雙重檢測(cè)生物傳感芯片及其制備方法和dna檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種雙重檢測(cè)生物傳感芯片，包括襯底，以及設(shè)置于襯底上三電極體系，三電極體系包括生物傳感電極、輔助電極和參比電極，所述生物傳感電極為納米金電極，納米金電極包括設(shè)置于襯底上的透明導(dǎo)電基底，該透明導(dǎo)電基底表面上設(shè)有若干規(guī)則排布的納米金顆粒。本發(fā)明的雙重檢測(cè)生物傳感芯片，將三電極體系中的工作電極采用納米金電極，納米金顆粒的電極結(jié)構(gòu)能進(jìn)行局域表面等離子的光學(xué)生物檢測(cè)；而透明導(dǎo)電基底本身也是N型半導(dǎo)體，實(shí)現(xiàn)電化學(xué)生物檢測(cè)的同時(shí)，其透明特性也不會(huì)影響光學(xué)檢測(cè)的進(jìn)行。
【專利說(shuō)明】雙重檢測(cè)生物傳感芯片及其制備方法和DNA檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物電子電化學(xué)和光學(xué)傳感【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種聯(lián)合電極表面電化學(xué)信號(hào)和局域表面等離子體共振的雙重檢測(cè)生物傳感芯片及其制備方法和檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]局域表面等離子體共振(LSPR,Localised Surface Plasmon Resonance)是金屬納米顆?；蛘卟贿B續(xù)的金屬納米結(jié)構(gòu)被入射光激發(fā)后，其內(nèi)部自由電子的協(xié)同震蕩產(chǎn)生局域表面等離子體共振，金屬納米結(jié)構(gòu)表面的局域電磁場(chǎng)被極大增強(qiáng)，展現(xiàn)強(qiáng)烈的表面等離子體共振吸收。生物傳感芯片利用納米顆粒表面修飾特定捕獲探針，檢測(cè)物質(zhì)與捕獲探針的雜交/親和結(jié)合會(huì)改變傳感器的檢測(cè)平面上納米顆粒本身的震動(dòng)頻率，從而使得傳感器對(duì)入射光產(chǎn)生的吸收峰發(fā)生改變，變化的大小程度與檢測(cè)物質(zhì)的濃度呈正相關(guān)。
[0003]在電化學(xué)檢測(cè)中，比如有酶催化體系主要用于安培型或伏安型電化學(xué)傳感器，利用循環(huán)伏安法進(jìn)行核酸或蛋白分析，操作簡(jiǎn)便、直觀，靈敏度高，常用于蛋白或核酸定量或定性分析。在酶催化放大電化學(xué)傳感器中，常以標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)催化相關(guān)底物反應(yīng)電信號(hào)，在電極表面放大檢測(cè)信號(hào)。差分脈沖伏安法具有靈敏度高、分辨能力強(qiáng)、選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，在分析領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。在定量檢測(cè)方面，常常比分子或院子吸收光譜、大部分色譜方法靈敏。
[0004]但目前，為滿足不同靶物質(zhì)定量或定性檢測(cè)要求，需要同時(shí)進(jìn)行光學(xué)生物檢測(cè)和電化學(xué)生物檢測(cè)等多種檢測(cè)才能確定待測(cè)物的準(zhǔn)確信息；而實(shí)施中則需分別制備上述特定檢測(cè)的電化學(xué)或光學(xué)傳感芯片，每一種傳感芯片只能實(shí)現(xiàn)單一種類檢測(cè)，導(dǎo)致檢測(cè)過(guò)程需要分次重復(fù)，耗時(shí)、成本高；需要分別制備對(duì)應(yīng)的單一傳感芯片，過(guò)程繁瑣。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種高靈敏度、制備簡(jiǎn)單、成本低的聯(lián)合電極表面電化學(xué)信號(hào)和局域表面等離子體共振的雙重檢測(cè)生物傳感芯片，以及其制備方法和檢測(cè)方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下:
[0007]—種雙重檢測(cè)生物傳感芯片，包括襯底，以及設(shè)置于所述襯底上三電極體系，所述三電極體系包括生物傳感電極、輔助電極和參比電極，所述生物傳感電極為納米金電極，所述納米金電極包括設(shè)置于所述襯底上的透明導(dǎo)電基底，該透明導(dǎo)電基底表面上設(shè)有若干規(guī)則排布的納米金顆粒。
[0008]本發(fā)明的雙重檢測(cè)生物傳感芯片，將三電極體系中的工作電極采用納米金電極，納米金顆粒的電極結(jié)構(gòu)能進(jìn)行局域表面等離子的光學(xué)生物檢測(cè)；并且納米金電極包括透明導(dǎo)電基體，而透明導(dǎo)電基體本身是選用N型半導(dǎo)體；同時(shí)能滿足實(shí)現(xiàn)電化學(xué)生物檢測(cè)和光學(xué)生物檢測(cè)，并且同時(shí)結(jié)合LSPR與電化學(xué)的檢測(cè)結(jié)果，可以減少樣品檢測(cè)中的假陽(yáng)性結(jié)果，整體檢測(cè)結(jié)果更加精確。
[0009]本發(fā)明進(jìn)一步還提出一種雙重檢測(cè)生物傳感芯片的制備方法，包括如下步驟:
[0010]制備納米金電極；
[0011]以所述納米金電極作為工作電極，與輔助電極和參比電極組裝成三電極體系。
[0012]采用本發(fā)明上述制備方法，采用在透明導(dǎo)電基底上形成納米金顆粒制成納米金電極，再將納米金電極用于三電極模板中的工作電極，即可同時(shí)實(shí)現(xiàn)光學(xué)和電化學(xué)的檢測(cè)。
[0013]本發(fā)明還提出一種基于雙重檢測(cè)生物傳感芯片的DNA檢測(cè)方法，包括如下步驟:
[0014]獲取待測(cè)DNA;
[0015]將待測(cè)DNA添加至雙重檢測(cè)生物傳感芯片的工作電極上；
[0016]檢測(cè)加樣后的雙重檢測(cè)生物芯片在400nm?800nm光波長(zhǎng)內(nèi)的吸收光譜，以及用差分脈沖伏安法測(cè)定雙重檢測(cè)生物芯片的電流峰譜。
[0017]本發(fā)明的基于雙重檢測(cè)生物傳感芯片的DNA檢測(cè)方法，相比現(xiàn)有的單一檢測(cè)的方式，可以同時(shí)進(jìn)行光學(xué)和電化學(xué)生物檢測(cè)，耗時(shí)短，且能避免分次檢測(cè)的結(jié)果偏差，更加提高了檢測(cè)的精確性和靈敏度；并且同時(shí)結(jié)合LSPR與電化學(xué)的檢測(cè)結(jié)果，可以減少樣品檢測(cè)中的假陽(yáng)性。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，附圖中:
[0019]圖1為本發(fā)明實(shí)施例雙重檢測(cè)生物傳感芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0020]圖2為本發(fā)明實(shí)施例納米金電極制備過(guò)程中壓印板與透明導(dǎo)電基底壓合示意圖；
[0021]圖3為圖2中壓印后抗蝕層表面生成納米級(jí)尺寸凹槽的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0022]圖4為圖3中抗蝕層表面沉積保護(hù)層后的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0023]圖5為圖4中抗蝕層被等離子蝕刻后的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0024]圖6為圖5中保護(hù)層和透明導(dǎo)電基底裸露表面生成Au膜后的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0025]圖7為圖6中去除殘留抗蝕層后獲得的納米金電極結(jié)構(gòu)示意圖；
[0026]圖8為本發(fā)明實(shí)施例雙重檢測(cè)生物傳感芯片進(jìn)行雙重檢測(cè)的示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0027]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0028]本發(fā)明實(shí)例提供了一種聯(lián)合電極表面電化學(xué)信號(hào)和局域表面等離子體共振的雙重檢測(cè)生物傳感芯片，參見圖1，其包括襯底I，該襯底I的表面上設(shè)置有納米金電極2、以及輔助電極3和參比電極4組成的三電極體系；
[0029]其中納米金電極2包括一設(shè)于襯底I上的透明導(dǎo)電基底21，該透明導(dǎo)電基底21表面上設(shè)有納米金顆粒；納米金顆粒尺寸大小為納米級(jí)，本發(fā)明中優(yōu)選采用20?80nm。且進(jìn)一步地，在本發(fā)明中納米金顆粒的數(shù)量可以有若干，整體規(guī)則、有序、均勻分布排列，可以提高LSPR傳感器對(duì)界面變化檢測(cè)的靈感度。
[0030]在本發(fā)明中，上述襯底I在實(shí)施中采用玻璃即可，基于其功能和電極襯底的效果用石英、亞克力等透明度和強(qiáng)度較好的材料進(jìn)行也可以，實(shí)施中也可以采用PCB。
[0031]并且為了使本發(fā)明中的三電極體系相比現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)三電極能夠具備微量檢測(cè)的功能，其中參比電極4用標(biāo)準(zhǔn)Ag/AgCl電極；輔助電極3用鉬黑電極、也可以使用在研究介質(zhì)中保持惰性的金屬材料如N1、W、Pb等，保證輔助電極3上的電流密度，使其在測(cè)量過(guò)程中基本上不被極化。
[0032]鑒于傳統(tǒng)的傳統(tǒng)的三電極體積龐大，化學(xué)試劑消耗較大，制備工藝繁瑣，僅適于大量檢測(cè)，因此在本發(fā)明中上述三電極體系采用絲網(wǎng)印刷方法進(jìn)行制作，采用絲網(wǎng)印刷電極制備三電極，本身絲網(wǎng)印刷技術(shù)具有如下特點(diǎn):1、適用于各種材質(zhì)，如S1、PVC、PC、PET、PU等材料均可使用；2、可以在基底表面印刷各種圖案，設(shè)計(jì)十分靈活；3、印刷過(guò)程易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化；4、重現(xiàn)性好；5、成本低廉；因此，絲網(wǎng)印刷技術(shù)能夠大批量生產(chǎn)重現(xiàn)性好的生物傳感器，而且制備的三電極體系可以用于非常微量的標(biāo)樣檢測(cè)。
[0033]本發(fā)明采用將現(xiàn)有電化學(xué)生物檢測(cè)芯片中的工作電極用能夠進(jìn)行局域表面等離子共振光學(xué)生物檢測(cè)的納米金電極2進(jìn)行；其中納米金電極2中的采用透明導(dǎo)電基底21 ；實(shí)施中該透明導(dǎo)電基底優(yōu)選為ITO即氧化銦錫，本身是一種N型半導(dǎo)體材料，具有良好的導(dǎo)電性、透明性和黏附性等獨(dú)特性能，在本發(fā)明中將其進(jìn)行加工形成厚度為納米級(jí)的玻璃膜的形式固設(shè)于襯底I上，然后在透明導(dǎo)電基底21表面上蝕刻形成納米金顆粒結(jié)構(gòu)，能進(jìn)行局域表面等離子的光學(xué)生物檢測(cè)，而且由于ITO本身又是導(dǎo)體，本發(fā)明中將其作為工作電極的基底，那么便可以用于電化學(xué)生物檢測(cè)，其材質(zhì)和導(dǎo)電的整體性能可以最優(yōu)地滿足本發(fā)明中進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)中的導(dǎo)電性能，以及作為光學(xué)檢測(cè)中基底的條件。當(dāng)然，該透明導(dǎo)電基底21除了上述ITO薄膜或者薄片之外，還可以采用同等性質(zhì)的AZO(鋁摻雜的氧化鋅)、FTO(SnO2:F)、PET-1TO等透明導(dǎo)電薄膜及玻璃進(jìn)行替換，皆可。為了使得ITO基底能夠較好地接入檢測(cè)，納米金電極2還包括與ITO基底連接的導(dǎo)電接口 22，更加便于電連接后進(jìn)行檢測(cè)。
[0034]當(dāng)然，進(jìn)一步地，本發(fā)明的雙重檢測(cè)生物傳感芯片，其納米金電極2上固定有靶向設(shè)計(jì)DNA探針，通過(guò)該DNA探針與待測(cè)的DNA特異性結(jié)合引起檢測(cè)中光譜或者電信號(hào)的差異，從而得出待測(cè)DNA的定量和定性結(jié)果。
[0035]本發(fā)明進(jìn)一步提出上述雙重檢測(cè)生物傳感芯片的制備方法，包括如下步驟:
[0036]S10，制備納米金電極；
[0037]S20，組裝雙重檢測(cè)生物傳感芯片；
[0038]S30，在納米金電極上固定DNA探針；
[0039]其中在本發(fā)明上述步驟中，步驟SlO為制備納米金電極，其具體實(shí)施中可以采用如下步驟進(jìn)行，具體可以參見圖2-7所示的示意圖:
[0040]S11，獲取一 ITO玻璃211，并將其表面進(jìn)行清洗、干燥后備用；
[0041]S12，在ITO玻璃211表面涂布一抗蝕層212 ；
[0042]S13，在抗蝕層212的表面上生成納米級(jí)尺寸的凹槽214 ；
[0043]S14,在抗蝕層212的非凹槽表面沉積一保護(hù)層215 ；
[0044]S15，將沉積有保護(hù)層215的ITO玻璃211進(jìn)行等離子蝕刻，除去位于凹槽214部位的抗蝕層212，并使位于該凹槽214部位的ITO玻璃211表面裸露；
[0045]S16，在步驟S15所制備的ITO玻璃211的裸露表面生成納米級(jí)厚度的Au膜216 ；
[0046]S17，再用氧氣等離子體處理，除去殘余的抗蝕層212，即得到ITO-納米金電極。
[0047]其中上述步驟S13中，抗蝕層212表面納米級(jí)尺寸凹槽214的形成在本發(fā)明中采用納米壓印技術(shù)進(jìn)行，其具體實(shí)施中可以選用一壓印板213，該壓印板213的壓印面上具有若干規(guī)則排布的尺寸為納米級(jí)的凸模型213a，將壓印板213的壓印面與抗蝕層212壓合，那么便能在抗蝕層212表面上形成與上述納米級(jí)的凸模型213a適配的凹槽214。當(dāng)然，本發(fā)明納米壓印實(shí)施中，鑒于檢測(cè)的需要，凸模型213a和凹槽214的形狀可以根據(jù)檢測(cè)的需求進(jìn)行設(shè)計(jì)，當(dāng)然一般為了檢測(cè)光譜的譜帶更加優(yōu)良，形狀優(yōu)選規(guī)則幾何形狀。
[0048]在完成上述納米金電極后，這一納米金電極其表面的納米金可以直接用于局域表面等離子光學(xué)生物檢測(cè)，進(jìn)一步為了滿足能夠同時(shí)進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)的功能，進(jìn)一步采用步驟S20組裝雙重檢測(cè)生物傳感芯片，在步驟S20中采用將SlO所制備的納米金電極安裝在三電極模板上。
[0049]在組裝完成雙重檢測(cè)生物芯片之后，為了能使其正常工作并進(jìn)行檢測(cè)，需要在步驟SlO完成的納米金電極上固定DNA探針；其中DNA探針可以通過(guò)現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)固定在金電極表面，但是在本發(fā)明中為了使探針的特異性，采用本發(fā)明如下定向錨定技術(shù)進(jìn)行DNA探針的固定，包括:
[0050]S31，電極活化:將所得的納米金電極分別用HNO3溶液、丙酮和純水清洗，干燥；[0051 ] S32，形成羥基單分子層:室溫下，將納米金電極用巰基乙酸溶液浸泡處理后，清洗干燥，則納米金電極上形成羥基單分子層；
[0052]S33，將具有羥基單分子層的納米金電極于含有偶聯(lián)劑和單鏈的DNA探針的MES (pH優(yōu)選6.5)溶液中浸泡處理；
[0053]S34,清洗、干燥,低溫保存?zhèn)溆谩?br> [0054]其中，步驟S31中因?yàn)榧{米金電極的表面極易發(fā)生鈍化，導(dǎo)致表面納米金顆粒的的結(jié)合力以及活性下降，因此本發(fā)明在使用時(shí)先將納米金電極用硝酸溶液進(jìn)行清洗，將其表面的鈍化膜、有機(jī)物、無(wú)機(jī)物等去除，進(jìn)行極化，使其電極達(dá)到能產(chǎn)生較好的電勢(shì)。
[0055]步驟S32和步驟S33中采用巰基乙酸對(duì)納米金電極進(jìn)行處理，并在偶聯(lián)劑偶聯(lián)劑(EDAC，或者EDAC與NHS混合)作用下，使金電極表面形成自由-OH基團(tuán)，自由-OH基團(tuán)與探針DNA5’ -端磷酸基團(tuán)通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合，將DNA探針的5’ -端定向錨定在金電極表面，避免了 DNA探針?lè)翘禺愋晕健?br> [0056]并進(jìn)一步在上述步驟S33中的DNA探針包括捕獲探針和二茂鐵標(biāo)記的特異DNA雜交指示信號(hào)探針，捕獲探針設(shè)計(jì)本身與待測(cè)樣品中靶DNA的雜交，使待測(cè)樣品中靶DNA序列能結(jié)合在DNA探針上，那么便實(shí)現(xiàn)檢測(cè)；而在捕獲探針之外，本發(fā)明DNA探針還包括用于雜交檢測(cè)的信號(hào)探針，該信號(hào)探針與雙鏈DNA中靶DNA序列的另一互補(bǔ)鏈為互補(bǔ)設(shè)計(jì)，檢測(cè)時(shí)捕獲探針和二茂鐵標(biāo)記的特異DNA雜交指示信號(hào)探針?lè)謩e與雙鏈DNA中的靶序列、以及靶序列互補(bǔ)序列互補(bǔ)識(shí)別，形成類似于脫氧核糖核苷酸單鏈“三文治”包夾結(jié)構(gòu)，信號(hào)探針上標(biāo)記有標(biāo)記物根據(jù)標(biāo)記物釋放的信號(hào)，根據(jù)反應(yīng)中信號(hào)變化便可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)樣品的目的。上述實(shí)施方式中DNA探針為根據(jù)已知的特異性基因進(jìn)行設(shè)計(jì)，如果檢測(cè)中待測(cè)DNA樣品能與這一 DNA探針進(jìn)行結(jié)合，那么便可以認(rèn)定待測(cè)的DNA即為該DNA探針?biāo)鶎俚陌行蛄蓄愋?；如果檢測(cè)中無(wú)法結(jié)合，那么說(shuō)明待測(cè)DNA的類型與DNA探針?biāo)龅陌行蛄蓄愋筒黄ヅ?，那么可以更換DNA探針，重復(fù)檢測(cè)過(guò)程，直至能得出待測(cè)DNA的類型為止。
[0057]并且，本發(fā)明采用上述二茂鐵分子標(biāo)記的信號(hào)探針進(jìn)行電化學(xué)生物檢測(cè)，因?yàn)槎F本身是一類具有夾心型結(jié)構(gòu)的富電子化合物，在適當(dāng)?shù)碾妱?shì)條件下，二茂鐵分子向電極表面轉(zhuǎn)移電子的效率有其余電極表面距離遠(yuǎn)近的影響，當(dāng)距離靠近時(shí)，二茂鐵分子中的Fe(II)氧化為Fe(III)的電子轉(zhuǎn)移效率高，可獲得較高的氧化還原峰電流；當(dāng)距離拉開時(shí)，其電子轉(zhuǎn)移效率降低，相應(yīng)的峰電流減弱。因此，充分利用二茂鐵分子電子轉(zhuǎn)移效率對(duì)距離的依賴性和分子識(shí)別元件與目標(biāo)物結(jié)合前后的構(gòu)象變化，可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同目標(biāo)物的檢測(cè)。二茂鐵在鄰近雜交效應(yīng)的研究中，對(duì)目標(biāo)DNA檢測(cè)的線性范圍可達(dá)lfM。因此采用二茂鐵作為信號(hào)探針的電信號(hào)檢測(cè)指示劑，使本發(fā)明中檢測(cè)的結(jié)果，還能大大提高檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度。
[0058]當(dāng)然，需要指出的是，本發(fā)明上述制備的ITO-納米金電極其本身的納米金材質(zhì)，容易被氧化和鈍化，因此在上述制備中進(jìn)行清洗后干燥時(shí)，需要在氮?dú)馓峁┑谋Ｗo(hù)氣氛氛圍下進(jìn)行干燥，避免其被氧化等。當(dāng)然出于相同的目的，氮?dú)庖部梢圆捎猛瑯泳哂斜Ｗo(hù)作用惰性等氣體替換皆可。并且在本發(fā)明中，上述步驟S30進(jìn)行DNA探針固定在S20組裝成三電極之后進(jìn)行；如果組裝直接進(jìn)行使用，那么DNA探針固定步驟也可在步驟S20組裝之前進(jìn)行。
[0059]采用本發(fā)明上述制備方法，采用在ITO玻璃基材上形成納米金顆粒制成納米金電極，再將納米金電極用于三電極模板中的工作電極，即可同時(shí)實(shí)現(xiàn)光學(xué)和電化學(xué)的檢測(cè)。并且納米金電極采用納米壓印技術(shù)，在ITO玻璃基材上形成具有規(guī)則、有序、均勻排列或者分布的的納米金顆粒結(jié)構(gòu)，提高LSPR傳感器對(duì)界面變化檢測(cè)的靈感度。
[0060]同時(shí)，進(jìn)一步為了保證測(cè)量的準(zhǔn)確，本發(fā)明采用定向錨定將DNA探針固定在納米金電極表面，避免了 DNA探針?lè)翘禺愋晕?，進(jìn)一步提升了測(cè)量的準(zhǔn)確性。
[0061]基于本發(fā)明上述雙重檢測(cè)生物芯片，本發(fā)明提出一種基于該雙重檢測(cè)生物芯片的DNA檢測(cè)方法，參考如下步驟進(jìn)行:
[0062]S100,獲取待測(cè)DNA樣品；
[0063]S200，將待測(cè)DNA樣品添加至工作電極上，靜置后沖洗干燥；
[0064]S300,雙重檢測(cè)，參見圖8所示:
[0065]用紫外分光光度計(jì)對(duì)雙重檢測(cè)生物芯片在400nm?800nm光波長(zhǎng)內(nèi)測(cè)量吸收光譜；
[0066]用差分脈沖伏安法測(cè)定雙重檢測(cè)生物芯片的電流峰譜。
[0067]在上述檢測(cè)過(guò)程中屬于樣品測(cè)試，在實(shí)施過(guò)程中可以再相同的條件下以相同的雙重檢測(cè)生物芯片不添加樣品作為對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比參考，或者將上述步驟S200之前，未添加待測(cè)DNA樣品時(shí)的雙重檢測(cè)生物芯片進(jìn)行吸收光譜和電流峰譜檢測(cè)，將檢測(cè)的吸收光譜和電流峰譜作為未加樣的對(duì)照。
[0068]為了使本發(fā)明上述方法更加清楚并易于理解，以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)行舉例說(shuō)明:
[0069]實(shí)施例1
[0070]S11，選用厚度為1mm、直徑為Icm的ITO圓形玻璃基材，分別用氨水、乙醇和蒸餾水超聲清洗3分鐘，用氮?dú)獯蹈桑?br> [0071]在這一步驟中，采用將ITO玻璃基材為了電極組裝及電極制備方便，選擇為圓形；當(dāng)然也可以根據(jù)所需用其他的規(guī)則或者不規(guī)則的形狀替換均可，并不僅僅限定于圓形形狀。
[0072]S12，在步驟Sll清洗后的ITO圓形玻璃基材上涂布單層壓印抗蝕劑如樹脂等，在ITO圓形玻璃基材上形成一樹脂層；
[0073]S13，獲取一壓印板，該壓印板的壓印面具有納米級(jí)的凸模型；將該壓印板的壓印面朝向樹脂層與ITO圓形玻璃基材壓合之后，再取掉壓印板，則在抗蝕層的表面上形成與凸模型適配的凹槽；
[0074]凹槽的形狀，在本發(fā)明中為了保證檢測(cè)中光譜的精確性，該凹槽的形狀優(yōu)選為規(guī)則形狀，其尺寸大小為納米級(jí)；這些凹槽的數(shù)量為若干個(gè)，整體在抗蝕層表面上均勻、有序、規(guī)則的排列，可以提高LSPR傳感測(cè)量中對(duì)界面變化檢測(cè)的靈感度。
[0075]S14，將壓印有上述納米級(jí)凹槽的ITO圓形玻璃基材斜置45度，在樹脂層表面沉積一層20nm的金屬鉻(Cr)層；并且由于抗蝕層表面存在上述納米級(jí)凹槽，那么金屬鉻(Cr)層沉積于樹脂層非凹槽的表面部位，凹槽部中則不會(huì)沉積上金屬鉻(Cr)層；該金屬鉻(Cr)層作為保護(hù)層，防止步驟S15中的等離子蝕刻導(dǎo)致樹脂層整體被蝕刻，而不能形成特定的納米金顆粒結(jié)構(gòu)。
[0076]S15,將沉積有金屬鉻(Cr)層的ITO圓形玻璃基材置于洗膠機(jī)中，使用氧氣等離子體進(jìn)行沖洗、刻蝕；那么在沖洗、蝕刻的處理中，非凹槽表面具有金屬鉻(Cr)層保護(hù)，則這一部分的抗蝕層不會(huì)被蝕刻去除，而由于凹槽內(nèi)表面沒(méi)有上述金屬鉻(Cr)層的沉積，那么位于凹槽部分的樹脂層會(huì)被蝕刻去除，使ITO圓形玻璃基材相對(duì)于凹槽部位的裸露；
[0077]S16，在步驟S15所形成的ITO圓形玻璃基材的表面裸露部位上進(jìn)行電子束蒸鍍，將20nm Au顆粒均勻蒸鍍，使ITO圓形玻璃基材的表面裸露部位生成一層Au膜；
[0078]S17，當(dāng)然由于采用蒸鍍的方式進(jìn)行，那么在殘留的抗蝕層表面上也會(huì)生成Au膜；那么再用氧氣等離子體處理，除去殘余的樹脂層整體除去，那么便能在ITO圓形玻璃基材表面形成均勻、有序、規(guī)則排列的納米金顆粒；即為本發(fā)明納米金電極。
[0079]進(jìn)一步采用本發(fā)明上述雙重檢測(cè)生物傳感芯片進(jìn)行檢測(cè)，需要先固定探針后再添加待測(cè)DNA樣品進(jìn)行檢測(cè)，步驟示例如下:
[0080]S31，電極活化:將所制得的納米金電極分別用HN03(1:1)溶液、丙酮和純水超聲清洗2分鐘后，氮?dú)獯蹈桑?br> [0081]S32，室溫下，將ITO-納米金電極在40mmol/L的巰基乙酸溶液中浸泡6小時(shí)，用超純水沖洗電極2分鐘，氮?dú)獯蹈?，使ITO-納米金電極上形成羥基單分子層；
[0082]S33,步驟S32所得電極浸泡在40mmol/L MES (包含lmg/ml EDAC和lmg/ml單鏈DNA探針)pH = 6.5的DNA固定緩沖液中，25°C處理24小時(shí)；
[0083]其中在這一步驟中單鏈DNA探針采用根據(jù)人HIV病毒基因組設(shè)計(jì)捕獲探針和信號(hào)探針:
[0084]捕獲探針TCATTGATGGTCTCTTTTAACA-SH(5’-3’)；
[0085]信號(hào)探針[Fe]C [Fe] G [Fe] C [Fe] GCTTA [Fe] C [Fe] G [Fe] C [Fe] G (EO) 3TTTGCATGGCTGCTTGATGTC(5’-3’)；
[0086]S34，將步驟S33獲得的電極用40mmol/L MES pH = 6.5清洗3遍，去除游離未固定的單鏈DNA探針?lè)肿?，氮?dú)獯蹈桑蜏乇４鎮(zhèn)溆茫?br> [0087]本發(fā)明上述納米金電極固定好DNA探針之后,初步僅能實(shí)現(xiàn)納米金顆粒的局域表面等離子共振的光學(xué)檢測(cè)，為了使其還能在電化學(xué)檢測(cè)中實(shí)現(xiàn)其功能，那么將納米金電極作為工作電極安裝于三電極模板上，輔助電極選擇鉬，參比電極為Ag/AgCl電極，共同組成三電極體系，組裝成本發(fā)明雙重檢測(cè)生物傳感芯片。
[0088]采用上述組裝成雙重檢測(cè)生物傳感芯片進(jìn)行檢測(cè)的步驟參考下述步驟進(jìn)行:
[0089]S100，取I μ I待測(cè)DNA樣品(這一實(shí)施例1中含有本發(fā)明所篩選的把金銀序列HIV target-sequence)；
[0090]在這一步驟中DNA待測(cè)溶液作為樣品，可以采用現(xiàn)有的試劑盒從待測(cè)的細(xì)菌、組織細(xì)胞等提取。
[0091]S200，采用本發(fā)明中的雙重檢測(cè)生物傳感芯片進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，分兩組進(jìn)行；
[0092]實(shí)驗(yàn)組:取上述步驟SlOO中的待測(cè)DNA樣品，滴加至雙重檢測(cè)生物傳感芯片的工作電極上，室溫靜置I小時(shí)；使用washing buffer沖洗電極后，并用氮?dú)饬鞲稍铮?br> [0093]對(duì)照組:在雙重檢測(cè)生物傳感芯片的工作電極上滴加不含上述目標(biāo)HIVtarget-sequence的溶液(在這里可以是緩沖液、或者是其他DNA溶液)；
[0094]S300，參見圖X所示，進(jìn)行LSPR和CV雙重傳感芯片雙重檢測(cè)；分別使用紫外分光光度計(jì)對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的工作電極在400nm?800nm光波長(zhǎng)內(nèi)測(cè)量其吸收光譜；觀察此時(shí)光譜與空白對(duì)照(不含有HIV target-sequence)的LSPR的光譜吸收峰的變化；
[0095]并且使用差分脈沖伏安法測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的電流峰。
[0096]采用上述實(shí)施例1的檢測(cè)方式，在LSPR的光譜吸收峰的結(jié)果對(duì)比中，實(shí)驗(yàn)組的吸收峰相機(jī)對(duì)照組的吸收峰發(fā)生了向右移動(dòng)，則表明DNA與LSPR傳感器表面固定的探針發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，即表明所檢測(cè)樣品中含有該檢測(cè)探針?biāo)鶎?duì)應(yīng)的靶序列。
[0097]而在對(duì)照組測(cè)量中LSPR的光譜吸收峰若吸收峰未出現(xiàn)移動(dòng)，則表明DNA與LSPR傳感器表面固定的探針沒(méi)有特異性結(jié)合，即表明所檢測(cè)樣品中沒(méi)有含有該DNA探針?biāo)鶎?duì)應(yīng)的靶序列；當(dāng)然在測(cè)量過(guò)程過(guò)中也偶爾出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的吸收峰相比對(duì)照組向左移動(dòng)，則是因?yàn)楸还潭ǖ腄NA探針在檢測(cè)或者洗脫的過(guò)程中脫落，因此導(dǎo)致峰譜向左移動(dòng)，那么需要重新按照上述S31?S34進(jìn)行探針固定，然后進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)然，在本發(fā)明檢測(cè)過(guò)程中，為了避免單次檢測(cè)中的偶發(fā)情形對(duì)檢測(cè)的結(jié)果產(chǎn)生偏差，因此上述檢測(cè)過(guò)程中可以測(cè)試的實(shí)驗(yàn)組可以做2?3個(gè)重復(fù)，那么良好的重復(fù)性結(jié)果更加有助于檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確分析。
[0098]同時(shí)在電化學(xué)檢測(cè)結(jié)果中，實(shí)驗(yàn)組在0.2?0.4V之間可以檢測(cè)到一個(gè)明顯的氧化還原峰，而對(duì)照組相比無(wú)該氧化還原峰。因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)組中捕獲探針、目標(biāo)DNA、信號(hào)探針三者相互結(jié)合使得信號(hào)探針上的二茂鐵分子能貼近電極表面，此時(shí)使用電化學(xué)工作站用差分脈沖伏安法對(duì)工作電極進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，由于二茂鐵分子的電化學(xué)性質(zhì)，該電極在0.2?0.4V之間可以檢測(cè)到一個(gè)明顯的氧化還原峰。而若存在的目標(biāo)DNA不能與捕獲探針和信號(hào)探針，則二茂鐵分子無(wú)法被固定在電極產(chǎn)生電化學(xué)反應(yīng)，工作站也無(wú)法檢測(cè)到氧化還原峰。
[0099]整體上采用本發(fā)明同時(shí)結(jié)合LSPR與電化學(xué)的檢測(cè)結(jié)果，可以減少樣品檢測(cè)中的假陽(yáng)性，對(duì)檢測(cè)中質(zhì)量控制起到了非常重要的作用。
[0100]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種雙重檢測(cè)生物傳感芯片，包括襯底，以及設(shè)置于所述襯底上三電極體系，所述三電極體系包括生物傳感電極、輔助電極和參比電極，其特征在于，所述生物傳感電極為納米金電極，所述納米金電極包括設(shè)置于所述襯底上的透明導(dǎo)電基底，該透明導(dǎo)電基底表面上設(shè)有若干規(guī)則排布的納米金顆粒。
2.如權(quán)利要求1所述的雙重檢測(cè)生物傳感芯片，其特征在于，所述納米金電極上固定有DNA探針。
3.如權(quán)利要求2所述的雙重檢測(cè)生物傳感芯片，其特征在于，所述DNA探針包括與待測(cè)靶DNA鏈互補(bǔ)的DNA捕獲探針、以及與靶DNA鏈的互補(bǔ)鏈互補(bǔ)并標(biāo)記有二茂鐵的信號(hào)探針。
4.如權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的雙重檢測(cè)生物傳感芯片，其特征在于，所述納米金顆粒的尺寸為20?80nm。
5.一種權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的雙重檢測(cè)生物傳感芯片的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 制備納米金電極； 以所述納米金電極作為工作電極，與輔助電極和參比電極組裝成三電極體系。
6.如權(quán)利要求5所述的雙重檢測(cè)生物傳感芯片的制備方法，其特征在于，所述制備納米金電極包括如下步驟: 獲取透明導(dǎo)電基底； 在所述透明導(dǎo)電基底表面形成抗蝕層； 獲取壓印板，該壓印板的壓印面具有納米級(jí)尺寸的凸模型； 將所述壓印板與設(shè)有抗蝕層的透明導(dǎo)電基底壓合，使抗蝕層表面形成與凸模型適配的凹槽； 在所述抗蝕層的非凹槽表面形成保護(hù)層； 將具有所述保護(hù)層和抗蝕層的透明導(dǎo)電基底進(jìn)行等離子刻蝕處理，使位于凹槽部分的抗蝕層被刻蝕去除以及位于凹槽部的透明導(dǎo)電基底表面裸露； 在所述位于凹槽部的透明導(dǎo)電基底的裸露表面上生成Au膜； 除去所述透明導(dǎo)電基底殘留的抗蝕層。
7.如權(quán)利要求6所述的雙重檢測(cè)生物傳感芯片的制備方法，其特征在于，在所述位于凹槽部的透明導(dǎo)電基底的裸露表面上生成Au膜步驟中，采用電子束蒸鍍方式生成所述Au膜。
8.如權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)所述的雙重檢測(cè)生物傳感芯片的制備方法，其特征在于， 在以所述納米金電極作為工作電極，與輔助電極和參比電極組裝成三電極體系步驟之后，還包括在所述納米金電極上固定DNA探針步驟； 或 在制備所述納米金電極步驟之后，組裝成三電極體系的步驟之前還包括在所述納米金電極上固定DNA探針步驟。
9.如權(quán)利要求8所述的雙重檢測(cè)生物傳感芯片的制備方法，其特征在于，在所述納米金電極上固定DNA探針包括: 將所述納米金電極進(jìn)行活化處理； 將活化處理后的所述納米金電極用巰基乙酸溶液浸泡處理； 將巰基乙酸處理后的所述納米金電極置于含有偶聯(lián)劑和DNA探針的MES溶液浸泡處理，使DNA探針與所述納米金電極結(jié)合。
10.如權(quán)利要求9所述的雙重檢測(cè)生物傳感芯片的制備方法，其特征在于，所述偶聯(lián)劑為EDAC或EDAC與NHS兩種組合。
11.一種基于權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的雙重檢測(cè)生物傳感芯片的DNA檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟: 獲取待測(cè)DNA ； 將待測(cè)DNA添加至雙重檢測(cè)生物傳感芯片的工作電極上； 檢測(cè)加樣后的雙重檢測(cè)生物芯片在400nm?800nm光波長(zhǎng)內(nèi)的吸收光譜，以及用差分脈沖伏安法測(cè)定雙重檢測(cè)生物芯片的電流峰譜。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104280365SQ201410329297
【公開日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】李科錚, 吳宇亮, 于洪宇 申請(qǐng)人:深圳威芯華創(chuàng)科技有限公司