專利名稱：人甲型流感病毒保護性多肽、其用途、疫苗和診斷工具的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及流行性感冒(以下簡稱流感)的診斷和預(yù)防領(lǐng)域，具體地說，涉及一種對甲型流感病毒感染具有交叉保護作用的多肽和含有該多肽的疫苗。本發(fā)明還涉及流感病毒診斷工具和本發(fā)明多肽的用途。
背景技術(shù)：
流感是由流感病毒引起的嚴重危害人類健康的一種急性病毒性呼吸道傳染病，20世紀曾經(jīng)發(fā)生過四次世界性大流行(1918年、1957年、1968年和1977年)。其中，僅第一次大流行就造成2600萬人死亡，給人類帶來深重的災(zāi)難。根據(jù)美國科學(xué)技術(shù)委員會的報告，近年來美國每年死于流感的人數(shù)達20000～40000，每年用于預(yù)防流感的費用和流感造成的損失超過120億美元(見Service RF.Researchers seek new weapon against the flu.Science，1997，275(5301)756-757.)。目前，對流感尚無完全有效的治療方法。疫苗接種是當(dāng)今防止流感疾病發(fā)生和流行的最有效手段，但目前使用的流感病毒三聯(lián)滅活疫苗(H3N2、H1N1和乙型)還存在下述缺陷(1)有效率只有50～80％(當(dāng)疫苗株與流行株相匹配時)，若疫苗株與流行株不匹配則會更低。由于流感病毒不斷變異，使接種疫苗效果很快減弱，甚至無效(Murphy BR，WebsterRG.Orthomyxoviruses.InFields BN.Knip DM.Chanock RM，et al.Virology，Vol.1.2nded.New York Raven Press 1990，1091-152；Kohn MA，F(xiàn)arley TA，et al.Summer time ourbreaks of influenza type A.J Infect Dis，1995，(7)246-9.)。為了保證免疫效果，世界衛(wèi)生組織在全世界進行流感監(jiān)測，每年根據(jù)監(jiān)測結(jié)果提供流行毒株的預(yù)測信息，推薦代表性毒株作為疫苗生產(chǎn)毒株。但因目前尚無絕對有效的手段對流行株進行預(yù)測，因此常因預(yù)測不準(zhǔn)確而造成疫苗無效；(2)現(xiàn)有滅活疫苗對老年人免疫效果差，而老年人是流感預(yù)防的重點人群；(3)不能激活特異性細胞免疫；(4)由雞胚生產(chǎn)，嚴重的雞蛋過敏病人不能使用；(5)現(xiàn)有雞胚生產(chǎn)方式難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需要，因為這受限于雞胚的供應(yīng)能力和培養(yǎng)能力，因此經(jīng)常存在疫苗供不應(yīng)求的問題。
鑒于上述情況，世界衛(wèi)生組織號召對流感病毒疫苗進行改進，其中如何有效對抗流感病毒，尤其是甲型流感病毒的變異是流感病毒疫苗研制必須要解決的一個難題，最理想的是能研制出一種對各種甲型流感病毒都有交叉保護作用的疫苗。
依據(jù)核殼蛋白(nucleocapsid protein，NP)和基質(zhì)蛋白(matrix protein，M)的特性，可將流感病毒分為甲、乙、丙三型。根據(jù)血凝素(hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)蛋白抗原性的差異，甲型流感病毒又可分為不同的亞型，迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了15個HA(H1～H15)和9個NA亞型(N1～N9)。目前在人群中流行的流感病毒主要為H3N2和H1N1亞型甲型流感病毒和乙型流感病毒。因此甲型流感病毒是流行的主體。
流感病毒的基因組為單股負鏈RNA，分為8個節(jié)段，編碼10種蛋白。流感病毒為有包膜病毒，其包膜來自宿主細胞的雙層脂膜，膜上嵌著HA、NA和M23種蛋白。病毒包膜內(nèi)為基質(zhì)蛋白M1，病毒顆粒內(nèi)部的核殼體呈螺旋絲狀，長約50～60nm，直徑10nm。核殼的蛋白成分包括NP以及由PA、PB1、PB2組成的RNA聚合酶復(fù)合物。另外每個病毒顆粒中還有130～200個NS2分子，與M1蛋白相關(guān)。其中神經(jīng)氨酸酶(NA)和血凝素(HA)兩種抗原的變異性非常強，正是由于它們不斷變異，使流感難以控制。

發(fā)明內(nèi)容
本說明書中使用的氨基酸縮寫的含義如下K賴氨酸 S絲氨酸 L亮氨酸 R精氨酸 H組氨酸 N；天冬酰胺 Q谷氨酰胺 P脯氨酸 W色氨酸 V纈氨酸 D天冬氨酸 I異亮氨酸 G甘氨酸 Y酪氨酸 T蘇氨酸本發(fā)明提供一種具有選自以下序列或其同源序列的氨基酸序列的多肽(a)KSLSRHDHIHHH(SEQ ID NO1)(b)KHHHHKQHGHHI(SEQ ID NO2)(c)KHHHQYKKRHHR(SEQ ID NO3)(d)KTHHTHPPRLPH(SEQ ID NO4)(e)SIRTLPHPGQPP(SEQ ID NO5)
(f)NWPRQKPRSLPH(SEQ ID NO6)(g)VTRHPSHLLHNH(SEQ ID NO7)。
本發(fā)明還提供一種用于預(yù)防流行性感冒的疫苗，該疫苗包含上述(a)-(g)的多肽及生理上可接受的佐劑。
本發(fā)明還提供了一種流感病毒診斷工具，其中含有上述(a)-(g)的多肽。所述診斷工具可以是試紙、試劑盒或芯片形式，也可以是其它合適的形式。
在用于診斷時，所述多肽用來與懷疑感染了甲型流感病毒(H3N2和H1N1亞型病毒)的人或動物或者可能感染的人或動物取得的血清反應(yīng)，有陽性反應(yīng)的表示已經(jīng)受到感染。
本發(fā)明還涉及所述(a)-(g)多肽的用途，該多肽可以用來制備流感病毒疫苗或流感病毒診斷工具。
本發(fā)明的多肽是對現(xiàn)有流行的甲型流感病毒(H3N2和H1N1亞型病毒)感染均有保護作用的模擬表位，可用于流感的預(yù)防或診斷。本發(fā)明的疫苗由于含有所述多肽，對各種甲型流感病毒都有交叉保護作用，因此可有效地預(yù)防甲型流感。
優(yōu)選的多肽是其氨基酸序列為序列(a)或其同源序列的多肽。就本發(fā)明的目的而言，“同源序列”是指與所述序列的同源性為80％以上的序列。
本發(fā)明的多肽可以用本領(lǐng)域常用的多肽合成方法制備(見Tam J P.Synthetic peptide vaccine designsynthesis and properties of a high-densitymultiple antigenic peptide system.Proc Natl Acad Sci USA，1988，855409-5413.)，也可以放在噬菌體上生產(chǎn)。
本發(fā)明的疫苗可以用本領(lǐng)域常用的疫苗制備方法制備。例如，可以將所述多肽以常規(guī)方法與生理上可接受的佐劑混合。作為佐劑可以使用本領(lǐng)域常用的用于流感疫苗的佐劑，例如，目前流感病毒滅活疫苗所使用的佐劑氫氧化鋁；用優(yōu)選能夠增強免疫反應(yīng)的佐劑，如，可以誘導(dǎo)小鼠等動物和人類產(chǎn)生細胞免疫反應(yīng)的核酸佐劑(CpG DNA)。
優(yōu)選的本發(fā)明疫苗是其中所述多肽的氨基酸序列為序列(a)或其同源序列的疫苗。
本發(fā)明是基于這樣一種假設(shè)，即流感病毒，尤其是同型病毒，雖然其抗原性變異很大，但作為同一種病毒肯定存在共同的抗原表位，這種表位應(yīng)該能誘導(dǎo)交叉保護性免疫，即對不同亞型病毒感染均有保護作用。為了驗證這一假設(shè)，我們首先利用隨機肽庫技術(shù)進行甲型流感病毒共同表位的篩選，得到一種模擬的功能表位。在得到這種表位之后，我們用其免疫小鼠，待產(chǎn)生抗體后，分別用H3N2和H1N1亞型流感病毒攻擊，觀察其保護作用。
本發(fā)明在表位篩選中使用了噬菌體隨機肽庫。噬菌體隨機肽庫技術(shù)是近年來興起的一種研究蛋白質(zhì)相互作用的有力工具，因在其表面蛋白中呈現(xiàn)隨機多肽序列而使其篩選非常方便，這一新的蛋白質(zhì)抗原表位分析方法彌補了傳統(tǒng)抗原表位分析方法的不足。噬菌體肽庫已成功應(yīng)用于篩選線性、非線性、甚至非肽類的表位。人工選擇的表位是直接通過與抗體成分結(jié)合而篩選出來的，具有與天然蛋白同樣的免疫原性，可直接刺激機體產(chǎn)生特異性抗體，因此可用于制備疫苗。我們的研究結(jié)果提示了這種可能性(見Kay B K，Adey NB，et al.An M13 phage library displaying random 38 amino acid peptides as asource of a novel segments with affinity to selccted targets.Gene，1993，12859-65；Wrigthton N C，F(xiàn)arrall F X，et al.Small peptides as potent mimics ofthe protein hormones crythropoietin.Science，1996，27458-468；Yanofsky S D，Raldwind D N，et al.High affinity type I interleukin Ireceptor antagonisdiscovered by screening recombinant peptide libraries.Proc Natl Acad Sci USA，1996，937381-7386；Folgoria，Tafir，Meola A，et al.A general strategy to identifymimotopes of pathological antigens using only random peptide libraries andhuman sera.EMBO J.，1994，13(9)2236-2243.)。
本發(fā)明的疫苗與現(xiàn)有流感病毒滅活疫苗相比，具有以下優(yōu)點(1)所含的免疫原性成分是一種模擬表位，可誘導(dǎo)針對不同亞型甲型流感病毒的保護性免疫，從而可有效對抗病毒變異這一難題；(2)容易生產(chǎn)免疫原性多肽序列很短，很容易合成，如果放在噬菌體上也容易生產(chǎn)。(3)可有效誘導(dǎo)細胞免疫。(4)安全性好，所述多肽對人體無害；噬菌體在人體內(nèi)不復(fù)制，對人體是安全的，可避免雞胚生產(chǎn)能力有限和使用者對雞蛋過敏的問題。


圖1示出陽性噬菌體與H1N1和H3N2單抗的免疫反應(yīng)。橫坐標(biāo)為克隆編號。
圖2示出陽性噬菌體免疫小鼠血清流感病毒抗體的檢測結(jié)果。第一、二、三組分別代表呈現(xiàn)第一、二、三組多肽的陽性噬菌體，第四組為野生型M13噬菌體，H1N1和H3N2分別代表相應(yīng)的病毒抗原，每一點代表一只小鼠的檢測結(jié)果。
圖3示出陽性噬菌體免疫小鼠血清流感病毒特異性IgG1/IgG2a抗體亞類檢測。第一、二、三組分別代表呈現(xiàn)第一、二、三組多肽的陽性噬菌體，第四組為野生型M13噬菌體。
圖4示出陽性噬菌體免疫小鼠脾細胞細胞因子檢測結(jié)果。對照組野生型噬菌體對照；第一組呈現(xiàn)第一組多肽的噬菌體免疫小鼠。
圖5示出陽性噬菌體免疫小鼠淋巴細胞CTL活性檢測。第一、二、三組分別代表呈現(xiàn)第一、二、三組多肽的陽性噬菌體，對照組為野生型M13噬菌體對照。
圖6示出A/PR/8/34(H1N1)病毒攻擊后陽性噬菌體免疫小鼠的生存率。第一、二、三組分別代表呈現(xiàn)第一、二、三組多肽的陽性噬菌體，對照組為野生型M13噬菌體。
圖7示出H3N2悉尼株病毒攻擊后第一組陽性噬菌體免疫小鼠組織中流感病毒抗原的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果。A～E為呈現(xiàn)第一組多肽的陽性噬菌體免疫小鼠，F(xiàn)～K為野生型M13噬菌體免疫的陰性對照小鼠。A，F(xiàn)肺；B，G腎；C，H肝；D，J腦；E，K脾。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖進一步闡述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。以下敘述中的試驗部分除特別指明外，均按照常規(guī)條件和方法，如分子克隆實驗室手冊(Sambrook，et al.New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述方法或試劑制造商提供的方法。
1.甲型流感病毒交叉反應(yīng)表位的篩選(1)親和篩選1)用包被液(0.05mol/L NaCHO3，pH9.6)稀釋的流感病毒(H3N2亞型)多克隆抗體(購自中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所)包被96孔酶標(biāo)板(Coster)，100ng/孔，放濕盒中4℃過夜；2)棄包被液，用Tris-HCl-0.05％Tween20(TBST)緩沖液洗板5次；3)加入封閉液，200μl/孔，4℃封閉2h；
4)吸去封閉液，用TBST反復(fù)洗板6次；5)將呈現(xiàn)隨機12肽庫的噬菌體(1×1010PFU)(Ph.D.TMPhage PeptideLibrary，購自美國New England Biolabs公司)稀釋于TBST，每孔加入100μl，室溫下緩慢搖蕩1h；6)吸去噬菌體，用TBST洗10次，每次均用加樣器用力吹打，然后靜置約1min，棄去洗液；7)每孔加入100μl 0.2mol/L甘氨酸-鹽酸(pH2.2)，室溫下放置10min以洗脫結(jié)合的噬菌體；8)每孔加入2mol/L Tris-HCl(pH9.1)15μl進行中和反應(yīng)；9)取2μl噬菌體做空斑滴定，其余噬菌體進行擴增與純化以用于下一輪篩選；10)重復(fù)上述步驟2次；11)將第三輪淘洗的噬菌體感染XL1-Blue菌(New England Biolabs)后，鋪制平板，挑取單個噬斑，制備噬菌體原種；12)用夾心ELISA法鑒定陽性克隆。
結(jié)果顯示，噬菌體展示肽庫在三輪淘洗過程中有明顯的富集效應(yīng)，從每輪加入的噬菌體及洗脫噬菌體數(shù)量，可明顯看到這一現(xiàn)象(表1)每次加入2×1010，隨淘洗次數(shù)增加，洗脫的噬菌體數(shù)也隨之增加，第三輪洗脫數(shù)較第一輪高出近300倍。
表1 噬菌體肽庫淘洗產(chǎn)量比較

(2)陽性噬菌體篩選1)分別將抗H3N2和H1N1亞型流感病毒的單克隆抗體(購自二炮總醫(yī)院)用包被液1∶1000稀釋，包被酶標(biāo)板，100μl/孔，同時以抗?jié)h坦病毒多抗包被酶聯(lián)板作陰性對照；2)TBST洗板3次，每次3min，加入封閉液，37℃封閉2h；3)洗板后往3個包被孔平行加入遞呈肽噬菌體和野生M13噬菌體稀釋液各50μl，37℃孵育1h；4)甩去液體，洗板后加入1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)記標(biāo)兔抗M13噬菌體抗體(Pharmacia公司)，37℃反應(yīng)1h；5)洗板后加入TMB，37℃顯色10min；6)滴加50μl 2mol/L硫酸終止反應(yīng)，測定吸光度(A450)；7)只同流感病毒H3N2和H1N1單抗包被孔反應(yīng)而不同漢坦病毒多抗包被孔反應(yīng)的克隆可判定為噬菌體陽性克隆。
將經(jīng)過第三輪淘洗的噬菌體鋪斑，隨機挑選18個單克隆擴增，ELISA分別檢測與H3N2、H1N1亞型流感病毒抗體的反應(yīng)情況。結(jié)果有12個克隆與H3N2和H1N1抗體均有特異結(jié)合，但與野生型噬菌體無結(jié)合反應(yīng)(圖1)。
(3)噬菌體單鏈DNA的制備和序列分析1)取擴增后的噬菌體液500μl，10000rpm離心10min；2)將上清轉(zhuǎn)移到新微量離心管中加入200μl PEG 8000/NaCl，顛倒混勻，室溫靜置10min；3)10000rpm離心10min，棄上清；4)用100μl碘緩沖液重懸沉淀，加入250μl乙醇，室溫10min；5)10000rpm離心10min，棄上清，用70％乙醇洗滌沉淀，真空干燥；6)用30μl TE緩沖液重懸沉淀；7)取5μl送上海生工公司測序。
對上述ELISA檢測陽性的12個克隆進行DNA序列測定，遞呈十二肽的相應(yīng)序列見表2。在這12個序列中，部分序列完全相同(4/7/15/17/18；11/12)，根據(jù)序列的同源性，將其分為3組(表2)。第一組與H3N2病毒的三種非結(jié)構(gòu)蛋白PA(HIH/SLS)、PB1(SLS)和NS1(LSR)有微弱同源性，其余均無同源性，證明所獲得的多肽表位均為模擬表位。
表2 陽性噬菌體呈現(xiàn)多肽氨基酸序列

2.免疫效果觀察(1)小鼠免疫根據(jù)模擬表位的序列相似性，按表2分組分別免疫6周齡的雌性BALB/c小鼠(購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心)，15只/組，以野生M13噬菌體(Pharmacia公司)為陰性對照，第二組為呈現(xiàn)2種多肽的噬菌體混合免疫、第三組為呈現(xiàn)4種多肽的噬菌體混合免疫。將陽性的噬菌體克隆大量擴增，并用BCA蛋白定量試劑盒(Pierrce公司)測定蛋白濃度。以100μg/只肌肉注射免疫小鼠，0.2ml/只，間隔兩周以30μg/只加強免疫，共免疫三次。
(2)血清IgG抗體檢測分別用純化的H1N1和H3N2亞型流感病毒(衛(wèi)生部長春生物制品研究所提供)包板，100μl/孔，4℃過夜。TBST洗滌后加入封閉液37℃封閉2h，TBST洗滌后加入稀釋的小鼠血清100μl，37℃孵育1h，TBST洗滌，加入1∶10000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG，37℃孵育1h，TBST洗滌；加入TMB底物(Sigma)，37℃顯色10min，加入50μl 2mol/L硫酸終止反應(yīng)，測定A450。
在小鼠第三次免疫兩周后進行尾部采血，1∶10000稀釋其血清，用ELISA法分別檢測抗H3N2和H1N1亞型流感病毒的特異性抗體。結(jié)果顯示，免疫小鼠均產(chǎn)生兩種特異性抗體，而用野生型噬菌體免疫的對照組小鼠無特異性抗體產(chǎn)生(圖2)，證明所篩選的表位均模擬了流感病毒的表位。
(3)IgG亞類測定將不同亞類IgG標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)進行稀釋，以ELISA法測定每個稀釋度相應(yīng)的A450，作出IgG1/IgG2a濃度-A450標(biāo)準(zhǔn)曲線；以相同的ELISA法分別檢測噬菌體免疫后小鼠血中流感病毒特異性抗體IgG1和IgG2a濃度。結(jié)果顯示，陽性噬菌體免疫的三組小鼠血清中的IgG2a含量均明顯高于IgG1的含量，而對照組血清中兩者的含量均很低(圖3)，提示呈現(xiàn)多肽的陽性噬菌體免疫小鼠誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)以細胞免疫反應(yīng)為主。
(4)細胞因子水平檢測在用陽性噬菌體進行3次免疫之后，按常規(guī)方法分離免疫小鼠的脾細胞，用小鼠IL-4和IFN-γ檢測試劑盒(Amsham Pharmaica公司產(chǎn)品)檢測IL-4和IFN-γ分泌水平，操作按試劑盒說明進行。結(jié)果顯示第一組的小鼠分泌很高水平的IFNγ，而IL-4值無明顯增高，未免疫組和野生型M13噬菌體免疫組的兩種細胞因子水平都很低(圖4)，因此再次提示多肽特異性免疫反應(yīng)以細胞免疫反應(yīng)為主。
(5)CTL檢測(Cr51釋放試驗)按常規(guī)方法分離正常未免疫小鼠淋巴細胞，加入與第一組多肽序列一致的合成肽(25μg/ml)制備刺激細胞，將免疫小鼠脾細胞與刺激細胞按10∶1比例混合培養(yǎng)5d，制備效應(yīng)細胞(E)。而后與已經(jīng)用同樣多肽刺激過并加入51Cr(20μCi/ml)的P815靶細胞(T)，按一定比例混合培養(yǎng)6h，測定51Cr釋放量，結(jié)果表明第一組多肽可有效誘導(dǎo)細胞免疫反應(yīng)(圖5)。
上述結(jié)果表明，第一組多肽表位可以誘導(dǎo)以細胞免疫為主的免疫反應(yīng)。多肽誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體可與H3N2和H1N1亞型流感病毒反應(yīng)，提示用該多肽制備的抗體可用于流感病毒的抗原檢測；而多肽表位本身可與H3N2和H1N1亞型流感病毒抗體反應(yīng)，因此也可用于流感病毒的抗體檢測，這充分提示了其在流感病毒診斷中的用途。
3.模擬多肽可誘導(dǎo)交叉免疫保護反應(yīng)為了證實我們篩選到的多肽可對不同亞型流感病毒實現(xiàn)交叉保護，我們以呈現(xiàn)多肽的陽性噬菌體免疫過的小鼠為模型，分別用H1N1或H3N2亞型流感病毒進行攻擊，觀察其保護作用。
(1)對H1N1病毒感染的保護作用在小鼠用呈現(xiàn)多肽的噬菌體免疫3次之后，以5×LD50的A/PR/8/34(H1N1)(購自中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所)鼻腔接種小鼠，觀測小鼠的死亡情況，發(fā)現(xiàn)對照組小鼠第6d開始死亡，在11d內(nèi)全部死亡；陽性噬菌體免疫的三組小鼠第7d才開始死亡，而且在14d內(nèi)尚有小鼠存活，免疫組小鼠的生存率分別為60％、20％和20％(圖6)。以確切概率法統(tǒng)計學(xué)處理小鼠生存率顯示第一組多肽免疫組與對照組生存率之間有顯著性差異(P＜0.05)。說明以抗H3N2亞型抗體篩選出的抗原表位(主要是第一組)可以對H1N1亞型產(chǎn)生保護作用。
(2)對H3N2病毒感染的保護作用由于H3N2亞型沒有小鼠完全適應(yīng)株，病毒不能殺死小鼠，因此無法用觀察小鼠死亡的辦法來評價多肽表位的免疫保護效果。在這種情況下，我們用經(jīng)小鼠多次傳代只有感染性而無致死性的H3N2悉尼株(購自中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所)在噬菌體免疫3次以后進行攻擊，而后通過用免疫組織化學(xué)方法觀察小鼠組織中流感病毒抗原的減少來評價抗原表位的保護作用。在H3N2(悉尼株)病毒感染7d后，處死小鼠分別取肺、脾、肝、腎和腦組織，用4％甲醛固定，石蠟包埋，進行熱抗原修復(fù)。冷卻后用PBS沖洗，滴加50μl過氧化物酶阻斷劑，室溫濕盒內(nèi)孵育10min。PBS沖洗后，再滴加非免疫性動物血清，室溫濕盒內(nèi)孵育15min，然后滴加抗流感病毒H3N2單克隆抗體，置4℃冰箱反應(yīng)過夜。次日用PBS沖洗，滴加生物素標(biāo)記的二抗(中山公司)，室溫濕盒內(nèi)孵育10min。再用PBS沖洗，滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(中山公司)，室溫濕盒內(nèi)孵育15min，PBS沖洗。在顯微鏡下控制DAB顯色至合適程度，用自來水終止反應(yīng)。最后用蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，透明，用中性樹膠封片，顯微鏡下進行觀察。結(jié)果顯示在呈現(xiàn)第一組多肽的噬菌體免疫小鼠的肺和腎中的病毒抗原量明顯少于其它組，肝、脾、腦中均未見到病毒抗原，而野生型M13噬菌體免疫小鼠的臟器中都有病毒抗原存在(圖7)，提示第一組多肽誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)能抑制病毒的復(fù)制，對H3N2病毒感染也有保護作用。
縱上所述，我們篩選出的第一組模擬表位不僅可以和H1N1、H3N2亞型流感病毒抗體結(jié)合，免疫產(chǎn)生的抗體也可以識別H1N1、H3N2亞型流感病毒抗原，且其誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)以細胞免疫為主，這種免疫反應(yīng)對H1N1與H3N2亞型流感病毒感染均有保護作用，表明在甲型流感病毒的預(yù)防和診斷中均具有很好的應(yīng)用價值。
序列表<110>中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所<120>人甲型流感病毒保護性多肽、其用途、疫苗和診斷工具<130>CP1050017<160>7<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>12<212>PRT<213>人工的<220>
<223>模擬表位<400>1Lys Ser Leu Ser Arg His Asp His Ile His His His1 5 10<210>2<211>12<212>PRT<213>人工的<220>
<223>模擬表位<400>2Lys His His His His Lys Gln His Gly His His Ile1 5 10<210>3<211>12<212>PRT
<213>人工的<220>
<223>模擬表位<400>3Lys His His His Gln Tyr Lys Lys Arg His His Arg1 5 10<210>4<211>12<212>PRT<213>人工的<220>
<223>模擬表位<400>4Lys Thr His His Thr His Pro Pro Arg Leu Pro His1 5 10<210>5<211>12<212>PRT<213>人工的<220>
<223>模擬表位<400>5Ser Ile Arg Thr Leu Pro His Pro Gly Gln Pro Pro1 5 10<210>6<211>12<212>PRT<213>人工的
<220>
<223>模擬表位<400>6Asn Trp Pro Arg Gln Lys Pro Arg Ser Leu Pro His1 5 10<210>7<211>12<212>PRT<213>人工的<220>
<223>模擬表位<400>7Val Thr Arg His Pro Ser His Leu Leu His Asn His1 5 10
權(quán)利要求
1.一種具有選自SEQ ID NO1-SEQ ID NO7的序列或其同源序列的氨基酸序列的多肽。
2.權(quán)利要求1的多肽，所述多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO1或其同源序列。
3.一種用于預(yù)防流行性感冒的疫苗，該疫苗包含權(quán)利要求1的多肽及生理上可接受的佐劑。
4.權(quán)利要求3的疫苗，其中所述多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO1或其同源序列。
5.一種流感病毒診斷工具，其中含有權(quán)利要求1的多肽。
6.權(quán)利要求5的診斷工具，其為試紙、試劑盒或芯片形式。
7.權(quán)利要求6的診斷工具，其中所述多肽序列為SEQ ID NO1或其同源序列。
8.權(quán)利要求1的多肽在制備流感病毒疫苗或流感病毒診斷工具中的用途。
9.權(quán)利要求8的用途，其中所述多肽序列為SEQ ID NO1或其同源序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及流行性感冒的診斷和預(yù)防領(lǐng)域。具體地說，涉及一種對甲型流感病毒感染具有交叉保護作用的多肽和含有該多肽的疫苗。本發(fā)明還涉及流感病毒診斷工具和本發(fā)明多肽的用途。
文檔編號G01N33/569GK1827636SQ200510051548
公開日2006年9月6日 申請日期2005年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月4日
發(fā)明者王健偉, 董京芳, 王彥斌, 洪濤 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所