一種包含ERβ的重組病毒的改造方法及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含ERβ的重組病毒的改造方法，其包含病毒載體以及選自如下的基因構(gòu)建體：1）人ERβ基因或其功能片段基因，或其簡(jiǎn)并性序列；和2）含有人ERβ基因或其功能性片段基因，或其簡(jiǎn)并性序列的嵌合基因。本發(fā)明還涉及人ERβ基因或其功能性片段基因的基因構(gòu)建體用于制備人乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌腫瘤疾病基因治療的藥物及對(duì)該基因治療藥物進(jìn)行改造得到的具有靶向性的基因治療藥物。本發(fā)明還涉及一種利用所述重組病毒或其改造物進(jìn)行乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌腫瘤疾病的靶向基因治療的方法。
【專利說明】—種包含ERP的重組病毒的改造方法及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌腫瘤疾病的基因治療領(lǐng)域。
[0002]【背景技術(shù)】
[0003]乳腺癌是一種嚴(yán)重影響婦女身心健康甚至危及生命的惡性腫瘤，其發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的首位,近年來發(fā)病率呈直線上升并呈低齡趨勢(shì),大中城市尤為突出，已成為城市女性的第一殺手。從病理學(xué)角度，乳腺癌是一種異質(zhì)性腫瘤，在組織形態(tài)、免疫表型、生物學(xué)行為及治療反應(yīng)上存在著極大的差異。2004年Nielsen等提出了三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)的概念。三陰性乳腺癌是指雌激素受體α(estrogen receptor, ER α ),孕激素受體(progesterone receptor, PR)與人表皮生長(zhǎng)因子受體 2 (human epidermal growth factorreceptor-2, HER-2)均陰性的乳腺癌，具有獨(dú)特的生物學(xué)行為及臨床病理特征，占全部乳腺癌總數(shù)的10%~15%，具有惡性程度高、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移快、對(duì)內(nèi)分泌治療不敏感、需要化療、預(yù)后差、死亡率高等特點(diǎn)，目前國(guó)內(nèi)外仍缺乏針對(duì)這類特殊類型乳腺癌的有效治療手段。大量研究證實(shí)，ERa表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞的分化程度、惡性程度、轉(zhuǎn)移部位密切相關(guān)，現(xiàn)已公認(rèn)為乳腺癌分類、評(píng)估預(yù)后、指導(dǎo)內(nèi)分泌治療的重要指標(biāo)。ERa陽(yáng)性乳腺癌中，60%的患者對(duì)他旲昔分術(shù)后輔助內(nèi)分泌治療有效,40 %的患者對(duì)內(nèi)分泌治療原發(fā)抗拒；而ERa陰性乳腺癌中，只有10%的患者對(duì)內(nèi)分泌治療有效。且ERa陰性的病人術(shù)后易有復(fù)發(fā)，不論淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移，ERa陰性者預(yù)后較陽(yáng)性者差。
[0004]ER^是1996年瑞典的Kuiper等在研究孤兒核受體時(shí)，從鼠前列腺癌細(xì)胞cDNA文庫(kù)中首先發(fā)現(xiàn)的一種雌激素受體新亞型，與ERa同屬于核受體超家族成員，但在基因、結(jié)構(gòu)、功能、作用機(jī)制、分布等方面均有不同，對(duì)雌激素靶器官和組織的生理、病理產(chǎn)生不同的影響。近年來研究發(fā)現(xiàn)，ER^·可通過多種機(jī)制產(chǎn)生抑瘤作用，具有對(duì)抗乳腺癌發(fā)展的保護(hù)性作用，可能成為一個(gè)腫瘤抑制基因。通過轉(zhuǎn)染在ERa陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、T47D和ERa陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、SK-BR-3中表達(dá)ERP可改變C_myc、細(xì)胞周期蛋白A、Dl和Cdk2、p21wafl/cipl、p27kipl、FasL等相關(guān)蛋白因子的表達(dá)，引起細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，降低腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力，并抑制裸鼠體內(nèi)移植瘤的形成。此外，通過轉(zhuǎn)染在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)ERi3還可引起血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和血小板衍生生長(zhǎng)因子(TOGFP)表達(dá)下調(diào)，減少微血管密度，顯著抑制腫瘤血管發(fā)生，協(xié)同其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，可進(jìn)一步提高體內(nèi)抑瘤效果。因此，向腫瘤細(xì)胞中導(dǎo)入ER3基因并表達(dá)可通過多種機(jī)制產(chǎn)生顯著的抑瘤效果。
[0005]基因治療是近年來興起的一種治療腫瘤的新方法。所謂基因治療是指運(yùn)用分子生物學(xué)方法，將具有治療作用的目的基因?qū)胫涟屑?xì)胞，賦予或增加其某種功能，從而達(dá)到治療疾病的目的。腫瘤是一種多基因參與的分子疾病，基因治療或許可為ERa陰性乳腺癌的治療提供一較為有效的治療策略。腺病毒載體具有高效低毒、容量大、易于分離等優(yōu)點(diǎn)而成為基因治療中應(yīng)用最為廣泛的載體。目前世界上進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)的基因治療制品有80%是采用腺病毒載體。與逆轉(zhuǎn)錄病毒家族載體不同，腺病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是非整合型的，以附加體的形式存在，不隨宿主細(xì)胞分裂而復(fù)制，是典型的一過性表達(dá)載體，因此它安全性高、致瘤性低。
[0006]近年來，已經(jīng)有大量的熒光材料被開發(fā)出來作為熒光生物成像的探針，包括:熒光蛋白、有機(jī)染料、金屬?gòu)?fù)合物以及半導(dǎo)體量子點(diǎn)。這些傳統(tǒng)的熒光染料一般都是基于單光子激發(fā)，由高能量的光激發(fā)出低能量的熒光。這些單光子激發(fā)染料存在以下缺點(diǎn):(i)長(zhǎng)時(shí)間的暴露在高能量的激發(fā)光下會(huì)造成生物體的DNA損傷和細(xì)胞死亡；(ii)來自生物組織的毛發(fā)、血液、組織和皮膚產(chǎn)生的本底熒光使得生物探針的信噪比很低；(iii)對(duì)生物組織的穿透能力低。稀土上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子(UCNPs)是以無機(jī)基質(zhì)為主體，鑭系摻雜元素為客體，且摻雜元素嵌入主體晶格的內(nèi)部而合成的納米晶。
[0007]這種性能獨(dú)特的UCNPs在做生物標(biāo)記成像時(shí)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì):發(fā)射峰窄；發(fā)光易調(diào)控；光學(xué)穩(wěn)定性好；壽命長(zhǎng)；毒性低；對(duì)組織損傷?。唤M織穿透性強(qiáng)；降低本底輻射干擾。UCNPs能夠?qū)⑦B續(xù)吸收的兩個(gè)或多個(gè)泵浦光子轉(zhuǎn)換成短波長(zhǎng)輻射，實(shí)現(xiàn)上轉(zhuǎn)換過程。
[0008]在含有摻雜元素的客體中，又存在敏化劑-活化劑體系，敏化劑(如Yb3+)首先接收近紅外光(NIR)，又通過非輻射能量傳遞，將能量傳遞給活化劑(如Er3+，Tm3+)，使其躍遷到更高的能級(jí)，最終活化劑以輻射的形式釋放出能量，發(fā)射出可見光。目前，氟化物化學(xué)性能穩(wěn)定，聲子能量低(~350CHT1)，發(fā)光效率較高，成為最常用的基質(zhì)。在980nm近紅外光下，以NaYF4作為基質(zhì)，吸收橫截面較大的Yb3+作為敏化劑，Er3+、Tm3+等稀土元素作為活化劑所合成UCNPs，已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。最近已經(jīng)有研究報(bào)道了 UCNPs在生物成像和藥物研究中的一些新的應(yīng)用。因此，UCNPs已經(jīng)成為了一類新型的生物成像標(biāo)記染料。本項(xiàng)目首次制備出激發(fā)光譜和發(fā)射光譜均在近紅外區(qū)的具有腫瘤靶向性及治療作用的上轉(zhuǎn)換納米熒光探針FA-Ad5-ER β -UCNP,并將其導(dǎo)入乳腺腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231中，體外實(shí)驗(yàn)考察其對(duì)ERa陰性乳腺癌細(xì)胞的靶向基因治療作用，并對(duì)其抑瘤機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的研究。另外，借助雙光子激光掃描共聚焦顯微鏡體外監(jiān)測(cè)以實(shí)時(shí)優(yōu)化感染效率，為后期將探針應(yīng)用于深層腫瘤組織的診斷和監(jiān)控治療研究提供理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0009](I)上轉(zhuǎn)換納米熒光粒子標(biāo)記的靶向基因治療藥物FA-Ad5-ERP -UCNP的構(gòu)建及表征
[0010]對(duì)重組腺病毒進(jìn)行葉酸修飾，形成葉酸-重組腺病毒(FA-Ad5-ER β )。用溶劑熱法合成(^-此冊(cè)(似￥?4:￥13，1'111)后，采用聚丙烯酸(PAA)進(jìn)行配體交換反應(yīng)，對(duì)共摻雜了 Yb，Tm的NaYF4納米晶體粒子進(jìn)行了有效的表面修飾，形成上轉(zhuǎn)換熒光納米探針(PAA-UCNPs)。利用PAA上的羧基和葉酸修飾的重組腺病毒(FA-Ad5-ERi3 )上的氨基進(jìn)行反應(yīng)，構(gòu)建激發(fā)和發(fā)射均在近紅外區(qū)的上轉(zhuǎn)換納米熒光粒子標(biāo)記的靶向基因治療藥物FA-Ad5-ERi3 -UCNP。
[0011]重組腺病毒包括腺病毒載體及如下的基因構(gòu)建體
[0012]I)人ERi3基因，或其簡(jiǎn)并性序列；和
[0013]2)人ERi3基因功能性片段ERP-DBDmut或其簡(jiǎn)并性序列的嵌合基因。
[0014](2)考察FA-Ad5-ERP-UCNP對(duì)ERa陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的作用及機(jī)制研
究
[0015]FA-Ad5-ERP-UCNP體外感染ERP低表達(dá)、ERa陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，通過雙光子激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)熒光陽(yáng)性細(xì)胞百分率以優(yōu)化感染條件，提高病毒感染效率。并用顯微鏡進(jìn)行熒光成像分析，考察藥物的靶向性。進(jìn)一步，通過藥理學(xué)檢測(cè)手段，研究轉(zhuǎn)染ERβ基因的乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，如細(xì)胞增值、運(yùn)動(dòng)能力、細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡，以探索ERi3的抑瘤效率及作用機(jī)制。并進(jìn)一步用實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot的方法考察腫瘤微血管密度、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因表達(dá)，以探索其抑瘤機(jī)制。
[0016](3)FA-Ad5-ERP-UCNP介導(dǎo)ERP基因靶向診斷和治療ERa陰性乳腺癌
[0017]將MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞接種于裸鼠腋窩皮下，建立人乳腺癌細(xì)胞移植瘤裸鼠模型。以PBS為空白對(duì)照，F(xiàn)A-Ad5-UCNP為空載體對(duì)照，F(xiàn)A-Ad5_ERβ -UCNP為實(shí)驗(yàn)組，尾靜脈注射給藥。通過上轉(zhuǎn)換熒光在體成像系統(tǒng)實(shí)時(shí)在位監(jiān)測(cè)ERi3基因的表達(dá)，考察FA-Ad5-ERi3-UCNP的感染效率。不斷優(yōu)化給藥方案，提高腫瘤感染效率。同時(shí)，利用該系統(tǒng)實(shí)時(shí)在位跟蹤考察FA-Ad5-ERi3 -UCNP對(duì)腫瘤的靶向診斷作用，跟蹤腫瘤的生長(zhǎng)狀態(tài)以考察治療效果。進(jìn)一步用藥理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)以及免疫組化等常規(guī)方法考察腫瘤微血管密度、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及與之相關(guān)的基因表達(dá)，以探索其抑瘤機(jī)制。
[0018]上轉(zhuǎn)換納米熒光粒子標(biāo)記的靶向基因治療藥物FA-Ad5_ERi3 -UCNP用途:用于制備針對(duì)哺乳動(dòng)物腫瘤疾病的靶向基因治療藥物的疫苗。人的乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌均可治療。
[0019]本發(fā)明的技術(shù)摘要如圖3所示。
[0020]有益效果:
[0021](1)首次將ERi3基因?qū)牖铙w腫瘤模型中，考察其對(duì)ERa陰性乳腺癌的抑制生長(zhǎng)作用，并對(duì)其抑瘤機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的研究。
[0022](2)目前，大多數(shù)基因治療的給藥方案都是瘤內(nèi)注射，這限制了基因治療方法應(yīng)用于一些深層腫瘤的治療。本項(xiàng)目利用葉酸的靶向作用，通過靜脈注射給藥，實(shí)現(xiàn)對(duì)三陰性乳腺癌的靶向基因治療。
[0023](3)傳統(tǒng)的基因治療方法存在轉(zhuǎn)染效率低下，轉(zhuǎn)染效率及治療結(jié)果要等到后期的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后才能獲知的缺陷。本項(xiàng)目借助上轉(zhuǎn)換納米熒光探針在體成像系統(tǒng)無損實(shí)時(shí)在位監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率、轉(zhuǎn)染范圍、腫瘤組織血氧等以實(shí)時(shí)優(yōu)化治療方案，并實(shí)現(xiàn)對(duì)深層腫瘤組織的診斷和監(jiān)控治療。
[0024]【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖LpAdxs1-ERP重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建流程圖；
[0026]圖2FA-Ad5_ERβ -UCNP 構(gòu)建的流程圖；
[0027]圖3本發(fā)明的技術(shù)摘要附圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028]實(shí)施例1上轉(zhuǎn)換納米熒光粒子標(biāo)記的靶向基因治療藥物FA-Ad5_ERi3 -UCNP的構(gòu)建及表征
[0029]對(duì)重組腺病毒進(jìn)行葉酸修飾，形成葉酸-重組腺病毒(FA-Ad5_ERi3 )。用紫外可見分光光度計(jì)分別對(duì)FA、Ad5和FA-Ad5-ERi3進(jìn)行光吸收分析，以確認(rèn)是否成功構(gòu)建FA-Ad5-ER0。并用SDS-PAGE法確定FA是否成功地連接到了 Ad5-ER0上。
[0030]用溶劑熱法合成OA-UCNP (NaYF4: Yb，Tm),并用高分辨透射電子顯微鏡(HR-TEM)、能量彌散X射線分析(EDXA)、X射線衍射(XRD)對(duì)其形貌、粒徑、組成及晶相結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。采用聚丙烯酸(PAA)進(jìn)行配體交換反應(yīng)，對(duì)共摻雜了 Yb，Tm的NaYF4納米晶體粒子進(jìn)行了有效的表面修飾，形成上轉(zhuǎn)換熒光納米探針(PAA-UCNPs)，并用同樣的方法進(jìn)行分析。利用PAA上的羧基和葉酸修飾的重組腺病毒(FA-Ad5-ERi3 )上的氨基進(jìn)行反應(yīng)，構(gòu)建了上轉(zhuǎn)換納米熒光粒子標(biāo)記的靶向基因治療藥物FA-Ad5-ER0 -UCNP。用TEM對(duì)FA-Ad5_ERβ -UCNP進(jìn)行分析，以確認(rèn)是否成功構(gòu)建FA-Ad5-ER0 -UCNP，如圖2所示。并用980nm激發(fā)對(duì)其上轉(zhuǎn)換發(fā)光光譜進(jìn)行分析。
[0031]具體實(shí)驗(yàn)方法，如圖1所示:
[0032]A.葉酸(FA)的活化。
[0033]①稱取22mg FA溶于3ml DMSO中，再加入15.47mg 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)與
15.3mg N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，待溶解后添加0.05ml三乙醇胺(TEA)。
[0034]②置于水浴中40度過夜。
[0035]③4000rpm離心2O分鐘
[0036]④取Iml上清液加入4ml丙酮及2~3滴氨水，至析出FA晶體。
[0037]⑤將丙酮吹干得到FA晶體，溶于Iml Tris0
[0038]B.葉酸(FA)修飾重組腺病毒。
[0039]活化后的FAlml加入Iml重組腺病毒(Ad5_ER β )(濃度為2 X 108pfu/ml)中，4度反應(yīng)4小時(shí),形成葉酸-重組腺病毒(FA-Ad5-ER3 )。
[0040]C.Sephadex G25柱層析分離純化葉酸-重組腺病毒(FA-Ad5_ER β )。
[0041]D.0A-UCNP (NaYF4:Yb, Tm)的制備。
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種包含ERi3的重組病毒的改造方法，其特征在于，對(duì)重組腺病毒進(jìn)行葉酸修飾，形成葉酸-重組腺病毒，用溶劑熱法合成OA-UCNP (NaYF4:Yb, Tm)后，采用聚丙烯酸(PAA)進(jìn)行配體交換反應(yīng)，對(duì)共摻雜了 Yb，Tm的NaYF4納米晶體粒子進(jìn)行了有效的表面修飾，形成上轉(zhuǎn)換熒光納米探針(PAA-UCNPs);利用PAA上的羧基和葉酸修飾的重組腺病毒(FA-Ad5-ERi3 )上的氨基進(jìn)行反應(yīng)，構(gòu)建激發(fā)和發(fā)射均在近紅外區(qū)的上轉(zhuǎn)換納米熒光粒子標(biāo)記的靶向基因治療藥物FA-Ad5-ER0 -UCNP。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的包含ERβ的重組病毒的改造方法，其特征在于，重組腺病毒包括腺病毒載體及如下的基因構(gòu)建體 1)人ERi3基因，或其簡(jiǎn)并性序列；和 2)人ERi3基因功能性片段ERP-DBDmut或其簡(jiǎn)并性序列的嵌合基因。
3.權(quán)利要求1或2中上轉(zhuǎn)換納米熒光粒子標(biāo)記的靶向基因治療藥物FA-Ad5-ERi3-UCNP的應(yīng)用，其特征在于，用于制備針對(duì)哺乳動(dòng)物腫瘤疾病的靶向基因治療藥物的疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述上轉(zhuǎn)換納米熒光粒子標(biāo)記的靶向基因治療藥物FA-Ad5-ER^-UCNP的應(yīng)用，其特征在于，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的上轉(zhuǎn)換納米熒光粒子標(biāo)記的靶向基因治療藥物FA-Ad5-ERi3 -UCNP的應(yīng)用，其特征在于，其中所述腫瘤類型為乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌。
【文檔編號(hào)】C12N15/861GK103623428SQ201310466728
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月9日
【發(fā)明者】涂真珍 申請(qǐng)人:南京郵電大學(xué)