一種內(nèi)生枯草芽孢桿菌正突變株、制備方法和制備的生防菌劑及其防治石榴干腐病的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種內(nèi)生枯草芽孢桿菌正突變株、制備方法和制備的生防菌劑及其防治石榴干腐病的應(yīng)用，包括：(1)Bacillussubtilis（枯草芽孢桿菌）野生型菌株NS04的篩選，正突變生防菌株NS04307的紫外線誘變和選育；(2)正突變株NS04307的抑菌穩(wěn)定性；(3)正突變株NS04307生防菌劑的制備方法；（4）正突變株NS04307防治植物病害的應(yīng)用。該生防菌劑具有殺菌譜廣、效果好、病害不易產(chǎn)生抗藥性、對(duì)人、畜、農(nóng)作物安全和環(huán)境友好等特點(diǎn)，特別對(duì)石榴干腐病的田間防治具有較好的效果。另外對(duì)芝麻白絹?。⊿clerotiumrolfsii）、蘋果霉心病（Trichotheciumroseum）、香蕉葉斑病菌喙突臍蠕孢（Exserohilumrostratum）、芝麻枯萎?。‵usariumoxysporum）、山茱萸褐斑?。ˋlternariaalternate）等15種不同病原菌的生長(zhǎng)有顯著的抑制活性。
【專利說明】—種內(nèi)生枯草芽孢桿菌正突變株、制備方法和制備的生防菌劑及其防治石榴干腐病的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種具有高抗石榴干腐病菌活性的內(nèi)生枯草芽孢桿菌正突變株NS04307及其制備以及防治石榴干腐病的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]石榴干腐病是影響石榴產(chǎn)業(yè)的重要病害，其病原菌為石榴墊殼孢
granati (Sacc.)Petr.&Syd)異名 'Zythia versoniana Sacc.,屬于半知菌亞門iDeuteromycotina )、球殼孢目(Sphaeropsidales、。主要侵染果實(shí)和樹干，也可以侵染石榴花器、果枝和新梢。病原菌的菌絲或分生孢子能夠在病果、病枝、病果臺(tái)上越冬，致使病果皮、病枝等成為初侵染源。當(dāng)夏季雨水多時(shí)，石榴干腐病發(fā)病情況尤其嚴(yán)重，輕者石榴產(chǎn)量受影響，重者石榴樹整枝或整株枯死。據(jù)統(tǒng)計(jì)，一般年份病果率達(dá)10%~40%，嚴(yán)重時(shí)病果率達(dá)到60%~80%，減產(chǎn)一般2~3成，高者達(dá)5成以上。此外，若貯藏期間濕度不適宜，造成大量爛果?？梢姡窀筛?yán)重影響了石榴的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值。
[0003]目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)石榴干腐病一般采取以農(nóng)業(yè)防治技術(shù)為基礎(chǔ)，化學(xué)防治技術(shù)為主導(dǎo)的綜合防 治措施。農(nóng)業(yè)防治多采用清園、套袋、加強(qiáng)栽培管理等。化學(xué)防治主要噴施化學(xué)農(nóng)藥，常使用的農(nóng)藥有甲基托布津(Thiophanate-Methyl),加瑞農(nóng)可濕性粉劑(Kasumin+Bordeaux)、代森猛鋒(Mancozeb)、多菌靈(Carbendazim)、福美砷(Carbendazim)、石硫合劑(Lime sulfur)等。
[0004]化學(xué)防治在短期內(nèi)的確有效，但是化學(xué)農(nóng)藥造成的環(huán)境污染問題、病原菌抗藥性問題和對(duì)人類健康的潛在威脅十分嚴(yán)重。我國(guó)耕地面積居世界第4位，但每年農(nóng)藥用量高達(dá)80~100萬(wàn)t，居世界之首?；瘜W(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的影響和破壞，尤其是對(duì)地下水和食品的污染問題已到了令人觸目驚心的地步；由于化學(xué)農(nóng)藥的不合理使用，導(dǎo)致病原微生物產(chǎn)生抗藥性，致使人們更頻繁的噴施更多、更毒的農(nóng)藥，產(chǎn)生惡性循環(huán)，極大的破壞了生態(tài)平衡和生物的多樣性。消費(fèi)者對(duì)無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品、綠色食品和有機(jī)食品的強(qiáng)烈需求，開發(fā)高效、低毒、無(wú)殘留的生物農(nóng)藥已成為迫切希望。生物農(nóng)藥是指利用生物產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)或生物活體作為農(nóng)藥，以及人工合成的與天然化合物結(jié)構(gòu)相同的農(nóng)藥，是不污染環(huán)境的綠色農(nóng)藥，可望成為解決化學(xué)農(nóng)藥殘留污染的有效途徑之一。
[0005]但是在微生物防治植物病害的相關(guān)研究中，活體微生物農(nóng)藥的有效性受到了田間環(huán)境的限制，很難在祀標(biāo)部位定殖，影響殺菌效果。植物內(nèi)生菌(Plant endophyte)作為生防菌株發(fā)展迅速并已成為當(dāng)前微生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，其獨(dú)具優(yōu)勢(shì)的特性使其成為植物病害生物防治的一類極具應(yīng)用潛能的新型資源菌?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生細(xì)菌具有穩(wěn)定的生存空間，它們與宿主植物之間的關(guān)系比宿主與土壤微生物及其附生菌更加密切。一些微生物能夠分泌拮抗物質(zhì)作用于病原菌的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、能量代謝系統(tǒng)及蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，從而抑制或殺死病原菌。此外，內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)占據(jù)了一定的生態(tài)位點(diǎn)從而阻止了病原菌的入侵和定殖；內(nèi)生細(xì)菌還可以與病原菌競(jìng)爭(zhēng)養(yǎng)分，使病原菌得不到營(yíng)養(yǎng)供給而死亡。目前，關(guān)于大豆、水稻、小麥、棉花、香蕉、蘋果、番茄、辣椒等作物的內(nèi)生細(xì)菌研究的較多。但從植物組織內(nèi)部篩選的內(nèi)生菌一般抑菌效果較低，誘變育種是工業(yè)微生物育種的重要方向，而其中又以物理誘變方法中的紫外線輻射誘變使用最為普遍，其他物理誘變因子則受設(shè)備條件的限制，難以普及，因此，可以使用紫外誘變的方法選育高抗活性的正突變株，使內(nèi)生生防菌在防治植物病害上有更大的應(yīng)用潛力。目前有關(guān)石榴干腐病內(nèi)生菌細(xì)菌的研究在國(guó)內(nèi)外還屬于空白。
[0006]綜上所述，篩選有效的內(nèi)生細(xì)菌，開發(fā)新型、安全有效的微生物殺菌劑，控制石榴干腐病的發(fā)生，是提高石榴產(chǎn)量，減少貯藏期石榴的損失，促進(jìn)石榴產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的迫切需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明需要解決的問題是利用植物內(nèi)生細(xì)菌資源開發(fā)一種可用于防治石榴干腐病及其它植物病害的廣譜、高效、可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的內(nèi)生枯草芽孢桿菌正突變株生防菌劑，提供由內(nèi)生菌feci77心subtilis NS04菌株為出發(fā)菌株選育的正突變菌株NS04307的方法，提供由正突變菌株NS04307制備的生防菌劑及其防治石榴干腐病的應(yīng)用方法。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
一種內(nèi)生枯草芽孢桿菌正突變株，其特征是，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisNS04307菌株，是一種防治石榴干腐病的生防菌，其特征在于該菌株為一株植物內(nèi)生細(xì)菌正突變株，由分離自石榴葉片內(nèi)部組織NS04菌株(已于2014年2月24日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.8812)經(jīng)紫外線誘變選育得到，編號(hào)為:NS04307，已于2014年2月24日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.8813。
[0009][XI] 一種內(nèi)生枯草芽孢桿菌正突變株的制備方法，其特征是:包括以下步驟:
(一)野生型內(nèi)生菌株NS04的篩選
(1)內(nèi)生菌株的分離和純化
采集健康的石榴葉片稱取3.0 g，自來水洗干凈，用無(wú)菌水沖洗3次，無(wú)菌剪刀剪成4-5mm見方的小塊后，在超凈工作臺(tái)上，依次用75%的酒精浸泡5 S，0.1 %的升汞浸泡50 S，無(wú)菌水漂洗3次，然后加30 mL無(wú)菌水在無(wú)菌研缽中研磨；研磨后靜止分層，上清液作為浸出液備用，其濃度為0.1 g/mL，取上清液I mL進(jìn)行梯度稀釋至10_5，從10_3、10_4、10_5稀釋懸液中各取0.2 mL涂布平板，以最后一次漂洗液0.2 mL涂布平板進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，每處理3個(gè)重復(fù)。在37°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24~48h，挑取單菌落在牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上采用平板劃線法進(jìn)行純化；純化后的菌株接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24 h，4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> (2)內(nèi)生生防菌株的篩選
采用平板對(duì)峙法測(cè)定內(nèi)生細(xì)菌對(duì)石槽干腐病菌{ Zythia Versoniana Sacc.)的抑制作用。首先將石榴干腐病菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上28 °C培養(yǎng)至產(chǎn)生孢子，用接種環(huán)挑取少量的病原菌孢子點(diǎn)接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板中央，在距平板中央3 cm的兩條對(duì)稱直線處劃線接種已分離的內(nèi)生細(xì)菌，以只接石榴干腐病菌為對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)，28 V恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對(duì)照皿中病原菌菌絲即將鋪滿全皿時(shí)，計(jì)算抑制率的大??；抑制率(％)=[(對(duì)照菌落直徑一處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑]X100 %，菌落直徑單位:厘米(cm)；
通過石榴葉片內(nèi)生菌的分離純化和篩選，獲得了一株對(duì)石榴干腐病菌有較好抑菌活性的內(nèi)生菌菌株，抑制率為55.6%，編號(hào)為NS04 ；
(二)正突變菌株NS04307的制備 (4.1)野生型菌株NS04生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
將活化后的出發(fā)菌株配成濃度為IX 108cfu/ml的菌懸液，取20 μ I接入裝有10 ml牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的試管中，共接18支，置于37 °C, 150 r/min搖床震蕩培養(yǎng)，從2 h后開始，每隔2 h取出一支試管放進(jìn)4 1:冰箱保存，等全部取完后，用分光光度計(jì)在625 nm波長(zhǎng)下分別測(cè)其OD值，以不接菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制菌株生長(zhǎng)曲線，確定其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。研究結(jié)果表明，NS04菌株的生長(zhǎng)曲線呈S型，0-14 h為延滯期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為16~24 h，26 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，30 h后則進(jìn)入衰亡期。故選擇培養(yǎng)20 h對(duì)數(shù)期的NS04菌懸液進(jìn)行誘變處理；
(4.2)致死率曲線的測(cè)定及野生型菌株的誘變 將NS04菌株接種于100 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)20 h，4 000 r/min離心10 min去上清，菌體用無(wú)菌生理鹽水和0.1 mo I/L的磷酸鹽緩沖液(pH 5.8)各洗滌一次后，調(diào)節(jié)菌液濃度約IX IO8 cfu/mL。取33個(gè)培養(yǎng)皿，每皿加入5 mL上述菌懸液，每3個(gè)為I組，共11組。選用20 W (照射距離30 cm)的紫外燈，預(yù)熱30 min使波長(zhǎng)穩(wěn)定后，分別照射 O s、20 s、40 s、60 s、80s、100 s、120 s、140 s、160 s、180 s、200 s，然后每皿吸取 0.I mL涂平板，37 1:恒溫培養(yǎng)24 h，待平板上長(zhǎng)出菌落后計(jì)數(shù)。以不經(jīng)紫外線誘變的平板為對(duì)照，依據(jù)下列公式計(jì)算出每個(gè)處理的致死率，以照射時(shí)間為橫坐標(biāo)、致死率為縱坐標(biāo)，繪制致死率曲線。
[0010]致死率(%)=[(對(duì)照組菌落數(shù)一紫外照射后菌落數(shù))/對(duì)照組菌落數(shù)]X 100%采用紫外照射對(duì)細(xì)菌NS04進(jìn)行誘變處理，在紫外燈功率和照射距離(保持30 Cm)不變時(shí)，致死率僅與照射時(shí)間有關(guān)，且照射時(shí)間越長(zhǎng)，誘變致死率越高。近年來研究認(rèn)為，致死率在70%~80%時(shí)誘變效果較好。從致死率突變曲線可知，NS04菌株的誘變時(shí)間為260 s時(shí)致死率為75.87 %，因此選擇260 s為NS04菌株最適誘變時(shí)間；
(4.3)突變菌株的篩選
采用瓊脂塊培養(yǎng)法進(jìn)行突變株的篩選，采用平板對(duì)峙法檢測(cè)突變株對(duì)石榴干腐病病原菌的抑菌活性。當(dāng)石榴干腐病病原菌長(zhǎng)滿平皿時(shí)，用無(wú)菌接種環(huán)挑取石榴干腐病病原菌孢子，接在馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板中央，在其兩側(cè)3 cm處劃線接種誘變菌株。在同樣條件下接種出發(fā)菌株和只接石榴干腐病菌為對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)，28 °C培養(yǎng)7 d后測(cè)病原菌菌落直徑，觀察平板抑制作用，并計(jì)算突變菌株與出發(fā)菌株對(duì)病原菌的生長(zhǎng)抑制率；
抑制率(％)=[(對(duì)照菌落直徑一處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑]X 100 %，菌落直徑單位:厘米(cm)；
經(jīng)過篩選得到了正突變菌株NS04307，對(duì)石榴干腐病菌的平板抑制作用明顯增強(qiáng)，其抑制率為80%，與出發(fā)菌株相比，抑制率提高了 30.5% ；
(4.4)正突變菌株NS04307的抑菌穩(wěn)定性測(cè)定
將NS04307菌株在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上傳代，共傳10次，并在相同條件下對(duì)每一代的菌株做平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，NS04307的抑菌率在71.95%~80.00%，該菌株對(duì)石榴干腐病的抑制率保持穩(wěn)定，說明NS04307突變菌株對(duì)石榴干腐病菌的抑制作用能穩(wěn)定遺傳。
[0011]一種內(nèi)生枯草芽孢桿菌正突變株在防治其他真菌病害中的應(yīng)用，其特征是:所述的內(nèi)生枯草芽孢桿菌突變株NS04307在防治芝麻白絹病iSclerotium ro7/^ii)、蘋果霉心病(Trichothecium roseum)、香蕉葉斑病菌_突胳螺抱(MxserohiIum rostraturn)、芝麻枯萎病{Fusari um oxysporum )、山茱萸褐斑病(Alterrmria al terna )、香蕉褐緣灰斑病iPseudocercospora musae ) >玉蜀黍赤霉菌(JJibberella zeae ) >山茱萸葉枯病iPeyronellaea glomera ia )、大葉黃楊炭疽病(Cb77<9 ? o tri chum sp.)、山茱萸擬盤多毛葉斑病 iPestalotiopsis foedans)、甘鹿鳳梨病(?ielaviopsis paradoxa)、玉米穗腐病致病性木賊鐮刀菌iFusarium equise ii )、玉米穗腐病致病串珠鐮刀菌(6?bberellamoni Iiformis )、玉米穗腐病致病層出鐮刀菌(Mt sari um prolifera turn )中的應(yīng)用。
[0012]根據(jù)所述內(nèi)生枯草芽孢桿菌正突變株制備的生防菌劑，其特征是，挑取活化的NS04307菌株，接種到IOmL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)中，37 °C, 180 r/min搖床培養(yǎng)，24 h，作為種子液；根據(jù)測(cè)定結(jié)果將種子液按1% (v/v)的比例接種于含200 mL PDB培養(yǎng)基的IL三角瓶中；37 °C，180 r/min搖床培養(yǎng)，72 h，得到發(fā)酵液，將發(fā)酵液稀釋10倍，濃度為
1.3X108cfu/mL,再在發(fā)酵液中添加3% (W/V)表面活性劑0P-10，充分混勻后獲得NS04307菌株的生防菌劑。
[0013]根據(jù)所述的內(nèi)生枯草芽孢桿菌正突變株及其生防菌劑在防治石榴干腐病中的應(yīng)
用。
[0014]根據(jù)所述的內(nèi)生枯草芽孢桿菌正突變株及其生防菌劑在防治石榴干腐病中的應(yīng)用，其特征是，包括以下兩個(gè)方面:
(I )NS04307菌株室內(nèi)果實(shí)離體防效試驗(yàn):將NS04307生防菌于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液37V, 180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h, 4 000 r/min離心10 min,棄上清,菌體用無(wú)菌水稀釋至IO8個(gè)/mL后備用；培養(yǎng)好的病原菌孢子用無(wú)菌水稀釋至IO8個(gè)/mL ;將石榴果實(shí)表面用75 %酒精消毒處理并自然晾干；用滅菌的5孔接種針在石榴果實(shí)腰部等距離地刺2處傷口，噴霧接種生防菌菌懸液及病原菌孢子懸液；該試驗(yàn)設(shè)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組3個(gè)處理，處理1:先接病原菌孢子懸液，24 h后再接生防菌菌懸液；處理2:先接生防菌菌懸液，24 h后再接病原菌孢子懸液；處理3:先接病原菌孢子懸液，待傷口晾干后立即接生防菌菌懸液；每處理5個(gè)果實(shí)，重復(fù)4次，以只接病原菌的處理為對(duì)照組；待其自然晾干后，將各處理的果實(shí)置于28 °C,RH 90%恒溫恒濕培養(yǎng)箱中貯存,待接種9 d后觀察并統(tǒng)計(jì)石榴干腐病的發(fā)病情況，用十字交叉法測(cè)定病斑直徑，最后計(jì)算抑制率；結(jié)果表明:NS04307生防菌株各處理對(duì)石榴干腐病都有很好的防治作用；處理I的抑制率為75.08 %，處理2和處理3對(duì)石榴干腐病的抑制率差異不顯著，分別為53.80 %和58.82 %，說明NS04307菌株對(duì)石榴干腐病有很好的治療作用和保護(hù)作用；
(2)NS04307生防菌劑大田防治石榴干腐病試驗(yàn):于6月底7月初開始防治石榴干腐病，在所選的石榴園將上述制備好的生防菌劑進(jìn)行噴施。試驗(yàn)采用隨機(jī)化完全區(qū)組設(shè)計(jì)進(jìn)行，從田間東、南、西、北和中部五個(gè)點(diǎn)選各取9株石榴果樹，分為3組，每3棵樹為I組，其中I組噴施NS04307生防菌劑，I組噴施60%代森錳鋅可濕性粉劑，一組噴施清水作為對(duì)照。每隔10 d重復(fù)施藥，連續(xù)3次，最后一次施藥后第15d調(diào)查果實(shí)發(fā)病情況，對(duì)病害進(jìn)行分級(jí)，計(jì)算病情指數(shù)和發(fā)病率。結(jié)果顯示:NS04307菌株生防菌劑在大田對(duì)石榴干腐病的防效可達(dá)65.15%，極顯著優(yōu)于果農(nóng)田間目前使用的化學(xué)藥劑代森錳鋅6.17%。
[0015]本發(fā)明采用的細(xì)菌是以分離自植物石槽葉片組織的內(nèi)生細(xì)菌subtil isNS04菌株為野生型菌株，按照常規(guī)方法以野生型NS04菌株為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線誘變進(jìn)行選育得到了高抗的正突變菌株，編號(hào)為NS04307。保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2014年I月26日，保藏號(hào)為CGMCC NO 8813。
[0016]本發(fā)明按照常規(guī)方法制備，以正突變株NS04307作為生產(chǎn)菌株，通過液體發(fā)酵和在發(fā)酵液中添加表面活性劑，制備NS04307菌株的生防菌劑；通過室內(nèi)平板實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)其對(duì)其它植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用；通過石榴果實(shí)離體防效試驗(yàn)、大田試驗(yàn)，評(píng)價(jià)其對(duì)石榴干腐病的防效。
[0017]本產(chǎn)品發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果:本發(fā)明具有穩(wěn)定的、高活性的內(nèi)生正突變細(xì)菌一Bacillus subti I is NS04307，該菌株培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單；NS04307菌株發(fā)酵過程所用原料主要為馬鈴薯和蔗糖，成本較低；由NS04307菌株發(fā)酵制備的生防菌劑方法簡(jiǎn)單，完全沒有因化學(xué)農(nóng)藥使用所帶來的一系列問題，因而有利于作物的無(wú)公害生產(chǎn)，對(duì)人畜無(wú)害、對(duì)農(nóng)作物無(wú)藥害，綠色環(huán)保，且大田中對(duì)石榴干腐病有顯著防效，對(duì)其它15種病原菌引起的植物病害也有較好的抑制作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為NS04菌株生長(zhǎng)曲線。
[0019]圖2為NS04菌株的致死率曲線。
[0020]圖3為NS04307菌株對(duì)石榴干腐病病菌的平板抑制作用。圖3中A:石榴干腐病病原菌；B:野生型菌株NS04對(duì)石榴干腐病的平板抑制作用；C:突變菌株NS04307對(duì)石榴干腐病的平板抑制作用。
[0021]圖4 NS04307菌株的抑菌穩(wěn)定性。
【具體實(shí)施方式】
[0022]本發(fā)明枯草芽孢桿菌subtil is NS04307菌株，是一種防治石榴干腐病的生防菌，其特征在于該菌株為一株植物內(nèi)生細(xì)菌正突變株，由分離自石榴葉片內(nèi)部組織NS04菌株(于2014年I月26日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.8812)經(jīng)紫外線誘變選育得到，編號(hào)為:NS04307，己于2014年I月26日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.8813。
[0023]所述的NS04菌株作為野生型菌株，通過紫外線誘變選育得到該菌株的正突變株NS04307，該突變株的抗石榴干腐病菌活性可達(dá)71.95%~80%，比野生型菌株的抗石榴干腐病活性提聞了 30.5%。
[0024]所述的內(nèi)生枯草芽孢桿菌的突變株NS04307的制備方法，其特點(diǎn)是先根據(jù)野生型菌株NS04的生長(zhǎng)曲線，研究出該菌株的致死率曲線，得出最佳誘變條件，再通過紫外線誘變和產(chǎn)量型突變菌株的篩選方法得到突變菌株NS04307。
[0025]所述的內(nèi)生枯草芽孢桿菌突變株NS04307抑菌性能的穩(wěn)定性，其特點(diǎn)是該突變菌株對(duì)石榴干腐病菌的抑菌性能穩(wěn)定，連續(xù)移接培養(yǎng)10代，其抑菌活性沒有發(fā)生變化。
[0026]所述的內(nèi)生枯草芽孢桿菌的突變株NS04307的生防菌劑的制備方法。
[0027]所述的生防菌劑在防治石榴干腐病中的應(yīng)用。
[0028]所述的內(nèi)生枯草芽孢桿菌突變株NS04307在防治芝麻白絹病iSclerotiumrolfsi i)、蘋果霉心病(Tri cho theci um roseum )、香蕉葉斑病菌_突胳螺抱iExserohi Iumriosira乙應(yīng))、芝麻才古萎病(/7W1Sari應(yīng) oxysporum)、山茱萸褐斑病alternate、、香蕉褐緣灰斑病{Pseudocercospora musae)、玉蜀黍赤霉菌((?'bberella zeae)、山茱萸葉枯病QPeyronellaea glomera ia )、大葉黃楊炭疽病(Cb77<9 ? o tri chum sp.)、山茱萸擬盤多毛葉斑病 iPes talo ti opsi s foedans )、甘鹿鳳梨病(?i ela vi opsi s paradoxa )、玉米穗腐病致病性木賊鐮刀菌iFusarium equise ii )、玉米穗腐病致病串珠鐮刀菌(6?bberellamoni Iiformis )、玉米穗腐病致病層出鐮刀菌(Mt sari um prolifera turn )中的應(yīng)用。
[0029]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例來進(jìn)一步講述本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
[0030]實(shí)施例1:野生型內(nèi)生菌株NS04的篩選
1.內(nèi)生菌株的分離和純化 采集健康的石榴葉片稱取3.0 g，自來水洗干凈，用無(wú)菌水沖洗3次，無(wú)菌剪刀剪成4-5mm見方的小塊后，在超凈工作臺(tái)上，依次用75%的酒精浸泡5 S，0.1 %的升汞浸泡50 S，無(wú)菌水漂洗3次，然后加30 mL無(wú)菌水在無(wú)菌研缽中研磨；研磨后靜止分層，上清液作為浸出液備用，其濃度為0.1 g/mL，取上清液I mL進(jìn)行梯度稀釋至10_5，從10_3、10_4、10_5稀釋懸液中各取0.2 mL涂布平板，以最后一次漂洗液0.2 mL涂布平板進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，每處理3個(gè)重復(fù)。在37°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24~48h，挑取單菌落在牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上采用平板劃線法進(jìn)行純化；純化后的菌株接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24 h，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0031]2.內(nèi)生生防菌株的篩選
采用平板對(duì)峙法測(cè)定內(nèi)生細(xì)菌對(duì)石槽干腐病菌{ Zythia Versoniana Sacc.)的抑制作用。首先將石榴干腐病菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上28 °C培養(yǎng)至產(chǎn)生孢子，用接種環(huán)挑取少量的病原菌孢子點(diǎn)接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板中央，在距平板中央3 cm的兩條對(duì)稱直線處劃線接種已分離的內(nèi)生細(xì)菌，以只接石榴干腐病菌為對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)，28 V恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對(duì)照皿中病原菌菌絲即將鋪滿全皿時(shí)，計(jì)算抑制率的大小。
[0032]抑制率(％ )=[(對(duì)照菌落直徑一處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑]X 100 %，菌落直徑單位:厘米(cm)。
[0033]通過石榴葉片內(nèi)生菌的分離純化和篩選，獲得了一株對(duì)石榴干腐病菌有較好抑菌活性的內(nèi)生菌菌株，抑制率為55.6%，編號(hào)為NS04。
[0034]3.內(nèi)生生防菌株NS04的鑒定
3.1 NS04菌株的形態(tài)學(xué)、生理生化特性
NS04菌株在NA平板培養(yǎng)基上菌落直徑約為0.76 cm,白色，不透明，不規(guī)則狀，隆起，邊緣裂葉狀，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)菌落表面出現(xiàn)褶皺。NS04單個(gè)細(xì)胞呈短桿狀，
0.63^0.87X 1.75^2.51 μ m，單生或?qū)ι?，革蘭氏染色陽(yáng)性，有橢圓形或柱狀芽孢。NS04菌株和枯草芽孢桿菌(ifeciBiAs的生理生化特性基本一致(表1)。
[0035]表1內(nèi)生生防菌NS04菌株生理生化特征
【權(quán)利要求】
1.一種內(nèi)生枯草芽孢桿菌正突變株，其特征是，枯草芽孢桿菌subtil isNS04307菌株，是一種防治石榴干腐病的生防菌，其特征在于該菌株為一株植物內(nèi)生細(xì)菌正突變株，由分離自石榴葉片內(nèi)部組織NS04菌株(已于2014年2月24日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.8812)經(jīng)紫外線誘變選育得到，編號(hào)為:NS04307，已于2014年2月24日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.8813。
2.一種內(nèi)生枯草芽孢桿菌正突變株的制備方法，其特征是:包括以下步驟: (一)野生型內(nèi)生菌株NS04的篩選 (1)內(nèi)生菌株的分離和純化 采集健康的石榴葉片稱取3.0 g，自來水洗干凈，用無(wú)菌水沖洗3次，無(wú)菌剪刀剪成4-5mm見方的小塊后，在超凈工作臺(tái)上，依次用75%的酒精浸泡5 S，0.1 %的升汞浸泡50 S，無(wú)菌水漂洗3次，然后加30 mL無(wú)菌水在無(wú)菌研缽中研磨；研磨后靜止分層，上清液作為浸出液備用，其濃度為0.1 g/mL，取上清液I mL進(jìn)行梯度稀釋至10_5，從10_3、10_4、10_5稀釋懸液中各取0.2 mL涂布平板，以最后一次漂洗液0.2 mL涂布平板進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，每處理3個(gè)重復(fù)；在37°〇恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24-48 h，挑取單菌落在牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上采用平板劃線法進(jìn)行純化；純化后的菌株接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24 h，4°C冰箱保存?zhèn)溆茫? (2)內(nèi)生生防菌株的篩選 采用平板對(duì)峙法測(cè)定內(nèi)生細(xì)菌對(duì)石槽干腐病菌{ Zythia Versoniana Sacc.)的抑制作用；首先將石榴干腐病菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上28 °C培養(yǎng)至產(chǎn)生孢子，用接種環(huán)挑取少量的病原菌孢子點(diǎn)接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板中央，在距平板中央3 cm的兩條對(duì)稱直線處劃線接種已分離的內(nèi)生細(xì)菌，以只接石榴干腐病菌為對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)，28 V恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對(duì)照皿中病原菌菌絲即將鋪滿全皿時(shí)，計(jì)算抑制率的大小； 抑制率(％)=[(對(duì)照菌落直徑一處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑]X 100 %，菌落直徑單位:厘米(cm)； 通過石榴葉片內(nèi)生菌的分離純化和篩選，獲得了一株對(duì)石榴干腐病菌有較好抑菌活性的內(nèi)生菌菌株，抑制率為55.6%，編號(hào)為NS04 ； (二)正突變菌株NS04307的制備 (4.1)野生型菌株NS04生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將活化后的出發(fā)菌株配成濃度為IX 108cfu/ml的菌懸液，取20 μ I接入裝有10 ml牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的試管中，共接18支，置于37 °C, 150 r/min搖床震蕩培養(yǎng)，從2 h后開始，每隔2 h取出一支試管放進(jìn)4 1:冰箱保存，等全部取完后，用分光光度計(jì)在625 nm波長(zhǎng)下分別測(cè)其OD值，以不接菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)；.以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制菌株生長(zhǎng)曲線，確定其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；結(jié)果表明，NS04菌株的生長(zhǎng)曲線呈S型，0-14 h為延滯期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為16~24 h，26 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，30 h后則進(jìn)入衰亡期；7.故選擇培養(yǎng)20 h對(duì)數(shù)期的NS04菌懸液進(jìn)行誘變處理； (4.2)致死率曲線的測(cè)定及野生型菌株的誘變 將NS04菌株接種于100 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)20 h，4 000 r/min離心10 min去上清，菌體用無(wú)菌生理鹽水和0.1 mo I/L的磷酸鹽緩沖液(pH 5.8)各洗滌一次后，調(diào)節(jié)菌液濃度約I X IO8 cfu/mL ;取33個(gè)培養(yǎng)皿，每皿加入5 mL上述菌懸液，每3個(gè)為I組，共11組；選用20W (照射距離30 cm)的紫外燈，預(yù)熱30 min使波長(zhǎng)穩(wěn)定后，分別照射O s、20 s、40 s、60 s、80s、100 s、120 s、140 s、160 s、180 s、200 s，然后每皿吸取 0.I mL 涂平板，37 1:恒溫培養(yǎng)24 h，待平板上長(zhǎng)出菌落后計(jì)數(shù)；以不經(jīng)紫外線誘變的平板為對(duì)照，依據(jù)下列公式計(jì)算出每個(gè)處理的致死率，以照射時(shí)間為橫坐標(biāo)、致死率為縱坐標(biāo)，繪制致死率曲線.致死率(%)=[(對(duì)照組菌落數(shù)一紫外照射后菌落數(shù))/對(duì)照組菌落數(shù)]X100% 采用紫外照射對(duì)細(xì)菌NS04進(jìn)行誘變處理，在紫外燈功率和照射距離(保持30 Cm)不變時(shí)，致死率僅與照射時(shí)間有關(guān)，且照射時(shí)間越長(zhǎng)，誘變致死率越高；致死率在70%~80%時(shí)誘變效果較好；從致死率突變曲線可知，NS04菌株的誘變時(shí)間為260 s時(shí)致死率為75.87 %，選擇260 s為NS04菌株最適誘變時(shí)間； (4.3)突變菌株的篩選 采用瓊脂塊培養(yǎng)法進(jìn)行突變株的篩選，采用平板對(duì)峙法檢測(cè)突變株對(duì)石榴干腐病病原菌的抑菌活性；當(dāng)石榴干腐病病原菌長(zhǎng)滿平皿時(shí)，用無(wú)菌接種環(huán)挑取石榴干腐病病原菌孢子，接在馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板中央，在其兩側(cè)3 cm處劃線接種誘變菌株；在同樣條件下接種出發(fā)菌株和只接石榴干腐病菌為對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)，28 °C培養(yǎng)7 d后測(cè)病原菌菌落直徑，觀察平板抑制作用，并計(jì)算突變菌株與出發(fā)菌株對(duì)病原菌的生長(zhǎng)抑制率； 抑制率(％)=[(對(duì)照菌落直徑一處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑]X 100 %，菌落直徑單位:厘米(cm)； 經(jīng)過篩選得到了正突變菌株NS04307，對(duì)石榴干腐病菌的平板抑制作用明顯增強(qiáng)，其抑制率為80%，與出發(fā)菌株相比，抑制率提高了 30.5% ； (4.4)正突變菌株NS04307的抑菌穩(wěn)定性測(cè)定 將NS04307菌株在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上傳代，共傳10次，并在相同條件下對(duì)每一代的菌株做平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，NS04307的抑菌率在71.95%~80.00%，該菌株對(duì)石榴干腐病的抑制率保持穩(wěn)定，說明NS04307突變菌株對(duì)石榴干腐病菌的抑制作用能穩(wěn)定遺傳。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種內(nèi)生枯草芽孢桿菌正突變株在防治其他真菌病害中的應(yīng)用，其特征是:所述的內(nèi)生枯草芽孢桿菌突變株NS04307在防治芝麻白絹病應(yīng)rolfsii)、蘋果霉心病(Trichothecium roseum)、香蕉葉斑病菌_突胳螺抱iExserohiIumriosira乙應(yīng))、芝麻才古萎病(/7W1Sari應(yīng) oxysporum)、山茱萸褐斑病alternate、、香蕉褐緣灰斑病{Pseudocercospora musae)、玉蜀黍赤霉菌((?'bberella zeae)、山茱萸葉枯病QPeyronellaea glomera ia )、大葉黃楊炭疽病(Cb77<9?o trichum sp.)、山茱萸擬盤多毛葉斑病 iPestalotiopsis foedans)、甘鹿鳳梨病(?ielaviopsis paradoxa )、玉米穗腐病致病性木賊鐮刀菌iFusarium equise ii )、玉米穗腐病致病串珠鐮刀菌(6?bberellamoni Iiformis )、玉米穗腐病致病層出鐮刀菌(Mt sari um prolifera turn )中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述內(nèi)生枯草芽孢桿菌正突變株制備的生防菌劑，其特征是，挑取活化的NS04307菌株，接種到IOmL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)中，37 °C, 180 r/min搖床培養(yǎng)，24 h，作為種子液；根據(jù)測(cè)定結(jié)果將種子液按1% (v/v)的比例接種于含200 mL PDB培養(yǎng)基的IL三角瓶中；37 °C，180 r/min搖床培養(yǎng)，72 h，得到發(fā)酵液，將發(fā)酵液稀釋10倍，濃度為1.3 X IO8 cfu/mL,再在發(fā)酵液中添加3% (W/V)表面活性劑0P-10，充分混勻后獲得NS04307菌株的生防菌劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和4所述的內(nèi)生枯草芽孢桿菌正突變株及其生防菌劑在防治石榴干腐病中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的內(nèi)生枯草芽孢桿菌正突變株及其生防菌劑在防治石榴干腐病中的應(yīng)用，其特征是，包括以下兩個(gè)方面: (I )NS04307菌株室內(nèi)果實(shí)離體防效試驗(yàn):將NS04307生防菌于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液37V, 180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h, 4 000 r/min離心10 min,棄上清,菌體用無(wú)菌水稀釋至IO8個(gè)/mL后備用；培養(yǎng)好的病原菌孢子用無(wú)菌水稀釋至IO8個(gè)/mL ;將石榴果實(shí)表面用75 %酒精消毒處理并自然晾干；用滅菌的5孔接種針在石榴果實(shí)腰部等距離地刺2處傷口，噴霧接種生防菌菌懸液及病原菌孢子懸液；該試驗(yàn)設(shè)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組3個(gè)處理，處理1:先接病原菌孢子懸液，24 h后再接生防菌菌懸液；處理2:先接生防菌菌懸液，24 h后再接病原菌孢子懸液；處理3:先接病原菌孢子懸液，待傷口晾干后立即接生防菌菌懸液；每處理5個(gè)果實(shí)，重復(fù)4次，以只接病原菌的處理為對(duì)照組；待其自然晾干后，將各處理的果實(shí)置于28 °C,RH 90%恒溫恒濕培養(yǎng)箱中貯存,待接種9 d后觀察并統(tǒng)計(jì)石榴干腐病的發(fā)病情況，用十字交叉法測(cè)定病斑直徑，最后計(jì)算抑制率；結(jié)果表明:NS04307生防菌株各處理對(duì)石榴干腐病都有很好的防治作用；處理I的抑制率為75.08 %，處理2和處理3對(duì)石榴干腐病的抑制率差異不顯著，分別為53.80 %和58.82 %，說明NS04307菌株對(duì)石榴干腐病有很好的治療作用和保護(hù)作用； (2) NS04307生防菌劑大田防治石榴干腐病試驗(yàn):于6月底7月初開始防治石榴干腐病，在所選的石榴園將上述制備好的生防菌劑進(jìn)行噴施；試驗(yàn)采用隨機(jī)化完全區(qū)組設(shè)計(jì)進(jìn)行，從田間東、南、西、北和中部五個(gè)點(diǎn)選各取9株石榴果樹，分為3組，每3棵樹為I組，其中I組噴施NS04307生防菌劑，I組噴施60%代森錳鋅可濕性粉劑，一組噴施清水作為對(duì)照；每隔10 d重復(fù)施藥，連續(xù)3次，最后一次施藥后第15d調(diào)查果實(shí)發(fā)病情況，對(duì)病害進(jìn)行分級(jí)，計(jì)算病情指數(shù)和發(fā)病率；結(jié)果顯示:NS04307菌株生防菌劑在大田對(duì)石榴干腐病的防效可達(dá)65.15%，極顯著優(yōu)于果農(nóng)田間目前使用的化學(xué)藥劑代森錳鋅6.17%。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104017749SQ201410144902
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年4月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月13日
【發(fā)明者】譚小艷, 馬耀華, 黃思良, 劉晶, 張盼盼, 牛小瑞, 羅偉 申請(qǐng)人:棗莊學(xué)院