專利名稱：一種檢測(cè)流感病毒抗體的熒光微量細(xì)胞凝集方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)流感病毒抗體的熒光微量細(xì)胞凝 集方法。
背景技術(shù)：
特定血清型流感病毒感染、感染后恢復(fù)、隱性感染、以及疫苗接種的人或動(dòng) 物，在其體液(如血清、支氣管灌洗液、血漿、組織液等)中會(huì)出現(xiàn)流感病毒血凝素抗 體，通過(guò)檢測(cè)特定血清型流感病毒的抗體，可以判斷、診斷或確診該人或該動(dòng)物是否感 染(包括早期感染、隱性感染或感染后恢復(fù)等)該特定血清型的流感病毒、或接種過(guò)流感 病毒疫苗、或評(píng)價(jià)其對(duì)特定血清型流感病毒的抵抗力等。
目前檢測(cè)待檢樣品中是否存在某一特定血清型的流感病毒抗體的方法，主要有 血凝抑制實(shí)驗(yàn)(HAI)和中和實(shí)驗(yàn)，即將某一特定血清型的流感病毒先與待檢樣品混合， 然后加入紅細(xì)胞或敏感細(xì)胞中，判斷待檢樣品是否能夠抑制該病毒的血凝反應(yīng)或細(xì)胞病 變效應(yīng)來(lái)進(jìn)行判定，其缺點(diǎn)是需要使用具有感染性的病毒，安全性存在隱患。在涉及病 毒的實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)國(guó)家有關(guān)法規(guī)(國(guó)務(wù)院《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》、衛(wèi) 生部《人間傳染的病原微生物名錄》、《人間傳染的高致病性病原微生物實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn) 活動(dòng)生物安全審批管理辦法》)及WHO的規(guī)定與建議，包括人H2N2以及部分禽流感病 毒的操作要求在BSL-III (P3)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，因此，上述方法的開(kāi)展對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求很 高，不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和規(guī)模檢測(cè)。文獻(xiàn)也有報(bào)道，利用表達(dá)流感病毒HA的假病毒顆 粒來(lái)代替具有感染性的流感病毒進(jìn)行HAI實(shí)驗(yàn)，但技術(shù)過(guò)于復(fù)雜。
上述方法的缺點(diǎn)還在于只能檢測(cè)流感病毒HA的抗體。流感病毒表面主要存在 著2種抗原性較強(qiáng)的糖蛋白刺突，即血凝素NA和神經(jīng)氨酸酶NA，當(dāng)流感病毒感染或隱 性感染或接種疫苗后，人或動(dòng)物的機(jī)體會(huì)針對(duì)HA和NA都產(chǎn)生抗體，正是如此，流感病 毒中的甲型流感病毒根據(jù)HA的抗原性分為Hl H16等16個(gè)亞型，NA的抗原性分為 Nl N9等9個(gè)亞型，在甲型流感病毒中根據(jù)HA和NA亞型的不同組合方式形成了眾多 亞型，如H5N1 (即H5亞型與Nl亞型組合)。因此，如檢測(cè)流感病毒抗體，除需檢測(cè) HA血清型外，還需要對(duì)NA血清型進(jìn)行檢測(cè)。而目前對(duì)NA血清型抗體的檢測(cè)則需要另 行通過(guò)神經(jīng)氨酸酶酶活抑制的方法進(jìn)行檢測(cè)。
除經(jīng)典的HAI和中和實(shí)驗(yàn)外，也有用ELISA方法和乳膠凝集實(shí)驗(yàn)方法來(lái)進(jìn)行檢 測(cè)的報(bào)道。ELISA和乳膠凝集的優(yōu)勢(shì)在于可以檢測(cè)HA和NA的抗體。其中，ELISA方 法是利用重組表達(dá)和純化的流感病毒HA和/或NA來(lái)檢測(cè)相應(yīng)的抗體，這需要獲保持抗 原特異性的重組蛋白的表達(dá)與純化，且由于流感病毒有眾多亞型，即使同種亞型的血清 交叉反應(yīng)強(qiáng)度不一，對(duì)不同血清型的HA和NA抗原都進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)與純化，其工 作量大、工藝要求高、批間穩(wěn)定性差。乳膠凝集方法相對(duì)于現(xiàn)有的其它方法(HAI、中 和實(shí)驗(yàn)以及ELISA方法)而言，反應(yīng)時(shí)間短、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，但仍存在一些不足。乳膠 凝集實(shí)驗(yàn)方法是將重組表達(dá)和純化的流感病毒HA和/或NA蛋白偶聯(lián)在惰性乳膠顆粒表面，利用凝集反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)流感病毒相應(yīng)的抗體，這同樣需要重組表達(dá)和純化的流感病 毒HA和NA，并需要獲得保持抗原特異性的重組蛋白的表達(dá)與純化，如需要檢測(cè)不同血 清型的流感病毒HA和NA抗體，就需要對(duì)不同毒株的HA和NA進(jìn)行重組表達(dá)和純化， 與ELISA方法一樣，存在工作量大、工藝要求高、批間穩(wěn)定性差等問(wèn)題。
由于檢測(cè)流感病毒抗體對(duì)人或該動(dòng)物是否感染(包括早期感染、隱性感染或感 染后恢復(fù)等)該特定血清型的流感病毒、或接種過(guò)流感病毒疫苗、或評(píng)價(jià)其對(duì)特定血清 型流感病毒的抵抗力等有重要意義，而目前的HAI、中和實(shí)驗(yàn)、ELISA以及乳膠凝集 等檢測(cè)手段，或需要使用具有感染性的病毒，或需要特定的實(shí)驗(yàn)條件和設(shè)備，或工藝復(fù) 雜，或檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)，因此，一種簡(jiǎn)便、快速、工藝相對(duì)簡(jiǎn)單易控的，可以同時(shí)檢 測(cè)流感病毒HA和NA抗體檢測(cè)方法具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
使用重組表達(dá)流感病毒血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的真核細(xì)胞為凝集反應(yīng) 基質(zhì)，利用凝集反應(yīng)，檢測(cè)待檢樣品中是否存在相應(yīng)流感病毒的抗體，這一方法相對(duì)于 上述傳統(tǒng)方法而言，可以更安全更快速的檢測(cè)流感病毒抗體。但由于該方法存在通量受 限、細(xì)胞消耗量大的缺點(diǎn)，因此，需要一種適合高通量檢測(cè)、細(xì)胞用量更少、簡(jiǎn)便、快 速、工藝相對(duì)簡(jiǎn)單易控、可以同時(shí)檢測(cè)流感病毒HA和NA抗體檢測(cè)方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中用于檢測(cè)流感病毒抗體中存在的細(xì)胞消耗量 大、工藝復(fù)雜、檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、通量受限等缺點(diǎn)，提供一種簡(jiǎn)便、快速、細(xì)胞用量少、適 合高通量檢測(cè)的用于檢測(cè)流感病毒抗體的方法。
本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明是將流感病毒血凝素基因和神經(jīng)氨酸酶基因克隆后轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，使真 核細(xì)胞表面重組表達(dá)流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白，對(duì)重組表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo) 記，該細(xì)胞表面的重組表達(dá)的血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白與待測(cè)樣品的流感病毒血凝素抗 體和神經(jīng)氨酸酶抗體結(jié)合，發(fā)生凝集反應(yīng)，熒光檢測(cè)分析，根據(jù)熒光面積是否增加來(lái)判 定待測(cè)樣品中是否存在流感病毒抗體。
作為一種優(yōu)選方案，所述熒光標(biāo)記為熒光素、熒光蛋白或其它能夠發(fā)出熒光的 物質(zhì)；所述熒光檢測(cè)分析所用的設(shè)備為熒光顯微鏡、熒光光度計(jì)或多功能微孔板檢測(cè) 儀。
利用RT-PCR克隆特定血清型流感病毒的HA和NA基因或其片段，構(gòu)建真核表 達(dá)載體，轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，細(xì)胞表面會(huì)存在重組表達(dá)的HA和NA，經(jīng)醛化固定后，該細(xì)胞 即成為表面含有HA和NA抗原的致敏顆粒。該細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)可同時(shí)轉(zhuǎn)染編碼熒光蛋白 (綠色熒光蛋白、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、青色熒光蛋白 等在激發(fā)光下可發(fā)射熒光的蛋白或多肽或突變體)的核酸，則該細(xì)胞即可被熒光標(biāo)記。 熒光標(biāo)記也可以使用熒光物質(zhì)，如CFSE、SYTO> Cy3、Cy5、FITC等，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo) 記。熒光標(biāo)記后的細(xì)胞與待檢樣品在微量凝集板中混合后，如待檢樣品中含有流感病毒 的抗體，即會(huì)在數(shù)分鐘發(fā)生凝集反應(yīng)，在熒光顯微鏡下可以清晰觀察和判斷出是否出現(xiàn) 凝集。同時(shí)也可經(jīng)拍照成像后用圖像分析軟件，如Image Pro Plus等對(duì)各孔熒光面積進(jìn)行 分析，利用細(xì)胞出現(xiàn)凝集后不易沉淀因而熒光免疫較大而判斷是否出現(xiàn)凝集。
具體地，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
將重組表達(dá)流感病毒血凝素(HA)的真核細(xì)胞，或重組表達(dá)神經(jīng)氨酸酶(NA)的 真核細(xì)胞，或同時(shí)表達(dá)有HA和NA的真核細(xì)胞，或單獨(dú)重組表達(dá)HA和NA的真核細(xì)胞 混合物，用熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，熒光標(biāo)記后的細(xì)胞與待檢樣品在微量凝集板中混合后， 如待檢樣品中含有流感病毒的抗體，即會(huì)在數(shù)分鐘發(fā)生凝集反應(yīng)，在熒光顯微鏡下可以 清晰觀察和判斷出是否出現(xiàn)凝集。同時(shí)也可經(jīng)拍照成像后用圖像分析軟件，如Image Pro Plus等對(duì)各孔熒光面積進(jìn)行分析，利用細(xì)胞出現(xiàn)凝集后不易沉淀因而熒光免疫較大而判 斷是否出現(xiàn)凝集。如出現(xiàn)凝集，表明檢測(cè)待檢樣品中是否存在相應(yīng)流感病毒的抗體。
作為一種優(yōu)選方案，所述重組表達(dá)為瞬時(shí)表達(dá)或穩(wěn)定表達(dá)。
流感病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒，其中甲型流感病 毒的HA可以分為16個(gè)亞型、NA可以分為9個(gè)亞型，同時(shí)，由于流感病毒HA和NA的突 變和進(jìn)化，即使是同一亞型的HA和NA，其交叉反應(yīng)性的強(qiáng)弱不一。因此，檢測(cè)某一特 定血清型流感病毒抗體時(shí)，使用本發(fā)明的方法，將重組表達(dá)該特定血清型毒株的HA的真 核細(xì)胞與待檢樣品進(jìn)行凝集實(shí)驗(yàn)即可。上述的流感病毒HA，是指甲型流感病毒的HI、 H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、HlU H12、H13、H14、H15、H16 亞 型，以及乙型流感病毒、丙型流感病毒的血凝素，可以根據(jù)檢測(cè)目的的需要使用某一特 定血清型的HA或其部分。上述的流感病毒NA，是指甲型流感病毒的Ni、N2、N3、 N4、N5、N6、N7、N8、N9亞型以及乙型流感病毒、丙型流感病毒的神經(jīng)氨酸酶。上 述的重組表達(dá)流感病毒HA和NA可以是上述不同HA和NA的任一組合方式。
作為一種優(yōu)選方案，所述流感病毒血凝素抗體和神經(jīng)氨酸酶抗體為tgG、IgM, IgA、IgE、IgD中的一種或幾種的混合物。
如是進(jìn)行較廣泛血清型的流感病毒抗體檢測(cè)，則可以根據(jù)所檢測(cè)的目的血清型 毒株的HA和NA進(jìn)行抗原性分析，選用抗原性保守或抗原交叉性強(qiáng)的HA和NA蛋白的 一部分進(jìn)行重組表達(dá)真核細(xì)胞的構(gòu)建，利用凝集反應(yīng)對(duì)較廣泛血清型的流感病毒抗體檢 測(cè)。上述的流感病毒HA和NA，可以是某一流感病毒毒株HA和NA或其中一部分， 也可以是不同流感病毒毒株的HA和NA或其中一部分或不同HA和NA的拼接或混合， 也可以是對(duì)流感病毒HA和NA進(jìn)行了突變和修飾，也可以是人工合成的天然不存在的序 列，但其核心是重組表達(dá)產(chǎn)物具有流感病毒HA和NA的抗原性。
上述的重組表達(dá)流感病毒HA和NA的真核細(xì)胞，是指將編碼有流感病毒HA和 NA的基因片段導(dǎo)入真核細(xì)胞，在真核細(xì)胞表面重組表達(dá)流感病毒的HA和NA。真核細(xì) 胞可以是酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞，以及其它的真核細(xì)胞，重組表達(dá)的流感病毒 HA和NA位于細(xì)胞膜或細(xì)胞壁表面。其中，真核細(xì)胞優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞， 其重組表達(dá)的流感病毒血凝素可以有更為接近病毒感染人或動(dòng)物所獲得翻譯后修飾、空 間構(gòu)型和抗原性，其與流感病毒相應(yīng)抗體的反應(yīng)特異性更佳。進(jìn)一步，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì) 胞重組表達(dá)流感病毒HA和NA。重組表達(dá)可以是瞬時(shí)表達(dá)，也可以是穩(wěn)定表達(dá)。編碼 有流感病毒HA和NA的基因片段可以是DNA，也可以是RNA，可以是單純的含有啟動(dòng) 子和編碼序列的片段，也可以是質(zhì)粒，也可以是病毒載體，其可以僅編碼流感病毒HA和 NA,也可以同時(shí)或獨(dú)立混合編碼其它蛋白或多肽或肽段，其目的是將編碼流感病毒HA 和NA的基因片段在真核細(xì)胞中獲得重組表達(dá)。導(dǎo)入真核細(xì)胞的方式可以使用電擊、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、病毒介導(dǎo)等，目的是將編碼流感病毒HA和NA的基因片段進(jìn)入真核細(xì)胞以得 到重組表達(dá)。上述的重組表達(dá)HA和NA的真核細(xì)胞，其核心在于獲得在細(xì)胞表面表達(dá) 有流感病毒HA和NA的真核細(xì)胞，且該細(xì)胞被熒光物質(zhì)進(jìn)行了熒光標(biāo)記，其目的是利用 熒光，可以高通量地以較少的細(xì)胞量，即可通過(guò)凝集實(shí)驗(yàn)檢測(cè)流感病毒抗體。在本發(fā)明 的實(shí)施方案中，公布了熒光標(biāo)記的重組表達(dá)流感病毒HA和NA的真核細(xì)胞的方法。
本發(fā)明檢測(cè)方法所用的真核細(xì)胞為酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或其它真核 細(xì)胞，重組表達(dá)的流感病毒血凝素位于細(xì)胞膜或細(xì)胞壁表面。使用真核細(xì)胞進(jìn)行重組表 達(dá)的目的是活的具有翻譯后修飾(如糖基化等)的流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白或其 部分肽段，以更好的與流感病毒血凝素抗體和神經(jīng)氨酸酶抗體或兩者之一發(fā)生識(shí)別、結(jié) 合和凝集，獲得更好的親和性和特異性。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明檢測(cè)流感病毒抗體的熒光微量細(xì)胞凝集方法不涉及具有感染性的病毒顆 粒；相比ELISA、HAI和中和實(shí)驗(yàn)所需的數(shù)小時(shí)至數(shù)天，熒光標(biāo)記的重組表達(dá)HA和NA 的細(xì)胞凝集反應(yīng)小于60分鐘，反應(yīng)時(shí)間快速；利用通用引物和載體可對(duì)不同血清型的 HA和NA基因進(jìn)行克隆與轉(zhuǎn)染表達(dá)，即可得到不同HA和NA抗原的致敏細(xì)胞顆粒，可以 更加廣泛地對(duì)不同血清型流感病毒抗體進(jìn)行檢測(cè)；相對(duì)于非熒光標(biāo)記的重組表達(dá)HA和 NA的細(xì)胞凝集反應(yīng)方法，本發(fā)明適合高通量檢測(cè)、細(xì)胞用量更少(僅需未用熒光標(biāo)記細(xì) 胞的 1/100 到 1/10)。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。
實(shí)施例1綠色熒光蛋白標(biāo)記的重組表達(dá)流感病毒HA和NA的真核細(xì)胞的方法
本實(shí)施例以一株H5 亞型的毒株 A/Chicken/Guangdong/1/2005(H5N1) 為例，進(jìn)行重組表達(dá)流感病毒血凝素HA真核表達(dá)細(xì)胞的制備。A/Chicken/ Guangdong/1/2005 (H5N1)是2005年在廣東省的雞中分離得到的一株H5N1亞型流 感病毒，其HA和NA的基因序列可在公共數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank上獲得，HA的序列號(hào)為 EU874899.2，NA的序列號(hào)為EU874900.2。將該株病毒增殖后使用Viral RNA Miniprep Kit 提取病毒 RNA，用 Uni-12 引物(5，-AgCAAAAgCAgg-3，)和 SuperScript III 或 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到病毒cDNA。根據(jù)該毒株HA的基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)用于HA 全長(zhǎng)基因克隆的引物，其引物序列具體如下上游引物H5HA-F，序列為5’ -GCAAAG CTTACCATGGAGAAAATACTTCTTC-3‘，從 5，端依次為 3 個(gè)保護(hù)性堿基、HindIII 酶 切位點(diǎn)、KOZAK序列、起始密碼子和配對(duì)區(qū)；下游引物H5HA-R，序列為5’ -CTCGG ATCCTTAAATGCAAATTCTGCATTGTAAG-3‘，從5’ 端依次為 3個(gè)保護(hù)性堿基、BamH I酶切位點(diǎn)、終止密碼子和配對(duì)區(qū)。利用這對(duì)引物，用高保真Taq酶對(duì)病毒cDNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增HA片段。
根據(jù)該毒株NA的基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)用于NA全長(zhǎng)基因克隆的引物，其引物序 列具體如下上游引物 NlNA-F 序列為 5，-GCAAAGCTTACCATGAATCCAAATCAG AAG-3，，從5’端依次為3個(gè)保護(hù)性堿基、HindIII酶切位點(diǎn)、KOZAK序列、起始密碼子和配對(duì)區(qū)；下游引物N1NA-R，序列為5，-CTCGGATCCCTACTTGTCAATGGTG AATG-3’，從5’端依次為3個(gè)保護(hù)性堿基、BamH I酶切位點(diǎn)、終止密碼子和配對(duì)區(qū)。 利用這對(duì)引物，用高保真Taq酶對(duì)病毒cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增NA片段。
PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后HA基因片段后，與表達(dá)載體pcDNA3分別進(jìn) 行使用Hind III和BamH I雙酶切，再次電泳回收后利用T4DNA連接酶將酶切回收后的 HA片段與載體進(jìn)行連接。NA片段與綠色熒光表達(dá)載體使用Hind III和BamH I雙酶切 后，電泳回收進(jìn)行連接，該載體編碼的綠色熒光蛋白與多克隆位點(diǎn)間有一個(gè)核糖體進(jìn)入 位點(diǎn)序列(IRES)，NA基因片段插入載體的啟動(dòng)子后、IRES前，當(dāng)啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄時(shí)可 以得到一個(gè)編碼有NA、IRES和綠色熒光蛋白的mRNA，最終翻譯得到單獨(dú)的NA和綠色 熒光蛋白。
連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布Amp抗性平板。菌落 經(jīng)PCR后，提取質(zhì)粒酶切鑒定和DNA測(cè)序，獲得含有HA基因片段的真核表達(dá)質(zhì)粒即 pcDNA-H5HA,獲得含有HA基因片段的真核表達(dá)質(zhì)粒即pIRES-EGFP_NlNA。含有 pcDNA-H5HA質(zhì)粒和pIRES-EGFP_NlNA質(zhì)粒的細(xì)菌，分別經(jīng)含有50 μ g/ml的氨芐 青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)過(guò)夜后，用高純度質(zhì)粒提取試劑盒提取pcDNA-H5HA質(zhì)粒和 pIRES-EGFP-ΝΙΝΑ質(zhì)粒，用于后續(xù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和重組表達(dá)實(shí)驗(yàn)。
根據(jù)Lipofectamine 2000 試劑盒說(shuō)明，將 2.5 μ g pcDNA_H5HA 質(zhì)粒、 0.5 μ gpIRES-EGFP-ΝΙΝΑ 質(zhì)粒和 10 μ 1 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染復(fù)合物，轉(zhuǎn)染一個(gè):35mm直徑培養(yǎng)皿含有生長(zhǎng)密度約為80% -90%融合率的人胚腎HEK-239細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后《ι去除 轉(zhuǎn)染復(fù)合物，更換新鮮的完全培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)。
轉(zhuǎn)染后，HEK-239細(xì)胞即可瞬時(shí)重組表達(dá)HA、NA和綠色熒光蛋白，即得到瞬 時(shí)綠色熒光蛋白標(biāo)記的重組表達(dá)流感病毒HA和NA的細(xì)胞。
為進(jìn)一步優(yōu)化，可以篩選獲得穩(wěn)定綠色熒光蛋白標(biāo)記的重組表達(dá)HA和NA的細(xì) 胞在轉(zhuǎn)染7Zh后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞吹打分散，將細(xì)胞懸液的1/20接種一個(gè)新的35mm直徑培 養(yǎng)皿中，補(bǔ)充完全培養(yǎng)基至3ml，經(jīng)過(guò)夜貼壁后，補(bǔ)加G418至濃度為600 μ g/ml。此后 每3至5天的更換一次含有600 μ g/ml G418的完全培養(yǎng)基，約3周后可見(jiàn)篩選出現(xiàn)的抗性 細(xì)胞集落。將抗性細(xì)胞集落經(jīng)胰酶消化后，按10-20個(gè)細(xì)胞/ml接種96孔板培養(yǎng)，加入 含有600 μ g/ml G418的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至長(zhǎng)至單層后，進(jìn)行傳代，獲得用于檢測(cè)的備份 培養(yǎng)96孔板。將檢測(cè)用的96孔板的細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定5分鐘，經(jīng)PBS漂洗 后，加入Cy3熒光標(biāo)記的抗H5亞型HA的抗體進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，同時(shí)觀察綠色熒光， 選擇紅色和綠色熒光陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)、紅色和綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞比例高的孔，對(duì)細(xì)胞繼續(xù)重 復(fù)的克隆化和免疫熒光，至陽(yáng)性細(xì)胞比例接近100%，即可得到穩(wěn)定綠色熒光蛋白標(biāo)記重 組表達(dá)該毒株HA和NA的細(xì)胞。
將綠色熒光蛋白標(biāo)記瞬時(shí)或穩(wěn)定重組表達(dá)該毒株HA和NA的細(xì)胞，經(jīng)貼壁或懸 浮培養(yǎng)后，用含有2% BSA的PBS將細(xì)胞吹打分散，將細(xì)胞懸液進(jìn)行離心，去除上清后 用含有2% BSA的PBS按IO5個(gè)/ml細(xì)胞密度進(jìn)行重懸。去除上清，用等體積的PBS重 懸、離心進(jìn)行洗滌2次，再次加入等體積的PBS，加入等體積的10%的冷甲醛，于4°C固 定2小時(shí)。經(jīng)離心、PBS重懸的方式進(jìn)行3次洗滌。最后將細(xì)胞沉淀，按IO5個(gè)/ml的 濃度重懸于含有0.2%尼泊爾金酯、2%BSA、20%甘油、0.5%肝素的PBS緩沖液中，使其能夠穩(wěn)定地長(zhǎng)時(shí)間保存，即得到了處理后的綠色熒光蛋白標(biāo)記重組表達(dá)HA和NA抗原 的真核細(xì)胞。
將該綠色熒光蛋白標(biāo)記重組表達(dá)HA和NA抗原的真核細(xì)胞的細(xì)胞懸液25 μ 1與 待檢樣品25 μ 1，在微量凝集板中混合，室溫放置60分鐘后，在熒光顯微鏡下觀察。如 未發(fā)生凝集，則發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞會(huì)沉淀在凝集板底部，鏡下可見(jiàn)熒光細(xì)胞聚集在中 央；如發(fā)生凝集，則發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞以絮狀懸浮在液體中，鏡下可見(jiàn)熒光細(xì)胞在視 野中分散，細(xì)胞與細(xì)胞間發(fā)生聚團(tuán)。利用這一特征，也可以用熒光顯微鏡進(jìn)行成像，利 用圖像分析軟件，通過(guò)設(shè)立熒光發(fā)光面積來(lái)實(shí)現(xiàn)軟件判讀凝集與否。待檢樣品發(fā)生凝集 時(shí)，說(shuō)明待檢樣品中含有與該毒株HA和/或NA具有反應(yīng)性的流感病毒HA和/或NA 抗體。
實(shí)施例2熒光素CFSE (羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯)標(biāo)記的重組表達(dá)流 感病毒HA和NA的真核細(xì)胞的方法
本實(shí)施例以一株Η5 亞型的毒株 A/Chicken/Guangdong/1/2005(H5N1) 為例，進(jìn)行重組表達(dá)流感病毒血凝素HA真核表達(dá)細(xì)胞的制備。A/Chicken/ Guangdong/1/2005 (H5N1)是2005年在廣東省的雞中分離得到的一株H5N1亞型流 感病毒，其HA和NA的基因序列可在公共數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank上獲得，HA的序列號(hào)為 EU874899.2，NA的序列號(hào)為EU874900.2。將該株病毒增殖后使用Viral RNA Miniprep Kit 提取病毒 RNA，用 Uni-12 引物(5，-AGCAAAAGCAGG-3，)禾Π SuperScript III 或 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到病毒cDNA。根據(jù)該毒株HA的基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì) 用于HA全長(zhǎng)基因克隆的引物，其引物序列具體如下上游引物H5HA-F，序列為5’ -G CAAAGCTTACCATGGAGAAAATAGTACTTCTTC-3‘，從 5，端依次為 3 個(gè)保護(hù)性堿 基、HindIII酶切位點(diǎn)、KOZAK序列、起始密碼子和配對(duì)區(qū)；下游引物H5HA-R，序列 為 5，-CTCGGATCCTTAAATGCAAATTCTGCATTGTAAG-3，，從 5，端依次為 3 個(gè)保 護(hù)性堿基、BamH I酶切位點(diǎn)、終止密碼子和配對(duì)區(qū)。利用這對(duì)引物，用高保真Taq酶對(duì) 病毒cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增HA片段。
根據(jù)該毒株NA的基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)用于NA全長(zhǎng)基因克隆的引物，其引物序 列具體如下上游引物 NlNA-F 序列為 5，-GCAAAGCTTACCATGAATCCAAATCAG AAG-3，，從5’端依次為3個(gè)保護(hù)性堿基、HindIII酶切位點(diǎn)、KOZAK序列、起始密 碼子和配對(duì)區(qū)；下游引物N1NA-R，序列為5，-CTCGGATCCCTACTTGTCAATGGTG AATG-3’，從5’端依次為3個(gè)保護(hù)性堿基、BamH I酶切位點(diǎn)、終止密碼子和配對(duì)區(qū)。 利用這對(duì)引物，用高保真Taq酶對(duì)病毒cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增NA片段。
PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后HA和NA基因片段后，與表達(dá)載體pcDNA3 分別進(jìn)行使用Hind III和BamH I雙酶切，再次電泳回收后利用T4DNA連接酶將酶切回 收后的HA片段與載體進(jìn)行連接、NA片段與載體進(jìn)行連接，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感 受態(tài)細(xì)胞，涂布Amp抗性平板。菌落經(jīng)PCR后，提取質(zhì)粒酶切鑒定和DNA測(cè)序，獲 得含有HA基因片段的真核表達(dá)質(zhì)粒即pcDNA-H5HA，獲得含有HA基因片段的真核表 達(dá)質(zhì)粒即pcDNA-NlNA。含有pcDNA_H5HA質(zhì)粒和pcDNA_NlNA質(zhì)粒的細(xì)菌，分別 經(jīng)含有50 μ g/ml的氨芐青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)過(guò)夜后，用高純度質(zhì)粒提取試劑盒提取 pcDNA-H5HA質(zhì)粒和pcDNA_NlNA質(zhì)粒，用于后續(xù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和重組表達(dá)實(shí)驗(yàn)。
根據(jù)Lipofectamine 2000 試劑盒說(shuō)明，將 2.5 μ g pcDNA_H5HA 質(zhì)粒、 0.5 μ gpcDNA-NlNA 質(zhì)粒和 10 μ 1 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染復(fù)合物，轉(zhuǎn)染一個(gè):35mm 直徑培養(yǎng)皿含有生長(zhǎng)密度約為80% -90%融合率的人胚腎HEK-239細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后《ι去除轉(zhuǎn)染 復(fù)合物，更換新鮮的完全培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)。
轉(zhuǎn)染后，HEK-239細(xì)胞即可瞬時(shí)重組表達(dá)HA和NA，即得到瞬時(shí)重組表達(dá)流感 病毒HA和NA的細(xì)胞。
為進(jìn)一步優(yōu)化，可以篩選獲得穩(wěn)定重組表達(dá)HA和NA的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染7Zh后將 轉(zhuǎn)染細(xì)胞吹打分散，將細(xì)胞懸液的1/20接種一個(gè)新的35mm直徑培養(yǎng)皿中，補(bǔ)充完全培 養(yǎng)基至3ml，經(jīng)過(guò)夜貼壁后，補(bǔ)加G418至濃度為600μ§/ιη1。此后每3至5天的更換一次 含有600yg/mlG418的完全培養(yǎng)基，約3周后可見(jiàn)篩選出現(xiàn)的抗性細(xì)胞集落。將抗性細(xì) 胞集落經(jīng)胰酶消化后，按10-20個(gè)細(xì)胞/ml接種96孔板培養(yǎng)，加入含有600 μ g/ml G418 的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至長(zhǎng)至單層后，進(jìn)行傳代，獲得用于檢測(cè)的備份培養(yǎng)96孔板。將檢測(cè) 用的96孔板的細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定5分鐘，經(jīng)PBS漂洗后，加入Cy3熒光標(biāo)記 的抗H5亞型HA的抗體和FITC熒光標(biāo)記的抗Nl亞型NA的抗體進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，選 擇紅色和綠色熒光陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)、紅色和綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞比例高的孔，對(duì)細(xì)胞繼續(xù)重復(fù) 的克隆化和免疫熒光，至陽(yáng)性細(xì)胞比例接近100%，即可得到穩(wěn)定重組表達(dá)該毒株HA和 NA的細(xì)胞。
瞬時(shí)或穩(wěn)定重組表達(dá)該毒株HA和NA的細(xì)胞，經(jīng)貼壁或懸浮培養(yǎng)后，用含有 2% BSA的PBS將細(xì)胞吹打分散，將細(xì)胞懸液進(jìn)行離心，去除上清后用含有0.1% BSA的 PBS按IO7個(gè)/ml細(xì)胞密度進(jìn)行重懸。每ml細(xì)胞懸液中，力卩入2 μ 1的5mmol/L的CFSE 母液，37°C放置10分鐘，再加入5ml冰預(yù)冷的PBS，于冰水混合物中放置5分鐘，離心 去除上清，用等體積的PBS重懸、離心進(jìn)行洗滌2次，再次加入等體積的PBS，加入等 體積的10%的冷甲醛，于4°C固定2小時(shí)。經(jīng)離心、PBS重懸的方式進(jìn)行3次洗滌。最 后將細(xì)胞沉淀，按105個(gè)/ml的濃度重懸于含有0.2%尼泊爾金酯、2%BSA、20%甘油、 0.5%肝素的PBS緩沖液中，使其能夠穩(wěn)定地長(zhǎng)時(shí)間保存，即得到了熒光素CFSE標(biāo)記的 重組表達(dá)HA和NA抗原的真核細(xì)胞。
將該綠色熒光蛋白標(biāo)記重組表達(dá)HA和NA抗原的真核細(xì)胞的細(xì)胞懸液25 μ 1與 待檢樣品25 μ 1，在微量凝集板中混合，室溫放置60分鐘后，在熒光顯微鏡下觀察。如 未發(fā)生凝集，則發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞會(huì)沉淀在凝集板底部，鏡下可見(jiàn)熒光細(xì)胞聚集在中 央；如發(fā)生凝集，則發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞以絮狀懸浮在液體中，鏡下可見(jiàn)熒光細(xì)胞在視 野中分散，細(xì)胞與細(xì)胞間發(fā)生聚團(tuán)。利用這一特征，也可以用熒光顯微鏡進(jìn)行成像，利 用圖像分析軟件，通過(guò)設(shè)立熒光發(fā)光面積來(lái)實(shí)現(xiàn)軟件判讀凝集與否。待檢樣品發(fā)生凝集 時(shí)，說(shuō)明待檢樣品中含有與該毒株HA和/或NA具有反應(yīng)性的流感病毒HA和/或NA 抗體。
實(shí)施例3綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白分別標(biāo)記單獨(dú)重組表達(dá)流感病毒HA和 NA的真核細(xì)胞的方法
本實(shí)施例以一株Η5 型的毒株 A/Chicken/Guangdong/1/2005(H5N1)為例，進(jìn)行重組表達(dá)流感病毒血凝素HA真核表達(dá)細(xì)胞的制備。A/Chicken/ Guangdong/1/2005 (H5N1)是2005年在廣東省的雞中分離得到的一株H5N1亞型流9感病毒，其HA和NA的基因序列可在公共數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank上獲得，HA的序列號(hào)為 EU874899.2，NA的序列號(hào)為EU874900.2。將該株病毒增殖后使用Viral RNA Miniprep Kit 提取病毒 RNA，用 Uni-12 引物(5，-AGCAAAAGCAGG-3，)禾Π SuperScript III 或 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到病毒cDNA。根據(jù)該毒株HA的基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì) 用于HA全長(zhǎng)基因克隆的引物，其引物序列具體如下上游引物H5HA-F，序列為5’ -G CAAAGCTTACCATGGAGAAAATAGTACTTCTTC-3，，從 5，端依次為 3 個(gè)保護(hù)性堿 基、HindIII酶切位點(diǎn)、KOZAK序列、起始密碼子和配對(duì)區(qū)；下游引物H5HA-R，序列 為 5，-CTCGGATCCTTAAATGCAAATTCTGCATTGTAAG-3，，從 5，端依次為 3 個(gè)保 護(hù)性堿基、BamH I酶切位點(diǎn)、終止密碼子和配對(duì)區(qū)。利用這對(duì)引物，用高保真Taq酶對(duì) 病毒cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增HA片段。
根據(jù)該毒株NA的基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)用于NA全長(zhǎng)基因克隆的引物，其引物序 列具體如下上游引物 NlNA-F 序列為 5，-GCAAAGCTTACCATGAATCCAAATCAG AAG-3，，從5’端依次為3個(gè)保護(hù)性堿基、HindIII酶切位點(diǎn)、KOZAK序列、起始密 碼子和配對(duì)區(qū)；下游引物N1NA-R，序列為5，-CTCGGATCCCTACTTGTCAATGGTG AATG-3’，從5’端依次為3個(gè)保護(hù)性堿基、BamH I酶切位點(diǎn)、終止密碼子和配對(duì)區(qū)。 利用這對(duì)引物，用高保真Taq酶對(duì)病毒cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增NA片段。
PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后HA基因片段后，與紅色熒光表達(dá)載體分別 進(jìn)行使用Hind III和BamH I雙酶切，再次電泳回收后利用T4DNA連接酶將酶切回收后 的HA片段與載體進(jìn)行連接。該紅色熒光表達(dá)載體，在編碼的紅色熒光蛋白與多克隆位 點(diǎn)間有一個(gè)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列(IRES)，HA基因片段插入載體的啟動(dòng)子后、IRES前， 當(dāng)啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄時(shí)可以得到一個(gè)編碼有HA、IRES和紅色熒光蛋白的mRNA，最終翻 譯得到單獨(dú)的HA和紅色熒光蛋白。NA片段與綠色熒光表達(dá)載體使用Hind III和BamH I雙酶切后，電泳回收進(jìn)行連接，該載體編碼的綠色熒光蛋白與多克隆位點(diǎn)間有一個(gè)核糖 體進(jìn)入位點(diǎn)序列(IRES)，NA基因片段插入載體的啟動(dòng)子后、IRES前，當(dāng)啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn) 錄時(shí)可以得到一個(gè)編碼有NA、IRES和綠色熒光蛋白的mRNA，最終翻譯得到單獨(dú)的NA 和綠色熒光蛋白。
連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布Amp抗性平板。菌落 經(jīng)PCR后，提取質(zhì)粒酶切鑒定和DNA測(cè)序，獲得含有HA基因片段的真核表達(dá)質(zhì)粒即 pIRES-Red-H5HA,獲得含有HA基因片段的真核表達(dá)質(zhì)粒即pIRES-EGFP_NlNA。含 有pIRES-Red_H5HA質(zhì)粒和pIRES_EGFP_NlNA質(zhì)粒的細(xì)菌，分別經(jīng)含有50 μ g/ml的氨 芐青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)過(guò)夜后，用高純度質(zhì)粒提取試劑盒提取pIRES-Red_H5HA質(zhì) 粒和pIRES-EGFP-ΝΙΝΑ質(zhì)粒，用于后續(xù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和重組表達(dá)實(shí)驗(yàn)。
根據(jù)Lipofectamine 2000 試劑盒說(shuō)明，將 3 μ g pIRES-Red"H5HA 質(zhì)粒和 10 μ ILipofectamine 2000轉(zhuǎn)染復(fù)合物，轉(zhuǎn)染一個(gè)35mm直徑培養(yǎng)皿含有生長(zhǎng)密度約為 80%-90(%融合率的人胚腎1^尺-239細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后《ι去除轉(zhuǎn)染復(fù)合物，更換新鮮的完全 培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)。
轉(zhuǎn)染后，HEK-239細(xì)胞即可瞬時(shí)重組表達(dá)HA，即得到紅色熒光蛋白標(biāo)記的瞬 時(shí)重組表達(dá)流感病毒HA的細(xì)胞。
為進(jìn)一步優(yōu)化，可以篩選獲得穩(wěn)定重組表達(dá)HA的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染7Zh后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞吹打分散，將細(xì)胞懸液的1/20接種一個(gè)新的35mm直徑培養(yǎng)皿中，補(bǔ)充完全培養(yǎng)基至 3ml，經(jīng)過(guò)夜貼壁后，補(bǔ)加G418至濃度為600yg/ml。此后每3至5天的更換一次含有 600yg/mlG418的完全培養(yǎng)基，約3周后可見(jiàn)篩選出現(xiàn)的抗性細(xì)胞集落。將抗性細(xì)胞集 落經(jīng)胰酶消化后，按10-20個(gè)細(xì)胞/ml接種96孔板培養(yǎng)，加入含有600 μ g/ml G418的完 全培養(yǎng)基培養(yǎng)至長(zhǎng)至單層后，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的紅色熒光，對(duì)細(xì)胞繼續(xù)重復(fù)的 克隆化，至紅色熒光陽(yáng)性細(xì)胞比例接近100%，即可得到紅色熒光蛋白標(biāo)記的穩(wěn)定重組表 達(dá)該毒株HA的細(xì)胞。
根據(jù) Lipofectamine 2000 試劑盒說(shuō)明，將 3 μ g pIRES-EGFP-NlNA 質(zhì)粒和 10 μ ILipofectamine 2000轉(zhuǎn)染復(fù)合物，轉(zhuǎn)染一個(gè)35mm直徑培養(yǎng)皿含有生長(zhǎng)密度約為 80%-90(%融合率的人胚腎1^尺-239細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后《ι去除轉(zhuǎn)染復(fù)合物，更換新鮮的完全 培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)。
轉(zhuǎn)染后，HEK-239細(xì)胞即可瞬時(shí)重組表達(dá)NA，即得到綠色熒光蛋白標(biāo)記的瞬時(shí) 重組表達(dá)流感病毒NA的細(xì)胞。
為進(jìn)一步優(yōu)化，可以篩選獲得穩(wěn)定重組表達(dá)NA的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染7Zh后將轉(zhuǎn)染 細(xì)胞吹打分散，將細(xì)胞懸液的1/20接種一個(gè)新的35mm直徑培養(yǎng)皿中，補(bǔ)充完全培養(yǎng)基 至3ml，經(jīng)過(guò)夜貼壁后，補(bǔ)加G418至濃度為600 μ g/ml。此后每3至5天的更換一次含 有600 μ g/ml G418的完全培養(yǎng)基，約3周后可見(jiàn)篩選出現(xiàn)的抗性細(xì)胞集落。將抗性細(xì) 胞集落經(jīng)胰酶消化后，按10-20個(gè)細(xì)胞/ml接種96孔板培養(yǎng)，加入含有600 μ g/ml G418 的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至長(zhǎng)至單層后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，選擇熒光陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)、 熒光陽(yáng)性細(xì)胞比例高的孔，對(duì)細(xì)胞繼續(xù)重復(fù)的克隆化和免疫熒光，至陽(yáng)性細(xì)胞比例接近 100%,即可得到綠色熒光蛋白標(biāo)記的穩(wěn)定重組表達(dá)該毒株NA的細(xì)胞。
紅色熒光蛋白標(biāo)記的瞬時(shí)或穩(wěn)定重組表達(dá)該毒株HA的細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后，用低 濃度胰酶(0.05%)溫和消化細(xì)胞約5分鐘，加入含有胎牛血清的培養(yǎng)基終止反應(yīng)，將細(xì) 胞懸液進(jìn)行離心，去除上清后用含有2% BSA的PBS進(jìn)行重懸，獲得胰酶處理后的細(xì)胞 懸液。為防止HA可能引起的細(xì)胞自凝集，在胰酶處理后的細(xì)胞懸液中加入神經(jīng)氨酸酶 (又稱神經(jīng)氨酸苷酶，Neuraminidase)進(jìn)行處理，消除重組表達(dá)的HA與細(xì)胞自身受體的 作用，避免細(xì)胞自身凝集。即，將細(xì)胞懸液經(jīng)離心后，用50mM檸檬酸鈉(pH 6.0)緩 沖液，將細(xì)胞按IO7個(gè)/ml進(jìn)行重懸，每ml細(xì)胞懸液中加入200單位的神經(jīng)氨酸酶，于 37°C條件下處理30分鐘后離心，去除上清，用等體積的PBS重懸、離心進(jìn)行洗滌2次， 再次加入等體積的PBS。上述經(jīng)胰酶和神經(jīng)氨酸酶處理的細(xì)胞懸液，加入等體積的10% 的冷甲醛，于4°C固定2小時(shí)。經(jīng)離心、PBS重懸的方式進(jìn)行3次洗滌。最后將細(xì)胞沉 淀，按IO5個(gè)/ml的濃度重懸于含有0.2%尼泊爾金酯、2%BSA、20%甘油、0.5%肝素的 PBS緩沖液中，使其能夠穩(wěn)定地長(zhǎng)時(shí)間保存，即得到了處理后的重組表達(dá)HA抗原的真核 細(xì)胞。
綠色熒光蛋白標(biāo)記的瞬時(shí)或穩(wěn)定重組表達(dá)該毒株NA的細(xì)胞，經(jīng)貼壁或懸浮培養(yǎng) 后，用含有2% BSA的PBS將細(xì)胞吹打分散，將細(xì)胞懸液進(jìn)行離心，去除上清后用含有 2% BSA的PBS按IO7個(gè)/ml細(xì)胞密度進(jìn)行重懸。去除上清，用等體積的PBS重懸、離 心進(jìn)行洗滌2次，再次加入等體積的PBS，加入等體積的10%的冷甲醛，于4°C固定2小 時(shí)。經(jīng)離心、PBS重懸的方式進(jìn)行3次洗滌。最后將細(xì)胞沉淀，按IO5個(gè)/ml的濃度重懸于含有0.2%尼泊爾金酯、2%BSA、20%甘油、0.5%肝素的PBS緩沖液中，使其能夠 穩(wěn)定地長(zhǎng)時(shí)間保存，即得到了處理后的重組表達(dá)NA抗原的真核細(xì)胞。
上述綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白分別標(biāo)記的單獨(dú)重組表達(dá)HA和NA的真核細(xì) 胞即可用檢測(cè)，同時(shí)也可將兩者按一定比例進(jìn)行混合，混合比例為重組表達(dá)HA的真核細(xì) 胞含量為10%-95%，優(yōu)選70%-80%，重組表達(dá)HA的真核細(xì)胞含量為5%-90%，優(yōu) 選20% -30%,混合后的細(xì)胞在檢測(cè)效果上與共同重組表達(dá)HA和NA的真核細(xì)胞類似。
將綠色熒光蛋白單獨(dú)重組表達(dá)HA或NA的真核細(xì)胞懸液和紅色熒光蛋白分別標(biāo) 記的單獨(dú)重組表達(dá)HA或NA的真核細(xì)胞懸液25 μ 1與待檢樣品25 μ 1，在微量凝集板中混 合，室溫放置60分鐘后，在熒光顯微鏡下觀察。如未發(fā)生凝集，則發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞 會(huì)沉淀在凝集板底部，鏡下可見(jiàn)熒光細(xì)胞聚集在中央；如發(fā)生凝集，則發(fā)出綠色熒光的 細(xì)胞以絮狀懸浮在液體中，鏡下可見(jiàn)熒光細(xì)胞在視野中分散，細(xì)胞與細(xì)胞間發(fā)生聚團(tuán)。 利用這一特征，也可以用熒光顯微鏡進(jìn)行成像，利用圖像分析軟件，通過(guò)設(shè)立熒光發(fā)光 面積來(lái)實(shí)現(xiàn)軟件判讀凝集與否。待檢樣品發(fā)生凝集時(shí)，說(shuō)明待檢樣品中含有與該毒株HA 和/或NA具有反應(yīng)性的流感病毒HA和/或NA抗體。
將紅色熒光蛋白標(biāo)記重組表達(dá)HA抗原的真核細(xì)胞懸液(設(shè)為Α)、綠色熒光蛋 白標(biāo)記重組表達(dá)NA抗原的真核細(xì)胞懸液(設(shè)為B)、綠色熒光蛋白標(biāo)記的重組表達(dá)HA和 NA抗原的真核細(xì)胞懸液(或綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白分別標(biāo)記的單獨(dú)表達(dá)HA和NA 的真核細(xì)胞混合懸液，設(shè)為C)，各加25 μ 1加到潔凈的微量凝集板中，然后各加入25 μ 1 的待檢樣品(血清、支氣管灌洗液、血漿、組織液等)至3種不同的細(xì)胞懸液中混合，室 溫放置60分鐘后，在熒光顯微鏡下觀察。如未發(fā)生凝集，則發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞會(huì)沉淀 在凝集板底部，鏡下可見(jiàn)熒光細(xì)胞聚集在中央；如發(fā)生凝集，則發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞以 絮狀懸浮在液體中，鏡下可見(jiàn)熒光細(xì)胞在視野中分散，細(xì)胞與細(xì)胞間發(fā)生聚團(tuán)。利用這 一特征，也可以用熒光顯微鏡進(jìn)行成像，利用圖像分析軟件，通過(guò)設(shè)立熒光發(fā)光面積來(lái) 實(shí)現(xiàn)軟件判讀凝集與否。待檢樣品發(fā)生凝集時(shí)，說(shuō)明待檢樣品中含有與該毒株HA和/ 或NA具有反應(yīng)性的流感病毒HA和/或NA抗體。
設(shè)立陽(yáng)性血清和陰性血清對(duì)照，如對(duì)照樣品符合預(yù)期結(jié)果，待檢樣品發(fā)生與上 述細(xì)胞懸液均未凝集時(shí)，說(shuō)明待檢樣品中不含有與該毒株HA和NA具有反應(yīng)性的流感病 毒HA和NA抗體或抗體濃度低于該方法所能達(dá)到的檢測(cè)濃度。設(shè)立陽(yáng)性血清和陰性血 清對(duì)照，如對(duì)照樣品符合預(yù)期結(jié)果，待檢樣品發(fā)生與上述細(xì)胞懸液均發(fā)生凝集時(shí)，說(shuō)明 待檢樣品中含有與該毒株HA和NA具有反應(yīng)性的流感病毒HA和NA抗體。
設(shè)立陽(yáng)性血清和陰性血清對(duì)照，如對(duì)照樣品符合預(yù)期結(jié)果，待檢樣品發(fā)生與細(xì) 胞懸液A和細(xì)胞懸液C均發(fā)生凝集時(shí)，而未與細(xì)胞懸液B發(fā)生凝集時(shí)，說(shuō)明待檢樣品中 含有與該毒株HA具有反應(yīng)性的流感病毒HA抗體，而不含有與該毒株NA具有反應(yīng)性的 流感病毒NA抗體或抗體濃度低于該方法所能達(dá)到的檢測(cè)濃度。
設(shè)立陽(yáng)性血清和陰性血清對(duì)照，如對(duì)照樣品符合預(yù)期結(jié)果，待檢樣品發(fā)生與細(xì) 胞懸液B和細(xì)胞懸液C均發(fā)生凝集時(shí)，而未與細(xì)胞懸液A發(fā)生凝集時(shí)，說(shuō)明待檢樣品中 含有與該毒株NA具有反應(yīng)性的流感病毒NA抗體，而不含有與該毒株HA具有反應(yīng)性的 流感病毒HA抗體或抗體濃度低于該方法所能達(dá)到的檢測(cè)濃度。
待檢樣品發(fā)生凝集時(shí)，說(shuō)明待檢樣品中含有與該毒株HA和/或NA具有反應(yīng)性的流感病毒HA和/或NA抗體。此時(shí)可以進(jìn)一步進(jìn)行相對(duì)定量分析，即，將待檢樣品1 進(jìn)行連續(xù)的倍比稀釋，然后分別與實(shí)施例2中的處理后的重組表達(dá)HA和/或NA抗原的 真核細(xì)胞懸液進(jìn)行凝集反應(yīng)，得到所能發(fā)生凝集的樣品最高稀釋度，設(shè)為dl。同樣方法 可得到待檢樣品2的凝集反應(yīng)陽(yáng)性最高稀釋度d2。以此橫向比較不同待檢樣品中流感病 毒HA和/或NA抗體的濃度差異和相對(duì)比例。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)流感病毒抗體的熒光微量細(xì)胞凝集方法，其特征在于所述方法是將流感 病毒血凝素基因和神經(jīng)氨酸酶基因克隆后轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，使真核細(xì)胞表面重組表達(dá)流感 病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白，對(duì)重組表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，該細(xì)胞表面的重組表達(dá) 的血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白與待測(cè)樣品的流感病毒血凝素抗體和神經(jīng)氨酸酶抗體結(jié)合， 發(fā)生凝集反應(yīng)，熒光檢測(cè)分析，根據(jù)熒光面積是否增加來(lái)判定待測(cè)樣品中是否存在流感 病毒抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)流感病毒抗體的熒光微量細(xì)胞凝集方法，其特征在于所 述重組表達(dá)流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶的真核細(xì)胞為同時(shí)共同重組表達(dá)流感病毒血凝 素和神經(jīng)氨酸酶，或者分別重組表達(dá)流感病毒血凝素的真核細(xì)胞與重組表達(dá)神經(jīng)氨酸酶 的真核細(xì)胞的混合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)流感病毒抗體的熒光微量細(xì)胞凝集方法，其特征在于所 述重組表達(dá)為瞬時(shí)表達(dá)或穩(wěn)定表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)流感病毒抗體的熒光微量細(xì)胞凝集方法，其特征在于所 述真核細(xì)胞表面重組表達(dá)的流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白為完整全長(zhǎng)的流感病毒血 凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白，或流感病毒血凝素蛋白和神經(jīng)氨酸酶的一部分，或流感病毒血 凝素和神經(jīng)氨酸酶的抗原表位，或?qū)⒘鞲胁《狙睾蜕窠?jīng)氨酸酶蛋白全長(zhǎng)或部分肽段 中的部分氨基酸進(jìn)行突變或修飾。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)流感病毒抗體的熒光微量細(xì)胞凝集方法，其特征在于所 述真核細(xì)胞表面重組表達(dá)的血凝素為甲型流感病毒的HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、 H8、H9、H10, HlU H12、H13、H14、H15、H16亞型、乙型流感病毒或丙型流感病 毒的血凝素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)流感病毒抗體的熒光微量細(xì)胞凝集方法，其特征在于所 述真核細(xì)胞表面重組表達(dá)的神經(jīng)氨酸酶蛋白為甲型流感病毒的Ni、N2、N3、N4、N5、 N6、N7、N8、N9亞型、乙型流感病毒或丙型流感病毒的神經(jīng)氨酸酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)流感病毒抗體的熒光微量細(xì)胞凝集方法，其特征在于所 述流感病毒血凝素抗體和神經(jīng)氨酸酶抗體為IgG、IgM, IgA、IgE、IgD中的一種或幾種 的混合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)流感病毒抗體的熒光微量細(xì)胞凝集方法，其特征在于所 述熒光標(biāo)記為熒光素、熒光蛋白或其它能夠發(fā)出熒光的物質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)流感病毒抗體的熒光微量細(xì)胞凝集方法，其特征在于所 述熒光檢測(cè)分析所用的設(shè)備為熒光顯微鏡、熒光光度計(jì)或多功能微孔板檢測(cè)儀。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 9中任意一條權(quán)利要求所述的檢測(cè)流感病毒抗體的熒光微量細(xì) 胞凝集方法，其特征在于所述真核細(xì)胞為酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或其它真核細(xì) 胞，重組表達(dá)的流感病毒血凝素位于細(xì)胞膜或細(xì)胞壁表面。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)流感病毒抗體的熒光微量細(xì)胞凝集方法。本發(fā)明方法是將流感病毒血凝素基因和神經(jīng)氨酸酶基因克隆后轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，使真核細(xì)胞表面重組表達(dá)流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白，對(duì)重組表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，該細(xì)胞表面的重組表達(dá)的血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白與待測(cè)樣品的流感病毒血凝素抗體和神經(jīng)氨酸酶抗體結(jié)合，發(fā)生凝集反應(yīng)，通過(guò)熒光顯微鏡拍照，根據(jù)熒光面積是否增加來(lái)判定待測(cè)樣品中是否存在流感病毒抗體。本發(fā)明檢測(cè)方法使用熒光標(biāo)記細(xì)胞，減少了細(xì)胞使用量，可進(jìn)行高通量檢測(cè)，可以實(shí)現(xiàn)流感病毒抗體的快速檢測(cè)、早期檢測(cè)、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和評(píng)價(jià)。
文檔編號(hào)G01N33/569GK102023213SQ20101029718
公開(kāi)日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2010年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月28日
發(fā)明者吳嘉偉, 吳彬冰, 孟燕萍, 李衛(wèi)中, 李康生, 李蕊, 王革非, 蔡漢杰, 黃秀梅 申請(qǐng)人:汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院