專利名稱：產(chǎn)伊維菌素的工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵及基因工程領(lǐng)域的一種產(chǎn)伊維菌素的工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，特別是涉及一種產(chǎn)伊維菌素的工程菌及其構(gòu)建方法與其在生產(chǎn)伊維菌素中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
伊維菌素(ivermectins)，又稱C-22，23雙氫阿維菌素B1，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最有效、應(yīng)用最廣泛的殺蟲(chóng)抗生素。它是阿維菌素(avermectins)B1在C-22，23位上用化學(xué)方法加氫還原的產(chǎn)物(其中C-22，23雙氫阿維菌素B1a的含量大于80％，而C-22，23雙氫阿維菌素B1b的含量小于20％)。與傳統(tǒng)的化學(xué)殺蟲(chóng)劑相比，阿維菌素和伊維菌素具有廣譜、高效、安全、無(wú)殘留、無(wú)副作用的特點(diǎn)，且不易產(chǎn)生耐藥性，與其它殺蟲(chóng)劑無(wú)交叉抗性，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)上均具有良好的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。
阿維菌素是由阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)。它們屬于十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，并表現(xiàn)出高效、低毒、廣譜的殺線蟲(chóng)和節(jié)肢動(dòng)物類寄生蟲(chóng)的活性。這類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)通式如下(式1) 在位置C-22和C-23之間的鍵表示單鍵或雙鍵。當(dāng)表示單鍵時(shí)，Y可以是氫或羥基，當(dāng)為雙鍵時(shí)Y僅表示氫。R1可以是甲氧基或羥基，R2是異丙基或仲丁基。為表示上述結(jié)構(gòu)變化的特性，已分離出來(lái)的天然物質(zhì)的名稱如表1所示
表1從阿維鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)物中分離的具有式1結(jié)構(gòu)通式的天然物質(zhì)

與阿維菌素相比，伊維菌素具有相同的殺蟲(chóng)活性，但毒性低2-3倍，更安全，主要制備成針劑用于防治家畜的各種體內(nèi)、外寄生蟲(chóng)病(吸蟲(chóng)和絳蟲(chóng)除外)和治療人體盤(pán)尾絲蟲(chóng)病。阿維鏈霉菌只合成阿維菌素，不能合成伊維菌素。迄今為止，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的伊維菌素生產(chǎn)均是用化學(xué)法對(duì)阿維菌素B1進(jìn)行加氫選擇性還原得到的?；瘜W(xué)法半合成伊維菌素需要從阿維鏈霉菌的發(fā)酵液中分離、提純阿維菌素B1和將阿維菌素B1還原成伊維菌素的工藝，由于阿維菌素B1在C-22，23位雙鍵的選擇性還原需要昂貴的氯化銠做催化劑，因此生產(chǎn)成本很高，僅還原一項(xiàng)，生產(chǎn)每公斤伊維菌素的成本就高達(dá)1000元左右。此外，阿維鏈霉菌除了產(chǎn)生阿維菌素外，還產(chǎn)生寡霉素(oligomycin)。而寡霉素是哺乳動(dòng)物細(xì)胞氧化磷酸化的抑制劑，毒性很高，因此必須再通過(guò)分離提純把它從發(fā)酵液中除去。
Ikeda等利用同位素標(biāo)記前體結(jié)合分析突變株積累中間產(chǎn)物的策略，已基本闡明阿維菌素生物合成的全過(guò)程，并于1999年完成了阿維菌素生物合成基因簇的序列和功能分析(Ikeda H，Nonomiya T，Usami M，et al.Organization of the biosyntheticgene cluster for the polyketide anthelmintic macrolide avermectin inStreptomyces avermitilis.Proc Natl Acad Sci USA.1999，96(17)9509-9514.)。阿維菌素的生物合成可分為3個(gè)階段(1)首先在阿維菌素聚酮合酶(AVES)的作用下形成起始糖苷配基6，8a-閉聯(lián)-6，8a-脫氧-5-氧阿維菌素糖苷配基(6，8a-seco-6，8a-deoxy-5-oxoavermectin aglycons)；(2)起始糖苷配基經(jīng)過(guò)一系列的修飾產(chǎn)生阿維菌素糖苷配基；(3)阿維菌素糖苷配基由脫氧胸苷二磷酸(dTDP)-齊墩果糖在C13和C4′位進(jìn)行O-糖基化形成阿維菌素。阿維菌素的起始糖苷配基是通過(guò)在起始單位(2-甲基丁酸或異丁酸)上按P-A-A-A-A-P-P-A-P-A-P-A(P代表丙酸鹽，A代表乙酸鹽)的順序添加12個(gè)延伸單位縮合而成，整個(gè)過(guò)程由阿維菌素聚酮合酶催化完成。
阿維菌素的生物合成基因簇結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示，該基因簇全長(zhǎng)82kb，共有18個(gè)開(kāi)放閱讀框架?；虼貎?nèi)部的60kb片段含有4個(gè)大的開(kāi)放閱讀框架，因轉(zhuǎn)錄方向相反被分成兩組aveA1-aveA2和aveA3-aveA4，它們分別編碼4個(gè)多功能蛋白AVES1，AVES2，AVES3和AVES4，共同組成阿維菌素聚酮合酶。該聚酮合酶由12個(gè)模塊組成，含有55個(gè)活性位點(diǎn)。模塊1、4、5和10中的酶域相同，都由酮酯?；厦?ketosynthase，KS)、酰基轉(zhuǎn)移酶(acyl transferase，AT)、?；d體蛋白(acyl carrier protein，ACP)和酮基還原酶(ketoreductase，KR)組成；模塊3和11中只有KS、AT、ACP；模塊2、6、7、8、9和12中除KS、AT、KR、ACP外，還有脫水酶(dehydratase，DH)結(jié)構(gòu)域，但模塊7中的DH和模塊10中的KR是沒(méi)有活性的。模塊2中的DH在脫水酶共有的活性位點(diǎn)HxxxGxxxxP有一個(gè)錯(cuò)配的氨基酸(P突變?yōu)镾)，似乎只有部分活性。在所有的模塊中都沒(méi)有烯基還原酶(enoyl reductase，ER)結(jié)構(gòu)域，這與阿維菌素糖苷配基中沒(méi)有完全飽和的β-碳鏈?zhǔn)菍?duì)應(yīng)的。與紅霉素聚酮合酶相同，在AVES1的N端也有一個(gè)負(fù)載域，包括兩個(gè)活性位點(diǎn)AT和ACP，在AVES4的C端有一個(gè)硫酯酶(thioesterase，TE)域。每個(gè)模塊負(fù)責(zé)一步摻入前體如乙酸或丙酸的聚合反應(yīng)及β-酮基的還原，最后所形成的聚酮在TE的作用下從聚酮合酶(PKS)上釋放出來(lái)成環(huán)內(nèi)酯化。阿維菌素PKS的基因結(jié)構(gòu)及其產(chǎn)物預(yù)測(cè)示意圖如圖2所示。
起始糖苷配基合成后要經(jīng)過(guò)一系列的修飾才能形成阿維菌素糖苷配基，包括呋喃環(huán)的閉合，C-5位酮基的還原和甲基化。C-6和C-8a間呋喃環(huán)的閉合是由aveE編碼的細(xì)胞色素P450羥化酶催化完成。aveC基因編碼的AveC的功能目前仍不清楚，aveC基因突變株僅產(chǎn)阿維菌素“2”組分(C-22，23位為CH2-CHOH)，但AveC的氨基酸序列與PKS或脂肪酸合酶(FAS)中的脫水酶的氨基酸序列之間沒(méi)有同源性。C-5位的酮基還原是由aveF編碼的C5-酮基還原酶催化的。aveD編碼C5-O-甲基轉(zhuǎn)移酶，該基因負(fù)責(zé)將S-腺苷甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移到阿維菌素“B”組分的C-5位羥基上而形成阿維菌素“A”組分。aveB(aveBI-aveBVIII)是一套涉及合成和轉(zhuǎn)移齊墩果二糖的基因，aveR是阿維菌素生物合成全基因簇的正調(diào)控基因。
在伊維菌素的生產(chǎn)過(guò)程中，一個(gè)重要的瓶頸就是阿維菌素B1的C-22，23位雙鍵的選擇性還原。阿維菌素的大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)屬于聚酮體，聚酮體中β-酮基的還原程度通常取決于相應(yīng)模塊中酶域的組成，要使β-酮基還原成亞甲基需要所有的還原酶域首先由KR催化β-酮基還原成羥基；接著由DH催化羥基形成甲烯基；最后在ER的作用下將雙鍵還原成飽和烴鍵。根據(jù)聚酮體合成反應(yīng)步驟與其PKS基因結(jié)構(gòu)之間的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，阿維菌素C-22，23位的還原程度由AVES1模塊2上的還原酶域DH和KR(DH2-KR2)決定，KR2將C-23位的β-酮基還原成羥基后，在DH2的作用下脫水形成雙鍵，最后的產(chǎn)物即為B1組分；如果DH不起作用，則最終形成的產(chǎn)物C-23位保持羥基即為B2組分，因此推測(cè)阿維菌素B1組分和B2組分的共存可能是由于DH2的不完全活性造成。對(duì)阿維菌素PKS的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行氨基酸序列分析，分析結(jié)果表明模塊2含有一個(gè)完全活性的KR和一個(gè)不完全活性的DH，DH2在脫水酶共有的活性位點(diǎn)HxxxGxxxxP中有一個(gè)氨基酸發(fā)生改變(P變?yōu)镾)，這可能導(dǎo)致了DH2只有部分活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)伊維菌素的工程菌及其構(gòu)建方法。
本發(fā)明所提供的產(chǎn)伊維菌素的工程菌，是將阿維鏈霉菌的阿維菌素聚酮合酶DH2-KR2結(jié)構(gòu)域的編碼基因替換為聚酮合酶DH-ER-KR結(jié)構(gòu)域編碼基因得到的重組菌。
所述聚酮合酶DH-ER-KR結(jié)構(gòu)域編碼基因來(lái)自于能合成I型聚酮合酶的鏈霉菌，且該聚酮合酶含有完整的β-酮基還原酶域(包含DH、ER和KR結(jié)構(gòu)域)，如委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomyces venezuelae)的苦霉素(pikromycin)PKS、紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的紅霉素(erythromycin)PKS、阿維鏈霉菌的寡霉素PKS、吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的雷帕霉素(rapamycin)PKS、弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)的泰勒菌素(tylosin)PKS、Streptomycescaelestis的niddamycin PKS、抗生鏈霉菌(Streptomyces antibioticus)的竹桃霉素(oleandomycin)PKS，優(yōu)選為委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(ATCC 15493)的苦霉素PKS。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種上述產(chǎn)伊維菌素的工程菌的構(gòu)建方法。
本發(fā)明所提供的產(chǎn)伊維菌素的工程菌的構(gòu)建方法，是構(gòu)建含有阿維鏈霉菌的阿維菌素聚酮合酶DH2-KR2結(jié)構(gòu)域編碼基因的5’端和3’端旁側(cè)序列和聚酮合酶DH-ER-KR結(jié)構(gòu)域編碼基因的基因取代載體，將基因取代載體轉(zhuǎn)化阿維鏈霉菌，得到含有基因取代載體的阿維鏈霉菌的轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子經(jīng)高溫誘導(dǎo)得到單交換突變株，再將單交換突變株經(jīng)傳代后獲得發(fā)生了同源雙交換的重組阿維鏈霉菌；所述基因取代載體中阿維菌素聚酮合酶DH2-KR2結(jié)構(gòu)域編碼基因的5’端旁側(cè)序列、聚酮合酶DH-ER-KR結(jié)構(gòu)域編碼基因和阿維菌素聚酮合酶DH2-KR2結(jié)構(gòu)域編碼基因的3’端旁側(cè)序列按上述順序且以相同方向順次連接。
用于構(gòu)建基因取代載體的出發(fā)載體可為任意一種大腸桿菌-鏈霉素穿梭載體，如pKC1139、pKC505、pIJ653、pIJ8154，優(yōu)選為pKC1139。
以pKC1139為出發(fā)載體構(gòu)建的基因取代載體為pXL211。
將基因取代載體轉(zhuǎn)化阿維鏈霉菌的方法優(yōu)選為PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，為提高轉(zhuǎn)化效率，可先用提自大腸桿菌的取代載體轉(zhuǎn)化弱限制修飾作用的變鉛青鏈霉菌TK54的原生質(zhì)體，然后從中提取質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化阿維鏈霉菌的原生質(zhì)體；但也可以采用其它生物工程領(lǐng)域中常用的方法，例如熱激法、電轉(zhuǎn)化法、接合轉(zhuǎn)化法等。
對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行高溫誘導(dǎo)的條件為將轉(zhuǎn)化子涂布于含8-12μg/mL安普霉素的YMS平板上，在34-39℃下培養(yǎng)7-10天。
將單交換突變株進(jìn)行傳代的培養(yǎng)基為無(wú)抗生素的YMS培養(yǎng)基。
一種伊維菌素的生產(chǎn)方法，是發(fā)酵上述重組阿維鏈霉菌得到伊維菌素。
本發(fā)明將不產(chǎn)寡霉素只產(chǎn)阿維菌素B的阿維鏈霉菌的阿維菌素聚酮合酶(PKS)中不完全活性的DH2結(jié)構(gòu)域用來(lái)自于其它I型PKS中完全活性的DH和ER取代，在阿維菌素聚酮體合成過(guò)程中，C-22，23位的CH2-CHOH在完全活性的DH和ER作用下還原成飽和烴鍵，則最終產(chǎn)物將是C-22，23雙氫阿維菌素B1(即伊維菌素)。本發(fā)明構(gòu)建的重組阿維鏈霉菌基因工程菌可直接用于伊維菌素的發(fā)酵生產(chǎn)，且不再產(chǎn)生有毒的寡霉素，從而免去復(fù)雜的分離提純阿維菌素B1和將阿維菌素B1化學(xué)還原成伊維菌素的工藝，在保證產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性的前提下，使生產(chǎn)成本大幅降低。


圖1為阿維菌素生物合成基因簇結(jié)構(gòu)示意2為阿維菌素PKS的基因結(jié)構(gòu)及其產(chǎn)物預(yù)測(cè)示意3為基因取代載體pXL211的構(gòu)建流程4為取代載體pXL211與阿維鏈霉菌Olm73-12染色體的同源雙交換示意5A為阿維鏈霉菌Olm73-12發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析圖譜圖5B為取代突變株Ive12-4發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析圖譜圖6A為取代突變株Ive14-5發(fā)酵產(chǎn)物的LC/MS分析色譜圖(正離子流圖)圖6B為取代突變株Ive14-5發(fā)酵產(chǎn)物的LC/MS分析質(zhì)譜圖(ES+)具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、產(chǎn)伊維菌素菌株的獲得一、PCR擴(kuò)增aveDH2-KR2兩側(cè)的5’-flanking和3’-flanking DNA片段以及pikDH4-ER4-KR4片段1、引物設(shè)計(jì)根據(jù)阿維鏈霉菌的阿維菌素PKS中DH2-KR2結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)的DNA序列，設(shè)計(jì)二對(duì)引物分別用于合成AVES1(GenBank號(hào)AB032367)中DH2-KR2結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)域(用“aveDH2-KR2”表示)兩側(cè)的DNA片段，分別命名為5’-flanking DNA片段和3’-flanking DNA片段，引物序列如下用于擴(kuò)增長(zhǎng)度為1.22kb的aveDH2-KR2的5’-flanking DNA片段的引物序列Primer 1(正向引物)5′-ATAAGATCTGACCTCGCGGATGTCGGATAC-3′(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Bgl II識(shí)別位點(diǎn))Primer 2(反向引物)5′-ATAACGCGTAGGTGGGGAGGTCGAGGTG-3′(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Mlu I識(shí)別位點(diǎn))用于擴(kuò)增長(zhǎng)度為1.36kb的aveDH2-KR2的3’-flanking DNA片段的引物序列Primer 3(正向引物)5′-ATAATGCATTGGCCCTCTTCGATGCGG-3′(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Nsi I識(shí)別位點(diǎn))Primer 4(反向引物)5′-TATAAGCTTGATAGTGATCGCAGGGCCTTCG-3′(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Hind III識(shí)別位點(diǎn))根據(jù)委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomyces venezuelae，保藏號(hào)ATCC 15439)的苦霉素(pikromycin)PKS中DH4-ER4-KR4結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)的DNA序列(GeneBank號(hào)AF079138，以下用“pikDH4-ER4-KR4”表示)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引物序列如下用于擴(kuò)增長(zhǎng)度為3.27kb的pikDH4-ER4-KR4片段的引物序列Primer 5(正向引物)5’-ATAACGCGTTCCAGACCGAGCGCTACTGG-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Mlu I識(shí)別位點(diǎn))Primer 6(反向引物)5’-ATAATGCATCCTCGCTGTCCATGGGCGTC-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Nsi I識(shí)別位點(diǎn))2、PCR擴(kuò)增aveDH2-KR2兩側(cè)的5’-flanking和3’-flanking DNA片段以及pikDH4-ER4-KR4片段以不產(chǎn)寡霉素而僅產(chǎn)阿維菌素B的阿維鏈霉菌Olm73-12(構(gòu)建方法參考文獻(xiàn)“Zhang XiaoLin，Chen Zhi，Zhao JinLei，et al.Deletion analysis of oligomycinPKS genes(olmA)in Streptomyces avermitilis.Chinese Science Bulletin.2004，49(4)350-354.”)的基因組DNA為模板，分別在引物對(duì)1(Primer 1和Primer 2)和引物對(duì)2(Primer 3和Primer 4)的引導(dǎo)下，用Stratagene公司的pfuUltra DNA聚合酶PCR擴(kuò)增aveDH2-KR2兩側(cè)的5’-flanking和3’-flanking DNA片段。PCR擴(kuò)增條件為先95℃ 5分鐘；再96℃ 1分鐘，65℃ 30秒，72℃ 1分鐘，共25個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分別在1.22kb和1.36kb處出現(xiàn)一條預(yù)期的特異性條帶，將1.22kb和1.36kb的目的條帶回收后，分別與載體pMD18-T(TaKaRa公司)進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有40μL(20mg/mL)X-Gal、4μL(200mg/mL)IPTG和100μg/mL安普霉素的LB平板(胰蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，瓊脂20g，加蒸餾水至1L，調(diào)pH至7.2)上37℃培養(yǎng)12-20小時(shí)，挑取白色單菌落，提取質(zhì)粒后用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III進(jìn)行酶切驗(yàn)證，選取外源片段插入方向與lacZα方向相同的重組質(zhì)粒，將含有長(zhǎng)度為1.22kb外源片段的重組質(zhì)粒命名為pXL5’flank，將含有長(zhǎng)度為1.36kb外源片段的重組質(zhì)粒命名為pXL3’flank。
以委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(ATCC 15439)的基因組DNA為模板，用Stratagene公司產(chǎn)的pfuUltra DNA聚合酶，在引物對(duì)3(Primer5和Primer 6)的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為先95℃ 5分鐘；再96℃ 1分鐘，67℃ 30秒，72℃ 3分鐘，共25個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在3.27kb處出現(xiàn)一條預(yù)期的特異性條帶，將該目的條帶回收后，與載體pMD18-T(TaKaRa公司)進(jìn)行連接，用上述同樣方法進(jìn)行篩選和酶切驗(yàn)證后得到外源片段插入方向與lacZα方向相同的正確的重組質(zhì)粒，命名為pXLpikAII。
分別對(duì)上述pXL5’flank，pXL3’flank和pXLpikAII三個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明所擴(kuò)增的5’-flanking和3’-flanking DNA片段以及pikDH4-ER4-KR4片段與報(bào)道的序列完全相同，可進(jìn)行下述基因取代載體的構(gòu)建。
二、基因取代載體pXL211的構(gòu)建基因取代載體pXL211的構(gòu)建流程如圖3所示，具體方法為用限制性內(nèi)切酶HindIII和Nsi I雙酶切步驟1獲得的質(zhì)粒pXL3’flank，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收1.36kb的3’-flanking DNA片段，并將其克隆到經(jīng)同樣酶雙酶切的質(zhì)粒pXLpikAII中，得到一新的重組質(zhì)粒載體，命名為pXLpikAII/3’flank。對(duì)質(zhì)粒pXL5’flank用限制性內(nèi)切酶Mlu I和BglII進(jìn)行雙酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收1.22kb的5’-flanking DNA片段，并將其與經(jīng)限制性內(nèi)切酶Mlu I和BamH I雙酶切的質(zhì)粒載體pXLpikAII/3’flank連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII進(jìn)行酶切驗(yàn)證，可得到2.69kp和5.85kp的酶切片段的為構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒，命名為pXL5’flank/pikAII/3’flank。在pXL5’flank/pikAII/3’flank中5’-flankDNA、pikDH4-ER4-KR4和3’-flank DNA片段被以相同的方向順次連接起來(lái)。然后用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III雙酶切質(zhì)粒pXL5’flank/pikAII/3’flank，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收5.85kb的目的片段，將其與經(jīng)同樣酶雙酶切的大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體pKC1139(Bierman M，Logan R，O’Brien K，et al.Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Esherichia colito Streptomyces spp.Gene，1992，11643-49.)連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，挑取白色單菌落提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III進(jìn)行酶切驗(yàn)證，可得到6.5kp和5.85kp酶切片段的為可用于雙交換的基因取代載體，命名為pXL211(pKC1139::5’flank+pikDH4-ER4-KR4+3’flank)。
三、阿維鏈霉菌基因取代突變株的獲得1、將基因取代載體pXL211轉(zhuǎn)化阿維鏈霉菌原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基R2YE的配制蔗糖103g，K2SO40.25g，MgCl2·6H2O 10.12g，葡萄糖10g，酪蛋白氨基酸0.1g，酵母膏5g，加蒸餾水至800mL，稱2g瓊脂粉放入250mL三角瓶中，加入80mL上述溶液，115℃滅菌20分鐘；使用前將培養(yǎng)基融化后，在每瓶中加入已滅菌的下述溶液KH2PO4(0.5％)1mL，CaCl2·2H2O(3.68％)8mL，L-proline(20％)1.5mL，TES緩沖液(5.73％，pH7.2)10mL，微量元素溶液*0.2mL，NaOH(1N)(無(wú)需滅菌)0.5mL；*微量元素溶液(1L)ZnCl240mg，F(xiàn)eCl3·6H2O 200mg，CuCl2·2H2O 10mg，MnCl2·4H2O 10mg，Na2B4O7·10H2O 10mg，(NH4)6Mo7O24·4H2O 10mg)。
為提高轉(zhuǎn)化效率，可先用提自大腸桿菌的穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化弱限制修飾作用的變鉛青鏈霉菌TK54(Kieser T，Bibb MJ，Butter MJ，Chater KF，Hopwood DA.2000.PracticalStreptomyces Genetics.Norwich UKThe John Innes Foundation)的原生質(zhì)體，然后從中提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化阿維鏈霉菌，則轉(zhuǎn)化效率至少可提高10倍。具體方法為先用上述獲得的質(zhì)粒pXL211轉(zhuǎn)化變鉛青鏈霉菌TK54的原生質(zhì)體，在原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基R2YE平板上30℃培養(yǎng)14小時(shí)后，將1mL含3000μg安普霉素的水溶液涂布于平板上，繼續(xù)培養(yǎng)7天后，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III進(jìn)行酶切驗(yàn)證，可得到6.5kp和5.85kp酶切片段的證明為陽(yáng)性克隆。
再用提自變鉛青鏈霉菌的質(zhì)粒pXL211轉(zhuǎn)化阿維鏈霉菌Olm73-12的原生質(zhì)體，涂于已吹干的原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基RM14(用0.1M的MES緩沖液(pH6.5)代替5.73％的TES緩沖液，蔗糖濃度為20％，其它成分同R2YE培養(yǎng)基)平板上，于28℃培養(yǎng)16-18小時(shí)后，將1mL含1500μg安普霉素的水溶液涂布于平板上，繼續(xù)培養(yǎng)10天，長(zhǎng)出的菌落即為含有質(zhì)粒pXL211的轉(zhuǎn)化子。
阿維鏈霉菌Olm73-12在RM14再生培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢，需挑取轉(zhuǎn)化子在阿維鏈霉菌固體產(chǎn)孢培養(yǎng)基YMS(酵母膏4g，可溶性淀粉4g，麥芽膏10g，CoCl2·6H2O 5mg，瓊脂20g，加蒸餾水至1L，調(diào)pH至7.2)平板上培養(yǎng)以恢復(fù)產(chǎn)孢。隨機(jī)挑取8個(gè)轉(zhuǎn)化子接種于含10μg/mL安普霉素的YMS培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7天后，均長(zhǎng)出成熟的灰色孢子。將長(zhǎng)好的孢子接于含5μg/mL安普霉素的改良YEME培養(yǎng)基(蔗糖200g或250g，葡萄糖10g，酵母膏3g，細(xì)菌蛋白胨5g，麥芽膏3g，加蒸餾水至1L，115℃滅菌20min；滅菌后每L培養(yǎng)基中加入2mL 2.5M的MgCl2；制備原生質(zhì)體時(shí)，還需加甘氨酸至終濃度為0.5％)中，28℃振蕩培養(yǎng)48小時(shí)后，提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III進(jìn)行酶切驗(yàn)證，可得到6.5kp和5.85kp的酶切片段，與步驟二的質(zhì)粒pXL211的酶切驗(yàn)證結(jié)果完全相同，表明質(zhì)粒載體pXL211在阿維鏈霉菌Olm73-12中可穩(wěn)定自我復(fù)制，未發(fā)生進(jìn)一步的重組。
2、阿維鏈霉菌基因取代突變株的獲得分別收集步驟1獲得的8個(gè)經(jīng)酶切驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化有基因取代載體pXL211的阿維鏈霉菌Olm73-12轉(zhuǎn)化子的孢子，制成孢子懸液，以每培養(yǎng)皿約100個(gè)孢子的量涂布于含有10μg/mL安普霉素的YMS平板上，置于28℃培養(yǎng)72小時(shí)，當(dāng)菌落長(zhǎng)到直徑約2mm左右，即將形成氣生菌絲時(shí)，將平板移至39℃培養(yǎng)7天進(jìn)行高溫誘導(dǎo)質(zhì)粒消除，一些菌落上出現(xiàn)扇形生長(zhǎng)，這些抗安普霉素的菌落即為單交換突變株(取代載體被整合到宿主菌的染色體上)。這是因?yàn)閜KC1139為溫敏型的大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，當(dāng)溫度高于34℃時(shí)不能自我復(fù)制，因此在含有安普霉素的YMS培養(yǎng)基上無(wú)法生長(zhǎng)；只有當(dāng)重組質(zhì)粒pXL211所攜帶的5’-flanking DNA片段或3’-flanking DNA片段與阿維鏈霉菌Olm73-12染色體上的同源區(qū)段發(fā)生同源重組，并通過(guò)單交換整合到染色體上的菌株才能表達(dá)安普霉素的抗性基因，從而在含有安普霉素的YMS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。將在39℃下長(zhǎng)出的抗安普霉素的單交換突變株在不添加抗生素的YMS平板上傳代，共轉(zhuǎn)接4次后，篩選安普霉素敏感的雙交換重組體(雙交換示意圖如圖4所示)。挑取其中8株菌，與阿維鏈霉菌Olm73-12一起在改良YEME培養(yǎng)基中28℃振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，均未能從中提取出質(zhì)粒，表明重組質(zhì)粒pXL211已被消除。單交換突變株經(jīng)無(wú)抗YMS平板傳代后篩選到的安普霉素敏感的菌株可能是已發(fā)生了雙交換的阿維鏈霉菌取代突變株，也可能是取代載體又被從染色體上全部切除而發(fā)生了回復(fù)突變的菌株，因此還需進(jìn)一步驗(yàn)證。
3、取代突變株的PCR驗(yàn)證提取8株突變株的總DNA，用引物對(duì)3(Primer5和Primer 6)可擴(kuò)增出3.27kbDNA片段的可能為發(fā)生了雙交換的阿維鏈霉菌基因取代突變株。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證pikDH4-ER4-KR4在阿維鏈霉菌突變株染色體上發(fā)生取代的位置是否正確，根據(jù)取代區(qū)域aveDH2-KR2兩側(cè)序列設(shè)計(jì)引物(Primer 7和Primer 8)擴(kuò)增自取代區(qū)域起始位點(diǎn)上游51bp至結(jié)束位點(diǎn)下游455bp的DNA片段。出發(fā)菌株Olm73-12的擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)為2.82kb，而取代突變株的擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)為3.78kb。
Primer 7(正向引物)5’-ACCCACCACGACAACCAACCC-3’(距置換區(qū)域起始位點(diǎn)上游51bp)Primer 8(反向引物)5’-ACAGCGTTGTCCGGTTGTGGC-3’(距置換區(qū)域結(jié)束位點(diǎn)下游455bp)以突變株的總DNA為模板，用引物對(duì)4(Primer7和Primer 8)擴(kuò)增出3.78kb DNA片段的突變株可能為正確的取代突變株。選取3個(gè)可擴(kuò)出3.78kbDNA片段的突變株，將3.78kbDNA片段回收后，連于載體pMD18-T上進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明該片段的序列與已知序列相同，沒(méi)有發(fā)生突變或重組，表明在這3個(gè)突變株的染色體上已經(jīng)發(fā)生了正確的基因取代，取代區(qū)域兩側(cè)的序列也沒(méi)有發(fā)生改變。
四、阿維鏈霉菌基因取代突變株發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析1、阿維鏈霉菌基因取代突變株的搖瓶發(fā)酵種子培養(yǎng)基可溶性淀粉30g，麥芽膏2g，大豆蛋白胨2g，CoCl2·6H2O 5mg，加蒸餾水至1L，調(diào)pH至7.0-7.2。
發(fā)酵培養(yǎng)基可溶性淀粉50g，酵母粉12g，MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，KCl 4g；CaCO32g，CoCl2·6H2O 5mg，加蒸餾水至1L，調(diào)pH至7.0-7.2。
將步驟三獲得的發(fā)生了雙交換的阿維鏈霉菌基因取代突變株與出發(fā)菌株阿維鏈霉菌Olm73-12(對(duì)照)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。發(fā)酵前先用稀釋平板法分離出產(chǎn)孢豐富的單菌落轉(zhuǎn)接于YMS培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7-10天，待長(zhǎng)出豐富的灰色孢子后接種于種子培養(yǎng)基(裝量為100mL/500mL三角瓶)中，28℃搖床培養(yǎng)24小時(shí)(轉(zhuǎn)速180rpm，偏心距4.0cm)。按5％接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(裝量均為100mL/500mL三角瓶)中，28℃培養(yǎng)8-10天(轉(zhuǎn)速180rpm，偏心距4.0cm)，放瓶，用HPLC法篩選產(chǎn)伊維菌素的基因工程菌株。
2、發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析1)樣品處理取1.0mL發(fā)酵液，加入4.0mL甲醇，浸泡30分鐘以上，每隔10分鐘振蕩一次，4000g離心10分鐘，取上清液進(jìn)樣分析；2)HPLC分析條件C18反相柱，柱長(zhǎng)150mm，柱內(nèi)徑4.6mm，柱溫40℃，流動(dòng)相為甲醇-水(85∶15)，流速1.0mL/min，進(jìn)樣體積10μL，波長(zhǎng)為246nm，儀器為WatersTM600高效液相色譜儀；3)標(biāo)準(zhǔn)品阿維菌素B1標(biāo)準(zhǔn)品(含97％的阿維菌素B1a和3％的阿維菌素B1b)和伊維菌素均購(gòu)自山東齊發(fā)藥業(yè)有限公司。將它們分別用甲醇配成濃度為100μg/mL的溶液。
HPLC分析結(jié)果如圖5A和圖5B所示，出發(fā)菌株阿維鏈霉菌Olm73-12產(chǎn)生阿維菌素B的4個(gè)組分，即B1a，B1b，B2a和B2b，阿維菌素的總產(chǎn)量為1537μg/mL，其中B1的產(chǎn)量為740μg/mL；發(fā)生了雙交換的阿維鏈霉菌基因取代突變株中，除了產(chǎn)生阿維菌素B1a和B2a，還產(chǎn)生了一個(gè)新組分(Ive)，其保留時(shí)間和峰型與C22，23雙氫阿維菌素B1a(伊維菌素B1a)標(biāo)準(zhǔn)品的一致，初步推測(cè)該組分有可能是伊維菌素B1a，伊維菌素B1a的產(chǎn)量很低，大約為1-4μg/mL，阿維菌素B1a和B2a的產(chǎn)量同樣也很低，僅為出發(fā)菌株的0.5-2％。將3株產(chǎn)伊維菌素的基因工程菌分別命名為Ive12-4，Ive14-1和Ive14-5。
五、產(chǎn)伊維菌素的基因工程菌株發(fā)酵產(chǎn)物的LC/MS分析將阿維鏈霉菌基因工程菌株的發(fā)酵液用等體積的甲醇浸泡30分鐘，每隔10分鐘振蕩一次，離心后，取上清夜與伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品一起進(jìn)行LC/MS分析。
儀器Waters 2690型高效液相色譜系統(tǒng)，Waters micromass ZQ2000質(zhì)譜檢測(cè)器；色譜條件采用Waters C18色譜柱(2.1×150mm，3.5μm)，柱溫40℃，流動(dòng)相為乙腈∶甲醇∶水＝62∶18∶20，流速為0.2mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為246nm，進(jìn)樣量為20μL；質(zhì)譜條件電噴霧電離源(ESI)，正離子檢測(cè)(ES+)，電離電壓為3.0KV，離子源溫度為110℃，錐孔電壓為55V-35V同時(shí)采集，去溶劑氣(N2)流量為310L/Hr；標(biāo)準(zhǔn)品伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自山東齊發(fā)藥業(yè)有限公司，含有質(zhì)量百分含量大于95％的C-22，23雙氫阿維菌素B1a和小于5％的C-22，23雙氫阿維菌素B1b)，用甲醇配成濃度為1μg/mL的溶液。
LC/MS分析結(jié)果如圖6A和圖6B(由上至下錐孔電壓(Cone voltage)依次為55V，45V，35V，25V)所示，表明Ive14-5發(fā)酵產(chǎn)物中有一個(gè)組分(組分I)的保留時(shí)間(21.51min)與伊維菌素B1a標(biāo)準(zhǔn)品(21.25min)的相同(圖6A)，該組分所對(duì)應(yīng)的正離子質(zhì)譜圖給出了m/z為897([M+Na]+)的離子峰，與伊維菌素B1a標(biāo)準(zhǔn)品的m/z相同，所以該組分的分子量為874，與計(jì)算值和文獻(xiàn)報(bào)道的伊維菌素B1a的分子量一致。此外，在圖6B中還可以看到m/z為569，551，307的碎片離子峰，在不同的錐孔電壓下Ive14-5中組分I的碎片峰與伊維菌素B1a標(biāo)準(zhǔn)品的保持一致，因此可以確定Ive14-5發(fā)酵產(chǎn)物中的組分I為伊維菌素B1a。
六、產(chǎn)伊維菌素基因工程菌株的穩(wěn)定性考察將阿維鏈霉菌基因工程菌株Ive14-1，Ive14-5和Ive12-4分別在無(wú)抗YMS平板上連續(xù)轉(zhuǎn)接5次后，用HPLC法檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物，工程菌Ive14-1，Ive14-5，Ive12-4仍然產(chǎn)生伊維菌素B1a，阿維菌素B1a和B2a組分，發(fā)酵單位也未發(fā)生變化，表明這3個(gè)基因工程菌株在遺傳上是穩(wěn)定的。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)伊維菌素的工程菌，是將阿維鏈霉菌的阿維菌素聚酮合酶DH2-KR2結(jié)構(gòu)域的編碼基因替換為聚酮合酶DH-ER-KR結(jié)構(gòu)域編碼基因得到的重組菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)伊維菌素的工程菌，其特征在于所述聚酮合酶DH-ER-KR結(jié)構(gòu)域編碼基因來(lái)自于委內(nèi)瑞拉鏈霉菌、紅色糖多孢菌、阿維鏈霉菌、吸水鏈霉菌、弗氏鏈霉菌、Streptomyces caelestis或抗生鏈霉菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)伊維菌素的工程菌，其特征在于所述鏈霉菌為委內(nèi)瑞拉鏈霉菌ATCC 15493。
4.一種權(quán)利要求1或2或3所述的產(chǎn)伊維菌素的工程菌的構(gòu)建方法，是構(gòu)建含有阿維鏈霉菌的阿維菌素聚酮合酶DH2-KR2結(jié)構(gòu)域編碼基因的5’端和3’端旁側(cè)序列和聚酮合酶DH-ER-KR結(jié)構(gòu)域編碼基因的基因取代載體，將基因取代載體轉(zhuǎn)化阿維鏈霉菌，得到含有基因取代載體的阿維鏈霉菌的轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子經(jīng)高溫誘導(dǎo)得到單交換突變株，再將單交換突變株經(jīng)傳代后，得到發(fā)生了同源雙交換的重組阿維鏈霉菌；所述基因取代載體中阿維菌素聚酮合酶DH2-KR2結(jié)構(gòu)域編碼基因的5’端旁側(cè)序列、聚酮合酶DH-ER-KR結(jié)構(gòu)域編碼基因和阿維菌素聚酮合酶DH2-KR2結(jié)構(gòu)域編碼基因的3’端旁側(cè)序列按上述順序且以相同方向順次連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述用于構(gòu)建基因取代載體的出發(fā)載體為大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體pKC1139、pKC505、pIJ653或pIJ8154。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述用于構(gòu)建基因取代載體的出發(fā)載體為pKC1139。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述基因取代載體為pXL211。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或5或6或7所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述將基因取代載體轉(zhuǎn)化阿維鏈霉菌的方法為PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。
9.根據(jù)權(quán)利要求4或5或6或7所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行高溫誘導(dǎo)挑選單交換突變株的條件為將轉(zhuǎn)化子涂布于含8-12μg/mL安普霉素的YMS平板上，在34-39℃下培養(yǎng)7-10天；將單交換突變株進(jìn)行傳代的培養(yǎng)基為無(wú)抗生素的YMS培養(yǎng)基。
10.一種伊維菌素的生產(chǎn)方法，是發(fā)酵權(quán)利要求1或2或3所述的重組阿維鏈霉菌得到伊維菌素。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種產(chǎn)伊維菌素的工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，其目的是涉及一種產(chǎn)伊維菌素的工程菌及其構(gòu)建方法與其在生產(chǎn)伊維菌素中的應(yīng)用。該工程菌是將阿維鏈霉菌的阿維菌素聚酮合酶DH2－KR2結(jié)構(gòu)域的編碼基因替換為聚酮合酶DH－ER－KR結(jié)構(gòu)域編碼基因得到的重組菌。本發(fā)明的基因工程菌可直接用于伊維菌素的發(fā)酵生產(chǎn)，并可避免復(fù)雜的分離提純阿維菌素B1和將阿維菌素B1化學(xué)還原成伊維菌素的工藝，同時(shí)不必再?gòu)陌l(fā)酵液中除去有毒的寡霉素，使生產(chǎn)成本大幅降低。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1687403SQ20051007493
公開(kāi)日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月6日
發(fā)明者文瑩, 張曉琳, 陳芝, 宋淵, 李萌, 李季倫 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)