一種高效提高枯草芽孢桿菌出芽率的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種高效提高枯草芽孢桿菌出芽率的方法。本發(fā)明在枯草芽孢桿菌發(fā)酵菌液中添加甘油作為發(fā)酵菌種，并且在發(fā)酵菌種培養(yǎng)至15～18h添加能提高芽孢出芽率的無機(jī)鹽溶液，所述無機(jī)鹽溶液含以下重量百分比的各組分：0.12～0.125%MgSO4·7H2O，0.01～0.015%MnSO4·H2O，0.05～0.1%CaCl2，0.005～0.008%FeSO4·7H2O，0.015～0.02%KI，0.035～0.04%KH2PO4，上述方法獲得的菌株發(fā)酵可達(dá)到5.8×1011CFU/ml，芽孢數(shù)為5.49×1011CFU/ml，芽孢出芽率為94.7%。
【專利說明】一種高效提高枯草芽孢桿菌出芽率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物制備【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，涉及一種高效提高枯草芽孢桿菌出芽率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種，其菌體呈桿狀，菌落表面粗糙不透明，污白色或微帶黃色?？莶菅挎邨U菌能形成芽孢，是重要的工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)菌，它可用于生產(chǎn)α -淀粉酶、蛋白酶、β -葡聚糖酶、堿性磷酸酶等，另外，枯草芽孢桿菌的菌體可直接用于生物農(nóng)藥，因此具有廣泛的應(yīng)用范圍和應(yīng)用價值。
[0003]芽孢是產(chǎn)芽孢細(xì)菌在生長過程中形成的一種抗逆性休眠體，枯草芽孢桿菌的芽孢較其營養(yǎng)體細(xì)胞易保存，復(fù)活率高，是制備枯草芽孢桿菌制劑的理想存在形式，而制劑中的芽孢含量是影響制劑應(yīng)用效果的關(guān)鍵因素，芽孢的形成受環(huán)境因素的影響，不同菌種形成芽孢的條件不同。
[0004]目前國內(nèi)眾多發(fā)酵(芽孢桿菌微生物制劑類)企業(yè)的產(chǎn)品存在發(fā)酵生產(chǎn)菌芽孢含量較低的問題，一般只有10~50X 107CFU/g，大大影響了產(chǎn)品的成本及質(zhì)量。為此，采取措施提高芽孢桿菌產(chǎn)品發(fā)酵生產(chǎn)的芽孢含量、保持產(chǎn)品使用過程中菌體的高活性是十分必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中芽孢桿菌微生物制劑類產(chǎn)品中芽孢含量低的缺陷，提供一種高效提高枯草芽孢桿菌出芽率的方法。
[0006]本發(fā)明的另一個目的是提供上述方法制備得到的活性高、芽孢含量高的枯草芽孢桿囷廣品。
[0007]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn):
本發(fā)明提供一種高效提高枯草芽孢桿菌出芽率的方法，所述方法是將枯草芽孢桿菌原始出發(fā)菌株經(jīng)復(fù)活和擴(kuò)大培養(yǎng)后，接種并轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在發(fā)酵的特定階段，向發(fā)酵液中加入特定配方組成的無機(jī)鹽溶液，該無機(jī)鹽溶液可以提高芽孢桿菌的出芽率；所述枯草芽孢桿菌原始出發(fā)菌種subtil is)可采用市購的枯草芽孢桿菌產(chǎn)品。
[0008]所述高效提高枯草芽孢桿菌出芽率的方法包括以下步驟:
51.原始出發(fā)菌株經(jīng)復(fù)活，擴(kuò)大培養(yǎng)得到發(fā)酵菌液；
52.往SI所得發(fā)酵菌液中添加甘油作為發(fā)酵菌種，保存?zhèn)溆茫?br> 53.將S2所述發(fā)酵菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵過程中添加無機(jī)鹽溶液，所述無機(jī)鹽溶液含以下重量百分比的各組分:0.12~0.125% MgSO4.7Η20、0.01~0.015% MnSO4.Η20、
0.05 ~0.1% CaCl2、0.005 ~0.008% FeSO4.7H20、0.015 ~0.02% KI,0.035 ~0.04%KH2PO4,最后調(diào)pH值為 6.8~7.2。
[0009]作為一種優(yōu)選方式，S3所述無機(jī)鹽溶液含以下重量百分比的各組分:0.122%MgSO4.7Η20，0.012% MnSO4.H2O, 0.056% CaCl2,0.007% FeSO4.7Η20，0.018% ΚΙ, 0.037%KH2PO4,最后調(diào)pH值為7.0。
[0010]其中，Mg2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+、I~、K+、P5+配合在一起能夠有效促進(jìn)細(xì)菌營養(yǎng)體向芽孢這種休眠體轉(zhuǎn)化。細(xì)菌營養(yǎng)體當(dāng)遇到逆境時，它自我保護(hù)產(chǎn)生芽孢，而無機(jī)鹽以某種形式配合起來，卻能起到為細(xì)菌營養(yǎng)體提供一個逆境的環(huán)境，促進(jìn)芽孢的生成。
[0011]優(yōu)選地，S3中所述無機(jī)鹽溶液的添加量為發(fā)酵液體積百分?jǐn)?shù)的5~10%。
[0012]最優(yōu)選地，S3中所述無機(jī)鹽溶液的添加量為發(fā)酵液體積百分?jǐn)?shù)的8.5%。
[0013]具體地，SI所述原始出發(fā)菌株的復(fù)活和 擴(kuò)大培養(yǎng)包括以下步驟:
511.從原始出發(fā)菌種中挑取一環(huán)菌體，接種到種子固體平板培養(yǎng)基上，劃線分離，于36~37°C培養(yǎng)12~16h培養(yǎng)得單細(xì)胞菌落；所述種子固體平板培養(yǎng)基是在菌種液體培養(yǎng)基中加入1.5~2%瓊酯倒入無菌平板中制成；
512.挑出Sll所述單細(xì)胞菌落，接種在種子固體斜面培養(yǎng)基上，于36~37°C培養(yǎng)12~16h長出菌體；所述種子固體斜面培養(yǎng)基是在菌種液體培養(yǎng)基中加入1.5~2%瓊酯倒入無菌試管中制成；
513.將S12所述菌體以1%的接種量接種到菌種液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至0D_=
0.7~0.9時停止培養(yǎng)；
所述搖床培養(yǎng)是在36~37°C、150~170rpm條件下培養(yǎng)16~20h ;所述菌種液體培養(yǎng)基包括以下重量百分比的組分:0.3~0.5%的葡萄糖、0.3~0.5%的NaCl、0.3~0.5%的蛋白腺；
514.將S13所得菌液轉(zhuǎn)至種子復(fù)壯固體斜面培養(yǎng)基上，于36~37°C培養(yǎng)5~6h，長出菌體；所述種子復(fù)壯固體斜面培養(yǎng)基是在種子復(fù)壯液體培養(yǎng)基中加入1.5~2%瓊脂倒入無菌試管中制成；
515.從S14所述菌體中挑取一環(huán)菌體轉(zhuǎn)至種子復(fù)壯液體培養(yǎng)基上，搖床培養(yǎng)至OD6tltl=
1.0~1.2，停止培養(yǎng)，所得菌液為發(fā)酵菌液。
[0014]所述種子復(fù)壯液體培養(yǎng)基包括以下重量百分比的組分:0.3~0.5%的葡萄糖、
0.3~0.5%的NaCl、0.2~0.5%的蛋白胨、0.5~0.6%豆粉、1.0~1.2%低聚異麥芽糖、
0.8~1.0%的大豆低聚糖，該培養(yǎng)基配方主要是為有效提高枯草芽孢桿菌的菌種的活性而設(shè)計的。
[0015]優(yōu)選地，S2所述甘油的添加量為發(fā)酵菌種體積的12~15%。
[0016]優(yōu)選地，S3所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下重量百分比的組分:1~1.1%糖蜜、0.9~
1.0% 玉米淀粉、0.05 ~0.06% Κ2ΗΡ04、0.05 ~0.06% ΚΗ2Ρ04、0.18 ~0.2% NaCU0.8 ~0.9%MgCl2U.5~L 6%魚粉和L 4~L 5%豆粉。
[0017]優(yōu)選地，S3中待發(fā)酵菌種生長至對數(shù)期時，添加無機(jī)鹽溶液。更優(yōu)選地，S3中待發(fā)酵菌種培養(yǎng)至15~18h時，添加無機(jī)鹽溶液。這是因為細(xì)菌生長到對數(shù)生長期的中后期，細(xì)菌含量幾乎達(dá)到最高，而此時細(xì)菌的活力也是最大的，對外界的影響因素也最敏感，在為了保持細(xì)菌的含量的情況下，令細(xì)菌能在發(fā)酵終止前盡可能轉(zhuǎn)化為芽孢，因此選擇對數(shù)生長期的中后期添加無機(jī)鹽溶液。
[0018]優(yōu)選地，S3所述發(fā)酵菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量為1.0~1.2%。
[0019]優(yōu)選地，S3所述發(fā)酵過程中還添加泡敵、豆油、硫酸鈣溶液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；當(dāng)還原糖降至0.5~0.6g/L,氨態(tài)氮降至21~23g/L時,終止發(fā)酵。
[0020]更優(yōu)選地，S3中所述泡敵和豆油分次添加，即在培養(yǎng)6~8h、10~12h、16~18h、24~26h時分別添加占發(fā)酵液重量百分?jǐn)?shù)為0.4~0.5%的泡敵和占發(fā)酵液重量百分?jǐn)?shù)為
0.8~1%的豆油；所述硫酸鈣溶液是在發(fā)酵菌種培養(yǎng)至12~14h時，添加質(zhì)量濃度為18~22%的硫酸鈣溶液至其濃度為6~8mg/L。
[0021]優(yōu)選地，S3所述發(fā)酵可采用500~1000L發(fā)酵罐，內(nèi)盛350~700L發(fā)酵培養(yǎng)液，S3所述發(fā)酵培養(yǎng)為:初始攪拌轉(zhuǎn)速為300~320rpm，通風(fēng)量為1: 0.8~1:1vvm,控制DO在80~100% ;在發(fā)酵進(jìn)入8~IOh時，攪拌轉(zhuǎn)速為350~400rpm，通風(fēng)量1: 0.5~0.6vvm,控制DO值在控制在80~100%范圍內(nèi)；在發(fā)酵進(jìn)入16~18h時，攪拌轉(zhuǎn)速為300~330rpm，通風(fēng)量1: 1.0~1.1vvm,控制DO值在控制在80~100%范圍內(nèi)。
[0022]本發(fā)明還提供了上述方法制備得到的枯草芽孢桿菌產(chǎn)品。
[0023]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明提供了一種高效提高枯草芽孢桿菌出芽率的方法，所述發(fā)酵方法簡單，成本低，本發(fā)明將將枯草芽孢桿菌菌株經(jīng)斜面活化及種子的復(fù)壯后，得到活性高的發(fā)酵種子，再經(jīng)獨(dú)特設(shè)計，即在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入特定配方組成的無機(jī)鹽溶液促進(jìn)芽孢生成的發(fā)酵工藝發(fā)酵，非常有利于提高芽孢含量及產(chǎn)品中菌體的活性。
[0024]本發(fā)明還提供了所述方法所得到的高活性、高芽孢含量的產(chǎn)品，上述方法獲得的菌株發(fā)酵可達(dá)到5.8X10nCFU/ml，芽孢數(shù)為5.49X 10nCFU/ml，芽孢出芽率為94.7%。
【具體實施方式】
[0025]下面通過實施例對本發(fā)明進(jìn)一步具體描述。下述所使用的實驗方法若無特殊說明，均為本【技術(shù)領(lǐng)域】現(xiàn)有常規(guī)的方法，所使用的配料或材料，如無特殊說明，均為通過商業(yè)途徑可得到的配料或材料。
[0026]實施例1
本實施例所用的菌種為枯草桿菌屬細(xì)菌subti I is),是從中國普通微生物菌種保藏中心購買的枯草芽孢桿菌，編號CGMCC1.433。
[0027]芽孢桿菌產(chǎn)品的發(fā)酵制備方法包括下述步驟:
(I)菌種液體培養(yǎng)基的配制:5g葡萄糖、5g氯化鈉、3g蛋白胨和IL水(pH值為6.5);配制三份；
種子復(fù)壯液體培養(yǎng)基的配制:5g葡萄糖、5g氯化鈉、3g蛋白胨、6g豆粉、12g食用級低聚異麥芽糖、IOg食用級大豆低聚糖和IL水(pH值為6.5)，配制一份；
在一份上述菌種液體培養(yǎng)基中加入2%瓊酯，倒入無菌試管中，制成種子固體斜面培養(yǎng)
基;
在另一份上述菌種液體培養(yǎng)基中加入2%瓊酯，倒入無菌平板中，制成種子固體平板培
養(yǎng)基;
在第三份菌種液體培養(yǎng)基中加入2%瓊酯，倒入無菌斜面中，制成種子固體斜面培養(yǎng)
基;
在上述種子復(fù)壯液體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂，倒入無菌試管中，制成種子復(fù)壯固體斜面
培養(yǎng)基;(2)用無菌接種環(huán)從原始出發(fā)菌種中挑取一環(huán)菌體，接種到種子固體平板培養(yǎng)基上，劃線分離，于37°C培養(yǎng)16h ；
(3)待種子固體平板培養(yǎng)基上長出單細(xì)胞菌落，用無菌接種環(huán)挑出單細(xì)胞菌落，接種在種子固體斜面培養(yǎng)基上，于37°C培養(yǎng)16h ；
(4)將種子斜面固體培養(yǎng)基上長出的菌體，以1%的接種量接種到菌種液體培養(yǎng)基中，于37°C溫度下，170rpm,搖床培養(yǎng)20h，每h測定一次OD值，直到0D_ = 0.9，停止培養(yǎng)；
(5)將步驟(4)中的菌液轉(zhuǎn)至種子復(fù)壯固體斜面培養(yǎng)基上，于37°C培養(yǎng)6h；
(6)從步驟(5)的種子復(fù)壯固體斜面培養(yǎng)基上長出的菌體中再挑取一環(huán)菌體轉(zhuǎn)至種子復(fù)壯液體培養(yǎng)基上，于37°C，170rpm,搖床培養(yǎng)20h后，直到0D_ =1.2，停止培養(yǎng)，作為發(fā)酵菌種；
(7)步驟(6)中培養(yǎng)的菌液中按體積百分比添加菌液的15%的甘油，放置于-20°C保
存；
(8)發(fā)酵培養(yǎng):
在1000 L發(fā)酵罐內(nèi)，將發(fā)酵菌種以1.2%接種量接入700 L發(fā)酵培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng)8h、12h、18h、26h時添加泡敵和豆油，每次按照發(fā)酵液重量的0.5%添加泡敵，按照發(fā)酵液重量的1%添加豆油，在培養(yǎng)至13h時，添加質(zhì)量濃度為20% CaSO4至CaSO4的濃度7mg/L ；上述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下重量百分比的各組分:1%糖蜜、0.9%玉米淀粉、0.05%Κ2ΗΡ04、0.05% ΚΗ2Ρ04、0.18% NaCl、0.8% MgCl2U.5% 魚粉和 1.4% 豆粉。
[0028]另外，可在菌種培養(yǎng)至對數(shù)生長期，即在菌種培養(yǎng)至15h，在上述發(fā)酵培養(yǎng)液添加能促進(jìn)芽孢生成的無機(jī)鹽溶液，所述無機(jī)鹽溶液的添加量為發(fā)酵液體積百分?jǐn)?shù)的的5%，所述無機(jī)鹽溶液含以下重量百分比的各組分:0.12% MgSO4.7Η20，0.01% MnSO4.H2O,0.05%CaCl2,0.005% FeSO4.7Η20，0.015% ΚΙ,0.035% KH2PO4, pH 為 6.8。
[0029]在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)定為320rpm、通風(fēng)量設(shè)定為l:lvvm,控制DO在90%;在發(fā)酵進(jìn)入IOh時，調(diào)整轉(zhuǎn)速至400rpm和通風(fēng)量至1:0.6vvm,以保證DO值在控制在80~100%范圍內(nèi)；在發(fā)酵進(jìn)入18h時,調(diào)整轉(zhuǎn)速至330rpm和通風(fēng)量至1: 1.1vvm,以保證DO值在控制在80~100%范圍內(nèi)；
當(dāng)還原糖降至0.57g/L和氨態(tài)氮降至21g/L (3，5 一二硝基水楊酸法和納氏試劑比色法)時，終止發(fā)酵得發(fā)酵產(chǎn)品。
[0030]實施例2
本實施例所用的菌種為枯草桿菌屬細(xì)菌subtilis、\l,從中國普通微生物菌種保藏中心購買的枯草芽孢桿菌，編號CGMCC1.504。
[0031]芽孢桿菌產(chǎn)品的發(fā)酵制備方法包括下述步驟:
(I)菌種液體培養(yǎng)基的配制:3g葡萄糖、3g氯化鈉、3g蛋白胨和IL水(pH值為6.5)；配制三份；
種子復(fù)壯液體培養(yǎng)基的配制:3g葡萄糖、3g氯化鈉、5g蛋白胨、5g豆粉、IOg食用級低聚異麥芽糖、Sg食用級大豆低聚糖和IL水(pH值為6.5)，配制一份；
在一份上述菌種液體培養(yǎng)基中加入2%瓊酯，倒入無菌試管中，制成種子固體斜面培養(yǎng)
基;
在另一份上述菌種液體培養(yǎng)基中加入2%瓊酯，倒入無菌平板中，制成種子固體平板培養(yǎng)基;
在第三份菌種液體培養(yǎng)基中加入2%瓊酯，倒入無菌斜面中，制成種子固體斜面培養(yǎng)
基;
在上述種子復(fù)壯液體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂，倒入無菌試管中，制成種子復(fù)壯固體斜面
培養(yǎng)基；
(2)用無菌接種環(huán)從原始出發(fā)菌種中挑取一環(huán)菌體，接種到種子固體平板培養(yǎng)基上，劃線分離，于36°C溫度下培養(yǎng)15h ；
(3)待種子固體平板培養(yǎng)基上長出單細(xì)胞菌落，用無菌接種環(huán)挑出單細(xì)胞菌落，接種在種子固體斜面培養(yǎng)基上，于36°C溫度下培養(yǎng)15h ；
(4)將種子斜面固體培養(yǎng)基上長出的菌體，以1%的接種量接種到菌種液體培養(yǎng)基中，于36°C溫度下，160rpm,搖床培養(yǎng)18h，每h測定一次OD6tltl直到OD6tltl = 0.8，停止培養(yǎng)；
(5)將步驟(4)中的菌液轉(zhuǎn)至種子復(fù)壯固體斜面培養(yǎng)基上，于36°C溫度下培養(yǎng)5h；
(6)從步驟(5)的種子復(fù)壯固體斜面培養(yǎng)基上長出的菌體中再挑取一環(huán)菌體轉(zhuǎn)至種子復(fù)壯液體培養(yǎng)基上，于36°C溫度下，160rpm,搖床培養(yǎng)18h后，直到0D_ = 1.0,停止培養(yǎng)，作為發(fā)酵菌種；
(7)步驟(6)中培養(yǎng)的菌液中按體積百分比添加菌液的12%的甘油，放置于-18°C溫度下保存；
(8)發(fā)酵培養(yǎng):
在1000L發(fā)酵罐內(nèi)，將發(fā)酵菌種以1.0%接種量接入350L發(fā)酵培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng)6h、10h、16h、24h時添加泡敵和豆油，每次按照發(fā)酵液重量的0.5%添加泡敵，按照發(fā)酵液重量的1%添加豆油，在培養(yǎng)至12h時，添加質(zhì)量濃度為19%CaS04至CaSO4的濃度8mg/L ；
上述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下重量百分比的各組分:1.02%糖蜜、0.95%玉米淀粉、0.055%Κ2ΗΡ04、0.055% ΚΗ2Ρ04、0.185% NaCl、0.85% MgCl2U.55% 魚粉和 1.45% 豆粉。
[0032]另外，可在菌種培養(yǎng)至對數(shù)生長期，即在菌種培養(yǎng)至16h，在上述發(fā)酵培養(yǎng)液中添加無機(jī)鹽溶液，所述無機(jī)鹽溶液的添加量為發(fā)酵液體積百分?jǐn)?shù)的6%，所述無機(jī)鹽溶液含以下重量百分比的各組分:0.121% MgSO4.7Η20，0.011% MnSO4.H2O, 0.06% CaCl2,0.006%FeSO4.7Η20，0.016% ΚΙ,0.036% KH2PO4, pH 為 6.9。
[0033]在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)定為300rpm、通風(fēng)量設(shè)定為1: 0.9vvm，控制DO在100% ;在發(fā)酵進(jìn)入8h時，調(diào)整轉(zhuǎn)速至350rpm和通風(fēng)量至1:0.5vvm,以保證DO值在控制在80~100%范圍內(nèi)；在發(fā)酵進(jìn)入16h時，調(diào)整轉(zhuǎn)速至300rpm和通風(fēng)量至1:1vvm,以保證DO值在控制在80~100%范圍內(nèi)；
當(dāng)還原糖降至0.55g/L和氨態(tài)氮降至21.5g/L (3，5 一二硝基水楊酸法和納氏試劑比色法)時，終止發(fā)酵得發(fā)酵產(chǎn)品。
[0034]實施例3
本實施例所用的菌種為枯草桿菌屬細(xì)菌subti I is),從中國普通微生物菌種保藏中心購買的枯草芽孢桿菌，編號CGMCC1.460。
[0035]芽孢桿菌產(chǎn)品的發(fā)酵制備方法包括下述步驟:
(O菌種液體培養(yǎng)基的配制:4g葡萄糖、3.5g氯化鈉、4g蛋白胨和IL水(pH值為7);配制三份；種子復(fù)壯液體培養(yǎng)基的配制:4g葡萄糖、4g氯化鈉、2g蛋白胨、5.5g豆粉、IIg食用級低聚異麥芽糖、8.5g食用級大豆低聚糖和IL水(pH值為7)，配制一份；
在一份上述菌種液體培養(yǎng)基中加入2%瓊酯，倒入無菌試管中，制成種子固體斜面培養(yǎng)
基;
在另一份上述菌種液體培養(yǎng)基中加入2%瓊酯，倒入無菌平板中，制成種子固體平板培
養(yǎng)基;
在第三份菌種液體培養(yǎng)基中加入2%瓊酯，倒入無菌斜面中，制成種子固體斜面培養(yǎng)
基;
在上述種子復(fù)壯液體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂，倒入無菌試管中，制成種子復(fù)壯固體斜面
培養(yǎng)基；
(2)用無菌接種環(huán)從原始出發(fā)菌種中挑取一環(huán)菌體，接種到種子固體平板培養(yǎng)基上，劃線分離，于36.5°C溫度下培養(yǎng)12h ；
(3)待種子固體平板培養(yǎng)基上長出單細(xì)胞菌落，用無菌接種環(huán)挑出單細(xì)胞菌落，接種在種子固體斜面培養(yǎng)基上，于36.5°C溫度下培養(yǎng)12h ；
(4)將種子斜面固體培養(yǎng)基上長出的菌體，以1%的接種量接種到菌種液體培養(yǎng)基中，于36.5°C溫度下，150rpm,搖床培養(yǎng)16h左右，每h測定一次OD6tltl直到OD6tltl = 0.7，停止培養(yǎng);
(5)將步驟(4)中的菌液轉(zhuǎn)至種子復(fù)壯固體斜面培養(yǎng)基上，于36.5°C溫度下培養(yǎng)5.5h ；
(6)從步驟(5)的種子復(fù)壯固體斜面培養(yǎng)基上長出的菌體中再挑取一環(huán)菌體轉(zhuǎn)至種子復(fù)壯液體培養(yǎng)基上，于36.5°C溫度下，150rpm，搖床培養(yǎng)16h后，直到OD6tltl= 1.1，停止培養(yǎng)，作為發(fā)酵菌種；
(7)步驟(6)中培養(yǎng)的菌液中按體積百分比添加菌液的13%的甘油，放置于一19°C溫度下保存；
(8)發(fā)酵培養(yǎng):
在1000L發(fā)酵罐內(nèi)，將發(fā)酵菌種以1.1%接種量接入500L發(fā)酵培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng)7h、llh、16h、24h時添加泡敵和豆油，每次按照發(fā)酵液重量的0.5%添加泡敵，按照發(fā)酵液重量的1%添加豆油，在培養(yǎng)至13h時，添加質(zhì)量濃度為20%CaS04至CaSO4的濃度6mg/L ；
上述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下重量百分比的各組分:1.04%糖蜜、0.96%玉米淀粉、0.056%Κ2ΗΡ04、0.056% ΚΗ2Ρ04、0.188% NaCl、0.89% MgCl2U.56% 魚粉和 1.47% 豆粉。
[0036]另外，可在生長至對數(shù)生長期時，即在菌種培養(yǎng)至17h，在上述發(fā)酵培養(yǎng)液中添加無機(jī)鹽溶液，所述無機(jī)鹽的添加量為發(fā)酵液體積百分?jǐn)?shù)的8.5%，所述無機(jī)鹽溶液含以下重量百分比的各組分:0.122% MgSO4.7Η20，0.012% MnSO4.H2O,0.056% CaCl2,0.007%FeSO4.7Η20，0.018% ΚΙ,0.037% KH2PO4, pH 為 7.0。
[0037] 在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)定為310rpm,通風(fēng)量設(shè)定為1: 0.8vvm,控制DO在80% ;在發(fā)酵進(jìn)入8h時，調(diào)整轉(zhuǎn)速至380rpm和通風(fēng)量至1:0.55vvm,以保證DO值在控制在80~100%范圍內(nèi)；在發(fā)酵進(jìn)入16.5h時，調(diào)整轉(zhuǎn)速至320rpm和通風(fēng)量至1:1.05vvm,以保證DO值在控制在80~100%范圍內(nèi)；
當(dāng)還原糖降至0.60g/L和氨態(tài)氮降至22.5g/L (3，5 一二硝基水楊酸法和納氏試劑比色法)時，終止發(fā)酵得發(fā)酵產(chǎn)品。[0038]實施例4
本實施例所用的菌種為枯草桿菌屬細(xì)菌(feci77m subti I is),從中國普通微生物菌種保藏中心購買，編號為CGMCC1.440。
[0039]枯草芽孢桿菌產(chǎn)品的發(fā)酵制備方法包括下述步驟:
(1)菌種液體培養(yǎng)基的配制:5g葡萄糖、5g氯化鈉、4g蛋白胨和IL水(pH值為7);配制三份；
種子復(fù)壯液體培養(yǎng)基的配制:4g葡萄糖、4g氯化鈉、3g蛋白胨、6g豆粉、12g食用級低聚異麥芽糖、9g食用級大豆低聚糖和IL水(pH值為7)，配制一份；
在一份上述菌種液體培養(yǎng)基中加入2%瓊酯，倒入無菌試管中，制成種子固體斜面培養(yǎng)
基;
在另一份上述菌種液體培養(yǎng)基中加入2%瓊酯，倒入無菌平板中，制成種子固體平板培
養(yǎng)基;
在第三份菌種液體培養(yǎng)基中加入2%瓊酯，倒入無菌斜面中，制成種子固體斜面培養(yǎng)
基;
在上述種子復(fù)壯液體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂，倒入無菌試管中，制成種子復(fù)壯固體斜面
培養(yǎng)基；
(2)用無菌接種環(huán)從原始出發(fā)菌種中挑取一環(huán)菌體，接種到種子固體平板培養(yǎng)基上，劃線分離，于37°C培養(yǎng)15h ；
(3)待種子固體平板培養(yǎng)基上長出單細(xì)胞菌落，用無菌接種環(huán)挑出單細(xì)胞菌落，接種在種子固體斜面培養(yǎng)基上，于37°C培養(yǎng)15h ；
(4)將種子斜面固體培養(yǎng)基上長出的菌體，以1%的接種量接種到菌種液體培養(yǎng)基中，于37°C，160rpm，搖床培養(yǎng)18h左右，直到OD6tltl=0.9，停止培養(yǎng)；
(5)將步驟(4)中的菌液轉(zhuǎn)至種子復(fù)壯固體斜面培養(yǎng)基上，于37°C培養(yǎng)5h；
(6)從步驟(5)的種子復(fù)壯固體斜面培養(yǎng)基上再挑取一環(huán)菌體轉(zhuǎn)至種子復(fù)壯液體培養(yǎng)基上，于37°C，160rpm,搖床培養(yǎng)18h直到OD6tltl = 1.2，停止培養(yǎng)，作為發(fā)酵菌種；
(7)步驟(6)中培養(yǎng)的菌液中按體積百分比添加菌液15%的甘油，放置于_20°C溫度下保存；
(8)發(fā)酵培養(yǎng):
在1000L發(fā)酵罐內(nèi)，將發(fā)酵菌種以1.2%的接種量接入600L發(fā)酵培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng)8h、10h、17h、25h添加泡敵和豆油，每次按照發(fā)酵液重量的0.5%添加泡敵，1%添加豆油，在培養(yǎng)至13h時，添加質(zhì)量濃度為21%CaS04至CaSO4的濃度6.5mg/L。
[0040]上述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下重量百分比的各組分:1.1%糖蜜、1.0%玉米淀粉、
0.06% Κ2ΗΡ04、0.06% ΚΗ2Ρ04、0.2% NaCl、0.9%MgCl2、l.6% 魚粉和 1.5% 豆粉。
[0041]另外，可在生長至對數(shù)生長期時，即在菌種培養(yǎng)至18h，在上述發(fā)酵培養(yǎng)液中添加無機(jī)鹽溶液，所述無機(jī)鹽溶液的添加量為發(fā)酵液體積百分?jǐn)?shù)的10%;所述無機(jī)鹽溶液含以下重量百分比的各組分:0.124% MgSO4.7Η20，0.015% MnSO4.H2O,0.1% CaCl2,0.008%FeSO4.7Η20，0.02% ΚΙ,0.04% KH2PO4, pH 為 7.2。
[0042]在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)定為320rpm、通風(fēng)量設(shè)定為1: 0.9vvm，控制DO在85% ;在發(fā)酵進(jìn)入9h時，調(diào)整轉(zhuǎn)速至360rpm和通風(fēng)量至1:0.6vvm,以保證DO值在控制在80~100%范圍內(nèi)；在發(fā)酵進(jìn)入17h時，調(diào)整轉(zhuǎn)速至320rpm和通風(fēng)量至1:1vvm,以保證DO值在控制在80~100%范圍內(nèi)。
[0043]當(dāng)還原糖降至0.547g/L和氨態(tài)氮降至22.4g/L (3，5 一二硝基水楊酸法和納氏試劑比色法)時，終止發(fā)酵得發(fā)酵產(chǎn)品。
[0044]對比例I
將枯草芽孢桿菌按照實施例3所述發(fā)酵條件和步驟進(jìn)行發(fā)酵，唯一不同的就是在發(fā)酵過程中不加入實施例3所述的無機(jī)鹽溶液。
[0045]對比例2
將枯草芽孢桿菌按照實施例3所述發(fā)酵條件和步驟進(jìn)行發(fā)酵，唯一不同的就是在發(fā)酵過程中所加入的無機(jī)鹽溶液不含KI。
[0046]對比例3
將枯草芽孢桿菌按照實施例3所述發(fā)酵條件和步驟進(jìn)行發(fā)酵，唯一不同的就是在發(fā)酵過程中所加入的無機(jī)鹽溶液不含KI和MnSO4.H2O0
[0047]實施例5
從植物根系和根系土壤，按照常規(guī)稀釋平板分離法選育獲得的枯草桿菌屬細(xì)菌{Bacillus subti I is)菌種和現(xiàn)有從廣東省微生物研究所菌種保藏中心購買的枯草芽孢桿菌I株，分別采用本發(fā)明實施例1~4和對比例I~3所述方法和常規(guī)方法進(jìn)行發(fā)酵處理(按照常用的肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，未添加無機(jī)鹽溶液)，發(fā)酵后的產(chǎn)品采用稀釋平板計數(shù)方法測定產(chǎn)品活菌含量，測定結(jié)果見表1所示。
[0048]表1枯草芽胞桿菌發(fā)酵的效果對比
【權(quán)利要求】
1.一種高效提高枯草芽孢桿菌出芽率的方法，其特征在于，包括以下步驟: 51.原始出發(fā)菌株經(jīng)復(fù)活，擴(kuò)大培養(yǎng)得到發(fā)酵菌液； 52.往SI所得發(fā)酵菌液中添加甘油作為發(fā)酵菌種，保存?zhèn)溆茫? 53.將S2所述發(fā)酵菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵過程中添加無機(jī)鹽溶液，所述無機(jī)鹽溶液含以下重量百分比的各組分:0.12~0.125% MgSO4.7Η20、0.01~0.015% MnSO4.Η20、0.05 ~0.1% CaCl2、0.005 ~0.008% FeSO4.7H20、0.015 ~0.02% KI,0.035 ~0.04%KH2PO4,最后調(diào)pH值為6.8~7.2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述高效提高枯草芽孢桿菌出芽率的方法，其特征在于，S3所述無機(jī)鹽溶液含以下重量百分比的各組分:0.122% MgSO4.7Η20，0.012% MnSO4.H2O, 0.056%CaCl2,0.007% FeSO4.7Η20，0.018% ΚΙ, 0.037% KH2PO4,最后調(diào) pH 值為 7.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述高效提高枯草芽孢桿菌出芽率的方法，其特征在于，所述無機(jī)鹽溶液的添加量為發(fā)酵液體積百分?jǐn)?shù)的5~10%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述高效提高枯草芽孢桿菌出芽率的方法，其特征在于，S3中所述無機(jī)鹽溶液的添加量為發(fā)酵液體積百分?jǐn)?shù)的8.5%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述高效提高枯草芽孢桿菌出芽率的方法，其特征在于，S3中待發(fā)酵菌種生長至對數(shù)期時，添加無機(jī)鹽溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述高效提高枯草芽孢桿菌出芽率的方法，其特征在于，S3中待發(fā)酵菌種培養(yǎng)至15~18h時,添加無機(jī)鹽溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述高效提高枯草芽孢桿菌出芽率的方法，其特征在于，S3所述發(fā)酵菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量為1.0~1.2%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述高效提高枯草芽孢桿菌出芽率的方法，其特征在于，S3所述發(fā)酵過程中還添加泡敵、豆油、硫酸鈣溶液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；當(dāng)還原糖降至0.5~0.6g/L，氨態(tài)氮降至21~23g/L時，終止發(fā)酵。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述高效提高枯草芽孢桿菌出芽率的方法，其特征在于，S3中所述泡敵和豆油分次添加，即在培養(yǎng)6~8h、10~12h、16~18h、24~26h時分別添加占發(fā)酵液重量百分?jǐn)?shù)為0.4~0.5%的泡敵和占發(fā)酵液重量百分?jǐn)?shù)為0.8~1%的丑油；所述硫酸鈣溶液是在發(fā)酵菌種培養(yǎng)至12~14h時，添加質(zhì)量濃度為18~22%的硫酸鈣溶液至其濃度為6~8mg/L。
10.權(quán)利要求1至9任一項所述方法制備得到的枯草芽孢桿菌產(chǎn)品。
【文檔編號】C12N1/20GK103937717SQ201410162370
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月22日
【發(fā)明者】張玲華, 鄺哲師, 蔡海明, 趙祥杰, 楚品品, 葉明強(qiáng) 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué), 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所