一種豬偽狂犬病等溫pcr現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種豬偽狂犬病等溫PCR現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑盒，由一套引物、10倍環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液、DNA聚合酶、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和顯色劑組成；所述的一套引物是由一對(duì)引物和一對(duì)內(nèi)引物組成。采用本發(fā)明可以定性定量檢測(cè)豬偽狂犬病。本發(fā)明利用Bst?DNA酶的鏈置換特性，設(shè)計(jì)4條引物，識(shí)別靶序列的6個(gè)區(qū)域，在等溫條件下生成大量重復(fù)的莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在定性檢測(cè)時(shí)不需任何特殊設(shè)備，只需眼觀(guān)反應(yīng)管道顏色變化即可判定，因此具有特異性、敏感性高和檢測(cè)時(shí)間比普通PCR短、適用于豬場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)等特點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種豬偽狂犬病等溫PCR現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種豬偽狂犬病等溫PCR現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑 盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬偽狂犬病PRV是由豬偽狂犬病毒引起的病毒性的豬傳染病，新生仔豬感染偽狂 犬病毒會(huì)引起大量死亡，臨診上新生仔豬第1天表現(xiàn)正常，從第2天開(kāi)始發(fā)病，3?5天內(nèi) 是死亡高峰期，有的整窩死光。同時(shí)，發(fā)病仔豬表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)癥狀、昏睡、嗚叫、嘔吐、拉 稀，一旦發(fā)病，1?2日內(nèi)死亡。剖檢主要是腎臟布滿(mǎn)針尖樣出血點(diǎn)，有時(shí)見(jiàn)到肺水腫、腦膜 表面充血、出血。15日齡以?xún)?nèi)的仔豬感染本病者，病情極嚴(yán)重，發(fā)病死亡率可達(dá)100%。仔 豬突然發(fā)病，體溫上升達(dá)41°C以上，精神極度委頓，發(fā)抖，運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)，痙攣，嘔吐，腹瀉，極 少康復(fù)。斷奶仔豬感染偽狂犬病毒，發(fā)病率在20%?40%左右，死亡率在10%?20%左 右，主要表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀、拉稀、嘔吐等。成年豬一般為隱性感染，若有癥狀也很輕微，易于 恢復(fù)。主要表現(xiàn)為發(fā)熱、精神沉郁，有些病豬嘔吐、咳嗽，一般于4?8天內(nèi)完全恢復(fù)。
[0003] 懷孕母豬可發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎兒或死胎，其中以死胎為主無(wú)論是頭胎母豬還 是經(jīng)產(chǎn)母豬都發(fā)病，而且沒(méi)有嚴(yán)格的季節(jié)性，但以寒冷季節(jié)即冬末春初多發(fā)。據(jù)近年來(lái)的報(bào) 道，奇癢癥狀以往在豬罕見(jiàn)，但目前則常可見(jiàn)到。
[0004] 偽狂犬病的另一發(fā)病特點(diǎn)是表現(xiàn)為種豬不育癥。近幾年發(fā)現(xiàn)有的豬場(chǎng)春季暴發(fā) 偽狂犬病，出現(xiàn)死胎或斷奶仔豬患偽狂犬病后，緊接著下半年母豬配不上種，返情率高達(dá) 90%，有反復(fù)配種數(shù)次都屢配不上的。此外，公豬感染偽狂犬病毒后，表現(xiàn)出睪丸腫脹、萎 縮，喪失種用能力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種豬偽狂犬病等溫PCR現(xiàn) 場(chǎng)快速檢測(cè)試劑盒，本發(fā)明的試劑盒由一套設(shè)計(jì)的引物、10XLAMP反應(yīng)液、DNA聚合酶、陽(yáng) 性對(duì)照、陰性對(duì)照和顯色劑組成。采用本發(fā)明可以定性檢測(cè)豬偽狂犬病。本發(fā)明利用Bst DNA酶的鏈置換特性，設(shè)計(jì)4條引物，識(shí)別靶序列的6個(gè)區(qū)域，在等溫條件下生成大量重復(fù)的 莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在定性檢測(cè)時(shí)不需任何特殊設(shè)備，只需眼觀(guān)反應(yīng)管道顏色變化即可判定，因此 具有特異性、敏感性高和檢測(cè)時(shí)間比普通PCR短、適用于豬場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)等特點(diǎn)。本發(fā) 明的目的具體體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：
[0006] 1.常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)相比本技術(shù)速度慢，從采樣到出結(jié)果最少需要48h，本技術(shù)僅 需30-90分鐘；
[0007] 2.常規(guī)PCR需要需要PCR儀、電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)等大型、昂貴的儀器設(shè)備本 技術(shù)僅需要一個(gè)恒溫箱或保溫杯即可；
[0008] 3.常規(guī)PCR的結(jié)果必須在凝膠成像儀下觀(guān)察，本技術(shù)的試劑盒反應(yīng)完畢后肉眼即 可判定結(jié)果；
[0009] 4.本試劑盒檢測(cè)的敏感性、特異性比常規(guī)PCR更高。
[0010] 其具體技術(shù)方案為：
[0011] 一種豬偽狂犬病等溫PCR現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑盒，
[0012] 由一套引物、10倍環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液、DNA聚合酶、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和顯 色劑組成；所述的一套引物是由一對(duì)引物和一對(duì)內(nèi)引物組成，其序列為：
[0013] 引物 1 :TCCGGATCTACCTCGACG
[0014] 引物 2 :CCTCCTCGCTCAGGCT
[0015] 內(nèi)引物 1 : TCGGCTCGGGCACGTACAGCTACGGCACCGGCAAGA
[0016] 內(nèi)引物 2 : CGTACTGGCGCACTCTGTTCGGTTCTGCTTCCGGGTCTGC
[0017] 其中，所述的一對(duì)引物與一對(duì)內(nèi)引物的摩爾數(shù)之比為1 :6?9 ;所述的DNA聚合 酶為具有鏈置換作用的Bst DNA聚合酶，活力為8個(gè)活性單位/微升；所述的陽(yáng)性對(duì)照為 含有插入豬偽狂犬病一段特異序列的陽(yáng)性質(zhì)粒，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增區(qū)位于該特異序 列中，其濃度為1〇 7拷貝/ μ L ;所述的陰性對(duì)照為滅菌雙蒸水；所述的顯色劑為20倍SYBR Green I。
[0018] 優(yōu)選地，所述的10倍環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液是由200mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸 鹽、lOOmM氯化鉀、lOOmM硫酸銨、40?lOOmM硫酸鎂、4?10M甜菜堿、5?18mM的dNTPs、 和質(zhì)量百分濃度〇· 1%的Triton X-100組成。
[0019] 優(yōu)選地，所述的dNTPs為含有四種dNTP的等量混合物。
[0020] 優(yōu)選地，所述的陽(yáng)性質(zhì)粒的制作方法為：采用PCR擴(kuò)增一段豬偽狂犬病TK基因特 異序列，然后裝入PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至DH5 α感受態(tài)細(xì)菌，抽取質(zhì)粒DNA經(jīng)序列確定后，采 用紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度并用滅菌雙蒸水調(diào)整拷貝數(shù)至107拷貝/ μ L。
[0021] 優(yōu)選地，所述的SYBR Green I為高靈敏度的DNA熒光染料。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0023] 1、本發(fā)明利用Bst DNA酶的鏈置換特性，設(shè)計(jì)4條引物，識(shí)別靶序列的6個(gè)區(qū)域， 在等溫條件下生成大量重復(fù)的莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在定性檢測(cè)時(shí)不需任何特殊設(shè)備。
[0024] 2、本發(fā)明的特異性、敏感性均高于普通PCR技術(shù)。
[0025] 3、本發(fā)明由于不需經(jīng)過(guò)PCR技術(shù)的3個(gè)溫度的重復(fù)循環(huán)，檢測(cè)時(shí)間比PCR短。
[0026] 4、本發(fā)明的結(jié)果判斷不需經(jīng)電泳，比PCR簡(jiǎn)單，極易推廣。對(duì)于定量檢測(cè)，雖然借 助了熒光定量PCR儀，但不需合成熒光探針，只需借助熒光染料SYBR Green I，成本大大減 低。
[0027] 5、本發(fā)明的反應(yīng)溫度在60°C?65°C左右，且識(shí)別靶基因6個(gè)特定區(qū)域，引物多聚 體及非特異性擴(kuò)增幾率大大降低，定量準(zhǔn)確性大大提高。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明。
[0029] 一種豬偽狂犬病等溫PCR現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑盒，包括以下步驟：
[0030] 由一套引物、10倍環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液、DNA聚合酶、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和顯 色劑組成；所述的一套引物是由一對(duì)引物和一對(duì)內(nèi)引物組成，其序列為：
[0031] 引物 1 :TCCGGATCTACCTCGACG
[0032] 引物 2 : CCTCCTCGCTCAGGCT
[0033] 內(nèi)引物 1 : TCGGCTCGGGCACGTACAGCTACGGCACCGGCAAGA
[0034] 內(nèi)引物 2 : CGTACTGGCGCACTCTGTTCGGTTCTGCTTCCGGGTCTGC
[0035] 其中，所述的一對(duì)引物與一對(duì)內(nèi)引物的摩爾數(shù)之比為1 :6?9 ;所述的DNA聚合 酶為具有鏈置換作用的Bst DNA聚合酶，活力為8個(gè)活性單位/微升；所述的陽(yáng)性對(duì)照為 含有插入豬偽狂犬病一段特異序列的陽(yáng)性質(zhì)粒，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增區(qū)位于該特異序 列中，其濃度為1〇 7拷貝/ μ L ;所述的陰性對(duì)照為滅菌雙蒸水；所述的顯色劑為20倍SYBR Green I。
[0036] 所述的10倍環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液（通常用"10XLAMP反應(yīng)液"的形式來(lái)表示， 數(shù)字" 10"表示的是使用時(shí)稀釋的倍數(shù)）是由200mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、100mM氯化 鉀、100mM硫酸銨、40?100mM硫酸鎂、4?10M甜菜堿、5?18mM的dNTPs、和質(zhì)量百分濃度 0.1%的Triton X-100組成。所述的mM是摩爾濃度的單位，指的是每升溶液中所含有溶質(zhì) 的摩爾數(shù)。
[0037] 所述的dNTPs為含有四種dNTP的等量混合物。所述的陽(yáng)性質(zhì)粒的制作方法為：采 用PCR擴(kuò)增一段豬偽狂犬病TK基因特異序列，然后裝入PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至DH5 α感受態(tài) 細(xì)菌，抽取質(zhì)粒DNA經(jīng)序列確定后，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度并用滅菌雙蒸 水調(diào)整拷貝數(shù)至1〇 7拷貝/ μ L。所述的SYBR Green I為高靈敏度的DNA熒光染料。SYBR Green I與雙鏈DNA的親和力非常高。對(duì)分子生物學(xué)中常用的酶沒(méi)有抑制作用。
[0038] 本發(fā)明工作原理是：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)過(guò)程是先由引物擴(kuò)增出內(nèi)引物擴(kuò)增所需 要的模板即起始反應(yīng)物模板的合成；緊接著由內(nèi)引物引導(dǎo)合成靶基因 DNA片段，由于內(nèi)引 物擴(kuò)增的DNA片段含有該引物5,端DNA片段的反向互補(bǔ)序列，因而這些反向互補(bǔ)序列之間 通過(guò)雜交形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，另外一條內(nèi)引物與其互補(bǔ)鏈退火雜交后引導(dǎo)鏈置換合成反應(yīng)，在 擴(kuò)增的DNA片段的另外一端產(chǎn)生了新的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)，在一小時(shí)內(nèi)該循環(huán)反 應(yīng)可使靶DNA累積到109拷貝，電泳后可見(jiàn)擴(kuò)增終產(chǎn)物由大小不等的DNA片段組成，呈梯狀 條帶，也可通過(guò)熒光染料來(lái)觀(guān)察擴(kuò)增結(jié)果。LAMP的整個(gè)反應(yīng)分三步完成，即起初反應(yīng)物模板 的合成、循環(huán)擴(kuò)增階段、延伸和再循環(huán)。
[0039] 以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此，任何熟 悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見(jiàn)地得到的技術(shù)方案的簡(jiǎn) 單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0001] SEQUENCE LISTING (序列表） <110>陜西溯源農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司 <120 -種豬偽狂犬病等溫PCR現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑盒 <160> 4 < 170> Patentln version 3.3 <210〉 1 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列 <400> 1 tccggatcta cctcgacg 18 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213>人工序列 <400〉 2 cctcctcgct caggct 16
[0002]
【權(quán)利要求】
1. 一種豬偽狂犬病等溫PCR現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于， 由一套引物、10倍環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液、DNA聚合酶、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和顯色劑 組成；所述的一套引物是由一對(duì)引物和一對(duì)內(nèi)引物組成，其序列為： 引物 1 :TCCGGATCTACCTCGACG 引物 2 :CCTCCTCGCTCAGGCT 內(nèi)引物 1 :TCGGCTCGGGCACGTACAGCTACGGCACCGGCAAGA 內(nèi)引物 2 :CGTACTGGCGCACTCTGTTCGGTTCTGCTTCCGGGTCTGC 其中，所述的一對(duì)引物與一對(duì)內(nèi)引物的摩爾數(shù)之比為1 :6?9 ;所述的DNA聚合酶為具 有鏈置換作用的Bst DNA聚合酶，活力為8個(gè)活性單位/微升；所述的陽(yáng)性對(duì)照為含有插 入豬偽狂犬病一段特異序列的陽(yáng)性質(zhì)粒，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增區(qū)位于該特異序列中， 其濃度為1〇 7拷貝/ μ L ;所述的陰性對(duì)照為滅菌雙蒸水；所述的顯色劑為20倍SYBR Green 1〇
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬偽狂犬病等溫PCR現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述 的10倍環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液是由200mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、lOOmM氯化鉀、lOOmM 硫酸銨、40?lOOmM硫酸鎂、4?10M甜菜堿、5?18mM的dNTPs、和質(zhì)量百分濃度0. 1%的 Triton X-100 組成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬偽狂犬病等溫PCR現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述 的dNTPs為含有四種dNTP的等量混合物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬偽狂犬病等溫PCR現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所 述的陽(yáng)性質(zhì)粒的制作方法為：采用PCR擴(kuò)增一段豬偽狂犬病TK基因特異序列，然后裝入 PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至DH5 α感受態(tài)細(xì)菌，抽取質(zhì)粒DNA經(jīng)序列確定后，采用紫外分光光度計(jì) 測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度并用滅菌雙蒸水調(diào)整拷貝數(shù)至107拷貝/ μ L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬偽狂犬病等溫PCR現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述 的SYBR Green I為高靈敏度的DNA熒光染料。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104087685SQ201410329239
【公開(kāi)日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月4日
【發(fā)明者】敬曉棋, 黃光東, 張瓊, 陳生葉 申請(qǐng)人:陜西溯源農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司