一種包含ERβ的重組病毒及含有其的藥物組合物及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組病毒，其包含病毒載體以及選自如下的基因構(gòu)建體：1）人ERβ基因或其功能片段基因，或其簡并性序列；和2）含有人ERβ基因或其功能性片段基因，或其簡并性序列的嵌合基因；本發(fā)明還涉及人ERβ基因或其功能性片段基因的基因構(gòu)建體用于制備人乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌腫瘤疾病基因治療的藥物及含有該基因治療藥物的藥物組合物的用途；本發(fā)明還涉及一種利用所述重組病毒或藥物組合物進行乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌腫瘤疾病基因治療的方法。
【專利說明】—種包含ERP的重組病毒及含有其的藥物組合物及其用途
[0001]發(fā)命領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及哺乳動物乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌腫瘤疾病的基因治療領(lǐng)域。具體涉及一種利用所述重組病毒或藥物組合物進行乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌腫瘤疾病基因治療的領(lǐng)域。
[0003]發(fā)明背景
[0004]乳腺癌發(fā)生在乳房腺上皮組織，是一種嚴重影響婦女身心健康甚至危及生命的惡性腫瘤，其發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的首位，近年來發(fā)病率呈直線上升趨勢并呈低齡趨勢，大中城市尤為突出，已成為城市女性的第一殺手，每年全世界約有120萬婦女患乳腺癌，50萬婦女死于乳腺癌。在我國，其發(fā)病率也明顯上升，已高出世界平均水平1%~2%，居于我國女性惡性腫瘤死亡率首位，嚴重威脅我國婦女健康。
[0005]乳腺癌是一種異質(zhì)性腫瘤，在組織形態(tài)、免疫表型、生物學(xué)行為及治療反應(yīng)上存在著極大的差異。2000年，美國斯坦福大學(xué)Perou和Sorlie等首先采用cDNA微陣列技術(shù)對乳腺癌手術(shù)標(biāo)本進行分析，根據(jù)基因表達譜的差異將乳腺癌分為5個亞型:Luminal A，Luminal B, Normal-like, HER-2 陽性型及 Basal-1ike 型。2004 年 Nielsen 等又提出了三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)的概念。三陰性乳腺癌是指雌激素受體 a (estrogen receptor, ER α ),孕激素受體(progesteronereceptor, PR)與人表皮生長因子受體 2 (human epidermal growth factorreceptor-2, HER-2)均陰性的乳腺癌，其具有獨特的生物學(xué)行為及臨床病理特征，占全部乳腺癌總數(shù)的10%~15%，具有惡性程度高、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移快、死亡 率高等特點，目前國內(nèi)外仍缺乏針對這類特殊類型乳腺癌的規(guī)范化治療指南。乳腺癌的治療手段多樣，進展迅速，但是可手術(shù)乳腺癌的治療原則仍然是以手術(shù)為主的綜合治療，其綜合治療手段包括手術(shù)、化學(xué)治療、放射治療、內(nèi)分泌治療及生物靶向治療，不同亞型的乳腺癌對治療的反應(yīng)和預(yù)后存在顯著差異。手術(shù)治療仍然是乳腺癌最重要的治療手段。但是自上世紀末起學(xué)術(shù)界的觀點已經(jīng)發(fā)生了很大的變化，首選的手術(shù)方式由根治術(shù)、擴大根治術(shù)向改良根治術(shù)、保乳根治術(shù)轉(zhuǎn)變，并積極開發(fā)應(yīng)用乳腺癌微創(chuàng)治療；在放療方面，放射野越來越小，部分乳房照射有可能代替全乳照射；在內(nèi)科治療方面，更加強調(diào)規(guī)范化、個體化和靶向治療，將根據(jù)化療和內(nèi)分泌藥物敏感性檢測結(jié)果確立全身治療方案；新型藥物主要針對特定分子靶點，亦在積極地研究開發(fā)中。然而，前述幾種現(xiàn)有的治療手段對晚期乳腺癌的治療效果仍然不理想，且仍有較高的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率。由于腫瘤是一種多基因參與的分子疾病，基因治療為乳腺癌的治療提供了一種較為有效和具有臨床應(yīng)用潛力的治療策略。2004年I月?lián)碛形覈灾髦R產(chǎn)權(quán)的重組人P53腺病毒注射液(今又生)獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局的準字號生產(chǎn)批文，世界上第一個獲得國家批準的基因治療藥物業(yè)已正式上市，表明基因治療在臨床疾病治療上的重要價值和廣闊發(fā)展前景。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，乳腺癌基因治療研究取得了很大進展，其目的是最大限度地消滅腫瘤或抑制腫瘤的生長，同時保護正常組織、器官的功能，目前應(yīng)用的基因治療方法主要有抑制癌基因、修復(fù)抑癌基因、自殺基因治療、導(dǎo)入血管新生抑制基因、基因免疫治療等措施，可有效抑制或殺滅乳腺癌細胞。
[0006]雌激素是一種由內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的類固醇性激素，它在乳腺、泌尿生殖系統(tǒng)、骨組織、心血管、免疫系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等多種組織的正常生理和病理過程中均發(fā)揮著重要作用，是調(diào)節(jié)這些靶組織生長與分化的主要因子。人體內(nèi)，雌激素通過與其特異性受體相結(jié)合進而調(diào)節(jié)一系列基因的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮其重要生理作用的。雌激素受體(Estrogen receptor, ER)是一類由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子,是核受體超家族的成員。1986年發(fā)現(xiàn)了第一種ER(ER-a )，10余年里它作為惟一的野生型受體的地位未受到挑戰(zhàn)。經(jīng)大量研究證實，ERa表達與乳腺癌細胞的分化程度、惡性程度、轉(zhuǎn)移部位密切相關(guān)，現(xiàn)已成為乳腺癌分類、評估預(yù)后、指導(dǎo)內(nèi)分泌治療的重要指標(biāo)。在ERa發(fā)現(xiàn)約10年后，1996年瑞典的Kuiper等在研究孤兒核受體時從鼠前列腺癌細胞cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)一種雌激素受體新亞型(ERP ),繼而Mosselman等從人睪丸中克隆出人源性型ERP受體。ERP與ERa屬于核受體超家族成員，但在基因、結(jié)構(gòu)、功能、作用機制、分布等方面均有不同，對雌激素靶器官和組織的生理、病理產(chǎn)生不同的影響，其發(fā)現(xiàn)拓展了我們對細胞內(nèi)雌激素信號途徑及雌激素對靶組織調(diào)節(jié)機制的認識。ER3在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要地位，其表達下調(diào)或缺失可能是乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的一個重要因素。大量研究表明，乳腺癌組織和細胞系中ERi3的表達水平明顯低于正常乳腺上皮細胞，且在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中，ERa升高ERi3下降，ER a/ER^比值升高。目前研究認為，乳腺癌中ERi3表達沉默機制主要是末端組蛋白脫乙酰基作用和基因甲基化作用。Zhao等采用實時定量PCR進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細胞中ER^的mRNA水平明顯低于原代培養(yǎng)的正常乳腺上皮細胞，啟動子ON在正常乳腺上皮細胞中是未甲基化的，而在乳腺癌細胞中存在廣泛的甲基化，啟動子OK在兩種細胞中都是未甲基化的。用組蛋白脫乙酰基酶抑制劑和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理乳腺癌細胞可誘導(dǎo)ERβ表達，并且兩者聯(lián)合使用可恢復(fù)ERa (—)MDA-MB-435細胞對內(nèi)分泌治療的反應(yīng)性。有研究發(fā)現(xiàn)不同的5’非翻譯區(qū)對ERi3表達具有翻譯后調(diào)節(jié)作用，在乳腺癌發(fā)生中具有一定的意義。此外，富含層粘連蛋白的基底膜基質(zhì)也會影響ERβ的表達和細胞形態(tài)，這是細胞微環(huán)境對ER β表達的調(diào)節(jié)。
[0007]大量臨床研究表明，ER^與乳腺癌的治療和預(yù)后亦有很大的相關(guān)性，可能成為一個新的診斷指標(biāo)。Novelli等采用免疫組化方法對936例乳腺癌中ERP I的蛋白水平進行檢測和統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，淋巴轉(zhuǎn)移陽性乳腺癌中ERi3 I表達預(yù)示著復(fù)發(fā)的高風(fēng)險性，而在淋巴轉(zhuǎn)移陰性病例中ER β I表達預(yù)示著對內(nèi)分泌治療的良好反應(yīng)性。Honma等采用免疫組化方法對442例乳腺癌中ERβ N、ERβ I和ER-β 2的蛋白水平進行檢測分析發(fā)現(xiàn)，ER-β N或ER-β I陽性與更好的預(yù)后生存相關(guān)，ER^ I可成為復(fù)發(fā)、總生存和無病生存的獨立預(yù)測指標(biāo)，此外在ERa (-)ER^ ( + )乳腺癌中ER^ I陽性與更好的預(yù)后生存明顯相關(guān)。Shaaban[20]等采用免疫組化方法對757例乳腺癌中ERi3 1、ERi3 2和ERi3 5的蛋白水平進行檢測分析，認為ERi3 2是乳腺癌中與預(yù)后結(jié)果相關(guān)性最大的ER亞型，ERβ 2和ER0 5與總生存明顯相關(guān),ERP 2還與無病生存相關(guān)并預(yù)示著對內(nèi)分泌治療的反應(yīng)性,但是核ERP 2預(yù)示著好的臨床反應(yīng)，而細胞質(zhì)ERi3 2預(yù)示著更差的總生存。該研究結(jié)果與前兩項研究認為ERβ I是最重要的ERi3亞型不同，這可能與不同地域的病例、樣本的采集部位、抗體的特異性與操作技術(shù)以及統(tǒng)計分析方法等有關(guān)，有待進一步的研究。由此可知，不同ERi3亞型的表達以及ER^亞型的細胞內(nèi)定位均會影響乳腺癌的預(yù)后結(jié)果，研究以及指導(dǎo)臨床時需嚴謹?shù)丶右詤^(qū)分考察。ERi3表達可結(jié)合配基而對內(nèi)分泌治療的反應(yīng)性進行調(diào)節(jié)，將來可能協(xié)同ERa —起作為判斷內(nèi)分泌治療反應(yīng)性的指標(biāo)，并可能成為乳腺癌治療的新靶標(biāo)，這對于ERa ( —)乳腺癌的治療尤其意義重大。
[0008]有研究發(fā)現(xiàn)，ER^可通過多種機制產(chǎn)生抑瘤作用，具有對抗乳腺癌發(fā)展的保護性作用，可能成為一個腫瘤抑制基因。通過轉(zhuǎn)染在ERa ( + )乳腺癌細胞系MCF-7、T47D和ER a (-)乳腺癌細胞系MDA-MB-231、SK-BR-3中表達ERP可改變Ciyc、細胞周期蛋白A、Dl和Cdk2、p21wafl/cip\ p27kip1、FasL等相關(guān)蛋白因子的表達，引起細胞周期阻滯，促進細胞凋亡，從而顯著抑制腫瘤細胞的生長，降低腫瘤細胞浸潤轉(zhuǎn)移能力，并抑制體內(nèi)裸鼠移植瘤的形成。在ERa ( + )ERi3 ( + )小鼠乳腺上皮細胞系HCll中，選擇性ERa激動劑可刺激細胞增殖，而選擇性ER β激動劑則抑制細胞生長，雌二醇同時激動ERa和ERP則兩種受體作用疊加的凈結(jié)果為不影響細胞生長。Williams等通過對T47D細胞中的35000個基因進行基因組研究發(fā)現(xiàn)，ER β可抑制ERa信號通路，抑制ERa對其靶基因的調(diào)節(jié)作用，并可改變一些ERi3特異性靶基因的表達。此外，通過轉(zhuǎn)染在乳腺癌細胞中表達ERi3還可引起血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和血小板衍生生長因子(H)GFβ)表達下調(diào)，減少微血管密度，顯著抑制腫瘤血管發(fā)生，協(xié)同其抑制腫瘤細胞生長的作用，可進一步提高體內(nèi)抑瘤效果。綜上可知，向腫瘤細胞中導(dǎo)入ERi3基因并表達能夠通過多種機制產(chǎn)生顯著的抑瘤效果。因此本項目采用基因治療的方法使ERi3在腫瘤中再表達或過表達，從而抑制腫瘤細胞的增殖和浸潤轉(zhuǎn)移，探索一種新的乳腺癌輔助治療方案。此外，有研究發(fā)現(xiàn)向乳腺癌MCF-7細胞中導(dǎo)AER^基因并表達，可通過影響細胞周期和凋亡而增加抗雌激素藥物他莫昔芬、雷洛昔芬和氟維司群的抗腫瘤增殖效果
[0009]基因治療的方法有體外和體內(nèi)治療，具體導(dǎo)入方法又分為病毒和非病毒載體介導(dǎo)，一般臨床試驗方案米用病毒作為載體。任何一種載體都有自身的優(yōu)缺點，沒有一個在安全高效的轉(zhuǎn)導(dǎo)和穩(wěn)定高效的表達方面是完美的。相對而言，病毒載體具有高效低毒、容量大、易于分離等優(yōu)點而成為基因治療中應(yīng)用最為廣泛的載體。腺病毒載體是近年來常用的載體，占全部癌癥基因治療臨床方案的28%以上。重組腺病毒顆粒牢固不易突變，血清滴度高，靶細胞的范圍廣，裝載容量大，可有效地將外源基因轉(zhuǎn)移并表達于多種細胞中，既可轉(zhuǎn)染分裂期細胞又可轉(zhuǎn)染靜止期細胞，這樣可以提高載體的轉(zhuǎn)染效率。與逆轉(zhuǎn)錄病毒家族載體不同，腺病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是非整合型的，以附加體的形式存在，不隨宿主細胞分裂而復(fù)制，是典型的一過性表達載體，因此它安全性高、致瘤性低[30]。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明所要解決問題就是:提供一種安全的，有效的，作用部位明確的治療乳腺癌的新方法，此方法還可借鑒到卵巢癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌的治療上，本發(fā)明的技術(shù)摘要如圖9所示。
[0011]技術(shù)方案:一種重組病毒，包含病毒載體，和如下的基因構(gòu)建體:
[0012]I)人ERi3基因，或其簡并性序列；和
[0013]2)人ERi3基因功能性片段ERP-DBDmut或其簡并性序列的嵌合基因。
[0014]3)病毒載體選自腺病毒載體、慢病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，或者無病毒基因病毒載體。[0015]4 )腺病毒載體為Ad2或Ad5型血清型病毒。
[0016]5)腺病毒載體為復(fù)制缺陷型病毒。
[0017]6)腺病毒載體為El和E3缺失的復(fù)制缺陷型病毒。
[0018]7)人 ER3 基因為選自如下之一:ER3 l，ER32(ER3cx)，ER33，ER34and ER^ 5基因。
[0019]8)含有ERi3 2基因的Ad5型重組腺病毒，其中ERi^ 2基因所編碼的氨基酸序列如SEQ IDNO: 2所示，該基因5’端和3’端分別連接于CMV啟動子和SV40polyA表達控制元件。
[0020]9)用于制備針對哺乳動物腫瘤疾病的基因治療的藥物。
[0021]有益效果:
[0022]I)該技術(shù)的實現(xiàn)將為ERa陰性以及三陰性乳腺癌臨床治療提供新的有效治療方案，大大改善這類患者的預(yù)后生存；
[0023]2)同時為揭示雌激素受體與乳腺癌及其內(nèi)分泌治療的關(guān)系提供新的依據(jù)，并為卵巢癌、前列腺癌等ERi3表達下調(diào)腫瘤的治療提供借鑒。
[0024]【專利附圖】

【附圖說明】:
[0025]圖1重組穿梭 載體質(zhì)粒pShuttle-ERP用SacII/XhoI兩種內(nèi)切酶進行酶切鑒定的電泳圖；
[0026]圖2XhoI內(nèi)切酶對重組腺病毒載體質(zhì)粒pAdxs1-ERP進行酶切鑒定的電泳圖；
[0027]圖3pAdxsi空載體XhoI酶切鑒定的電泳圖；
[0028]圖4構(gòu)建好的重組病毒Ad5-ERP轉(zhuǎn)染MCF-7細胞后檢測ERP蛋白的表達量；
[0029]圖5外源性高表達ER β抑制了 MCF-7細胞的生長，和藥物組合后進一步增強了其抑瘤效果；
[0030]圖6外源性高表達ER β對MCF-7細胞產(chǎn)生了的遷移抑制作用；
[0031]圖7外源性高表達ERi3對MCF-7細胞體外移植瘤產(chǎn)生了抑制作用；
[0032]圖8HE染色對MCF-7細胞體外移植瘤進行病理檢測；
[0033]圖9本發(fā)明的技術(shù)摘要附圖。
[0034]本發(fā)明包括以下步驟:
[0035]LER^蛋白重組腺病毒載體的構(gòu)建與病毒的包裝
[0036]將本實驗室已構(gòu)建的pDsRed2-Nl_ERe質(zhì)粒中ERP融合基因片段通過PCR、雙酶切和連接插入到穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV (加拿大Microbix Biosystems, Inc.公司)中，得到pShuttIe-CMV-ER^。采用AdMax?腺病毒系統(tǒng)按照說明書制備重組腺病毒Ad5_ER β。
[0037]2重組腺病毒對乳腺癌細胞生長的作用
[0038]重組腺病毒體外感染ER β低表達的ER α陽性乳腺癌細胞MCF_7、T47D和ER α陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231，流式細胞儀檢測熒光陽性細胞百分率即為病毒感染率，RT-PCR和western blot檢測ER0相對表達量，流式細胞術(shù)檢測細胞周期和細胞凋亡，四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)、軟瓊脂集落生長實驗和細胞劃痕法考察ER β表達對乳腺癌細胞體外生長和遷移的影響并探討其作用機制。
[0039]3腺病毒介導(dǎo)ERi3基因?qū)嶒炐灾委熑橄侔?br> [0040]將乳腺癌細胞接種于無胸腺小鼠腋窩皮下，建立人乳腺癌細胞移植瘤裸鼠模型。接種細胞后10天左右腫瘤長至50~IOOmm3時，以PBS為空白對照，Ad5為空載體對照，采用高低兩個劑量瘤內(nèi)多點注射重組腺病毒Ad5-ER β進行基因治療研究并探索其機制?！揪唧w實施方式】
[0041]實施例lAd5_ER0重組病毒的制備
[0042]1.將pShuttle-ERP重組穿梭載體的構(gòu)建
[0043]將腺病毒穿梭載體即pShuttle-CMV重組穿梭載體用HindIII/BamHI酶切，CIP去
磷酸化處理，切膠回收3.4kb載體片段。酶切體系及反應(yīng)條件:
[0044]
【權(quán)利要求】
1.一種重組病毒，其特征在于，包含病毒載體，和如下的基因構(gòu)建體: 1)人ERi3基因，或其簡并性序列；和 2)人ERi3基因功能性片段ERP-DBDmut或其簡并性序列的嵌合基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組病毒，其中所述的病毒載體選自腺病毒載體、慢病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，或者無病毒基因病毒載體。
3.權(quán)利要求2所述的重組病毒，其中所述腺病毒載體為Ad2血清型病毒。
4.權(quán)利要求3所述的重組病毒，其中所述腺病毒載體為Ad5型。
5.權(quán)利要求4所述的重組病毒，其中所述腺病毒載體為復(fù)制缺陷型病毒。
6.權(quán)利要求5所述的重組病毒，其中所述腺病毒載體為El和E3缺失的復(fù)制缺陷型病毒。
7.權(quán)利要求1所述的重組病毒，其中所述人ERi3基因為選自如下之一:ER β 1，ER β 2 (ER β cx)，ER β 3，ER β 4and ER β 5 基因。
8.權(quán)利要求7所述的重組病毒，其為含有ERi32基因的Ad5型重組腺病毒，其中ER3 2基因所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，該基因5’端和3’端分別連接于CMV啟動子和SV40polyA表達控制元件。
9.一種重組病毒的應(yīng)用，其特征在于，將權(quán)利要求1至8任一項，用于制備針對哺乳動物腫瘤疾病的基因治療的藥物。
【文檔編號】A61P35/00GK103834690SQ201310466741
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2013年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月9日
【發(fā)明者】涂真珍 申請人:南京郵電大學(xué)