HAlN-端干區(qū)段在Αρ+1至Αρ+5、Αρ+5至ΑΡ+1(Ι、ΑΡ+1(Ι至ΑΡ+15、ΑΡ+15至 Ap+20、Ap+20 Αρ+25、Αρ+25 Αρ+30、Αρ+30 Αρ+35、Αρ+35


至αρ+4(ι或αρ+4(ι至αρ+5(ι的范圍內(nèi)結(jié)束。例如，在Αρ+38結(jié)束的HAlN-端干區(qū)段將結(jié)束于Η3血細(xì)胞凝集素的Arg90。HAlN-端干區(qū)段的末端應(yīng)當(dāng)結(jié)合HAlC-端干區(qū)段和流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽的末端進(jìn)行選擇使得所得嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽能夠形成與野生型流感血細(xì)胞凝集素類似的三維結(jié)構(gòu)。在這樣的實(shí)施方案中，流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽(其對所述流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的)在一級序列中位于流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽的N-端區(qū)段和C-端區(qū)段之間。
[0209]在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的HAlC-端干區(qū)段不起始于Aq (例如，來自H3血細(xì)胞凝集素的HAl亞單位的Cys277)，而是起始于在序列和結(jié)構(gòu)靠近Aq的殘基。例如，在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多妝的 HAlC- ?而干區(qū)段起$口于約 Atrl'Atr2'Atr3'Atr4'Atr5'Atr6'Atr7'Atr8'Atr9'Atric^ Atrll'Atrl2'Aq-13、Atrl4、Atrl5、Atr20、Atr25、Atr30、Atr35、Aq_40 > Aq_45> Aq_50> Atr55、Atr6cu Atr65、Aq_70 > Atr75 5? Atr8c^某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的HAlC-端干區(qū)段在Atrl
至 \-5、\-5 至 Aq-10、Aq-10 Aq-15、Aq-! 5 Aq-20、Aq-20 Aq-25、Aq-25 Aq-30、Aq-30
Aq-35、Aq-35 至
Aq-40、Aq-40 ^-q-45 Λ ^-q-45 ^-q-50 Λ ^-q-50 ^-q-55 Λ ^-q-55 ^-q-60 Λ ^-q-60 ^-q-65 Λ ^-q-65 ^-q-70 Λ ^-q-75 ^-q-80
的范圍內(nèi)開始。例如，在Aq_77結(jié)束的HAlC-端干區(qū)段將起始于H3血細(xì)胞凝集素的Gly200 ；和在Acrici結(jié)束的HAlC-端干區(qū)段將起始于H3血細(xì)胞凝集素的異亮氨酸262。在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的HAlC-端干區(qū)段起始于Aq+1、Aq+2、^q+3、Aq+4、Aq+5、Aq+6、Aq+7、Aq+8、Aq+9、Aq+10、Aq+11、Aq+12、Aq+13、Aq+14、Aq+15、Aq+16、Aq+17、Aq+18、Aq+19、Aq+20、Aq+21、Aq+22、\+23、Aq+24、\+25、Aq+26、\+27、Aq+28、^-q+29 Λ ^-q+30 ° 在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的HAlC-端干區(qū)段在Aq+1至AqfAf3至\+5、k的至Aq+8、Aq+8至Aq+10> Aq+10至Aq+15或Aq+15至Aq+2(l的范圍內(nèi)開始。HAlN-端干區(qū)段的末端應(yīng)當(dāng)結(jié)合HAlC-端干區(qū)段和流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽的起點(diǎn)進(jìn)行選擇使得所得嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽能夠形成與野生型流感血細(xì)胞凝集素類似的三維結(jié)構(gòu)。在這樣的實(shí)施方案中，流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽(其對所述流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的)在一級序列中位于流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽的N-端區(qū)段和C-端區(qū)段之間。
[0210]在一個(gè)實(shí)例中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的HAlN-端干區(qū)段可結(jié)束于血細(xì)胞凝集素氨基酸位置45-48(采用H3編號)中的任意一個(gè)，而所述嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的HAlC-端干區(qū)段可起始于血細(xì)胞凝集素氨基酸位置285-290 (米用H3編號)中的任意一個(gè)；和所述異源的頭結(jié)構(gòu)域可起始于氨基酸位置46-49中的任意一個(gè)且結(jié)束于氨基酸位置284-289(采用H3編號)中的任意一個(gè)。在另一個(gè)實(shí)例中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的HAlN-端干區(qū)段結(jié)束于血細(xì)胞凝集素氨基酸位置90 (采用H3編號)且所述嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的HAlC-端干區(qū)段起始于血細(xì)胞凝集素氨基酸位置200 (采用H3編號)；和所述異源的頭結(jié)構(gòu)域起始于氨基酸位置91且結(jié)束于氨基酸位置199 (采用H3編號)。
[0211]在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的N-端干區(qū)段的末尾是Alri，且本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是A,+在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的N-端干區(qū)段的末尾是Ap_2，且本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq_2。在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的N-端干區(qū)段的末尾是Ap_3，且本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq_3。在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的N-端干區(qū)段的末尾是V4,且本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Ar4。在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的N-端干區(qū)段的末尾是Ap_5，且本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq_5。在這樣的實(shí)施方案中，流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽(其對所述流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的)在一級序列中位于所述流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽的N-端區(qū)段和C-端區(qū)段之間。
[0212]在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的N-端干區(qū)段的末尾是Αρ+1，且本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq+1。在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的N-端干區(qū)段的末尾是Ap+2，且本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq+2。在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的N-端干區(qū)段的末尾是Ap+3，且本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq+3。在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的N-端干區(qū)段的末尾是Ap+4，且本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq+4。在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的N-端干區(qū)段的末尾是Ap+5，且本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq+5。在這樣的實(shí)施方案中，流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽(其對所述流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的)在一級序列中位于所述流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽的N-端區(qū)段和C-端區(qū)段之間。
[0213]在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的N-端干區(qū)段的末尾是Alri，且本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq+1。在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的N-端干區(qū)段的末尾是Ap_2，且本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq+2。在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的N-端干區(qū)段的末尾是Ap_3，且本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq+3。在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的N-端干區(qū)段的末尾是V4,且本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq+4。在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的N-端干區(qū)段的末尾是Ap_5，且本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq+5。在這樣的實(shí)施方案中，流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽(其對所述流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的)在一級序列中位于所述流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽的N-端區(qū)段和C-端區(qū)段之間。
[0214]在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的N-端干區(qū)段的末尾是Ap+1，且本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是A,+在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的N-端干區(qū)段的末尾是Ap+2，且本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq_2。在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的N-端干區(qū)段的末尾是Ap+3，且本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq_3。在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的N-端干區(qū)段的末尾是Ap+4，且本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Ar4。在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的N-端干區(qū)段的末尾是Ap+5，且本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq_5。在這樣的實(shí)施方案中，流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽(其對所述流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽來說是異源的)在一級序列中位于所述流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽的N-端區(qū)段和C-端區(qū)段之間。
[0215]本文也提供的是包含ΗΑ2亞單位和嵌合的HAl亞單位的嵌合的流感血細(xì)胞凝集素多肽。在某些實(shí)施方案中，所述嵌合的HAl亞單位包含第一種流感病毒毒株或亞型的HAl亞單位的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、60、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、75、75、76、77、78、79或80個(gè)氨基酸，而所述嵌合的HAl亞單位的剩余氨基酸是來自第二種流感病毒毒株或亞型。在某些實(shí)施方案中，所述嵌合的HAl亞單位包含第一種流感病毒毒株或亞型的HAl 亞單位的 1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90 或 90-100 個(gè)氨基酸，而所述嵌合的HAl亞單位的剩余氨基酸是來自第二種流感病毒毒株或亞型。在某些實(shí)施方案中，來自第一種流感病毒毒株或亞型的氨基酸可以是連續(xù)的，或者可以代表嵌合的HAl結(jié)構(gòu)域的N-端和/或C-端的某些部分。在多個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述嵌合的HAl亞單位包含流感病毒血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其包含流感病毒的兩種或兩種以上不同的亞型或毒株的氨基酸。在多個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述嵌合的HAl亞單位包含具有流感病毒的兩種或兩種以上不同的亞型或毒株的氨基酸的球狀頭。
[0216]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本文提供的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽可以根據(jù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知并且本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為是合適的任何技術(shù)(包括本文描述的技術(shù))來制備。在某些實(shí)施方案中，所述嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽是分離的。
[0217]5.2流感血■細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽
[0218]本文提供的是用于產(chǎn)生流感HA多肽(包括本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽。
[0219]一般而言，本文提供的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽是包含流感血細(xì)胞凝集素多肽的球狀頭結(jié)構(gòu)域或基本上由其組成的多肽。流感血細(xì)胞凝集素多肽的頭結(jié)構(gòu)域是為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的頭結(jié)構(gòu)域。
[0220]在某些實(shí)施方案中，本文提供的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽包含與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域具有至少70 %、75 %、80%、85%、90 %、95 %、96%、98%或99%氨基酸序列同一性的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域。
[0221]本文也提供的是包含來自流感病毒的兩種或兩種以上毒株或亞型的氨基酸的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽。在某些實(shí)施方案中，嵌合的HAl亞單位包含第一種流感病毒毒株或亞型的 HAl 亞單位的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、60、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、75、75、76、77、78、79或80個(gè)氨基酸，而所述嵌合的HAl亞單位的剩余氨基酸是來自第二種流感病毒毒株或亞型。在某些實(shí)施方案中，嵌合的HAl亞單位包含第一種流感病毒毒株或亞型的 HAl 亞單位的 1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100個(gè)氨基酸，而所述嵌合的HAl亞單位的剩余氨基酸是來自第二種流感病毒毒株或亞型。在某些實(shí)施方案中，來自第一種流感病毒毒株或亞型的氨基酸可以是連續(xù)的和/或可以代表嵌合的HAl結(jié)構(gòu)域的N-端和/或C-端的多個(gè)部分。
[0222]本文也提供的是包含缺失形式的已知流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中至多約 150、145、140、135、130、125、120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 I 個(gè)氨基酸殘基從頭結(jié)構(gòu)域中缺失。本文也提供的是包含缺失形式的已知流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中約1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140 或 140-150 個(gè)氨基酸殘基從頭結(jié)構(gòu)域中缺失。本文進(jìn)一步提供的是包含改變形式的已知流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述頭結(jié)構(gòu)域的至多約80、75、7065、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或I個(gè)氨基酸殘基用其它氨基酸取代(例如，保守取代)。本文也提供的是包含改變形式的已知流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述頭結(jié)構(gòu)域的至多約1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100個(gè)氨基酸殘基用其它氨基酸取代(例如，保守取代)。在某些實(shí)施方案中，至多50、60或更多個(gè)氨基酸從流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域的N-末端缺失(根據(jù)一級氨基酸序列評定的)和至多70、80或更多個(gè)氨基酸從流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域的C-末端缺失(根據(jù)一級氨基酸序列評定的)。
[0223]本文也提供的是包含與流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域締合的抗原性區(qū)域(例如，已知包含表位或由表位組成的頭結(jié)構(gòu)域的區(qū)域)中的一個(gè)或多個(gè)的缺失的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽(例如，抗原性位點(diǎn)A、B、C和D，其中所述頭結(jié)構(gòu)域是來自亞型H3 ;或抗原性位點(diǎn)Sa、Sb、Ca和Cb，其中所述頭結(jié)構(gòu)域是來自亞型Hl)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含一個(gè)抗原性區(qū)域(例如，已知包含表位或由表位組成的頭結(jié)構(gòu)域的一個(gè)區(qū)域)的缺失的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含兩個(gè)抗原性區(qū)域(例如，已知包含表位或由表位組成的頭結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)區(qū)域)的缺失的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含三個(gè)抗原性區(qū)域(例如，已知包含表位或由表位組成的頭結(jié)構(gòu)域的三個(gè)區(qū)域)的缺失的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含四個(gè)抗原性區(qū)域(例如，已知包含表位或由表位組成的頭結(jié)構(gòu)域的四個(gè)區(qū)域)的缺失的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含五個(gè)抗原性區(qū)域(例如，已知包含表位或由表位組成的頭結(jié)構(gòu)域的五個(gè)區(qū)域)的缺失的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定本領(lǐng)域已知的或使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和本文描述的技術(shù)后來鑒定的流感頭結(jié)構(gòu)域的抗原性區(qū)域(例如，表位)。
[0224]在某些實(shí)施方案中，本文描述的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽包含(i)來自與干結(jié)構(gòu)域同源的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽的一、二、三個(gè)或三個(gè)以上的抗原性區(qū)域(即，來源于相同的流感病毒毒株或亞型)和(ii)來自與干結(jié)構(gòu)域異源的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽的一、二、三個(gè)或三個(gè)以上的抗原性區(qū)域(即，來源于不同的流感病毒毒株或亞型)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述頭結(jié)構(gòu)域的C抗原性位點(diǎn)/區(qū)域與所述干結(jié)構(gòu)域同源(S卩，來源于相同的流感病毒毒株或亞型)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述頭結(jié)構(gòu)域的D抗原性位點(diǎn)/區(qū)域與所述干結(jié)構(gòu)域同源(即，來源于相同的流感病毒毒株或亞型)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述頭結(jié)構(gòu)域的C和D抗原性位點(diǎn)/區(qū)域與所述干結(jié)構(gòu)域同源(即，來源于相同的流感病毒毒株或亞型。在又一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述頭結(jié)構(gòu)域的Ca和/或Cb抗原性位點(diǎn)/區(qū)域與所述干結(jié)構(gòu)域同源(即，來源于相同的流感病毒毒株或亞型)。
[0225]本文也提供的是包含與流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域締合的抗原性區(qū)域(例如，已知包含表位或由表位組成的頭結(jié)構(gòu)域的區(qū)域)中的一個(gè)或多個(gè)被非抗原性多肽序列(例如，已知不誘導(dǎo)免疫應(yīng)答或已知產(chǎn)生對流感沒有特異性的免疫應(yīng)答的多肽序列)置換的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含一個(gè)抗原性區(qū)域(例如，已知包含表位或由表位組成的頭結(jié)構(gòu)域的一個(gè)區(qū)域)被非抗原性多肽序列(例如，已知不誘導(dǎo)免疫應(yīng)答或已知產(chǎn)生對流感沒有特異性的免疫應(yīng)答的多肽序列)置換的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含兩個(gè)抗原性區(qū)域(例如，已知包含表位或由表位組成的頭結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)區(qū)域)被非抗原性多肽序列(例如，已知不誘導(dǎo)免疫應(yīng)答或已知產(chǎn)生對流感沒有特異性的免疫應(yīng)答的多肽序列)置換的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含三個(gè)抗原性區(qū)域(例如，已知包含表位或由表位組成的頭結(jié)構(gòu)域的三個(gè)區(qū)域)被非抗原性多肽序列(例如，已知不誘導(dǎo)免疫應(yīng)答或已知產(chǎn)生對流感沒有特異性的免疫應(yīng)答的多肽序列)置換的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含四個(gè)抗原性區(qū)域(例如，已知包含表位或由表位組成的頭結(jié)構(gòu)域的四個(gè)區(qū)域)被非抗原性多肽序列(例如，已知不誘導(dǎo)免疫應(yīng)答或已知產(chǎn)生對流感沒有特異性的免疫應(yīng)答的多肽序列)置換的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含五個(gè)抗原性區(qū)域(例如，已知包含表位或由表位組成的頭結(jié)構(gòu)域的五個(gè)區(qū)域)被非抗原性多肽序列(例如，已知不誘導(dǎo)免疫應(yīng)答或已知產(chǎn)生對流感沒有特異性的免疫應(yīng)答的多肽序列)置換的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定本領(lǐng)域已知的或使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和本文描述的技術(shù)后來鑒定的流感頭結(jié)構(gòu)域的抗原性區(qū)域(例如，表位)。
[0226]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文提供的是包含一、二、三個(gè)或三個(gè)以上異源抗原性區(qū)域(即，來自不同流感病毒毒株或亞型(例如，對于全部或部分群體是原初的流感病毒毒株或亞型)的血細(xì)胞凝集素的一、二、三個(gè)或三個(gè)以上的抗原性區(qū)域)的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽的異源抗原性區(qū)域包含一個(gè)或多個(gè)非天然存在的糖基化位點(diǎn)，如下文在第5.4.2節(jié)中論述的。雖然不受任何具體操作理論的束縛，但是相信在干結(jié)構(gòu)域中的保守亞免疫優(yōu)勢抗原性區(qū)域的免疫原性將通過在所述流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域中的這些免疫優(yōu)勢區(qū)域中添加一個(gè)或多個(gè)非天然存在的糖基化位點(diǎn)而增加。在多個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽包含一、二、三個(gè)或三個(gè)以上的異源抗原性區(qū)域，其中所述異源抗原性區(qū)域包含一個(gè)或多個(gè)非天然存在的糖基化位點(diǎn)。
[0227]本文提供的流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽可基于技術(shù)人員已知的或后來發(fā)現(xiàn)的任何流感血細(xì)胞凝集素的頭結(jié)構(gòu)域(即，可具有序列同一性)。在某些實(shí)施方案中，流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽基于甲型流感血細(xì)胞凝集素的頭結(jié)構(gòu)域(例如，在下文第5.4節(jié)中描述的甲型流感病毒的血細(xì)胞凝集素的頭結(jié)構(gòu)域)。在某些實(shí)施方案中，所述流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽基于選自 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16和H17的甲型流感血細(xì)胞凝集素的頭結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽基于乙型流感血細(xì)胞凝集素的頭結(jié)構(gòu)域(例如，在下文第5.4節(jié)中描述的乙型流感病毒的血細(xì)胞凝集素的頭結(jié)構(gòu)域)。在有些實(shí)施方案中，所述流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽基于B/Seal/Netherlands/1/99的頭結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽基于選自H5、H6和/或H9組的甲型流感血細(xì)胞凝集素的頭結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述流感血細(xì)胞凝集素頭結(jié)構(gòu)域多肽基于選自H5、H7和/或H9組的甲型流感血細(xì)胞凝集素的頭結(jié)構(gòu)域。
[0228]5.3流感血■細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽
[0229]本文提供的是用于產(chǎn)生流感血細(xì)胞凝集素多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽。盡管不受任何具體操作理論的束縛，但是相信在本文提供的流感血細(xì)胞凝集素多肽(例如，嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽)的上下文中，所述流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽可用于將一個(gè)或多個(gè)相對保守的抗原性區(qū)域呈遞至宿主免疫系統(tǒng)以便產(chǎn)生能夠與多種流感毒株交叉反應(yīng)的免疫應(yīng)答。由于一個(gè)或多個(gè)抗原性區(qū)域在流感血細(xì)胞凝集素亞型間是十分保守的，因此這樣一種免疫應(yīng)答可能與全長流感血細(xì)胞凝集素多肽的若干亞型交叉反應(yīng)。
[0230]一般而言，本文提供的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽是包含流感血細(xì)胞凝集素多肽的干結(jié)構(gòu)域或基本上由其組成的多肽。流感血細(xì)胞凝集素多肽的干結(jié)構(gòu)域是為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的干結(jié)構(gòu)域。
[0231]在某些實(shí)施方案中，本文提供的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽很少包含或不包含流感血細(xì)胞凝集素多肽的球狀頭結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽是通過本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為合適的任何技術(shù)缺失其球狀頭結(jié)構(gòu)域的流感血細(xì)胞凝集素。
[0232]在某些實(shí)施方案中，本文描述的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽保留了在圖1中在流感血細(xì)胞凝集素多肽中標(biāo)識為Ap和Aq的半胱氨酸殘基。在某些實(shí)施方案中，本文描述的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽在低于野生型流感病毒的血細(xì)胞凝集素的pH(例如，pH小于 5.2、小于 5.1、小于 5.0 或小于 4.9，例如 4.8,4.7,4.6,4.5,4.4.、4.3,4.2,4.1,4.0、3.9、3.8等)下具有更高的穩(wěn)定性。在多個(gè)特別的實(shí)施方案中，本文描述的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽在低于野生型流感病毒的血細(xì)胞凝集素的PH下經(jīng)歷了從融合前構(gòu)象到融合構(gòu)象的構(gòu)象變化。在有些實(shí)施方案中，本文描述的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽包含在低pH(例如，介于4.9至5.2,4.5至3.5,3.5至2.5,2.5至1.5、1.5至0.5之間的pH)下增加多肽穩(wěn)定性的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，例如HA1H17Y(H3編號)。流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽的穩(wěn)定性可以采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)來評價(jià)，例如所述血細(xì)胞凝集素分子對胰蛋白酶消化的敏感性，如描述于例如Thoennes等人，2008，Virology370:403-414。
[0233]所述流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為合適的任何技術(shù)(包括以下描述的技術(shù))來制備。在某些實(shí)施方案中，所述干結(jié)構(gòu)域多肽是分離的。
[0234]在有些實(shí)施方案中，流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽的一級結(jié)構(gòu)按下列順序包含:HA1N-端干區(qū)段、接頭、HAlC-端干區(qū)段和HA2。在有些實(shí)施方案中，流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽的一級結(jié)構(gòu)按下列順序包含=HAlN-端干區(qū)段、接頭、HAlC-端短干區(qū)段和HA2。在有些實(shí)施方案中，流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽的一級結(jié)構(gòu)按下列順序包含:HAlN-端長干區(qū)段、接頭、HAlC-端長干區(qū)段和HA2。在有些實(shí)施方案中，所述流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽按下列順序包含=HAlN-端干區(qū)段、接頭、HAl中間干區(qū)段、第二接頭、HAlC-端干區(qū)段和HA2。
[0235]一級序列可以由單條多肽構(gòu)成，或者它可以由多條多肽構(gòu)成。典型地，單條多肽通過本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為合適的任何技術(shù)來表達(dá)。在單條多肽的多個(gè)實(shí)施方案中，所述HAl區(qū)段和所述HA2是呈三級締合。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的，單一 HA多肽可以被切割，例如在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)條件下被蛋白酶切割得到呈四級締合的兩條多肽。該切割典型地在所述HAlC-端干區(qū)段和所述HA2之間。在某些實(shí)施方案中，本文提供的是多條多肽，例如兩條多肽，流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域。在多條多肽的多個(gè)實(shí)施方案中，所述HAl區(qū)段和HA2是呈四級締合。
[0236]在某些實(shí)施方案中，本文提供的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽是單體的。在某些實(shí)施方案中，本文提供的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽是多聚體的。在某些實(shí)施方案中，本文提供的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽是三聚體的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，天然流感血細(xì)胞凝集素多肽能夠在體內(nèi)三聚化并且本文提供的某些流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽能夠三聚化。在以下描述的特別的實(shí)施方案中，本文提供的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽包含三聚化結(jié)構(gòu)域以促進(jìn)三聚化。
[0237]在某些實(shí)施方案中，流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽包含信號肽。典型地，信號肽在多肽表達(dá)和翻譯期間或之后被切除以產(chǎn)生成熟的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽。信號肽對于所述流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽的表達(dá)可能是有利的。在某些實(shí)施方案中，本文也提供的是缺少信號肽的成熟的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽。
[0238]流感血細(xì)胞凝集素HA2典型地包含干結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，本文提供的是包含HA2干結(jié)構(gòu)域、HA2胞腔結(jié)構(gòu)域、HA2跨膜結(jié)構(gòu)域和HA2細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽。這樣的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽可被表達(dá)為膜結(jié)合的抗原。在某些實(shí)施方案中，本文提供的是包含HA2干結(jié)構(gòu)域、HA2胞腔結(jié)構(gòu)域和HA2跨膜結(jié)構(gòu)域但缺少一些或全部的典型細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽。這樣的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽可被表達(dá)為膜結(jié)合的抗原。在某些實(shí)施方案中，本文提供的是包含HA2干結(jié)構(gòu)域和HA2胞腔結(jié)構(gòu)域但缺少HA2跨膜結(jié)構(gòu)域和HA2細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域二者的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽。這樣的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽可有利地被表達(dá)為可溶性多肽。在某些實(shí)施方案中，本文提供的是包含HA2干結(jié)構(gòu)域但缺少HA2胞腔結(jié)構(gòu)域、HA2跨膜結(jié)構(gòu)域和HA2細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽。這樣的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽可有利地被表達(dá)為可溶性多肽。在某些實(shí)施方案中，所述流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽包含與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的流感HA2干結(jié)構(gòu)域具有至少70 %、75%、80 %、85%、90 %、95%、96 %或98%氨基酸序列同一性的HA2干結(jié)構(gòu)域。來自已知的甲型流感和乙型流感血細(xì)胞凝集素的示例性的已知HA2干結(jié)構(gòu)域在下文的表中提供。
[0239]本文也提供的是包含缺失形式的HA2干結(jié)構(gòu)域的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽，其中至多 100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、
5、4、3、2或I個(gè)氨基酸殘基從HA2干結(jié)構(gòu)域的任一個(gè)或兩個(gè)末端缺失。本文進(jìn)一步提供的是包含改變形式的HA2干結(jié)構(gòu)域的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽，其中至多100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 I 個(gè)氨基酸殘基用其它氨基酸保守取代。進(jìn)一步提供的是包含缺失的和改變的HA2干結(jié)構(gòu)域的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽。在某些實(shí)施方案中，所述流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽包含包含一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)的HA2干結(jié)構(gòu)域，其中所述修飾的糖基化位點(diǎn)包含破壞聚糖附著到修飾的糖基化位點(diǎn)的能力的天然存在的糖基化位點(diǎn)的修飾，如描述于第5.4.1節(jié)，參見下文。雖然不受任何具體操作理論的束縛，但是相信在所述干結(jié)構(gòu)域里面的免疫原性和可及性(accessibility)抗原性區(qū)域可通過以在該位點(diǎn)破壞糖基化(即，聚糖的附著)的方式修飾所述干結(jié)構(gòu)域里面的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)而增加。
[0240]在有些實(shí)施方案中，流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽的一級結(jié)構(gòu)按下列順序包含:HA1N-端干區(qū)段、接頭、HAlC-端干區(qū)段和HA2。所述HAlN-端干區(qū)段可以是由本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本文提供的定義而認(rèn)識的任何HAlN-端干區(qū)段。典型地，HAlN-端干區(qū)段對應(yīng)于由成熟的HAl (即缺少信號肽的HAl)的N-端氨基酸直到位于HAl的序列中大約第52號殘基的半胱氨酸殘基組成的多肽。這個(gè)半胱氨酸殘基，在本文中稱SAp，一般能夠與HAl的C-端干區(qū)段中的半胱氨酸殘基形成二硫橋。在圖1中顯示了 16種代表性的甲型流感血細(xì)胞凝集素的序列，其中殘基Ap分別作了標(biāo)注。
[0241]在某些實(shí)施方案中，所述HAlN-端干區(qū)段不精確地結(jié)束于Ap(例如，來自H3血細(xì)胞凝集素的HAl亞單位的Cys52)，但是結(jié)束于在序列和結(jié)構(gòu)靠近Ap的殘基。例如，在某些實(shí)施方案中，所述HAlN-端干區(qū)段結(jié)束于A"、



Ap-2、Ap-3、Ap-4、Ap-5、Ap 一 6、Ap_7、Ap_8、Ap_9、Ap_10、Ar^1 x、Ap-12、Ap-! 3 λ Αρ_14λ Ap 一 15、Αρ_16λ Αρ_17λ Ap 一 18、Αρ_19λ Ap 一 20、Ap 一 21、Ap 一 22、Ap 一 23、Ap 一 23、Ap 一 24、Ap 一 25、Ap 一 26、Ap 一 27、Αρ—28、ΑΡ—29、ΑΡ—3。。在某些實(shí)施方案中，本文描述的流感血細(xì)胞凝集素多肽的HAlN-端干區(qū)段^ Ap-1 S Αρ—3、_Αρ—3 M Αρ_5Λ Αρ_5 M Αρ_8 Λ Αρ_8 M Αρ_10Λ Αρ_10 S Αρ—15、Αρ—15 至 Αρ—20、Αρ—20 至
Αρ—30、Αρ—30
至Αρ_4(ι的范圍內(nèi)結(jié)束。在其它的實(shí)施方案中，所述HAlN-端干區(qū)段結(jié)束于Αρ+1、Αρ+2、Αρ+3、Ap+4、Ap+5 > Ap+6 > Ap+7 > Ap+8 > Ap+9> Ap+10> Ap+11、Ap+12> Ap+13> Ap+14> Ap+15> Ap+16> Ap+17> Ap+18> Ap+19> Ap+20> Ap+21>
Ap+22、Ap+23、Ap+24 > Ap+25 > Ap+26> Ap+27 > Ap+28 > Ap+29> Ap+30 > Ap+31 > Ap+32 > Ap+33 > Ap+34 > Ap+35> Ap+36 > Ap+37 > Ap+38 >
Ap+39、Ap+4(i。在某些實(shí)施方案中，本文描述的流感血細(xì)胞凝集素多肽的HAlN-端干區(qū)段在Αρ+ι
Ap+5、^p+5 Ap+1、Αρ+ι。Ap+i5、^p+15 ^ρ+20Λ +2 O Αρ+25、^ρ+2^ ^ρ+30Λ ^ρ+30 ^ρ+35 Λ ^ρ+35
AP+4Q或Αρ+4(ι至Αρ+5(ι的范圍內(nèi)結(jié)束。HAlN-端干區(qū)段的末端應(yīng)當(dāng)結(jié)合所述HAlC-端干區(qū)段的末端和所述接頭進(jìn)行選擇使得所得的連接的HAl干結(jié)構(gòu)域能夠形成如下所述與流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域類似的三維結(jié)構(gòu)。
[0242]在某些實(shí)施方案中，所述流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽包含與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的流感HAlN-端干區(qū)段具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%或98%氨基酸序列同一性的HAlN-端干區(qū)段。示例性的已知HAlN-端干區(qū)段在下文的表中提供。
[0243]本文也提供的是包含缺失形式的HAlN-端干區(qū)段的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽，其中至多 100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、
6、5、4、3、2或I個(gè)氨基酸殘基從所述HAlN-端干區(qū)段的任一個(gè)或兩個(gè)末端缺失。本文也提供的是包含缺失形式的已知流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽，其中約 1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100 個(gè)氨基酸殘基從所述干結(jié)構(gòu)域中缺失。在某些實(shí)施方案中，本文提供的是包含擴(kuò)展形式的HAlN-端干區(qū)段的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)或更多個(gè)殘基被添加到所述HAlN-端干區(qū)段的C-末端；這些添加的殘基可來源于與HAlN-端干區(qū)段毗鄰的球狀頭結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。本文進(jìn)一步提供的是包含改變形式的HAlN-端干區(qū)段的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽，其中至多80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或I個(gè)氨基酸殘基用其它氨基酸保守取代。本文也提供的是包含改變形式的已知流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述干結(jié)構(gòu)域的至多約 1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90 或 90-100 個(gè)氨基酸殘基用其它氨基酸取代(例如，保守取代)。進(jìn)一步提供的是包含缺失的和改變的HAlN-端干區(qū)段的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽。在某些實(shí)施方案中，至多50、60或更多個(gè)氨基酸從流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域的N-末端缺失(根據(jù)一級氨基酸序列評定的)和至多70、80或更多個(gè)氨基酸從流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域的C-末端缺失(根據(jù)一級氨基酸序列評定的)。
[0244]所述HAlC-端干區(qū)段可以是由本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本文提供的定義而認(rèn)識的任何HAlC-端干區(qū)段。典型地，HAlC-端干區(qū)段對應(yīng)于由位于HAl的序列中大約第277號殘基(采用H3編號)的半胱氨酸殘基直到HAl的C-端氨基酸組成的多肽。這個(gè)半胱氨酸殘基，在本文中稱為Aq，一般能夠與HAl的N-端干區(qū)段中的半胱氨酸殘基Ap形成二硫橋。在圖1中顯示了 17種代表性的甲型流感血細(xì)胞凝集素的序列，其中殘基Aq分別作了標(biāo)注。
[0245]在某些實(shí)施方案中，所述HAlC-端干區(qū)段不起始于Aq (例如，來自H3血細(xì)胞凝集素的HAl亞單位的Cys277)，而是起始于在序列和結(jié)構(gòu)靠近Aq的殘基。例如，在某些實(shí)施方案中，所述 HAlC- ?而干區(qū)段起$口于約 Atrl'Atr2、Atr3、Atr4、Atr5、Atr6、Atr7、AtJfAtr9、Atrltl、Atrl丨、Atrl2、Aq-13、Aq-14、Atrl5、Aq_2o、\-25、^q-30、^q-35、^q-40、\_45、^q-50、Aq-55、Aq_g0、Aq_g5、Aq_70、Aq_75 5? Aq_g0。
某些實(shí)施方案中，所述HAlC-端干區(qū)段在Atrl至Aq_5、Ar5至Α,_1(ι、Atrltl至Aq_15、Atrl5至Aq_2。、
Aq-20 Aq-25、Aq-25 Aq-30、Aq-30 Aq-35、Aq-35 S Aq—40、Aq_40 S Aq-45、Aq-45 Aq-50、Aq-50
Aq—55、
Aq—55 Aq—60、Aq—60 Aq-65、Aq-65 Aq—70、Aq—75 至Atr8ci的范圍內(nèi)開始。在其它的實(shí)施方案中，所述 HAlC-端干區(qū)段起始于 Aq+1、Aq+2、Aq+3、Aq+4、Aq+5、Aq+6、Aq+7、Aq+8、Aq+9 或 Aq+1(l。在某些實(shí)施方案中，本文描述的流感血細(xì)胞凝集素多肽的HAlC-端干區(qū)段在Aq+1至Aq+3、Aq+3至AfpAf5至Aq+8> Aq+8至Aq+1(l、Aq+10至Aq+15或Aq+15至Aq+2(l的范圍內(nèi)開始。HAlN-端干區(qū)段的末端應(yīng)當(dāng)結(jié)合所述HAlC-端干區(qū)段的起點(diǎn)和所述接頭進(jìn)行選擇使得所得的HAl干結(jié)構(gòu)域能夠形成如下所述與流感血細(xì)胞凝集素類似的三維結(jié)構(gòu)。
[0246]在某些實(shí)施方案中，所述流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽包含與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的流感HAlC-端干區(qū)段具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%或98%氨基酸序列同一性的HAlC-端干區(qū)段。示例性的已知HAlC-端干區(qū)段在下文的表中提供。
[0247]在某些實(shí)施方案中，所述N-端干區(qū)段的末尾是Alri，且所述C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是A,+在某些實(shí)施方案中，所述N-端干區(qū)段的末尾是Ap_2，且所述C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq_2。在某些實(shí)施方案中，所述N-端干區(qū)段的末尾是Ap_3，且所述C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Atr3t5在某些實(shí)施方案中，所述N-端干區(qū)段的末尾是Ap_4，且所述C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Atr4t5在某些實(shí)施方案中，所述N-端干區(qū)段的末尾是Ap_5，且所述C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Ar50
[0248]在某些實(shí)施方案中，所述N-端干區(qū)段的末尾是Ap+1，且所述C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq+1。在某些實(shí)施方案中，所述N-端干區(qū)段的末尾是Ap+2，且所述C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq+2。在某些實(shí)施方案中，所述N-端干區(qū)段的末尾是Ap+3，且所述C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq+3。在某些實(shí)施方案中，所述N-端干區(qū)段的末尾是Ap+4，且所述C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq+4。在某些實(shí)施方案中，所述N-端干區(qū)段的末尾是Ap+5，且所述C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq+5。
[0249]在某些實(shí)施方案中，所述N-端干區(qū)段的末尾是Alri，且所述C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq+1。在某些實(shí)施方案中，所述N-端干區(qū)段的末尾是Ap_2，且所述C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq+2。在某些實(shí)施方案中，所述N-端干區(qū)段的末尾是Ap_3，且所述C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq+3。在某些實(shí)施方案中，所述N-端干區(qū)段的末尾是Ap_4，且所述C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq+4。在某些實(shí)施方案中，所述N-端干區(qū)段的末尾是Ap_5，且所述C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq+5。
[0250]在某些實(shí)施方案中，所述N-端干區(qū)段的末尾是Ap+1，且所述C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是A,+在某些實(shí)施方案中，所述N-端干區(qū)段的末尾是Ap+2，且所述C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Aq_2。在某些實(shí)施方案中，所述N-端干區(qū)段的末尾是Ap+3，且所述C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Atr3t5在某些實(shí)施方案中，所述N-端干區(qū)段的末尾是Ap+4，且所述C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Atr4t5在某些實(shí)施方案中，所述N-端干區(qū)段的末尾是Ap+5，且所述C-端干區(qū)段的起點(diǎn)是Ar50
[0251]本文也提供的是包含缺失形式的HAlC-端干區(qū)段的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽，其中至多 100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、
6、5、4、3、2或I個(gè)氨基酸殘基從所述HAlC-端干區(qū)段的任一個(gè)或兩個(gè)末端缺失。本文也提供的是包含缺失形式的已知流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽，其中約 1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90 或 90-100 個(gè)氨基酸殘基從所述干結(jié)構(gòu)域中缺失。在某些實(shí)施方案中，本文提供的是包含擴(kuò)展形式的HAlC-端干區(qū)段的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)或更多個(gè)殘基被添加到所述HAlC-端干區(qū)段的N-末端；這些添加的殘基可來源于與HAlC-端干區(qū)段毗鄰的球狀頭結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。在多個(gè)特別的實(shí)施方案中，如果一個(gè)殘基被添加到所述C-端干區(qū)段，那么一個(gè)殘基被添加到所述N-端干區(qū)段；如果兩個(gè)殘基被添加到所述C-端干區(qū)段，那么兩個(gè)殘基被添加到所述N-端干區(qū)段；如果三個(gè)殘基被添加到所述C-端干區(qū)段，那么三個(gè)殘基被添加到所述N-端干區(qū)段。本文進(jìn)一步提供的是包含改變形式的HAlC-端干區(qū)段的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽，其中至多約80、75、7065、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或I個(gè)氨基酸殘基用其它氨基酸保守取代。本文也提供的是包含改變形式的HAlC-端干區(qū)段的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述HAlC-端干區(qū)段的至多約 1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90 或 90-100 個(gè)氨基酸殘基用其它氨基酸取代(例如，保守取代)。進(jìn)一步提供的是包含缺失的和改變的HAlC-端干區(qū)段的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽。在某些實(shí)施方案中，所述C-端干區(qū)段包含或多個(gè)(or more)修飾的糖基化位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中,所述N-端干區(qū)段包含或多個(gè)(or more)修飾的糖基化位點(diǎn)。在其它的實(shí)施方案中，所述C-端干區(qū)段和N-端干區(qū)段包含一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)。
[0252]在某些實(shí)施方案中，本文提供的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽包含HAl亞單位的干結(jié)構(gòu)域的嵌合體/雜合體。HAl亞單位的干結(jié)構(gòu)域的嵌合體可包含第一種流感病毒毒株或亞型的 HAl 亞單位的干結(jié)構(gòu)域的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、60、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、75、75、76、77、78、79或80個(gè)氨基酸，而所述HAl亞單位的干結(jié)構(gòu)域的嵌合體的剩余氨基酸可來自第二種流感病毒毒株或亞型。在某些實(shí)施方案中，所述HAl亞單位的干結(jié)構(gòu)域的嵌合體包含第一種流感病毒毒株或亞型的HAl亞單位的干結(jié)構(gòu)域的1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90 或 90-100 個(gè)氨基酸，而所述 HAl 亞單位的干結(jié)構(gòu)域的嵌合體的剩余氨基酸是來自第二種流感病毒毒株或亞型。在某些實(shí)施方案中，本文提供的流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽包含HA2亞單位和HAl亞單位的干結(jié)構(gòu)域的嵌合體。在某些實(shí)施方案中，所述流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽包含HAl亞單位的干結(jié)構(gòu)域的嵌合體/雜合體，其中一個(gè)或多個(gè)天然存在的糖基化位點(diǎn)已被修飾使得該修飾破壞聚糖附著到所述修飾的糖基化位點(diǎn)的能力，如描述于第5.4.1節(jié)，參見下文。雖然不受任何具體操作理論的束縛，但是相信在所述干結(jié)構(gòu)域里面的免疫原性和可及性抗原性區(qū)域可通過以在該位點(diǎn)破壞糖基化(即，聚糖的附著)的方式修飾所述干結(jié)構(gòu)域里面的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)而增加。
[0253]所述流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽可基于技術(shù)人員已知的或后來發(fā)現(xiàn)的任何流感血細(xì)胞凝集素(即，可具有序列同一性，如上所述)。在某些實(shí)施方案中，流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽基于甲型流感血細(xì)胞凝集素。在某些實(shí)施方案中，所述流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽基于選自 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16和H17的甲型流感血細(xì)胞凝集素。在某些實(shí)施方案中，流感血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域多肽基于乙型流感血細(xì)胞凝集素，如下文詳細(xì)描述的。
[0254]所述HAlN-端干區(qū)段可基于技術(shù)人員已知的或后來發(fā)現(xiàn)的任何HAlN-端干區(qū)段(即，可具有序列同一性，如上所述)。在某些實(shí)施方案中，所述HAlN-端干區(qū)段基于甲型流感HAlN-端干區(qū)段。在某些實(shí)施方案中，所述HAlN-端干區(qū)段基于選自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 和 H17 的甲型流感血細(xì)胞凝集素。在某些實(shí)施方案中，所述HAlN-端干區(qū)段選自SEQ ID N0S:34-490在某些實(shí)施方案中，所述HAlN-端干區(qū)段選自SEQ ID N0S: 34-49，各自具有一個(gè)氨基酸從其C-末端缺失。在某些實(shí)施方案中，所述HAlN-端干區(qū)段選自SEQ ID NOS: 34-49，各自具有兩個(gè)氨基酸從其C-末端缺失。在某些實(shí)施方案中，所述HAlN-端干區(qū)段選自SEQ ID N0S: 34-49，各自具有三個(gè)氨基酸從其C-末端缺失。在某些實(shí)施方案中，所述HAlN-端干區(qū)段選自SEQ ID NOS:34-49,各自具有四個(gè)氨基酸從其C-末端缺失。在某些實(shí)施方案中，所述HAlN-端干區(qū)段選自SEQID N0S: 34-49，各自具有五個(gè)氨基酸從其C-末端缺失。在某些實(shí)施方案中，所述HAlN-端干區(qū)段選自SEQ ID N0S:177-224。在某些實(shí)施方案中，所述HAlN-端干區(qū)段是或基于AnnArbor/6/60> A/Puerto Rico/8/34 或 A/Perth/16/2009 流感病毒的 HA-1N-端干區(qū)段。
[0255]所述HAlC-端干區(qū)段可基于技術(shù)人員已知的或后來發(fā)現(xiàn)的任何HAlC-端干區(qū)段(即，可具有序列同一性，如上所述)。在某些實(shí)施方案中，所述HAlC-端干區(qū)段基于甲型流感HAlC-端干區(qū)段。在某些實(shí)施方案中，所述HAlC-端干區(qū)段基于選自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 和 H17 的甲型流感血細(xì)胞凝集素。在某些實(shí)施方案中，所述HAlC-端干區(qū)段選自SEQ ID NOS:50-650在某些實(shí)施方案中，所述HAlC-端干區(qū)段選自SEQ ID N0S: 50-65，各自具有一個(gè)氨基酸從其N-末端缺失。在某些實(shí)施方案中，所述HAlC-端干區(qū)段選自SEQ ID N0S: 50-65，各自具有兩個(gè)氨基酸從其N-末端缺失。在某些實(shí)施方案中，所述HAlC-端干區(qū)段選自SEQ ID N0S: 50-65，各自具有三個(gè)氨基酸從其N-末端缺失。在某些實(shí)施方案中，所述HAlC-端干區(qū)段選自SEQ ID NOS:50-65,各自具有四個(gè)氨基酸從其N-末端缺失。在某些實(shí)施方案中，所述HAlC-端干區(qū)段選自SEQID N0S: 50-65，各自具有五個(gè)氨基酸從其N-末端缺失。在某些實(shí)施方案中，所述HAlC-端干區(qū)段選自SEQ ID N0S:226-2730在某些實(shí)施方案中，所述HAlC-端干區(qū)段是或基于AnnArbor/6/60> A/Puerto Rico/8/34 或 A/Perth/16/2009 流感病毒的 HA-1N-端干區(qū)段。
[0256]所述HA2干結(jié)構(gòu)域可基于技術(shù)人員已知的或后來發(fā)現(xiàn)的任何HA2干結(jié)構(gòu)域(即，可具有序列同一性，如上所述)。在某些實(shí)施方案中，所述HA2干結(jié)構(gòu)域基于甲型流感HA2干結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述HA2干結(jié)構(gòu)域基于選自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16和H17的甲型流感血細(xì)胞凝集素。在某些實(shí)施方案中，所述HA2干結(jié)構(gòu)域選自SEQ ID N0S:66-970在某些實(shí)施方案中，所述HA2干結(jié)構(gòu)域是或基于 A/Ann Arbor/6/60-1 ike>A/Puerto Rico/8/1934-1 ike>A/Perth/16/2009-1 ike>A/Cali fornia/07/2009-1 ike > A/Brisbane/59/07-1 ike > A/New Cal edoni a/20/1999-1 ike 或A/Victoria/361/201-like流感病毒的HA干結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述HA2干結(jié)構(gòu)域是或基于后來發(fā)現(xiàn)的HA2干結(jié)構(gòu)域。
[0257]在某些實(shí)施方案中，所述HA2干結(jié)構(gòu)域是來自與所述HAl亞單位的干結(jié)構(gòu)域相同的流感病毒毒株或亞型。
[0258]在包含信號肽的多個(gè)實(shí)施方案中，所述信號肽可基于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何流感病毒信號肽。在某些實(shí)施方案中，所述信號肽基于甲型流感信號肽。在某些實(shí)施方案中，所述信號肽基于選自 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 和H16的甲型流感血細(xì)胞凝集素。在某些實(shí)施方案中，所述信號肽可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為有用的任何信號肽。在某些實(shí)施方案中，所述信號肽選自SEQ ID N0S: 18-33。
[0259]在包含胞腔結(jié)構(gòu)域的多個(gè)實(shí)施方案中，所述胞腔結(jié)構(gòu)域可基于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何流感胞腔結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述胞腔結(jié)構(gòu)域基于甲型流感胞腔結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述HA2胞腔結(jié)構(gòu)域基于選自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16和H17的甲型流感血細(xì)胞凝集素。在某些實(shí)施方案中，所述胞腔結(jié)構(gòu)域可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為有用的任何胞腔結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述胞腔結(jié)構(gòu)域選自SEQ ID N0S:98-113。在某些實(shí)施方案中，所述胞腔結(jié)構(gòu)域是來自與所述HA2亞單位的干結(jié)構(gòu)域相同的流感病毒毒株或亞型。
[0260]在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞腔結(jié)構(gòu)域是來自與所述HA2亞單位的干結(jié)構(gòu)域相同的流感病毒毒株或亞型。在其它的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域是來自與所述HA2亞單位的干結(jié)構(gòu)域相同的流感病毒毒株或亞型。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和胞腔結(jié)構(gòu)域是來自與所述HA2亞單位的干結(jié)構(gòu)域相同的流感病毒毒株或亞型。
[0261]在包含跨膜結(jié)構(gòu)域的多個(gè)實(shí)施方案中，所述跨膜結(jié)構(gòu)域可基于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何流感跨膜結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述跨膜結(jié)構(gòu)域基于甲型流感跨膜結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述HA2跨膜結(jié)構(gòu)域基于選自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16和H17的甲型流感血細(xì)胞凝集素。在某些實(shí)施方案中，所述跨膜結(jié)構(gòu)域可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為有用的任何跨膜結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述跨膜結(jié)構(gòu)域選自SEQ ID NOS: 114-129。在某些實(shí)施方案中，所述跨膜結(jié)構(gòu)域是來自與所述HA2亞單位的干結(jié)構(gòu)域相同的流感病毒毒株或亞型。
[0262]在包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的多個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域可基于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何流感細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域基于甲型流感細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述HA2細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域基于選自Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16和H17的甲型流感血細(xì)胞凝集素。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為有用的任何細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域選自SEQ ID N0S: 130-145。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域是來自與所述HA2亞單位的干結(jié)構(gòu)域相同的流感病毒毒株或亞型。
[0263]在某些實(shí)施方案中，所述血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域的糖基化位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)被修飾(例如，通過氨基酸添加、缺失或取代)使得這些位點(diǎn)上的糖基化在多肽的加工和成熟期間將不會(huì)發(fā)生。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，流感HA典型地包含一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)(例如Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys，其中Xaa是任意氨基酸，或者，在某些實(shí)施方案中，其中Xaa是Pro除外的任意氨基酸)。在某些實(shí)施方案中，糖基化位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基用破壞所述糖基化位點(diǎn)的氨基酸殘基保守取代。在某些實(shí)施方案中，糖基化位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基用破壞所述糖基化位點(diǎn)的任意氨基酸殘基取代。在某些實(shí)施方案中，糖基化序列中的一個(gè)或多個(gè)天冬酰胺殘基用丙氨酸取代。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，H3血細(xì)胞凝集素的位置38的天冬酰胺被改變成丙氨酸。在某些實(shí)施方案中，所述血細(xì)胞凝集素干結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)，如在下文第5.4.1節(jié)所論述的。
[0264]下面的表I標(biāo)識了甲型流感血細(xì)胞凝集素多肽的信號肽、HAlN-端干區(qū)段、HAlC-端干區(qū)段和HA2結(jié)構(gòu)域。這些信號肽、干區(qū)段和結(jié)構(gòu)域均可用于本文描述的多肽和方法中。
[0265]表1.示例性的甲型流感血細(xì)胞凝集素序列
[0266] HA亞型信號肽 HAl N-端千& HAI C-端干U HA2結(jié)構(gòu)域
(Genbank段段
N0.) 1--
PR8-HINI 1 L V L [ -S T DT '.[)丁' ■ [ - ^.入 INSS 1-P YQ'.1TGMIDGW YG Y H H Q
—CALAAKNVTVTHSVNHPVT1GECPKYNEQGSGYAADQKST |
(EF467821.1) ADALLEDSHNGKLVRSAKLRMVTQNA1NGITNKVNTV1 |
『SEO IDCGLRNNPSIQSR—EKMNIQFTAVGKEF I
NO: 18] I [SEQ ID NO:34] [SEQIDNOiSO] NKLEKRMENLNKK |


VDDGFLDIWTYNAE I


LLVLLENERTLDFH I



1.)SNVKN1.\'liKVKSQ




?.ΚΝΝ.\ΚΙ；Ι(.；Ν(.?(:? I；




? VIiK( l:)NI；( M1-SVR




N(.s I VDVPK^'S1.l-SK




f.MU'.KV 丨)(iVKl.l:S
Al YSTVAS


SLVLLVSLGAISFW I



MC SNGSLQCKICl


[SEQ ID NO:66] |
[0267] HA亞璧信號政 HAl N-端千g HAl C-端千K HA2結(jié)構(gòu)域
(Gen bank?段
N0.)
H2MAIIY DQICIGYHSNN^ ^CETKCQTPLGGLFGAIAGFiEGGW
L1|136) LlLLFT STEKVDTILER A1NTTLPFHNV QGM1DGWYGYHHS‘1.' !A\.RG \\'T\-THAQ\i HIiLT iGECPKY M)QGSGYAADKEST
rSEO ID LEKTHNGKLC VKSERLVLAT QKA1DGITNRVNSVI
NO; 19] [SEQIDNO:35] GLRN WQ 丨 ESR EKMNTQFEAVGKEF


[SEQ ID NO-51] SNLEKRLENLNKKM


EDGFLDVWTYNAE


LLVLMENERTLDFH


DSWKN L'iDRXRM


QLRDNAKELGNGCF


EFYHKCDDECMNS


VKNGTYDYPKYEEE


SKLNRNEIKGVKLS


NMGVYQIL AIYATV


AGSLSLAiMIAGiSL


WMCSNGSLQCRICI



[SEQ ID NO:67]
HMKTII QDLPGNDNSTCISECITPNGSIGLFGAIAGFIENGW
HK68-H3N2 ALSYlF ATLCLGHHAV PNDKPFQNVN EGM1DGWYGFRHQ"— CLALG PNGTL VKTITD KITYGACPKY N SEGTGQ AADLKST(EF409245)1Q DQIEVTNATEL VKQNTLKLAT QAAl DQINGK LN RVI
PDB ■ !HGJ Lo-201 vQssstgkic GMRN YPEKQT EKTNEKFHQIEKEFS
■ [SEQIDNO:36] REVEGR1QDLEKYVE

[SEQIDNO:52] DTKIDLWSYNAELL


VALENQHTIDLTDS


EMNKLFEKTRRQLR


ENAEDMGNGCFKIY


HKCDNACIESIRNGT


YDHDVYRDEALNN


RFQIKGVELKSGYK


DWILWISFAISCFLL


CVVLLGFIMWACQR


GNIRCNICI



[SEQ ID NO;68]
[0268]
【權(quán)利要求】
1.嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽，包含HA干結(jié)構(gòu)域和HA球狀頭結(jié)構(gòu)域，其中所述HA球狀頭結(jié)構(gòu)域?qū)λ鯤A干結(jié)構(gòu)域是異源的。
2.嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽，包含季節(jié)性流感病毒毒株的HA干結(jié)構(gòu)域和異源流感病毒毒株的HA球狀頭結(jié)構(gòu)域。
3.權(quán)利要求1或2的嵌合的流感病毒HA多肽，其中所述HA干結(jié)構(gòu)域維持在圖1中命名為Ap和Aq的半胱氨酸殘基。
4.權(quán)利要求1或2的嵌合的流感病毒HA多肽，其中所述HA干結(jié)構(gòu)域是亞型Hl的流感病毒的HA干結(jié)構(gòu)域。
5.權(quán)利要求1或2的嵌合的流感病毒HA多肽，其中所述HA干結(jié)構(gòu)域是亞型H3的流感病毒的HA干結(jié)構(gòu)域。
6.權(quán)利要求4的嵌合的流感病毒HA多肽，其中所述HA球狀頭結(jié)構(gòu)域是亞型H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hl1、H12、H13、H14、H15、H16 或 H17 的流感病毒的 HA 球狀頭結(jié)構(gòu)域。
7.權(quán)利要求5的嵌合的流感病毒HA多肽，其中所述HA球狀頭結(jié)構(gòu)域是亞型H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 或 H17 的流感病毒的 HA 球狀頭結(jié)構(gòu)域。
8.權(quán)利要求6的嵌合的流感病毒HA多肽，其中所述HA球狀頭結(jié)構(gòu)域是亞型H5、H6、H8、H9、Hll、H12、H13或H16的流感病毒的HA球狀頭結(jié)構(gòu)域。
9.權(quán)利要求7的嵌合的流感病毒HA多肽，其中所述HA球狀頭結(jié)構(gòu)域是亞型H4、H7、H10、H14或H15的流感病毒的HA球狀頭結(jié)構(gòu)域。
10.核酸，其編碼權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的多肽。
11.細(xì)胞，其表達(dá)權(quán)利要求10的核酸。
12.病毒，其包含經(jīng)工程改造以表達(dá)權(quán)利要求10的核酸的基因組。
13.病毒，其包含權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的多肽。
14.權(quán)利要求12的病毒，其中所述病毒是流感病毒。
15.權(quán)利要求13的病毒，其中所述病毒是流感病毒。
16.權(quán)利要求14的病毒，它是滅活的或裂解的。
17.權(quán)利要求15的病毒，它是滅活的或裂解的。
18.病毒樣顆粒，包含權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的多肽。
19.免疫原性組合物，包含權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的多肽。
20.免疫原性組合物，包含權(quán)利要求12的病毒。
21.免疫原性組合物，包含權(quán)利要求13的病毒。
22.免疫原性組合物，包含權(quán)利要求14的病毒。
23.免疫原性組合物，包含權(quán)利要求15的病毒。
24.免疫原性組合物，包含權(quán)利要求18的病毒樣顆粒。
25.給對象實(shí)施免疫的方法，包括給予所述對象有效量的權(quán)利要求19的免疫原性組合物。
26.給對象實(shí)施免疫的方法，包括給予所述對象有效量的權(quán)利要求20的免疫原性組合物。
27.給對象實(shí)施免疫的方法，包括給予所述對象有效量的權(quán)利要求21的免疫原性組合物。
28.給對象實(shí)施免疫的方法，包括給予所述對象有效量的權(quán)利要求22的免疫原性組合物。
29.給對象實(shí)施免疫的方法，包括給予所述對象有效量的權(quán)利要求23的免疫原性組合物。
30.給對象實(shí)施免疫的方法，包括給予所述對象有效量的權(quán)利要求24的免疫原性組合物。
31.權(quán)利要求25的方法，其中所述對象是人。
32.權(quán)利要求26的方法，其中所述對象是人。
33.權(quán)利要求27的方法，其中所述對象是人。
34.權(quán)利要求28的方法，其中所述對象是人。
35.權(quán)利要求29的方法，其中所述對象是人。
36.權(quán)利要求30的方法，其中所述對象是人。
37.權(quán)利要求25的方法，其中所述免疫原性組合物經(jīng)肌內(nèi)或鼻內(nèi)給予所述對象。
38.預(yù)防流感病毒疾病的方法，包括給予對象有效量的權(quán)利要求25的免疫原性組合物。
39.治療流感病毒感染或流感病毒疾病的方法，包括給予對象有效量的權(quán)利要求25的免疫原性組合物。
40.預(yù)防流感病毒疾病的方法，包括給予對象有效量的權(quán)利要求25的免疫原性組合物。
41.預(yù)防流感病毒疾病的方法，包括給予對象有效量的權(quán)利要求25的免疫原性組合物。
42.權(quán)利要求26的方法，其中所述免疫原性組合物經(jīng)肌內(nèi)或鼻內(nèi)給予所述對象。
43.預(yù)防流感病毒疾病的方法，包括給予對象有效量的權(quán)利要求26的免疫原性組合物。
44.治療流感病毒感染或流感病毒疾病的方法，包括給予對象有效量的權(quán)利要求26的免疫原性組合物。
45.預(yù)防流感病毒疾病的方法，包括給予對象有效量的權(quán)利要求26的免疫原性組合物。
46.預(yù)防流感病毒疾病的方法，包括給予對象有效量的權(quán)利要求26的免疫原性組合物。
47.預(yù)防對象的流感病毒疾病或感染的方法，包括給予所述對象流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽，該對象對于所述多肽來說是原初的。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽是來自亞型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 和 / 或 H17 的流感病毒。
49.權(quán)利要求48的方法，包括給予所述對象第二種流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽，該對象對于所述多肽來說是原初的，其中所述第二種流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽是來自亞型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16 和 / 或 H17 的流感病毒，和其中第一次和第二次給藥的所述流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽是來自不同的流感病毒亞型。
50.權(quán)利要求49的方法，包括給予所述對象第三種流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽，該對象對于所述多肽來說是原初的，其中所述第三種流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽是來自亞型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 和 / 或 H17 的流感病毒，和其中第一次、第二次和第三次給藥的所述流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽是來自不同的流感病毒亞型。
51.預(yù)防對象的流感病毒疾病或感染的方法，包括給予所述對象流感病毒，其中所述流感病毒包含血細(xì)胞凝集素多肽，該對象對于所述多肽來說是原初的。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽是來自亞型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 和 / 或 H17 的流感病毒。
53.權(quán)利要求52的方法，包括給予所述對象第二種流感病毒，其中所述第二種流感病毒包含血細(xì)胞凝集素多肽，該對象對于所述多肽來說是原初的；其中所述第二種流感病毒的所述血細(xì)胞凝集素多肽是來自亞型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、HlU H12、H13、H14、H15、H16和/或H17的流感病毒；和其中第一次和第二次給藥的所述流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽是來自不同的流感病毒亞型。
54.權(quán)利要求53的方法，包括給予所述對象第三種流感病毒，其中所述第三種流感病毒包含血細(xì)胞凝集素多肽，該對象對于所述多肽來說是原初的；其中所述第三種流感病毒的血細(xì)胞凝集素多肽是來自亞型 H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16和/或H17的流感病毒；和其中第一次、第二次和第三次給藥的所述流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽是來自不同的流感病毒亞型。
55.嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽，包含HA干結(jié)構(gòu)域和HA球狀頭結(jié)構(gòu)域，其中所述HA球狀頭結(jié)構(gòu)域?qū)λ鯤A干結(jié)構(gòu)域是異源的，其中所述HA干結(jié)構(gòu)域包含至少一個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)，其中所述修飾的糖基化位點(diǎn)包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位點(diǎn)的修飾，和其中所述修飾破壞聚糖附著到所述修飾的糖基化位點(diǎn)的能力，和其中Xaa是任意氨基酸。
56.權(quán)利要求55的嵌合的流感病毒HA多肽，其中所述修飾包含所述天然存在的糖基化位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。
57.權(quán)利要求55的嵌合的流感病毒HA多肽，其中根據(jù)H3編號系統(tǒng)，所述修飾的糖基化位點(diǎn)位于選自氨基酸位置 20-22、21-23、33-35、46-48、289-291、290-292、296-298 和481-483的氨基酸位置，其中所述撤干結(jié)構(gòu)域是來自亞型!11、!12、冊、冊、!18、!19、!111、!112、H13和H16的流感病毒的HA干結(jié)構(gòu)域。
58.權(quán)利要求55的嵌合的流感病毒HA多肽，其中根據(jù)H3編號系統(tǒng)，所述修飾的糖基化位點(diǎn)位于選自氨基酸位置8-10、22-24、38-40、46-48、296-298、410-412和481-483的氨基酸位置，其中所述HA干結(jié)構(gòu)域是來自亞型H3、H4、H7、H10、H14或H15的流感病毒的HA干結(jié)構(gòu)域。
59.權(quán)利要求55-58中任一項(xiàng)的嵌合的流感病毒HA多肽，其中所述HA球狀頭結(jié)構(gòu)域還包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的一個(gè)或多個(gè)非天然存在的糖基化位點(diǎn),其中Xaa是任意氨基酸。
60.權(quán)利要求59的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽，其中所述HA球狀頭結(jié)構(gòu)域是流感病毒Hl亞型的HA球狀頭結(jié)構(gòu)域和其中所述非天然存在的糖基化位點(diǎn)位于Sa、Sb、Ca或Cb抗原性位點(diǎn)中；或其中所述HA球狀頭結(jié)構(gòu)域是流感病毒H3亞型和其中所述非天然存在的糖基化位點(diǎn)位于A、B、C或D抗原性位點(diǎn)中。
61.權(quán)利要求59的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽，其中根據(jù)H3編號，所述非天然存在的糖基化位點(diǎn)是在血細(xì)胞凝集素氨基酸位置59-61、129-131、158-160或165-167上。
62.嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽，包含HA干結(jié)構(gòu)域和HA球狀頭結(jié)構(gòu)域，其中所述HA球狀頭結(jié)構(gòu)域?qū)λ鯤A干結(jié)構(gòu)域是異源的，和其中所述HA球狀頭結(jié)構(gòu)域包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的一個(gè)或多個(gè)非天然存在的糖基化位點(diǎn),和其中Xaa是任意氨基酸。
63.非嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽，包含HA干結(jié)構(gòu)域和HA球狀頭結(jié)構(gòu)域，其中所述HA球狀頭結(jié)構(gòu)域與所述HA干結(jié)構(gòu)域同源，其中所述HA干結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)，其中所述修飾的糖基化位點(diǎn)包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位點(diǎn)的修飾，和其中所述修飾破壞聚糖附著到所述修飾的糖基化位點(diǎn)的能力，其中Xaa是任意氨基酸。
64.權(quán)利要求63的非嵌合的流感病毒HA多肽，其中所述HA球狀頭結(jié)構(gòu)域還包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的一個(gè)或多個(gè)非天然存在的糖基化位點(diǎn),其中Xaa是任意氨基酸。
65.權(quán)利要求64的非嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素多肽，其中所述HA球狀頭結(jié)構(gòu)域是流感病毒Hl亞型的HA球狀頭結(jié)構(gòu)域和其中所述非天然存在的糖基化位點(diǎn)位于Sa、Sb、Ca或Cb抗原性位點(diǎn)中；或其中所述HA球狀頭結(jié)構(gòu)域是流感病毒H3亞型和其中所述非天然存在的糖基化位點(diǎn)位于A、B、C或D抗原性位點(diǎn)中。
66.權(quán)利要求64或65的非嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽，其中根據(jù)H3編號，所述非天然存在的糖基化位點(diǎn)是在血細(xì)胞凝集素氨基酸位置59-61、81-83、129-131、143-145、158-160 和 / 或 165-167、170-172、187-189、193-195、197_199、208_210 上。
67.流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)干結(jié)構(gòu)域多肽，包含: a.流感血細(xì)胞凝集素HAl結(jié)構(gòu)域，其包含HAlN-端干區(qū)段共價(jià)連接于1_50個(gè)異源殘基的接頭，所述接頭又共價(jià)連接于HAl C-端短干區(qū)段；所述HAl結(jié)構(gòu)域與 b.流感血細(xì)胞凝集素HA2結(jié)構(gòu)域以三級或四級締合， 其中所述流感病毒HA干結(jié)構(gòu)域多肽結(jié)構(gòu)域還包含一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)，其中所述修飾的糖基化位點(diǎn)包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位點(diǎn)的修飾，其中所述修飾破壞聚糖附著到所述修飾的糖基化位點(diǎn)的能力，和其中Xaa是任意氨基酸。
68.流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)干結(jié)構(gòu)域多肽，包含: a.流感血細(xì)胞凝集素HAl結(jié)構(gòu)域，其包含HAlN-端長干區(qū)段共價(jià)連接于1_50個(gè)異源殘基的接頭，所述接頭又共價(jià)連接于HAl C-端長干區(qū)段；所述HAl結(jié)構(gòu)域與 b.流感血細(xì)胞凝集素HA2結(jié)構(gòu)域以三級或四級締合， 其中所述流感病毒HA干結(jié)構(gòu)域多肽結(jié)構(gòu)域還包含一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)，其中所述修飾的糖基化位點(diǎn)包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位點(diǎn)的修飾，其中所述修飾破壞聚糖附著到所述修飾的糖基化位點(diǎn)的能力，和其中Xaa是任意氨基酸。
69.流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)干結(jié)構(gòu)域多肽，包含: a.流感血細(xì)胞凝集素HAl結(jié)構(gòu)域，其包含HAlN-端干區(qū)段共價(jià)連接于1_50個(gè)異源殘基的接頭，所述接頭又共價(jià)連接于HAl C-端干區(qū)段；所述HAl結(jié)構(gòu)域與 b.流感血細(xì)胞凝集素HA2結(jié)構(gòu)域以三級或四級締合， 其中所述流感病毒HA干結(jié)構(gòu)域多肽結(jié)構(gòu)域還包含一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)，其中所述修飾的糖基化位點(diǎn)包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位點(diǎn)的修飾，其中所述修飾破壞聚糖附著到所述修飾的糖基化位點(diǎn)的能力，和其中Xaa是任意氨基酸。
70.流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)干結(jié)構(gòu)域多肽，包含: a.流感血細(xì)胞凝集素HAl結(jié)構(gòu)域，其包含按順序連接的HAlN-端干區(qū)段、1_50個(gè)異源殘基的第一接頭、HAl中間干區(qū)段、1-50個(gè)異源殘基的第二接頭和HAl C-端干區(qū)段；所述HAl結(jié)構(gòu)域與 b.流感血細(xì)胞凝集素HA2結(jié)構(gòu)域以三級或四級締合， 其中所述流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)干結(jié)構(gòu)域多肽結(jié)構(gòu)域還包含一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基化位點(diǎn)，其中所述修飾的糖基化位點(diǎn)包含具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys的天然存在的糖基化位點(diǎn)的修飾，其中所述修飾破壞聚糖附著到所述修飾的糖基化位點(diǎn)的能力，和其中Xaa是任意氨基酸。
71.權(quán)利要求68-71中任一項(xiàng)的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)干結(jié)構(gòu)域多肽，其中根據(jù)H3編號系統(tǒng)，所述修飾的糖基化位點(diǎn)位于選自氨基酸位置20-22、21-23、33-35、46-48、289-291,290-292,296-298和481-483的氨基酸位置，其中所述HA干結(jié)構(gòu)域是來自亞型H1、H2、H5、H6、H8、H9、Hll、H12、H13 和 H16 的流感病毒的 HA 干結(jié)構(gòu)域。
72.權(quán)利要求68-71中任一項(xiàng)的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)干結(jié)構(gòu)域多肽，其中根據(jù)H3編號系統(tǒng)，所述修飾的糖基化位點(diǎn)位于選自氨基酸位置8-10、22-24、38-40、46-48、296-298,410-412和481-483的氨基酸位置，其中所述HA干結(jié)構(gòu)域是來自亞型H3、H4、H7、H10、H14、H15的流感病毒的HA干結(jié)構(gòu)域。
73.權(quán)利要求1-9或55-72中任一項(xiàng)的HA多肽，其中所述多肽是可溶的。
74.核酸，其編碼權(quán)利要求55-62中任一項(xiàng)的多肽。
75.核酸,其編碼權(quán)利要求63-66中任一項(xiàng)的多肽。
76.細(xì)胞，其表達(dá)權(quán)利要求74的核酸。
77.細(xì)胞，其表達(dá)權(quán)利要求75的核酸。
78.病毒,其包含權(quán)利要求55-62中任一項(xiàng)的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽。
79.病毒,其包含權(quán)利要求63-66中任一項(xiàng)的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽。
80.免疫原性組合物，包含權(quán)利要求55-62中任一項(xiàng)的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽。
81.免疫原性組合物，包含權(quán)利要求63-66中任一項(xiàng)的嵌合的流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)多肽。
82.給對象實(shí)施免疫的方法，包括給予所述對象有效量的權(quán)利要求80的免疫原性組合物。
83.給對象實(shí)施免疫的方法，包括給予所述對象有效量的權(quán)利要求81的免疫原性組合物。
84.權(quán)利要求82的方法，其中所述對象是人。
85.權(quán)利要求83的方法，其中所述對象是人。
【文檔編號】A61K39/145GK104185476SQ201280057023
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月20日
【發(fā)明者】阿道夫·加西亞-塞斯特, 彼得·帕雷斯, 佛羅萊恩·克拉默, 納塔利·皮卡, 德克·艾根克, 拉法爾·A·麥迪納-席爾瓦, 海容 申請人:西奈山醫(yī)學(xué)院