專利名稱：應(yīng)用rna酶保護(hù)法高通量篩選天然存在的正義－反義轉(zhuǎn)錄物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高通量篩選天然存在的正義-反義轉(zhuǎn)錄物(Natural sense-antisensetranscripts，NSATs)的新方法。利用這一方法，可以通過用實(shí)驗(yàn)的手段實(shí)現(xiàn)高通量篩選各種來源和狀態(tài)的組織或細(xì)胞內(nèi)真正的正義RNA-反義RNA復(fù)合物，理論上，通過該方法可以獲得細(xì)胞內(nèi)任何一個(gè)存在的NSATs。在鑒定RNA作用的靶向基因或篩選潛在的RNA藥物時(shí)，本發(fā)明也有重要的應(yīng)用價(jià)值。
背景技術(shù)：
相當(dāng)多的證據(jù)表明在高等生物中RNA介導(dǎo)的調(diào)控普遍存在(Mattick JS，Nature Review inGenetics.5(4)316-23.2004)。事實(shí)上，相對(duì)于蛋白作為調(diào)控因子而言，RNAs和靶RNAs或靶DNAs之間的識(shí)別和作用比蛋白更精確而特異，RNAs能夠更快速的生成和降解，在很多方面尤其在需要非常精細(xì)而快速的調(diào)節(jié)過程中比如細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育，RNA是比蛋白質(zhì)更理想、更簡單的調(diào)控因子(Eddy SR，Nature Review in Genetics.2919-929.2001，Ke XS et al.，Current Opinions in Chemical Biology.7516-523.2003)。RNA介導(dǎo)的調(diào)控涉及很多的機(jī)制，但是依賴雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)的機(jī)制是最常用且最主要的一種。
內(nèi)源性的dsRNA也就是自然發(fā)生的正義-反義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(natural sense-antisensetranscripts，NSATs)，鑒定NSATs是理解RNA介導(dǎo)的基因調(diào)控一個(gè)非常重要的方面?；赗NA介導(dǎo)調(diào)控的生物學(xué)事件的普遍性，以及最近各種生物的大規(guī)模基因組測序和轉(zhuǎn)錄組測序的完成，對(duì)NSATs進(jìn)行高通量的篩選與鑒定顯得尤為重要與迫切。迄今為止，已有多個(gè)研究小組作了相關(guān)的探索(Lehner B et al.Trends in Genetics.18(2)63-5.2002，Shendure J et al.，Genome Biol.3(9)RESEARCH0044.2002，Yelin R et al.Nat Biotechnol.21(4)379-86.2003，Okazaki Y et al.Nature.420(6915)563-73.2002，Kiyosawa H et al Genome Res.15(4)463-74.2005)。這些研究結(jié)果帶來強(qiáng)烈的信息，那就是NASTs比我們以前想象的多得多。
但是，這些研究都是利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行的序列分析或microarry雜交分析，這些策略有其極大的不可避免的局限性，即僅僅揭示了在一種細(xì)胞內(nèi)或整個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組里，存在有很多具有形成雙鏈RNA潛能的RNA分子，而無法知道這些RNA在細(xì)胞內(nèi)是否真正形成了雙鏈RNA，因?yàn)閮蓷l游離的單鏈的RNA可能分別存在于細(xì)胞的不同細(xì)胞器或同一個(gè)組織或細(xì)胞群中的不同細(xì)胞里。
基于RNA分子基因調(diào)控中的重要而廣泛的作用，而目前的研究手段面臨重大局限性的情況下，迫切需要建立一種新的方法，以實(shí)現(xiàn)高通量篩選細(xì)胞內(nèi)真正的NSATs。
為了徹底解決以上工作存在的局限性，實(shí)現(xiàn)用實(shí)驗(yàn)的手段大規(guī)模篩選NSATs，確保所有得到的NSATs在細(xì)胞內(nèi)都是以雙鏈RNA結(jié)構(gòu)的形式真實(shí)存在，本發(fā)明利用雙鏈RNA分子能夠免受單鏈特異的RNase I的酶解作用，從而在RNase I酶解反應(yīng)中保留下來的特性，建立了一種簡便、可靠的全新方法來高通量篩選細(xì)胞內(nèi)真正的NSATs，并建立了一個(gè)系統(tǒng)、全面的生物信息學(xué)分析策略對(duì)NSATs序列的各種特征做而深入的分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用細(xì)胞內(nèi)正義-反義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物復(fù)合物(NSATs)是雙鏈RNA分子的特點(diǎn)，以及雙鏈RNA分子能夠免受單鏈RNA特異的RNase I的酶解作用，從而在RNase I酶解反應(yīng)中保留下來的特性，建立了應(yīng)用RNase I保護(hù)法來高通量篩選細(xì)胞內(nèi)真正的NSATs的方法。
本發(fā)明首先總RNA，用DNase I徹底消化以排除基因組DNA的潛在污染，用單鏈特異的RNase I處理總RNA得到大量的NSATs。
本發(fā)明通過聯(lián)用單鏈RNA特異的RNase I和雙鏈RNA特異的RNase III來證實(shí)NSATs確是雙鏈RNA分子。通過體外模擬實(shí)驗(yàn)證實(shí)雙鏈RNA分子不是在體外形成，而是內(nèi)源性的。
得到NSATs后，用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)從這些dsRNA得到cDNA。為了實(shí)現(xiàn)定向克隆，用末端轉(zhuǎn)移酶在單鏈cDNA的3’端加上多聚A，然后用多聚T引物引導(dǎo)合成cDNA的第二條鏈，這一引物上帶有含多個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的接頭(adaptor)。分別用T4DNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶使雙鏈DNA一端為平端，一端為粘端，然后與帶有同樣末端的克隆載體pBluescriptII SK(pBSK)連接，構(gòu)建總RNA中NSATs的cDNA文庫。對(duì)克隆進(jìn)行測序得到NSATs序列。
本發(fā)明建立了一個(gè)應(yīng)用各種生物信息學(xué)方法對(duì)NSATs序列進(jìn)行全面系統(tǒng)的分析的策略，包括把NSATs序列在基因組精確定位、NSATs序列對(duì)應(yīng)的基因組位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄狀態(tài)分析、NSATs序列相關(guān)基因編碼功能分析、NSATs序列相關(guān)基因功能分析、NSATs序列對(duì)應(yīng)的基因組位點(diǎn)重疊模式分析等。
一般定義本發(fā)明中術(shù)語正義RNA和反義RNA是指在序列能夠完全互補(bǔ)的兩個(gè)單鏈RNA分子。自然發(fā)生的正義-反義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(NSATs)是指在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的一個(gè)正義RNA和一個(gè)反義RNA通過序列互補(bǔ)形成的雙鏈RNA復(fù)合物。互補(bǔ)的DNA(cDNA)是指以RNA為模板生成的單鏈DNA。這里的克隆載體是指能夠攜帶外源DNA片段并且在宿主細(xì)胞中能夠自主復(fù)制的DNA分子，常用的克隆載體包括質(zhì)粒、噬菌體、病毒等。cDNA文庫是指一個(gè)給定的RNA分子混合物對(duì)應(yīng)的所有cDNA的集合，這些cDNA通常是以插入克隆載體然后轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞后，以細(xì)胞克隆的形式存在。


圖1小鼠胚胎總RNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
1總RNA，MDNA marker DL2000，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp and 100bp.
圖2總RNA經(jīng)過RNase I處理后的產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
1總RNA經(jīng)過RNase I處理60分鐘，MDNA marker DL2000，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp and 100bp.
圖3總RNA被RNase I或RNase III處理后的產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
1總RNA用單鏈RNA特異性的酶(RNase I)處理30分鐘2總RNA用單鏈RNA特異性的酶(RNase I)處理16小時(shí)3總RNA用雙鏈RNA特異性的酶(RNase III)處理30分鐘4總RNA同時(shí)用RNase I和RNase III處理30分鐘圖4兩個(gè)完全互補(bǔ)的單鏈RNA形成雙鏈RNA分子實(shí)驗(yàn)。
1正義RNA和反義RNA混合物熱變性及緩慢退火后經(jīng)過RNase I處理結(jié)果2正義RNA和反義RNA混合物直接在室溫溫育后經(jīng)過RNase I處理結(jié)果圖5NSATs的cDNA第一條鏈的合成圖.6cDNA文庫的完整性分析11，21，31，41，51和60分別是克隆的編號(hào)。
圖7應(yīng)用BLAT程序把31號(hào)克隆在小鼠基因組上的多拷貝精確定位結(jié)果。
圖8應(yīng)用GENOME BROWER程序?qū)?號(hào)克隆對(duì)應(yīng)的小鼠基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和轉(zhuǎn)錄方向的分析。
實(shí)施例在本實(shí)施例中，我們以在胚胎發(fā)育過程中的反義RNA調(diào)控作用為研究重點(diǎn)，選擇了小鼠胚胎的總RNA為研究材料，高通量篩選小鼠胚胎中的NSATs，構(gòu)建NSATs的cDNA文庫，并對(duì)NSATs序列進(jìn)行全面系統(tǒng)的分析。這些對(duì)其研究結(jié)果說明了本發(fā)明的有效性和可靠性，但是不限制本發(fā)明的范圍。
一、獲得小鼠胚胎的NSATs用GIBCO公司的Trizol試劑提取13.5dpc的C57BL/6J小鼠胚胎總RNA，按試劑使用說明操作。
用DNase I徹底降解用Trizol試劑提取總RNA，以去除痕量的基因組DNA的污染。瓊脂糖凝膠電泳表明總RNA的質(zhì)量很好(圖1)，有很完整的28SrRNA和18SrRNA條帶，泳道中從0.5-8kb之間有一片彌散的拖影，大部分集中在1.5-2kb，這些拖影是分子量大小不等的mRNA分子，同時(shí)基因組DNA污染基本不可見，表明DNase I處理已經(jīng)完全。
用單RNA鏈特異性的RNase I酶處理總RNA60分鐘后，殘余的RNA分子就是雙鏈RNA(dsRNA)。瓊脂糖凝膠電泳表明28SrRNA和18SrRNA條帶完全消失，表明RNase I的單鏈切割作用已經(jīng)完全，但在500bp處有一條清晰的條帶，從500bp到100bp以下有明顯的彌散RNA分子(圖2)，表明這些RNA分子能夠耐受RNase I的單鏈切割作用，或者說它們不是單鏈RNA分子。
二、dsRNA的可靠性分析為確認(rèn)總RNA用RNase I降解后剩下的RNA是雙鏈RNA(dsRNA)，設(shè)計(jì)四組平行實(shí)驗(yàn)。取等量的總RNA，①用單鏈RNA特異性的酶(RNase I)處理30分鐘，②用單鏈RNA特異性的酶(RNase I)處理16小時(shí)，③用雙鏈RNA特異性的酶(RNase III)處理30分鐘，④同時(shí)用RNase I和RNase III處理30分鐘。所用酶量均參照廠家的說明，選用標(biāo)準(zhǔn)酶量，以此來比較各組的酶解產(chǎn)物。
瓊脂糖凝膠電泳表明(圖3)，總RNA被RNase I長時(shí)間(16小時(shí))作用比標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間作用后的剩下的RNA要少，這可能是RNase I雖然是單鏈特異性的RNA酶，但過量或超長時(shí)間作用也會(huì)一定程度降解雙鏈RNA，從而導(dǎo)致雙鏈RNA被非特異的切割，所以以28SrRNA和18SrRNA的完全降解為RNase I作用完全的標(biāo)志是必要的，否則，雙鏈RNA減少必將降低cDNA文庫的完整性和復(fù)雜性?？俁NA被RNase III短時(shí)間(30分鐘)作用后幾乎完全被降解，第一泳道中對(duì)RNase I耐受的RNA分子完全消失，這充分說明，第一泳道中的RNA分子是雙鏈RNA分子?？俁NA被RNase III完全被降解是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)的RNA分子總是以復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)即各種莖環(huán)(stem-loop)存在，這些莖結(jié)構(gòu)都是一些局部雙鏈結(jié)構(gòu)，都是RNase III作用的靶序列，所以總RNA可以被RNase III幾乎完全被降解。同時(shí)用RNase I和RNase III切割總RNA，比單用RNase III更徹底。
綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說明總RNA用RNase I降解后剩下的RNA是雙鏈RNA。
三、dsRNA的內(nèi)源性分析為確認(rèn)總RNA用RNase I降解后剩下的RNA是內(nèi)源性的dsRNA，即在體內(nèi)就是dsRNA的形式存在，而不是原本是兩條游離的單鏈的RNA在細(xì)胞破裂后，體外的RNA提取過程中形成的dsRNA，我們進(jìn)行了dsRNA的內(nèi)源性分析。首先用RNA體外轉(zhuǎn)錄法獲得兩條完全互補(bǔ)的單鏈RNA分子(Sense RNA和Antisesne RNA)，然后把這兩種RNA混合在一起，把混合物分為兩等份，一種經(jīng)過80℃加熱5分鐘變性、緩慢退火處理，一種在室溫一起溫育1小時(shí)，然后把兩種處理的混合物完全模擬常規(guī)用Trizol試劑提取RNA的步驟，把RNA混合物抽提一遍，再分別用RNase I處理，根據(jù)混合物的RNase I抗性來分析單鏈RNA分子在室溫操作下形成dsRNA的可能性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖4)，Sense RNA和Antisesne RNA經(jīng)過熱變性及緩慢退火后，RNA混合物能夠耐受RNase I切割，說明已經(jīng)形成了雙鏈RNA分子，而Sense RNA和Antisesne RNA直接在室溫溫育的混合物，不能耐受RNase I切割，說明它們不能形成雙鏈RNA分子，而仍然以單鏈RNA的形式存在，所以被RNase I酶解。
四、NSATs的cDNA文庫的構(gòu)建dsRNA經(jīng)過變性，用隨機(jī)引物和RNase H缺陷型莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MuLV)合成了cDNA的第一條鏈，用RNase H除出DNA-RNA雜合鏈上的RNA，1.5％的瓊脂糖凝膠電泳顯示，cDNA主要在300bp-500bp之間，在300bp以下有一片彌散的拖影(圖.5)。
用末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)在單鏈cDNA的3’末端連續(xù)加上多聚A，多聚A可以給cDNA介定方向提供標(biāo)記。含有多聚A尾巴的單鏈由帶有多聚T的adapter做引物，引物的序列為5’-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)，這個(gè)引物包括限制性內(nèi)切酶XhoI，Sal I，Acc I，Hinc II和Cla I的識(shí)別位點(diǎn)。利用大腸桿菌DNA聚合酶大片段可以DNA為模板的聚合酶的活性介導(dǎo)cDNA第二條鏈的生成。合成的dsDNA利用T4DNA聚合酶具DNA聚合酶和單鏈特異性的3’→5’外切核酸酶活性，使雙鏈DNA的末端平滑化，然后用限制性內(nèi)切酶Sal I酶切，使雙鏈DNA的另一個(gè)末端粘端化。
選擇pBSK為克隆載體。pBSK載體的克隆位點(diǎn)含有豐富的常用限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(Kpn I，Xho I，Hinc II，Apa I，Sal I，Spe I，Sma I，Xba I，Pst I，HindIII，Cla I，EcoR I，EcoR V，Not I，Eag I，Sac I和Sac II)，便于定向克隆，并且這些多克隆位點(diǎn)處于帶有編碼β-半乳糖甘酶α互補(bǔ)片段的LacZ基因區(qū)域，可以用藍(lán)白斑篩選，常常作為cDNA克隆的載體。
用限制性內(nèi)切酶EcoR V酶切pBSK載體制備一個(gè)平端，用限制性內(nèi)切酶Sal I酶切平端化的pBSK載體，再制備一個(gè)粘端，把具有一個(gè)平端和一個(gè)粘端的dsDNA與同樣具有一個(gè)平端和一個(gè)粘端的pBSK載體用T4DNA連接酶連接，實(shí)現(xiàn)定向克隆。把連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到新鮮制備的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建了13.5dpc小鼠胚胎NSATs的cDNA文庫。
隨機(jī)挑取6個(gè)5.10轉(zhuǎn)化的平板中細(xì)菌克隆，小規(guī)模培養(yǎng)，小量制備質(zhì)粒，用Xho I和EcoRI雙酶切質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳顯示，白色克隆的陽性率為100％，插入片段的大小從250bp-1000bp之間散在分布，大部分在500bp附近(圖6)，插入片段大小分布的散在性表明dsRNA的cDNA文庫具有較好的完整性。
五、NSATs的生物信息學(xué)分析挑取60個(gè)細(xì)菌單克隆進(jìn)行序列測定，克隆的編號(hào)依次為1-60。測序結(jié)果表明，clone 6測序失敗，克隆14、15、18、45、51與克隆8為同一個(gè)序列，克隆21、22與克隆2為同一序列，克隆46與克隆48為同一序列，克隆4與克隆24為同一序列，最后用于分析的克隆數(shù)為60-1-5-2-1-1＝50個(gè)。序列靠近M13引物一端為adapter(dT)17，說明達(dá)到了定向克隆。
1.基因組定位把克隆序列在基因組定位通過在UCSC Genome Bioinformatics Site用BLAST-LikeAlignment Tool(BLAT)程序與小鼠基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat)。50個(gè)克隆中，19個(gè)克隆在小鼠基因組上精確定位，它們的編號(hào)分別是2、8、10、11、19、23、25、27、31、34、35、36、37、38、40、44、47、57和58。其余31個(gè)無法在小鼠基因組上精確定位的克隆與人基因組序列比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)27個(gè)克隆能夠精確匹配，他們的編號(hào)分別是1、3、4、7、9、12、13、16、20、26、28、29、30、32、33、39、41、42、46、50、52、53、54、55、56、59和60。
在基因組定位是進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)部分克隆序列在基因組中有多拷貝定位。在19個(gè)能小鼠基因組上精確定位克隆，有9個(gè)克隆有兩個(gè)或以上個(gè)拷貝，它們的編號(hào)分別是2、8、11、23、31、36、38、57和58。在27個(gè)能在人基因組精確定位的克隆，有4個(gè)克隆有兩個(gè)或以上拷貝，他們的編號(hào)分別是3、29、54和55。
綜合以上數(shù)據(jù)，克隆能在基因組中精確定位的百分比是46/50＝92％。在基因組中有多拷貝精確定位的克隆數(shù)在所有能精確定位的克隆的百分比是13/46＝28.2％。克隆在基因組中有多拷貝精確定位以31號(hào)克隆在小鼠基因組上的定位為例(圖7)。
2.基因組位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄方向分析對(duì)克隆序列對(duì)應(yīng)的基因組位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄方向通過基因組瀏覽器(GenomeBrowser)(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)。與小鼠基因組有精確匹配的19個(gè)克隆中，所有克隆匹配的基因組位點(diǎn)可以轉(zhuǎn)錄。在與人基因組有精確匹配的27個(gè)克隆中，有18個(gè)克隆匹配的基因組位點(diǎn)可以轉(zhuǎn)錄，它們的編號(hào)是1、3、4、9、16、20、26、28、29、30、32、33、42、50、52、54、56和60。
在與小鼠基因組有精確匹配且有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的19個(gè)克隆中，除了57號(hào)和58號(hào)克隆外，其余17個(gè)克隆匹配的基因組位點(diǎn)的兩條鏈上都有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在與人基因組有精確匹配且有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的18個(gè)克隆中，有6個(gè)克隆匹配的基因組位點(diǎn)的兩條鏈上都有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，它們的編號(hào)是4、20、26、42、56、60。
綜合以上數(shù)據(jù)，在基因組中匹配序列中有轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)的克隆數(shù)在能精確定位的克隆數(shù)百分比是37/46＝80.4％。在基因組中匹配序列的中兩條鏈上都有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即同時(shí)有sense RNA和antisense RNA產(chǎn)生的克隆數(shù)在有轉(zhuǎn)錄的克隆數(shù)百分比是23/37＝62.1％。
克隆序列對(duì)應(yīng)的基因組位點(diǎn)有雙向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以8號(hào)克隆在小鼠基因組和42號(hào)克隆在人基因組GENOME BROWER分析結(jié)果為例(圖8)。
3.基因組位點(diǎn)相關(guān)基因功能分析對(duì)NSATs匹配的基因組位點(diǎn)相關(guān)基因功能分析在美國國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)的Entrez Genehttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝gene中查找基因的已知功能。在與小鼠基因組有精確匹配且有基因產(chǎn)生的18個(gè)克隆中，有12個(gè)在Genbank里有基因命名，2、8、10、11、25、31、34、35、36、40、44、47和58。在與人基因組有精確匹配且有基因產(chǎn)生的15個(gè)克隆中，有9個(gè)在Genbank里有基因命名，它們的編號(hào)是3、16、26、29、30、32、42、50和52。在這些功能已知的NSAT相關(guān)基因里，與細(xì)胞分化或胚胎發(fā)育有關(guān)的基因14個(gè)見下表。


綜合以上數(shù)據(jù)，在基因組的匹配序列中有已知基因產(chǎn)生的克隆數(shù)在有基因產(chǎn)生的克隆數(shù)百分比是21/33＝63.6％。在所有的功能已知基因中與細(xì)胞分化或胚胎發(fā)育有關(guān)的基因的百分比是14/21＝66.7％。
綜合生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，這些克隆序列對(duì)應(yīng)的基因組位點(diǎn)的DNA兩條鏈大部分都有基因轉(zhuǎn)錄，即同時(shí)有正義RNA和反義RNA產(chǎn)生，具備產(chǎn)生順式NSATs的特點(diǎn)，另外，一部分克隆序列在基因組里有多拷貝的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)，具備產(chǎn)生反式NSATs的特點(diǎn)，這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了本策略的可靠性和有效性。對(duì)克隆序列相關(guān)基因的功能分析結(jié)果表明，這些基因中大部分是細(xì)胞分化或胚胎發(fā)育相關(guān)基因，提示了反義RNA在胚胎發(fā)育過程有著重要而普遍的調(diào)控作用，為闡明胚胎發(fā)育的機(jī)制提供了重要線索。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一種高通量篩選細(xì)胞內(nèi)真正的正義-反義轉(zhuǎn)錄物的新方法，實(shí)施步驟為i.提取組織總RNA。ii. 用RNaseI處理總RNA。iii. 證實(shí)殘余的RNA是雙鏈RNA(Double-stranded RNA，dsRNA)。iv. 證實(shí)殘余的RNA是細(xì)胞內(nèi)源的RNA。v.把雙鏈RNA變性為單鏈RNA。vi. 把單鏈RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)的DNA(Complement DNA，cDNA)。vii. 在cDNA的3’端加上多聚A。viii. 合成cDNA的第二條鏈。ix. 制備雙鏈DNA(Double-stranded DNA，dsDNA)的一個(gè)平端和一個(gè)粘端。x.把雙鏈DNA克隆入克隆載體。xi. 把重組載體轉(zhuǎn)化如宿主細(xì)胞，構(gòu)建總RNA中NSATs的cDNA文庫。xii. 對(duì)克隆進(jìn)行序列測定。xiii. 把克隆序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，所用的RNA酶是單鏈RNA特異性的酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1，證實(shí)雙鏈RNA所用的方法是聯(lián)用單鏈RNA特異性的酶和雙鏈RNA特異性的酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1，證實(shí)內(nèi)源性雙鏈RNA所用的方法是在體外檢測兩個(gè)完全互補(bǔ)的單鏈RNA分子能否在室溫操作過程中形成雙鏈RNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求4，兩個(gè)完全互補(bǔ)的單鏈RNA分子是通過RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄得到的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1，合成cDNA的第二條鏈?zhǔn)且詭в薪宇^的多聚T為引物，序列為5’-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求1，對(duì)克隆序列的生物信息學(xué)分析所用的策略是先把克隆序列在基因組進(jìn)行定位，分析基因組位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，轉(zhuǎn)錄方向，再對(duì)基因組位點(diǎn)相關(guān)基因的功能進(jìn)行分類。
8.根據(jù)權(quán)利要求7，基因組定位是用BLAST-Like Alignment Tool(BLAT)程序與基因組序列里進(jìn)行比對(duì)分析(http//genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat)，序列的定位標(biāo)準(zhǔn)為至少有90％以上長度的序列有超過94％的同源性，(Identity≥94％，Coverage≥90％)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7，分析基因組位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄方向是用基因組瀏覽器(GenomeBrowser)(http//genome.uesc.edu/cgi-bin/hgGateway)。
10.根據(jù)權(quán)利要求7，對(duì)基因組位點(diǎn)相關(guān)基因的功能進(jìn)行分類是在美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的Entrez Genehttp//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝gene查找基因的已知功能。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高通量篩選天然存在的正義－反義轉(zhuǎn)錄物(Naturalsense－antisense transcripts，NSATs)的新方法。本發(fā)明利用細(xì)胞內(nèi)NSATs是雙鏈RNA分子的特點(diǎn)，以及雙鏈RNA分子能夠免受單鏈RNA特異的RNase I的酶解作用，從而在RNase I酶解反應(yīng)中保留下來的特性，建立了通過實(shí)驗(yàn)的手段來實(shí)現(xiàn)高通量篩選細(xì)胞內(nèi)真正的NSATs的方法。利用這一方法，可以通過高通量篩選各種來源和狀態(tài)的組織或細(xì)胞內(nèi)真正的正義RNA－反義RNA復(fù)合物，理論上，通過該方法可以獲得細(xì)胞內(nèi)任何一個(gè)存在的NSATs。在鑒定RNA作用的靶向基因或篩選潛在的RNA藥物時(shí)，本發(fā)明也有重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1876812SQ20051007506
公開日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2005年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月9日
發(fā)明者劉德培, 柯細(xì)松, 宮環(huán), 陸璐, 屈祎 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所