專利名稱：促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)的芽孢桿菌kr083及含有該菌株的微生物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由1號(hào)序列所代表的芽孢桿菌KR083(Bacillus sp.KR083)(該菌株于2003年6月11日被保藏在韓國(guó)農(nóng)業(yè)微生物保藏中心(KACC)，保藏編號(hào)為KACC 91050；并于2005年5月27日被重新保藏到韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，保藏編號(hào)為KCTC 10811BP)，該菌株可代替化肥來促進(jìn)植物生長(zhǎng)。更具體地，本發(fā)明涉及芽孢桿菌KR083以及含有該菌株的微生物制劑，該菌株通過定殖于植物根系內(nèi)外來固定大氣中的氮、促進(jìn)植物生長(zhǎng)并抑制植物病原體的生長(zhǎng)。
背景技術(shù)：
肥料是決定農(nóng)作物產(chǎn)量的一種重要的農(nóng)業(yè)物資，但如果使用過量，它作為一種農(nóng)作物生長(zhǎng)的劣質(zhì)因子會(huì)導(dǎo)致農(nóng)作物品質(zhì)退化、河流超營(yíng)養(yǎng)化、地下水污染、土壤營(yíng)養(yǎng)失衡以及產(chǎn)量降低。然而，由于工業(yè)發(fā)展，農(nóng)田面積逐步減少，為提高農(nóng)作物產(chǎn)量不可避免地要使用肥料。因此，急需開發(fā)更多的環(huán)境友好型肥料(pro-environmental fertilizers)來替代化肥。
同時(shí)，使用土壤微生物來培育農(nóng)作物已經(jīng)在豆科植物中得到廣泛應(yīng)用，主要使用的微生物是與豆科植物形成共生關(guān)系的根瘤菌(Rhizobium)。1980年由Kloepper等人命名的促進(jìn)植物生長(zhǎng)的根細(xì)菌(Plant growth-promotingrhizobacteria(PGPR))不與寄主植物形成共生關(guān)系并能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，它包括固氮螺菌(Azospirrilum sp.)(Okon，1985)、假單孢菌(Pseudomonas sp.)(Kloepper等人，1980)、芽孢桿菌(Backman等人，1994)等。被稱為PGPR的植物生長(zhǎng)促進(jìn)微生物通過多種功能幫助植物生長(zhǎng)，例如固定大氣中的氮(Boddy和Dobereiner，1995)、產(chǎn)生植物生長(zhǎng)促進(jìn)激素、促進(jìn)養(yǎng)分吸收(Hallmann等人，1997)以及避免植物受病害攻擊(Pleban等人，1995)。已經(jīng)證實(shí)接種不同的植物生長(zhǎng)促進(jìn)微生物可將水稻產(chǎn)量提高19-60％(Baldani，2000)，并可提高西紅柿(Kloepper和Schroth，1981)、菜豆(Polonenko等人，1987；和Dashti等人，1998)、小麥(Freitas和Germida，1990)和甜菜(Suslow和Schrith，1982)的產(chǎn)量。植物生長(zhǎng)促進(jìn)微生物的應(yīng)用已有研究。
另外，Ward等人(1992)報(bào)道指出，已經(jīng)分類并鑒定的微生物種類占生活在土壤中全部微生物種類的5％以下；Young(1992)報(bào)道指出，能固定大氣中的氮的微生物超過100種；而Torisvik等人(1990)報(bào)道說在土壤中存在許多未被人工培育的微生物。因此，在土壤中還存在許多具有優(yōu)秀功能的微生物，其數(shù)量遠(yuǎn)大于之前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的，由此引起了關(guān)于它們的后續(xù)研究。
然而，在歸類于促進(jìn)植物生長(zhǎng)的根細(xì)菌的土壤微生物中，還沒有關(guān)于能固定大氣中的氮、分泌植物生長(zhǎng)促進(jìn)激素并抑制植物病害的單菌株的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的發(fā)明人在研究土壤微生物時(shí)分離并鑒定了可定殖于水稻植物根系內(nèi)外的芽孢桿菌KR083，并且還發(fā)現(xiàn)該菌株能固定大氣中的氮、分泌植物生長(zhǎng)促進(jìn)激素并抑制植物病害。
本發(fā)明的目的是提供具有固定大氣中的氮、分泌植物生長(zhǎng)促進(jìn)激素并抑制植物病害功能的芽孢桿菌KR083。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述芽孢桿菌KR083的次級(jí)代謝物。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供含有芽孢桿菌KR083作為有效成分的微生物制劑。
本發(fā)明涉及1號(hào)序列所代表的芽孢桿菌KR083以及含有該菌株的微生物制劑，所述菌株能通過定殖于植物根系內(nèi)外來固定大氣中的氮、分泌植物生長(zhǎng)促進(jìn)激素并抑制植物病害。


圖1示出了芽孢桿菌KR083的分離；圖2a和圖2b是芽孢桿菌KR083的電鏡照片；圖3是定殖于植物根內(nèi)部的芽孢桿菌KR083的照片。
生物保藏本發(fā)明的KR083菌株被命名為“芽孢桿菌KR083”，于2003年6月11日被保藏在附屬于韓國(guó)農(nóng)村振興廳/韓國(guó)國(guó)家農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所的韓國(guó)農(nóng)業(yè)微生物保藏中心(KACC)，保藏編號(hào)為KACC 91050。
2005年5月27日，KR083被重新保藏到韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，保藏編號(hào)為KCTC 10811BP。
具體實(shí)施例方式
下面將詳細(xì)說明本發(fā)明。
如圖2所示，KR083呈桿狀，兩端為圓形，具有鞭毛，大小為1.5-2.0×0.8-1.0微米。當(dāng)該菌株在PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)后，會(huì)產(chǎn)生聚-β-羥丁酸(poly-β-oxybutyrate)。所述KR083菌株是革蘭氏陽性菌，可產(chǎn)生芽孢，進(jìn)行有氧代謝并有觸酶活性。另外，KR083菌株能固定氮分子(N2)，并能在7％的NaCl溶液中生長(zhǎng)，在石蕊牛奶(Litmus milk)試驗(yàn)中不顯色。當(dāng)加入培養(yǎng)基的碳源為葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖或甘露醇時(shí)，KR083菌株會(huì)形成酸；而當(dāng)加入培養(yǎng)基的碳源為檸檬酸鹽、糊精、鼠李糖(rhamnose)、山梨糖醇或淀粉時(shí)，該菌株會(huì)形成堿。另外，該菌株不能在含有半乳糖醇或甘油的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。此外，如圖3所示，本發(fā)明的KR083菌株的特征是存在于植物根系外部并定殖于根內(nèi)部。
KR083菌株的生理生化特征如下表1所示。
表1KR083菌株的生理生化特征

參考實(shí)施例1KR083的序列分析采用16S rDNA序列分析方法分析KR083DNA序列。首先，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增16S rDNA部分，將產(chǎn)物插入pGEMT-T載體中，然后用DNA自動(dòng)測(cè)序儀ABI3100(Applied Biosystem，美國(guó))進(jìn)行DNA序列分析。PCR反應(yīng)使用2號(hào)序列的 fD1(5′-agagtttgatggctcag-3′)和3號(hào)序列的rP2(5′-acggctaccttgttacgactt-3′)。另外，使用pUC/M13的正向引物(5′-gttttcccagtcacgac-3′4號(hào)序列)和反向引物(5′-gcggataacaatttcacacagg-3′5號(hào)序列)進(jìn)行反應(yīng)來分析上述引物的兩端部分，并使用四個(gè)引物進(jìn)行反應(yīng)來分析內(nèi)部的DNA序列。根據(jù)大腸桿菌16S rDNA序列(Ecsherichia coil 16S rDNA，GenBank第J01695號(hào))，每個(gè)DNA序列使用16SP-1的311-330部分(5′-gccacactggaactgagacac-3′)、16SP-2的684-703部分(5′-tgtagcggtgaaatgcgtg-3′)、16SP-3的944-963部分(5′-ggagcatgtgt tattcg-3′)以及16SP-4的1228-1247部分(5′-ctacacacgtg ctacaatgg-3′)。
1號(hào)序列代表KR083菌株的16S rDNA序列。對(duì)該菌株和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中DNA序列之間的同源性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，該菌株與芽孢桿菌的同源性大于99％，而與其它菌種的同源性低于98％，由此將該菌株劃分為芽孢桿菌。
根據(jù)本發(fā)明的芽孢桿菌KR083對(duì)植物生長(zhǎng)的促進(jìn)效果如下當(dāng)將玉米根部浸入到稀釋了50倍的所述菌株培養(yǎng)液中維持1.5小時(shí)，根長(zhǎng)增加21.3％。另外，當(dāng)該菌株在室溫下培養(yǎng)72小時(shí)，其固氮量分別比Herbaspirrilumseropedicae BR11175和固氮醋酸桿菌(Acetobacter diazotrophicus)BR11281高1.02和143倍。此外，芽孢桿菌KR083還對(duì)立枯絲核病菌(Rhizoctoniasolani)和胡蘿卜歐氏桿菌(Erwinia carotovora)顯示出很強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制活性。
可以使用本領(lǐng)域熟知的方法將本發(fā)明的微生物制劑配制成植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑或植物病原生長(zhǎng)抑制劑，但并不局限于此。為代替化肥，本發(fā)明的微生物制劑優(yōu)選配制成用于促進(jìn)植物生長(zhǎng)的有機(jī)肥料。
當(dāng)本發(fā)明的微生物制劑是一種干粉狀或液態(tài)肥料的植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑時(shí)，每1克干粉或1毫升液體中芽孢桿菌KR083的含量為105-107。
當(dāng)本發(fā)明的微生物制劑是一種干粉狀或液態(tài)肥料的病原生長(zhǎng)抑制劑時(shí)，每1克干粉或1毫升液體中芽孢桿菌KR083的含量應(yīng)超過107。在這種情況下，其特征是該菌株的含量比植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑的含量更高。
下述實(shí)施例將詳細(xì)說明本發(fā)明。然而，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，顯然，這些實(shí)施例只是用來描述本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范疇。
<實(shí)施例1>KR083的分離如圖1所示，把在無菌培養(yǎng)基中發(fā)芽的一粒水稻種子轉(zhuǎn)移到0.6％的瓊脂糖培養(yǎng)基中，將0.5克土壤樣品(來自俄羅斯St.Petersburg)接種在距水稻根部1-2厘米處，然后將培養(yǎng)基在28℃培養(yǎng)48小時(shí)。將上述根碾碎使之形成懸浮液后，將該懸浮液涂敷到LC培養(yǎng)基中以分離菌株。
<實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1>KR083的大氣固氮作用在用于血液收集的真空管中加入5毫升半固體狀的LGI培養(yǎng)基并將KR083菌株接種其中，在恒溫下培養(yǎng)，然后用氣相色譜測(cè)定其乙炔還原活性(Hardy，1970)。結(jié)果如下表2中所示。
表2KR083的大氣固氮作用

如表2所述，根據(jù)本發(fā)明的芽孢桿菌KR083比Herbaspirillum seropedicaeBR1175、Herbaspirillum rubrisubalbicans BR11192和固氮醋酸桿菌BR11281顯示出更高的大氣固氮作用。
<實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例2>KR083的植物生長(zhǎng)促進(jìn)效果為檢測(cè)芽孢桿菌KR083的植物生長(zhǎng)促進(jìn)效果，對(duì)橢圓小球藻(Chlorellavulgaris)、海藻和玉米幼苗進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)Hata培養(yǎng)基的溫度為50℃時(shí)，將橢圓小球藻與培養(yǎng)基(液態(tài))混合，然后將混合好的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中固化。在每個(gè)平板中開一個(gè)半徑為4毫米的孔，將100微升芽孢桿菌KR083涂于平板上，重復(fù)10次。將處理后的海藻在光照條件下放置5天，然后檢測(cè)海藻的生長(zhǎng)范圍。將玉米根末端3毫米浸入該菌株培養(yǎng)物懸浮液中，并保持1.5小時(shí)，其它玉米根部浸入無菌培養(yǎng)液中作為對(duì)照。將玉米幼苗放置在塑料箱中的濕濾紙上，然后用濾紙將存在于根的起始線上的根末端(the rootend existing on the starting line ofthe root)蓋好，于28℃培養(yǎng)24小時(shí)。測(cè)量新增長(zhǎng)的根的長(zhǎng)度，重復(fù)10次，測(cè)得的所述KR083菌株的玉米生長(zhǎng)促進(jìn)效果如下表3中所示。
表3菌株對(duì)海藻和玉米的生長(zhǎng)促進(jìn)效果

如表3所述，接種5天后芽孢桿菌KR083的生長(zhǎng)促進(jìn)水平使小球藻直徑增加3毫米。在玉米根的例子中，在用以1∶2稀釋的原液(4.5×109c.f.u/毫升)進(jìn)行接種時(shí)，本發(fā)明的芽孢桿菌KR083的生長(zhǎng)促進(jìn)水平降低了20％，而在用以1∶50稀釋的原液進(jìn)行接種時(shí)，其生長(zhǎng)促進(jìn)水平卻提高了26.3％。
<實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例3>KR083對(duì)植物病原體的抑制效果使用下列方法檢測(cè)KR083對(duì)植物病原體的抑制效果。首先，在PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)中分別接種病原真菌和細(xì)菌，然后將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中固化。在每個(gè)平板中開一個(gè)半徑為4毫米的孔，將100微升芽孢桿菌KR083在PDA液體培養(yǎng)基中于28℃下培養(yǎng)5天，然后接種到該孔中。將平板在28℃下放置5天，然后檢測(cè)PGPR的生長(zhǎng)抑制范圍。將5毫升(1×106分生孢子/毫升)真菌和5毫升(1×108cfu/毫升)細(xì)菌在45℃下分別與250毫升PDA培養(yǎng)基混合并振蕩，每個(gè)培養(yǎng)皿中各取25毫升溶液鋪板，重復(fù)3次。結(jié)果如表4中所示。
表4芽孢桿菌KR083菌株對(duì)植物病原真菌和細(xì)菌的生長(zhǎng)抑制范圍(生長(zhǎng)抑制范圍，Φ/毫米)

結(jié)果顯示，本發(fā)明的KR083菌株對(duì)立枯絲核病菌、腐霉菌(Pythium)、胡蘿卜歐氏桿菌和丁香假單孢桿菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制效果。
<實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例4>在農(nóng)作物中接種芽孢桿菌KR083的效果將常規(guī)培養(yǎng)的本發(fā)明芽孢桿菌KR083的培養(yǎng)液接種到大麥、辣椒和番茄上，結(jié)果如下表5中所示。
表5KR083的接種

如表5所示，證實(shí)芽孢桿菌KR083使大麥生長(zhǎng)增加了3.9％，辣椒生長(zhǎng)增加了13.7％，番茄生長(zhǎng)增加了165.7％，并且證實(shí)了本發(fā)明的芽孢桿菌KR083可增加農(nóng)作物產(chǎn)量。
工業(yè)實(shí)用性如上所述，已證實(shí)本發(fā)明的芽孢桿菌KR083通過定殖于植物根系內(nèi)外來固定大氣中的氮、促進(jìn)植物生長(zhǎng)并抑制植物病原體的生長(zhǎng)。因此，當(dāng)使用常規(guī)方法將芽孢桿菌KR083用作微生物制劑時(shí)，它能保護(hù)水質(zhì)和土壤環(huán)境、增加農(nóng)作物產(chǎn)量并保護(hù)農(nóng)作物免受植物病原體侵害。
序列表<110>韓國(guó)農(nóng)村振興廳(Republic ofKorea represented by Rural Development Administration)<120>促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)的芽孢桿菌KR083及含有該菌株的微生物制劑<130>I5047YOL<150>KR10-2004-0043317<151>2004-06-12<160>5<170>PatentIn 3.1<210>1<211>1512<212>DNA<213>芽孢桿菌KR083(Bacillus sp.KR083)<400>1gagtttgatc ctggctcagg acgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgagcg 60gtggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt120aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaatactgg atggttgttt180gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat ggacccgcgg240cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag300agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta360gggatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgaatg aaggttttcg420gatcgtaaag ctctgttgtt agggaagaac aagtgccgtt caaatagggc ggcaccttga480cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt540ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga600tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga660agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag720tggcgaaggc gactctctgg tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa780caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt840tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa900
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<223>用于擴(kuò)增假芽孢桿菌KR083基因的PCR引物fD1<400>2agagtttgat ggctcag 17<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增假芽孢桿菌KR083基因的PCR引物rP2<400>3acggctacct tgttacgact t21<210>4
<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增假芽孢桿菌KR083基因的pUC/M13的PCR擴(kuò)增正向引物<400>4gttttcccag tcacgac 17<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增假芽孢桿菌KR083基因的pUC/M13的PCR擴(kuò)增反向引物<400>5gcggataaca atttcacaca gg 2權(quán)利要求
1.一種芽孢桿菌KR083(Bacillus sp.KR083)，其含有1號(hào)序列所代表的rDNA序列，其保藏編號(hào)為KCTC 10811BP。
2.一種微生物制劑，該微生物制劑含有如權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌KR083作為有效成分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物制劑，其中，所述制劑是代替化肥的有機(jī)肥料。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物制劑，其中，所述制劑用于促進(jìn)植物生長(zhǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物制劑，其中，所述制劑用于抑制病原體生長(zhǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物制劑，其中，所述制劑還含有芽孢桿菌KR083的次級(jí)代謝物作為有效成分。
7.一種土壤管理或植物培育方法，該方法通過用如權(quán)利要求2-6中任意一項(xiàng)所述的微生物制劑處理土壤或植物來進(jìn)行土壤管理或植物培育。
全文摘要
本發(fā)明涉及1號(hào)序列所代表的芽孢桿菌KR083，該菌株可代替化肥來促進(jìn)植物生長(zhǎng)。更具體地，本發(fā)明涉及芽孢桿菌KR083以及含有該菌株的微生物制劑，該菌株通過定殖于植物根系內(nèi)外來固定大氣中的氮、促進(jìn)植物生長(zhǎng)并抑制植物病原體的生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)C12N15/31GK1876806SQ200510075198
公開日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2005年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月10日
發(fā)明者姜渭金, 樸香美, 林時(shí)圭, 康庚姬, 趙賢濟(jì), V·切博塔里 申請(qǐng)人:韓國(guó)農(nóng)村振興廳