一種抗菌肽及其在制備抗感染藥物、抗腫瘤藥物、免疫促進(jìn)劑和飼料添加劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小菜蛾抗菌肽及其在制備抗感染藥物、抗腫瘤藥物、免疫促進(jìn)劑和飼料添加劑中的應(yīng)用。所述小菜蛾抗菌肽的氨基酸序列如SEQ?ID?No.3所示。本發(fā)明的小菜蛾抗菌肽，對多種細(xì)菌均具有抑殺作用，能用于制備抗感染藥物；對乳腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞具有極顯著的生長抑制作用，具有明顯的體外抗腫瘤活性，能用于制備抗腫瘤藥物；能促使CD4T細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其分泌IFNγ，同時(shí)能抑制IL4合成，調(diào)整Th1/Th2平衡，具備免疫促進(jìn)活性，能用于制備免疫促進(jìn)劑；用作飼料添加劑可顯著提高仔豬的存活率，降低仔豬和育肥豬的腹瀉率，提高仔豬和育肥豬的日增重，降低仔豬和育肥豬的料肉比。
【專利說明】一種抗菌肽及其在制備抗感染藥物、抗腫瘤藥物、免疫促進(jìn) 劑和飼料添加劑中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種抗菌肽及其在制備抗感染藥物、抗腫瘤 藥物、免疫促進(jìn)劑和飼料添加劑中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 抗菌肽（antibacterial peptide)是一類在一定誘導(dǎo)條件下，由宿主細(xì)胞特定編 碼基因產(chǎn)生的、對抗外源性病原體致病作用的防御性多肽類的總稱，具有廣譜的抗菌、抗病 毒作用，是天然免疫系統(tǒng)的組成部分。
[0003] 抗菌肽具有分子量小、穩(wěn)定性高、無免疫原性等特點(diǎn)。部分抗菌肽具在100°C下加 熱10?15min仍能保持其活性；同時(shí)，抗菌肽對較大的離子強(qiáng)度和較高或較低的pH值均具 有較強(qiáng)的抗性，部分抗菌肽尚具備抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力。
[0004] 1975 年瑞典科學(xué)家 G.Boman 等人（Steinerhd et al. Nature, 1981，292:246-248.)從惜古比天香（Hyatophoracecropia)的蛹中誘導(dǎo)分離得 到一種殺菌肽，并將其命名為cecropin。此后許多抗菌肽相繼被分離、純化。一些抗菌肽的 氨基酸一級結(jié)構(gòu)和基因序列得到確定。其后的抗菌肽研究，早期主要集中在大型的經(jīng)濟(jì)昆 蟲來源的抗菌肽、其后又?jǐn)U展到來源于一些小型昆蟲、無脊椎動物及脊椎動物（特別是兩 棲動物）乃至哺乳動物的抗菌肽；另外，細(xì)菌和植物來源的抗菌肽也一直是研究的熱點(diǎn)。
[0005] 已報(bào)道的抗菌肽除了具有廣譜的抗菌、抗病毒作用外，還對部分原蟲具備殺滅作 用；更為令人感興趣的是，一些抗菌肽對癌細(xì)胞具有強(qiáng)有力的殺傷作用，有些抗菌肽還具有 免疫刺激功能。廣袤自然界中還有更多具備強(qiáng)大功能的抗菌肽有待挖掘。
[0006] 抗菌肽中最大的一類陽離子抗菌肽，其作用機(jī)理是破壞細(xì)胞膜，破壞其完整性并 產(chǎn)生穿孔現(xiàn)象，造成細(xì)胞內(nèi)容物溢出胞外而死亡，而不是作用于某個(gè)靶點(diǎn)酶或者受體。所以 在應(yīng)用上，抗菌肽還具有傳統(tǒng)抗生素?zé)o法比擬的優(yōu)越性，即不會誘導(dǎo)抗藥菌株的產(chǎn)生。
[0007] 鑒于抗菌肽的這些特點(diǎn)和功能，長期以來，許多科學(xué)家和技術(shù)人員致力于抗菌肽 應(yīng)用于抗菌藥物、抗腫瘤藥物、動物保健品和飼料添加劑等方面的研究和開發(fā)。
[0008] 但是，抗菌肽的天然產(chǎn)量低，天然提取步驟復(fù)雜、產(chǎn)率低；而化學(xué)合成則價(jià)格相當(dāng) 昂貴；所以利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)抗菌肽，是抗菌肽開發(fā)利用產(chǎn)業(yè)化的必由之路，具有重要 意義。而抗菌肽分子量小，重組表達(dá)時(shí)mRNA穩(wěn)定性差，而且抗菌肽本身對某些工程菌就具 有抑殺作用，所以，如何構(gòu)建高表達(dá)工程菌也是個(gè)關(guān)鍵問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供了一種抗菌肽基因，該基因表達(dá)的抗菌肽抗菌譜廣，具有多種生物活 性。
[0010] 一種抗菌肽基因，堿基序列如SEQ ID. No. 1所示。該抗菌肽基因 pxCAl是通過以 下方法分離獲得的：
[0011] (1)將小菜蛾（Plutella xylostella)幼蟲飼養(yǎng)至4?7日齡，以針蘸取培養(yǎng)至對 數(shù)期的大腸桿菌對小菜蛾腹部進(jìn)行穿刺接種，繼續(xù)飼養(yǎng)24h后提取幼蟲總RNA ;
[0012] (2)對總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA ;
[0013] (3)以所述cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，即獲得所述小菜蛾抗菌肽基因；
[0014] 所述引物的堿基序列為：
[0015] 上游引物：5, -ATGAAACTGTCAAATATTTTCTTTTTC-3,；
[0016] 下游引物：5' -CTATTTCCCGGCAGGTCTAGCG-3'。
[0017] 所述抗菌肽基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯后得到的全長肽段的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所 示。該全長肽段中，第1?22位氨基酸為信號肽，第23?24位氨基酸在翻譯后被切除，第 25?65位氨基酸為成熟肽，即為本發(fā)明所述抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。
[0018] 為實(shí)現(xiàn)所述抗菌肽的大量表達(dá)，本發(fā)明對所述抗菌肽基因編碼序列進(jìn)行了密碼子 優(yōu)化，人工合成獲得了編碼所述抗菌肽的基因，以適應(yīng)具有不同密碼子偏好的工程菌。
[0019] 本發(fā)明提供了兩種編碼抗菌肽的基因，其堿基序列分別如SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示；SEQ ID No. 4所示的基因適合在大腸桿菌中表達(dá)，SEQ ID No. 5所示的基因適合 在酵母中表達(dá)。
[0020] 本發(fā)明還提供了含有所述基因的重組表達(dá)載體，以及含有所述重組表達(dá)載體的重 組工程菌。
[0021] 本發(fā)明提供了兩種重組工程菌，其中，重組工程菌A的出發(fā)菌株為大腸桿菌，所述 基因的堿基序列如SEQ ID No. 4所示；重組工程菌B的出發(fā)菌株為酵母菌，所述基因的堿基 序列如SEQ ID No. 5所示。
[0022] 由于所述抗菌肽對大腸桿菌具有較強(qiáng)的抑殺作用，以大腸桿菌作出發(fā)菌株時(shí)，要 選擇適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用pET32a質(zhì)粒構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，抗菌肽能實(shí)現(xiàn)融 合蛋白形式的可溶性表達(dá)；而采用pET22b質(zhì)粒構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，抗菌肽在大腸桿菌中 單獨(dú)表達(dá)，不僅會抑制大腸桿菌的生長甚至引發(fā)菌體自溶，導(dǎo)致實(shí)際表達(dá)量極低，實(shí)際應(yīng)用 價(jià)值不大。
[0023] 當(dāng)以酵母菌作出發(fā)菌株時(shí)，優(yōu)選采用pGAPZ α A質(zhì)粒構(gòu)建重組表達(dá)載體。pGAPZ α A 質(zhì)粒含丙酮酸激酶強(qiáng)啟動子，能夠啟動插入基因的組成型表達(dá)，不需要甲醇誘導(dǎo)，表達(dá)產(chǎn)物 隨菌體增殖而自然累積并分泌至胞外，發(fā)酵上清不含有毒物質(zhì)甲醇，可直接作為飼料添加 劑加以利用。
[0024] 本發(fā)明所述抗菌肽可采用以下方法制備：
[0025] (i)將重組工程菌A活化后接種至大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液中，發(fā)酵至0D_為0. 5以 上后加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；
[0026] 所述大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液可選用M9補(bǔ)料培養(yǎng)基，IPTG的終濃度為0. 2?ImM，于 37°C下誘導(dǎo)表達(dá)3?4h(0D6QQ達(dá)1. 5以上）；
[0027] (ii)收集菌體并對其進(jìn)行超聲破碎，離心收集上清液，過鎳柱親和層析獲得融合 蛋白，融合蛋白經(jīng)腸激酶剪切后再過鎳柱，獲得初步純化的抗菌肽原液；進(jìn)一步過陽離子交 換柱，即可獲得純化的抗菌肽原液；
[0028] 或者，采用以下方法制備：
[0029] 將重組工程菌B活化后接種至酵母發(fā)酵培養(yǎng)液中，發(fā)酵后收集發(fā)酵上清液；所述 酵母菌優(yōu)選為畢赤酵母，所述酵母發(fā)酵培養(yǎng)液可選用Yro培養(yǎng)基或無機(jī)鹽甘油培養(yǎng)基，發(fā) 酵條件優(yōu)選為在30°c下培養(yǎng)72?120h ;
[0030] 所述發(fā)酵上清液中雜蛋白含量極少，因此可直接視為抗菌肽原液。
[0031] 本發(fā)明還提供了所述抗菌肽在制備飼料添加劑中的應(yīng)用，以及利用所述抗菌肽原 液制備的飼料添加劑。
[0032] 本發(fā)明中，可將所述抗菌肽原液與淀粉混合，獲得所述飼料添加劑。當(dāng)利用重組 工程菌B來制備時(shí)，可直接取發(fā)酵上清液與淀粉混勻，獲得所述飼料添加劑。因抗菌肽在 pGAPZ α A質(zhì)粒的丙酮酸激酶強(qiáng)啟動子作用下，能夠?qū)崿F(xiàn)組成型表達(dá)，不需要甲醇誘導(dǎo)，表達(dá) 產(chǎn)物隨菌體增殖而自然累積并分泌至胞外，發(fā)酵上清液不含有毒物質(zhì)甲醇，可直接用于制 備飼料添加劑。并且酵母菌本身或其分泌物質(zhì)中也含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，也可直接用于飼 喂動物。
[0033] 本發(fā)明還提供了含有所述飼料添加劑的豬飼料，所述豬飼料是在豬基礎(chǔ)日糧中添 加0. 1?2. 0%的飼料添加劑而獲得的。
[0034] 利用所述豬飼料對斷奶仔豬和育肥豬分別進(jìn)行飼喂試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明 的抗菌肽能夠顯著提高仔豬的存活率，腹瀉率與對照組相比降低了 7倍以上，死亡率降低 到〇%，仔豬日增重的提高和料肉比的降低，均達(dá)到差異顯著水平。本發(fā)明的抗菌肽能夠顯 著降低各種致病菌引起的育肥豬腹瀉，同時(shí)對其他疾病也有預(yù)防作用，酵母表達(dá)抗菌肽的 組死淘率顯著低于對照，對各種致病菌引起的腹瀉的保護(hù)率達(dá)到95% -100%，達(dá)到0死亡； 育肥豬日增重的提高和料肉比的降低也均達(dá)到差異顯著水平。
[0035] 本發(fā)明還提供了所述抗菌肽在制備抗感染藥物中的應(yīng)用。
[0036] 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的抗菌肽抗菌譜廣、活性高，對包括抗生素抗性菌在內(nèi)的多種細(xì) 菌均具有抑殺作用；抗菌肽為20 μ g/ml時(shí)，大腸桿菌和甲氧西林抗性菌的存活率均為零。 由此可見，本發(fā)明抗菌肽具有明顯的抗菌活性，能用于抗感染藥物的制備。
[0037] 本發(fā)明還提供了所述抗菌肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0038] 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的抗菌肽還對四種癌細(xì)胞具有顯著的生長抑制作用，并呈現(xiàn)出 明顯的劑量依賴性，IC 5(I在0. 19至0. 86 μ Μ之間，抑制效果遠(yuǎn)超過陽性對照藥物順鉬；與文 獻(xiàn)報(bào)道的其它抗菌肽（IC5(I為幾至幾十μ Μ)比較（高潔等，抗菌肽的抗腫瘤作用研究新進(jìn) 展，世界臨床藥物，2012, 33:620)，則呈一至兩個(gè)數(shù)量級的提高。由此可見，本發(fā)明抗菌肽具 有明顯的體外抗腫瘤活性，能用于抗腫瘤藥物的制備。
[0039] 本發(fā)明還提供了所述抗菌肽在制備免疫促進(jìn)劑中的應(yīng)用。
[0040] 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的抗菌肽能夠激活小鼠機(jī)體免疫系統(tǒng)，促使CD4T細(xì)胞的增殖、 促進(jìn)其分泌IFN γ，同時(shí)能抑制IL4合成，調(diào)整Thl/Th2平衡，進(jìn)而顯著改善小鼠的適應(yīng)型細(xì) 胞介導(dǎo)的免疫功能。提示本發(fā)明的抗菌肽具備免疫促進(jìn)活性，可用于免疫促進(jìn)劑的制備。
[0041] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0042] (1)本發(fā)明從小菜蛾中擴(kuò)增得到全新的抗菌肽基因，其合成并分泌的抗菌肽對包 括抗生素抗性菌在內(nèi)的多種細(xì)菌均具有抑殺作用，由于其為純生物制劑，不易誘導(dǎo)產(chǎn)生抗 藥性，因此可用于開發(fā)多肽類抗菌藥物；
[0043] (2)本發(fā)明的抗菌肽具有明顯的體外抗腫瘤活性，對乳腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、結(jié)腸 癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞具有顯著的生長抑制作用，抗腫瘤活性遠(yuǎn)高于其它的抗菌肽，能用于抗腫 瘤藥物的制備；
[0044] (3)本發(fā)明的抗菌肽能促使⑶4T細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其分泌IFN γ，同時(shí)能抑制IL4 合成，調(diào)整Thl/Th2平衡，具備免疫促進(jìn)活性，可用于免疫促進(jìn)劑的制備；
[0045] (4)本發(fā)明的抗菌肽用作飼料添加劑可顯著提高仔豬的存活率，降低仔豬和育肥 豬的腹瀉率，提高仔豬和育肥豬的日增重，降低仔豬和育肥豬的料肉比。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0046] 圖1為pxCAl基因 PCR擴(kuò)增電泳檢測圖；其中，Μ表示DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（100bp， Thermo, GeneRuler)，泳道 1 為 pxCAl 基因；
[0047] 圖2為本發(fā)明的抗菌肽全長序列與現(xiàn)有小菜蛾抗菌肽序列的比對圖；其中， 7-BAF36816. seq、2_ADD17414. seq、3-ADC54851. seq、4_ADA13281. seq、5_ACX31606. seq、 6-BAF64473. seq表示六個(gè)現(xiàn)有小菜蛾抗菌肽的氨基酸序列，1-專利.seq表示本發(fā)明的抗 菌肽全長序列，consensus表示本發(fā)明的抗菌肽全長序列與所列六個(gè)小菜蛾抗菌肽氨基酸 序列的同源堿基；
[0048] 圖3為工程菌株pET32a-pxCAl/BL21 (DE3)誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE圖；其中，Μ表示 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為未加 IPTG誘導(dǎo)獲得的上清，泳道2為37°C、IPTG誘導(dǎo)并破碎菌 體獲得的上清，泳道3為28°C、IPTG誘導(dǎo)并破碎菌體獲得的上清，泳道4為16°C、IPTG誘導(dǎo) 并破碎菌體獲得的上清，泳道5為37°C、IPTG誘導(dǎo)并破碎菌體獲得的沉淀，泳道6為28°C、 IPTG誘導(dǎo)并破碎菌體獲得的沉淀，泳道7為16°C、IPTG誘導(dǎo)并破碎菌體獲得的沉淀；
[0049] 圖4為Trx-His6-EK-pxCAl融合蛋白經(jīng)Ni2-IDA純化過程圖；其中，Μ表示蛋白質(zhì) 分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為37°C、IPTG誘導(dǎo)并破碎菌體獲得的上清，泳道2為過柱流穿液；泳道3 為Binding Buffer淋洗液；泳道4為60mM咪唑漂洗液；泳道5?9為250mM咪唑洗脫液；
[0050] 圖5為利用腸激酶對Trx-His6-EK_pxCAl融合蛋白進(jìn)行酶切、純化的效果圖；其 中，泳道1、3為酶切Oh ;泳道2、4為酶切16h(溫度分別為15°C和37°C );泳道5為超低分 子量蛋白Marker ;泳道6為空泳道，未上樣；泳道7為剪切物鎳柱純化后初步純化抗菌肽原 液；泳道8為鎳柱純化后繼之以陽離子交換純化的pxCAl抗菌肽原液。
[0051] 圖6為pxCAl抗菌肽的殺菌活性檢測結(jié)果圖；其中，E. coli K12D31表示大腸桿菌 K12D31，MRSA5636表不甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌5636 ;
[0052] 圖7為pxCAl抗菌肽的透明圈法抑菌（金黃色葡萄球菌）效果圖；其中，1為大腸 桿菌表達(dá)提取的抗菌肽原液（5 μ g/ml)，2為畢赤酵母表達(dá)的抗菌肽原液（5 μ g/ml)，3為生 理鹽水，4為氨芐青霉素（1 μ g/ml)，5為氨芐青霉素（10 μ g/ml)，6為PBS。
[0053] 圖8為酵母工程菌株X33/pGAPZ a A-pxCAl發(fā)酵液的Tricine-SDS-PAGE檢測結(jié)果 圖；其中，泳道1為超低分子量蛋白Marker ;泳道2?3分別為2個(gè)不同轉(zhuǎn)化子發(fā)酵96h的 發(fā)酵液；泳道4為出發(fā)菌株X33發(fā)酵96h的發(fā)酵液。

【具體實(shí)施方式】
[0054] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0055] 實(shí)施例1.小菜蛾抗菌肽pxCAl的基因克隆
[0056] 1. 1小菜蛾幼蟲的感染免疫
[0057] 分離小菜蛾幼蟲并人工飼養(yǎng)至4?7日齡，以針蘸取培養(yǎng)至對數(shù)期的大腸桿菌 JM109對小菜蛾腹部進(jìn)行應(yīng)激穿刺，繼續(xù)飼養(yǎng)24h后，提取幼蟲總RNA。
[0058] 1. 2總RNA的提取
[0059] ①將組織標(biāo)本在_80°C預(yù)冷的小研磨中碾碎，往研磨中加入Trizol試劑，每50? 100mg組織加入lml TRIzol試劑（組織塊體積不要超過TRIzol體積的10% )，充分將組織 研磨成勻漿；用移液槍將勻漿液吸入到1. 5ml的EP管，冰上放置5min。
[0060] ②待核酸和蛋白充分解離后，向每lml TRIzol試劑用量的勻漿液中加入0.2ml 氯仿，蓋緊管蓋，手動劇烈震搖15s，然后室溫靜置2?3min，最后于4°C中12000rpm離心 5min。
[0061] ③取上層水相于新的1.5ml的EP管，按每lml TRIZol液加1.5ml異丙醇的比例 加入異丙醇，輕輕振蕩混勻，于4°C中12000rpm離心10min。
[0062] ④棄上清液，按每lml TRIzol加至少lml的比例加入70%乙醇（DEPC水配制）， 用移液槍混勻，于4°C中12000rpm離心5min。
[0063] ⑤棄去上清液，用移液槍小心吸去管壁上殘液，室溫或真空干燥10min，加入50 μ L Rnase Free水充分溶解即得。
[0064] 1. 3逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA
[0065] 使用杭州寶賽公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，對實(shí)施例1獲得的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲取 cDNA。
[0066] 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系見表1 :
[0067] 表 1
[0068]

【權(quán)利要求】
1. 一種抗菌肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。
2. 編碼如權(quán)利要求1所述抗菌肽的基因。
3. 如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，堿基序列如SEQ ID. No. 4或SEQ ID No. 5所 /_J、1 ο
4. 含有如權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體。
5. 含有如權(quán)利要求4所述重組表達(dá)載體的重組工程菌。
6. 如權(quán)利要求5所述的重組工程菌，其特征在于，出發(fā)菌株為大腸桿菌，所述基因的堿 基序列如SEQ ID. No. 4所不； 或者，出發(fā)菌株為酵母菌，所述基因的堿基序列如SEQ ID. No. 5所示。
7. 如權(quán)利要求1所述抗菌肽在制備抗感染藥物中的應(yīng)用。
8. 如權(quán)利要求1所述抗菌肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
9. 如權(quán)利要求1所述抗菌肽在制備免疫促進(jìn)劑中的應(yīng)用。
10. 如權(quán)利要求1所述抗菌肽在制備飼料添加劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/63GK104098666SQ201410344397
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
【發(fā)明者】石應(yīng)輝, 徐冬玲, 桂向東, 李曉祥 申請人:安徽新星生物工程有限公司