專利名稱：厚葉旋蒴苣苔BcBCP1基因在培育耐旱耐鹽植物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用從厚葉旋蒴苣苔屬植物中克隆到的一個編碼區(qū)為606bp的干旱相關(guān)的藍銅蛋白類似基因(BcBCP1)，該基因編碼201個氨基酸組成的多肽，在氨基末端具有質(zhì)膜導(dǎo)向信號肽，中部具有Cu2+結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，羧基末端含有植物細胞壁伸展蛋白所特有的PPR結(jié)構(gòu)，具典型的小分子量藍銅蛋白結(jié)構(gòu)特征。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來提高植物抗旱性，研究其可能功能的方法。
背景技術(shù)：
干旱脅迫是影響植物生長發(fā)育的主要逆境因子之一，在許多地域是農(nóng)業(yè)發(fā)展的一大障礙。干旱對農(nóng)作物造成的損失在所有的非生物脅迫中居首位。因此，利用轉(zhuǎn)基因手段來獲得抗干旱的轉(zhuǎn)基因植物，已經(jīng)成為當(dāng)今植物生物技術(shù)領(lǐng)域研究的熱點之一。隨著對植物抗旱基礎(chǔ)分子生物學(xué)研究的不斷深入和對抗性基因的不斷發(fā)現(xiàn)和挖掘，迄今，已有數(shù)十種植物被轉(zhuǎn)化并獲得了不同程度的抗旱和/或耐鹽的轉(zhuǎn)基因植物?，F(xiàn)已證實，在轉(zhuǎn)基因植物中超量表達低分子量化合物如甘露醇(Tarczynski，1993)、甜菜堿(Rathinasabapathi，1994)、芒柄醇(Sheveleva，1997)等、可溶性糖如果聚糖(Ebskamp，1994)、海藻糖(Romero，1997)和晚期胚胎發(fā)生富含蛋白(Xu，1996)等，能夠賦予轉(zhuǎn)基因植物抗水分脅迫的能力。然而，植物的抗旱機制極其復(fù)雜，植物的抗旱性與多個性狀有關(guān)，在不同植物之間存在著很大的差異。對于某一種作物到底轉(zhuǎn)移哪些抗旱基因，對提高抗旱性更為有效對目前的植物抗旱基因工程研究提出的嚴峻問題。這就需要克隆出越來越多的抗旱基因，并對它們的功能進行深入細致的分析。
厚葉旋蒴苣苔(Boea crassifolia)是苦苣苔科旋蒴苣苔屬植物，主要分布在中國西南部的具石灰?guī)r地貌的地區(qū)，是一種極其耐旱的植物，它能在極端的條件下生存下來。本實驗采用mRNA差異顯示技術(shù)及RACE技術(shù)從厚葉旋蒴苣苔中克隆得到一個小分子量的藍銅蛋白類似基因，該基因編碼一條由201個氨基酸組成的多肽，在氨基末端具有一個信號肽，中部具有一個Cu2+結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，羧基末端含有一個植物細胞壁伸展蛋白所特有的PPR結(jié)構(gòu)，具有典型的小分子量的藍銅蛋白的結(jié)構(gòu)特征。小分子量的藍銅蛋白是銅蛋白(copper protein)大家族的一個很小的分枝。銅蛋白根據(jù)銅中心的類型分為六類I型銅蛋白(藍銅蛋白)，II型銅蛋白，III型銅蛋白，三核中心銅蛋白，CuA和CuB蛋白。其中I型銅蛋白是藍色的，在600nm附近有吸收峰，順磁性，可用EPR檢測。I型銅蛋白(藍銅蛋白)又分為小分子量的藍銅蛋白(包括Auracyanin，Azurin，Phytocyanin，Plastocynin，Rusticynin)，藍氧化酶(Blue oxidases)和亞硝酸還原酶(Nitritereductase)。I型銅蛋白可以與一個銅原子相結(jié)合，通常為兩個組氨酸，一個甲硫氨酸和一個半胱氨酸與銅原子相互作用，形成銅中心，這種蛋白存在于高等植物，綠藻和藍綠藻中，主要參與電子傳遞、光合作用和細菌的呼吸代謝。目前國內(nèi)外有關(guān)高等植物藍銅蛋白的資料尚少(Turner，2002)。依據(jù)來自藍藻和黃瓜的研究(Nersissian，1996)來推測藍銅蛋白在植物抗逆中的作用可能銅離子結(jié)合中心在與電子傳遞相關(guān)的氧化還原反應(yīng)中起重要作用，而這對抗逆過程中消除活性氧的毒害是十分重要的。此外藍銅蛋白中一個類似伸展蛋白(extensin)的結(jié)構(gòu)域，它可能在細胞結(jié)構(gòu)保護方面起重要作用。
本實驗不僅從厚葉旋蒴苣苔中分離得到一個新的受干旱誘導(dǎo)的藍銅蛋白類似基因，而且將其構(gòu)建成的植物表達載體，在轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)中研究了該基因在提高植物耐旱、耐鹽、耐高溫、耐低溫性能中的重要功能。這對于揭示厚葉旋蒴苣苔的耐旱機理，豐富植物耐旱分子生物學(xué)理論，提高植物的抗旱、耐鹽、耐高溫、耐低溫能力，具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個主要目的是為植物抗旱、抗鹽育種提供有價值的藍銅蛋白類似基因，通過該基因的過量表達，使植物的抗旱、抗鹽、抗高溫、低溫脅迫性能得到大幅度的提高，最終獲得抗(耐)旱、抗(耐)鹽、抗(耐)高溫、抗(耐)低溫能力明顯增強的優(yōu)良植物品種。
技術(shù)方案1.從厚葉旋蒴苣苔中克隆到一個干旱相關(guān)的藍銅蛋白類似基因
(1)采用mRNA差異顯示技術(shù)分離藍銅蛋白類似基因片段本實驗即采用mRNA差異顯示技術(shù)從厚葉旋蒴苣苔中分離藍銅蛋白類似基因片段。
(2)采用RACE技術(shù)獲得藍銅蛋白類似基因全長cDNA本實驗采用5’RACE技術(shù)獲得藍銅蛋白類似基因5’端未知序列。序列拼接后在兩端設(shè)計引物，再次RT-PCR獲得全長cDNA序列。
2.構(gòu)建藍銅蛋白類似基因BcBCP1的植物表達載體我們首先選用了啟動能力很強的、在雙子葉植物中最常用的花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子，將得到的厚葉旋蒴苣苔藍銅蛋白類似基因BcBCP1全長cDNA序列連于其后，構(gòu)建成功雙元表達載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草、矮牽牛。載體構(gòu)建示意圖見

圖1。
同時我們又將BcBCP1基因置于在單子葉中高效表達的Ubi啟動子驅(qū)動下，通過基因槍法導(dǎo)入廣泛應(yīng)用的草坪植物如早熟禾、高羊茅、黑麥草、紫羊茅、剪股穎、結(jié)縷草、狗牙根、苜蓿、沙打旺、百脈根、畫眉草和冰草等植物中。載體示意圖見圖2。
另外，我們還將BcBCP1基因置于受干旱、低溫、高溫誘導(dǎo)的啟動子BcDh2的驅(qū)動下，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化了煙草、矮牽牛。載體示意圖見圖3。
3.通過基因槍和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法對煙草、矮牽牛、草坪草和牧草進行了遺傳轉(zhuǎn)化，并獲得了耐旱轉(zhuǎn)基因煙草、矮牽牛、草坪草和牧草將BcBCP1基因分別置于在雙子葉植物中高效表達的35S啟動子和單子葉植物中高效表達的Ubi啟動子驅(qū)動下，通過基因槍和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法導(dǎo)入煙草、矮牽牛和廣泛應(yīng)用的草坪植物如早熟禾、高羊茅、黑麥草、剪股穎、結(jié)縷草、狗牙根以及牧草如苜蓿、沙打旺、百脈根、畫眉草、冰草中，使煙草、矮牽牛、草坪草和牧草的耐旱、耐鹽、耐高、低溫性能顯著提高，對于解決城市綠化中草坪耗水量大與我國水資源形勢嚴峻的矛盾，以及草坪草和牧草安全渡過冬季、夏季等帶有極端溫度的季節(jié)有重要意義。目前已獲得轉(zhuǎn)基因煙草、矮牽牛、草坪草和牧草，并已初步表現(xiàn)出增加耐缺水、耐鹽、耐高、低溫度脅迫能力，有助于解決草坪草耗水量大、養(yǎng)護困難的問題。因此這一轉(zhuǎn)基因草坪草在節(jié)約城市綠化用水方面很有潛力。
這里應(yīng)特別指出的是，本發(fā)明利用我們從厚葉旋蒴苣苔中分離所得到的藍銅蛋白類似基因BcBCP1，但這并不意味著利用從厚葉旋蒴苣苔這一種指定的植物中分離得到的基因，使用厚葉旋蒴苣苔所屬的旋蒴苣苔屬植物分離得到的藍銅蛋白類似基因進行其他方面的應(yīng)用均在本發(fā)明權(quán)利要求之內(nèi)。
這里還應(yīng)特別指出的是，本發(fā)明利用我們所得到的藍銅蛋白類似基因BcBCP1，構(gòu)建植物表達載體，但這并不意味著此基因只有這一個應(yīng)用價值。使用本發(fā)明中的基因進行其他方面的應(yīng)用均在本發(fā)明權(quán)利要求之內(nèi)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，我們選用煙草、矮牽牛、草坪草(早熟禾、高羊茅、黑麥草、剪股穎、結(jié)縷草、狗牙根)及牧草(苜蓿、沙打旺、百脈根、畫眉草、冰草)作為轉(zhuǎn)基因植物材料。但這并不意味著本發(fā)明所構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因載體只能用于轉(zhuǎn)化煙草、矮牽牛、草坪草(早熟禾、高羊茅、黑麥草、剪股穎、結(jié)縷草、狗牙根)及牧草(苜蓿、沙打旺、百脈根、畫眉草、冰草)，還包括其它植物。使用含本發(fā)明中藍銅蛋白類似基因BcBCP1的正義及反義表達載體轉(zhuǎn)化其他植物材料，均在本發(fā)明的權(quán)利要求之內(nèi)。因為本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以利用本專利構(gòu)建好的藍銅蛋白類似基因BcBCP1基因表達載體，利用本專利提供的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化其它植物。
在本發(fā)明的一個實施方案中，BcBCP1基因被置于CaMV 35S啟動子和Tnos終止子的調(diào)控之下，再連至CAMBIA公司的雙元表達載體pCAMBIA3300，構(gòu)成一個植物表達載體，用于雙子葉植物的轉(zhuǎn)化。根據(jù)本發(fā)明的這一實施方案，構(gòu)建所選用的植物表達載體除了pCAMBIA3300之外，還可以選用CAMBIA公司的其它表達載體或者本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的其它如pGPTV系列，pBI系列，pCB系列等的植物表達載體，有關(guān)pCAMBIA3300載體的詳細信息可以在CAMBIA公司網(wǎng)站www.cambia.org.au中得到詳細說明。
在本發(fā)明的一個實施方案中，BcBCP1基因被置于Ubiquitin啟動子和Tnos終止子的調(diào)控之下，再連至表達載體pAHC25，構(gòu)成一個植物表達載體，用于單子葉植物的轉(zhuǎn)化。根據(jù)本發(fā)明的這一實施方案，構(gòu)建所選用的植物表達載體除了pAHC25之外，還可以選用其它適合于單子葉植物的表達載體，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的其它載體。有關(guān)pAHC25載體的詳細信息可以在www.defra.gov.uk網(wǎng)站中得到詳細說明。
在本發(fā)明的一個實施方案中，BcBCP1基因被置于干旱、高溫、低溫誘導(dǎo)型啟動子BcDh2和終止子Tnos的調(diào)控之下，再連至CAMBIA公司的雙元表達載體pCAMBIA3300，構(gòu)成一個植物表達載體，用于雙子葉植物的轉(zhuǎn)化。根據(jù)本發(fā)明的這一實施方案，構(gòu)建所選用的干旱、鹽脅迫誘導(dǎo)型啟動子除了BcDh2之外，還可以選用文獻資料中所列的其他誘導(dǎo)型啟動子，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過參考有關(guān)文獻獲得詳情。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，植物篩選所用的抗生素為除草劑，具體選用何種篩選要看選用植物表達載體所對應(yīng)的標(biāo)記基因。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，所選用的農(nóng)桿菌菌株為LBA4404。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，所選用的農(nóng)桿菌菌株除了LBA4404外，還應(yīng)包括農(nóng)桿菌的其它菌株，如EHA101。這些菌株的特征是本身含有Vir毒性蛋白區(qū)，能夠幫助轉(zhuǎn)入的植物表達載體中的T-DNA轉(zhuǎn)移到植物的基因組中。
在本發(fā)明的一個實施方案中，植物表達載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌的方法為凍融法。凍融法為本領(lǐng)域技術(shù)人員非常熟悉的技術(shù)操作，不是本發(fā)明的關(guān)鍵。通過PCR檢測陽性的農(nóng)桿菌菌株，用于轉(zhuǎn)化煙草、矮牽牛、早熟禾、高羊茅、黑麥草、剪股穎、結(jié)縷草、狗牙根以及牧草如苜蓿、沙打旺、百脈根、畫眉草、冰草等。本發(fā)明中對于靶植物的轉(zhuǎn)化方法不是關(guān)鍵，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的各種不同的轉(zhuǎn)化技術(shù)將重組DNA序列導(dǎo)入待轉(zhuǎn)化的靶植物細胞。這些方法包括但不僅限于農(nóng)桿菌侵染法，微粒轟擊法，顯微注射法，共沉淀法，電穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過參考有關(guān)文獻獲得詳情。
本發(fā)明中用于將轉(zhuǎn)化細胞再生成植株的方法不是關(guān)鍵，可以使用任何對靶植物合適的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過參考有關(guān)文獻得到詳情。最好使被轉(zhuǎn)化的序列穩(wěn)定的整合到靶植物細胞的基因組中，從而使其在傳代的過程中不被丟失。另外，用于轉(zhuǎn)化靶植物的核苷酸序列可以以線性，環(huán)形或其它重組載體的形式如人工染色體的形式存在。
本發(fā)明的有益效果厚葉旋蒴苣苔的藍銅蛋白類似基因BcBCP1受干旱誘導(dǎo)表達強烈，同時也受高濃度鹽、高溫、低溫、外源ABA的誘導(dǎo)表達，其編碼蛋白在氨基末端具有一個信號肽，中部具有一個Cu2+結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，羧基末端含有一個植物細胞壁伸展蛋白所特有的PPR結(jié)構(gòu)。這種蛋白的結(jié)構(gòu)推測與植物光合作用的電子傳遞和植物在病蟲害、干旱、鹽害、高溫、低溫等逆境條件下的信號傳遞及植物體內(nèi)活性氧的清除有關(guān)，從而提高植物的抗逆能力。我們構(gòu)建了該基因的植物表達載體，并將此耐旱基因?qū)敫黝愔参镏校蕴岣咧参锏哪秃?、耐鹽、耐高低溫度脅迫性能。將BcBCP1基因?qū)霟煵?、矮牽牛、草坪草和牧草后，能有效提高轉(zhuǎn)基因植物的耐旱保水、耐鹽、耐高溫和耐低溫脅迫能力。轉(zhuǎn)基因株系在液體培養(yǎng)條件下，在PEG8000模擬干旱脅迫48小時后，與未轉(zhuǎn)基因株系相比，葉片相對電導(dǎo)率下降9.6％。在正常條件下，轉(zhuǎn)基因株系的葉片凈光合速率提高38％-98％，10％的PEG6000模擬干旱脅迫處理5天后，葉片凈光合速率提高47％-1.6倍，處理10天后，提高1.7-3.4倍。相對電導(dǎo)率和葉片凈光合速率是衡量植物干旱條件下生理狀態(tài)的重要指標(biāo)。相對電導(dǎo)率越低，耐旱性能越強。而植株在干旱條件下保持光合速率越高，耐旱能力越強。在液體培養(yǎng)條件下，125mM NaCL處理20天后，轉(zhuǎn)基因株系比未轉(zhuǎn)基因株系葉片相對電導(dǎo)率下降21.6％，總?cè)~綠素含量提高了19.7％。在37℃處理10天后，轉(zhuǎn)基因株系在形態(tài)上比未轉(zhuǎn)基因株系明顯健壯。
四、附圖簡要說明圖1是植物表達載體p3300-BcBCP1構(gòu)建流程的示圖。
圖2是植物表達載體pAHC-BcBCP1的示圖。
圖3是植物表達載體pBcDh2-BcBCP1的示圖。
圖4是BcBCP1基因轉(zhuǎn)化煙草的PCR檢測。
圖中擴增條帶大小為0.6kb，電泳帶從左到右編號依次為M，CK，0，1，2，3，4，5，6，7，8。M表示分子標(biāo)記Marker，CK為陽性對照，0為陰性對照，1-6，8為不同轉(zhuǎn)基因株系，7為轉(zhuǎn)基因陰性植株。
圖5是BcBCP1基因轉(zhuǎn)化煙草的Southern檢測。
圖6是BcBCP1基因轉(zhuǎn)化煙草的Northern檢測。
譜帶從左到右編號依次為1，2，3，4，5。4為陰性對照，1-3，5表示不同轉(zhuǎn)基因株系。
圖7是在干旱處理后BcBCP1基因轉(zhuǎn)化的煙草和未轉(zhuǎn)基因煙草的照片左邊是轉(zhuǎn)基因植株，右邊是未轉(zhuǎn)基因植株，時間是PEG6000處理后第10天。
圖8是BcBCP1基因轉(zhuǎn)化煙草在干旱處理下的葉片質(zhì)膜透性柱形中編號1是未轉(zhuǎn)基因植株，2-4是轉(zhuǎn)基因植株。
圖9是BcBCP1基因轉(zhuǎn)化煙草在干旱處理下的葉片凈光合速率柱形中0，5，10分別表示PEG6000處理前，處理后第5天，處理后第10天測定的葉片凈光合速率。每一天的測定結(jié)果條形柱從左到右編號依次為1，2，3，4。1-3為轉(zhuǎn)基因植株，4為未轉(zhuǎn)基因植株。
圖10是BcBCP1基因轉(zhuǎn)化煙草在鹽脅迫處理下的葉片質(zhì)膜透性柱形中條形柱編號從左到右編號依次為1，2，3，4。1為未轉(zhuǎn)基因植株，2-4為轉(zhuǎn)基因植株。
圖11是BcBCP1基因轉(zhuǎn)化煙草在鹽脅迫處理下的葉片葉綠素含量柱形中條形柱編號從左到右編號依次為1，2，3，4。1為未轉(zhuǎn)基因植株，2-4為轉(zhuǎn)基因植株。
圖12是在37℃高溫處理后BcBCP1基因轉(zhuǎn)化的煙草和未轉(zhuǎn)基因煙草的照片圖中左邊為未轉(zhuǎn)基因植株，右邊為轉(zhuǎn)基因植株。
五具體實施例方式實驗所涉及的藥品均購自Invitrogen，Promega公司，Takara公司，Sigma公司及上海生工公司。具體實驗操作依據(jù)《分子克隆》及相關(guān)文獻。
實施例1藍銅蛋白類似基因BcBCP1的獲得1.藍銅蛋白類似基因BcBCP1基因片段的獲得為獲得厚葉旋蒴苣苔中干旱脅迫下差異表達的序列標(biāo)簽，我們采用了mRNA差異顯示(mRNA different display)結(jié)合反向Northern(Reverse Northernblotting)的方法。分別抽取干旱誘導(dǎo)(失水約43％)及自然環(huán)境下生長未經(jīng)干旱處理的厚葉旋蒴苣苔總RNA，根據(jù)fluroDD試劑盒說明書，選擇3條錨定引物(AP1，AP6和AP10)和4條隨機引物(APR7，APR9，APR18和APR20)組合進行mRNA差異顯示分析，得到的cDNA片段在5.6％的變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。差異顯示重復(fù)3次，選擇在3次實驗中都出現(xiàn)的26條片段做進一步分析。將挖取的片段放入30ulTE中，37℃保溫1-2天，取2ul在50ul體系中進行以相同的引物進行第二次PCR擴增。
(1)厚葉旋蒴苣苔總RNA的獲得取0.1g～0.2g厚葉旋蒴苣苔葉片放入研缽中，加液氮迅速研磨成粉沫；將粉末轉(zhuǎn)入盛有0.5ml ConcertTM Plant RNA Reagent的DEPC處理的1.5ml離心管中；室溫靜置5min，室溫小于12000g離心2min；將上清液轉(zhuǎn)入新離心管，加入100ul 5mol/LNaCl，混勻；在加入300氯仿，混勻，4℃小于12000g離心10min；將上清液轉(zhuǎn)入新離心管，加0.5ml異丙醇，15-30℃放置10min；4℃小于12000g離心10min；去上相，加1ml 75％乙醇渦懸洗滌沉淀；室溫小于12000g離心1min；自然干燥(不要干透)，槍頭吹打溶于50-100ul RNase-freewater；用RNase-free的DNase I處理總RNA，在PE UV/VIS spectrometer LambdaBio40上測定A230nm至280nm波長范圍內(nèi)的吸光值，并計算A260/A280和A260/A230比值以檢測樣品的純度。據(jù)RNA(ug/mL)＝OD260×37ug/ml×稀釋倍數(shù)，計算樣品的RNA濃度。
(2)RT-PCR將對照組和處理組總RNA分別稀釋成0.1μg/μl，各取2μl，用不同的anchored primer進行逆轉(zhuǎn)錄。在0.2ml PCR管中加入(50μl體系)1.95μLddH2O，10×PCR buffer II 1.0μL，25mM MgCl21.5μL，250μM dNTPs2.0μL，5’APR(2μM)1.75μL，3’AP(5μM)0.7μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.0μL，AmpliTaq(5U/μL)，0.1μL。PCR擴增條件為95℃預(yù)變性2min；4個循環(huán)92℃15s50℃ 30s；72℃ 2min；30個循環(huán)92℃ 30s；60℃ 30s；72℃2min；72℃延伸7min。
(3)反向Northern雜交為降低差異顯示中高比例70-80％的假陽性，進行了兩次反向Northern雜交。在克隆片段之前進行第一次反向Northern雜交，取6μL擴增的片段同時點在兩張Hybond-N+(Amersham Pharmarcia，U.S.A)尼龍膜上，分別以干旱誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的苣苔總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記總cDNA探針。在預(yù)雜交液中，65℃進行2-3小時的預(yù)雜交，過夜進行雜交。陽性的cDNA片段被克隆到pGEM-T Easy載體(Promega，USA)上，每一條片段選擇6個克隆，進行第二次反向Northern雜交。選擇陽性cDNA片段進行測序。(雜交和顯色方法參見分子克隆)。
2.藍銅蛋白類似基因BcBCP1基因全長cDNA的獲得根據(jù)所獲得的藍銅蛋白類似基因BcBCP1片段設(shè)計三條反向基因特異引物，參照5’RACE的操作說明進行操作。設(shè)計的三條反向基因特異引物序列如下GSP15’-CTTCAGCGAACAACATGCAT-3’GSP25’-CTGTGG CTGCAGCTGGATAG-3’GSP35’-GGATAGGGATGCGGAGTTGT-3’5’RACE試劑盒提供的引物如下AAP5-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3AUAP5-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3將所獲得目的片段回收，與pGEM-T easy載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆進行測序，并對序列進行分析，發(fā)現(xiàn)已得到了基因的起始序列。將5’RACE序列與差異顯示所獲得的序列拼接，獲得拼接的基因序列，根據(jù)此序列在兩端設(shè)計引物，再次RT-PCR擴增全長基因，并進行序列測定。擴增全長基因所用的引物BCP-cDNA-L5’-AGGATCCATGGGGGGACTCAAGGTTTTTGCT-3’(含BamHI和NcoI酶切位點)BCP-cDNA-R5’-AAACACTTCAGCGAACAACATGCA-3’PCR反應(yīng)條件為94℃ 5分鐘；94℃ 20秒，72℃ 6分鐘，6個循環(huán)；94℃20秒，70℃ 6分鐘，6個循環(huán)；94℃ 20，68℃ 6分鐘，6個循環(huán)；94℃ 20秒，66℃ 6分鐘，6個循環(huán)；94℃ 20秒，64℃ 6分鐘，6個循環(huán)；94℃ 20，62℃ 6分鐘，10個循環(huán)；66℃ 7分鐘。
實施例2植物表達載體的構(gòu)建植物表達載體p3300-BcBCP1的結(jié)構(gòu)見圖1。
植物表達載體p3300-BcBCP1的構(gòu)建將p BI121以HindIII和EcoRI酶切，回收2.8kb的片段，將pCAMBIA3301以HindIII和EcoRI酶切，與上述回收的2.8kb片段連接，命名為p3301-121。同時，將p BI121以EcoRI和Sac I酶切，回收0.2kb的小片段，將pCAMBIA3300以EcoRI和Sac I酶切，與上述0.2kb的小片段連接，獲得質(zhì)粒命名為p3300-Tnos。將p3300-Tnos以HindIII和SacI酶切，回收0.2kb的小片段，將p3301-121以HindIII和SacI酶切0.2kb片段連接，獲得質(zhì)粒命名為p35S-3300-Tnos。將BcBCP1基因連接到pGEM-Teasy載體上，并命名為pT-BcBCP1。pT-BcBCP1以EcoRI酶切，回收0.6kb片段與載體pGEM-7Z以EcoRI酶切后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)后，挑取菌落分別以BCP-cDNA-L和BCP-cDNA-R為上下游引物進行PCR鑒定。陽性的菌落提取質(zhì)粒，以BamHI酶切鑒定BcBCP1基因插入載體pGEM-7Z中的方向。因上游引物BCP-cDNA-L和載體pGEM-7Z中均含BamHI識別序列。BamHI酶切若能得到0.6kb片段的小片段，則為正向插入，該質(zhì)粒命名為p3300-BcBCP1。將p3300-BcBCP1以Xba I和Sac I酶切，回收0.6kb片段與載體p35S-3300-Tnos以Xba I和Sac I酶切后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)后，挑取菌落分別以BCP-cDNA-L和BCP-cDNA-R為上下游引物進行PCR鑒定，陽性菌落以Xba I和Sac I酶切鑒定后得到p3300-BcBCP1。BcBCP1基因的啟動子為35S，終止子為Tnos；篩選標(biāo)記基因為Bar，Bar基因的啟動子亦為35S，終止子為35S polyA。
植物表達載體pAHC-BcBCP1的結(jié)構(gòu)見圖2。
植物表達載體pAHC-BcBCP1的構(gòu)建將BcBCP1基因置于Ubiquitin(泛素蛋白基因的5’端調(diào)控區(qū)，在單子葉植物中組成型表達)啟動子的調(diào)控之下，構(gòu)建了適合于單子葉的植物表達載體pAHC-BcBCP1。將該基因連接到pGEM-Teasy載體上，并命名為pT-BcBCP1。Not I酶切pT-BcBCP1，回收約0.6kb的小片段，連接到pGEM-5Z上，得到中間載體p5Z-BcBCP1。將p5Z-BcBCP1用EcoRV和Sac I酶切，回收小片段，同時將pAHC25用Sma I和Sac I酶切，回收大片段，連接小片段和大片段，轉(zhuǎn)化DH5α并進行PCR和酶切鑒定后得到pAHC-BcBCP1。該表達載體由于沒有LB(Left Border)、RB(Right Border)，因此不能通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化植物，而采取基因槍的方法轉(zhuǎn)化植物。BcBCP1基因的啟動子為Ubiquitin，終止子為Tnos；篩選標(biāo)記基因為Bar，Bar基因的啟動子亦為Ubiquitin，終止子為Tnos。
植物表達載體pBcDh2-BcBCP1的結(jié)構(gòu)見圖3。
植物表達載體pBcDh2-BcBCP1的構(gòu)建將BcBCP1基因置于BcDh2(厚葉旋蒴苣苔脫水素的5’端調(diào)控區(qū)，本實驗克隆，受干旱、高鹽、高溫、低溫誘導(dǎo)表達的誘導(dǎo)型啟動子)啟動子的調(diào)控之下，構(gòu)建了誘導(dǎo)型植物表達載體pBcDh2-BcBCP1。將連接在pGEM-Teasy載體上的BcDh2啟動子用EcoRI酶切，回收約1.0kb的小片段，與載體pGEM-7Z以EcoRI酶切后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)后，挑取菌落分別以pBcDh2-promoter-L和pBcDh2-promoter-R為上下游引物進行PCR鑒定。陽性的菌落提取質(zhì)粒，以BamHI和BamHI+XbaI酶切鑒定BcBCP1基因插入載體pGEM-7Z中的方向。因上游引物pBcDh2-promoter-L和載體pGEM-7Z中均含BamHI識別序列。BamHI酶切不能得到小片段，而BamHI+XbaI酶切得到1.0kb片段的小片段，則為正向插入，該質(zhì)粒命名為p7Z-pBcDh2。p7Z-pBcDh2以HindIII+XbaI酶切，回收1.0kb的片段，與p3300-BcBCP1以同樣酶切回收的大片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)后，挑取菌落經(jīng)PCR鑒定，陽性菌落以HindIII+XbaI酶切鑒定后得到pBcDh2-BcBCP1。BcBCP1基因的啟動子為BcDh2，終止子為Tnos；篩選標(biāo)記基因為Bar，Bar基因的啟動子亦為35S，終止子為35S polyA。
實施例3農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化(1)農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備1.挑取土壤農(nóng)桿菌單菌落接種于5ml含適當(dāng)抗生素的LB/YEB液體培養(yǎng)基中，28℃、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜；2.按1∶100接種于40ml含適當(dāng)抗生素的LB/YEB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)4-6h；3.4℃，5,000rpm離心10min，去上清；
4.用600μl冰預(yù)冷0.05M的CaCL2溶液洗滌菌體；5.4℃，5,000rpm離心10min，去上清；6.用200μl冰預(yù)冷的冰預(yù)冷0.05M的CaCL2重懸菌體，于4℃保存。
(2)轉(zhuǎn)化1.在感受態(tài)農(nóng)桿菌中加入約0.5-1.0μg質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，冰上放置5min；2.置于液氮中3min；3.37℃溫育5min；4.500μL LB/YEB液體培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)5-6h；5.5,000rpm離心3min，去大部分上清，剩200μ1左右，懸浮菌體；6.均勻涂布于含適當(dāng)抗生素的LB/YEB選擇平板上，28℃倒置培養(yǎng)兩天。
實施例4煙草、矮牽牛的遺傳轉(zhuǎn)化及再生在本發(fā)明的這一實施方案中，轉(zhuǎn)化煙草的方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法。
侵染農(nóng)桿菌的制備(1)挑取經(jīng)鑒定呈陽性的農(nóng)桿菌單菌落，接種到含適當(dāng)抗生素的的10mL液體LB培養(yǎng)基中，于28℃恒溫搖床振蕩培養(yǎng)30個小時至對數(shù)生長期。對煙草葉盤進行轉(zhuǎn)化前4-6小時，取搖至對數(shù)生長期的農(nóng)桿菌菌液按1∶100的比例接種到含適當(dāng)抗生素的40mL液體LB培養(yǎng)基中，于28℃恒溫搖床振蕩培養(yǎng)以使菌株活化，搖至對數(shù)生長期時備用。
(2)取無菌煙草葉片，去葉緣和葉片主脈，剩余部分切成0.5cm的小塊。
(3)將搖至對數(shù)生長期農(nóng)桿菌LBA4404菌液于4℃，5000rpm離心，沉淀用等體積無菌MS液體培養(yǎng)基重新懸浮。
(4)將切好的小塊煙草葉片放入重新懸浮后的農(nóng)桿菌中，浸泡15-30分鐘，其間不斷輕搖幾次。
(5)取出材料，用無菌濾紙吸去多余菌液，將葉片正面朝下置于MS固體培養(yǎng)基中，并使葉片與MS固體培養(yǎng)基緊密接觸。25℃暗培養(yǎng)兩天；把材料轉(zhuǎn)入含相應(yīng)抗生素和500mg/L Cb的分化培養(yǎng)基中，25℃光下培養(yǎng)至分化出愈傷組織，直至長出芽；(6)將長至3-5cm的芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(相應(yīng)抗生素，Cb500)上誘導(dǎo)生根。
實施例5對草坪草的遺傳轉(zhuǎn)化基因槍法轉(zhuǎn)化過程包括種子或幼穗(包括草坪植物如早熟禾、高羊茅、黑麥草、)誘導(dǎo)愈傷組織、基因槍轟擊、抗性愈傷篩選、苗的分化、植株鑒定。
種子誘導(dǎo)愈傷的步驟成熟種子用0.1％升汞消毒后，先接于MS基本培養(yǎng)基上，讓其萌動3天，露出小芽時，將胚縱切后轉(zhuǎn)接于誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上，形成愈傷(約30天左右)后，每次挑選色澤鮮、增殖快、質(zhì)地硬的愈傷組織繼代培養(yǎng)，繼代愈傷可供基因槍轉(zhuǎn)化；幼穗誘導(dǎo)愈傷的步驟取長約0.2～1cm左右的幼穗，用70％乙醇表面消毒后，在超凈臺內(nèi)剝出幼穗，接種于誘導(dǎo)誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，形成愈傷后，每20天繼代培養(yǎng)一次，供基因槍轉(zhuǎn)化；基因槍的轉(zhuǎn)化及苗的分化質(zhì)粒提取的質(zhì)粒濃度調(diào)整為1μg/μL。子彈配制30mg金粉或鎢粉加1mL 100％乙醇旋渦洗滌15分鐘，無菌水洗3次，加500μL 50％甘油備用。取上述鎢或金粉懸液50μL，加5μL DNA，加50μL 2.5M CaCl2，加20μL 0.1M亞精胺，旋渦，冰上靜置15分鐘，離心數(shù)秒，70％乙醇142μL洗一次，離心數(shù)秒，100％140μL乙醇洗一次，離心數(shù)秒，加50μL 100％乙醇，供5槍用。
供試基因槍PDS-1000/He(美國伯樂公司)基因槍可裂膜用1350Psi可裂膜，真空度25inHg，6cm射擊距離，每皿射擊一槍。槍擊前的愈傷組織在含0.4M甘露醇的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～8小時，槍擊16小時后移入正常繼代培養(yǎng)基。槍擊后的愈傷組織一周后轉(zhuǎn)至含除草劑2-5mg/L的繼代篩選2～4輪，每輪20天。篩選后得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入含50g糖的培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)20天，然后轉(zhuǎn)入去掉2，4-D的分化培養(yǎng)基中分化成苗。當(dāng)小苗長到4-5片葉時，取少量葉片提取植物總DNA，進行PCR檢測。小苗長至5～10cm大小時，移入蛭石松針土為1∶1的土中，塑料袋保溫一周后，苗即成活。
實施例6轉(zhuǎn)基因植株Southern雜交和Northern雜交檢測得到抗生素篩選陽性的轉(zhuǎn)基因煙草、矮牽牛、早熟禾、高羊茅、黑麥草、剪股穎、結(jié)縷草、狗牙根、苜蓿、沙打旺、百脈根、畫眉草、冰草后，在生長初期，取轉(zhuǎn)基因植株葉片并用SDS法提取植株的總DNA進行PCR鑒定，以合成的BcBCP1基因特異性引物BCP-cDNA-L5’-AGGATCCATGGGGGGACTCAAGGTTTTTGCT-3’BCP-cDNA-R5’-AAACACTTCAGCGAACAACATGCA-3’進行PCR擴增，可以得到約0.6Kb的條帶，說明BcBCP1基因已整合至轉(zhuǎn)基因植株的基因組。(見圖5轉(zhuǎn)基因煙草、矮牽牛、草坪草和牧草的PCR鑒定)轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA的制備(SDS法)1.稱取0.2g植物材料，液氮研磨，加入0.75ml提取緩沖液中，混勻；2.加40μl 20％SDS溶液使終濃度為1％，劇烈振蕩，混勻，65℃保溫15分鐘；3.加160μl 5M KAc，劇烈振蕩，混勻，冰浴20-30分鐘；4.4℃20000g離心10分鐘；5.取上清，加入2/3體積異丙醇，混勻，-20℃放置30-40分鐘；6.15000g離心10-15分鐘；7.沉淀干燥，溶解于100-200μl 50×TE緩沖液中，若不溶解，65℃加熱助溶；8.加入RNase A 37℃保溫15分鐘；9.苯酚/氯仿，苯酚/氯仿/異戊醇，各抽提一次；10.取上清，加入1/10體積3M NaAc，2體積無水乙醇；11.12000g離心10分鐘；12.70％乙醇洗滌；13.干燥，溶于TE緩沖液中，65℃加熱10分鐘助溶。
轉(zhuǎn)基因植株基因組RNA的制備(TRIzol法)1.每50-100mg組織中加入1mL TRIZOL，組織體積≤10％總體積；2.勻漿液混勻后，于15-30℃放置5分鐘，于12000g離心10分鐘去渣；
3.每1mL TRIZOL加入0.2mL氯仿，振蕩15秒，于15-30℃放置2-3分鐘；4.2-8℃，≤12000g離心15分鐘，分三層，上層無色水相約占總體積60％5.移出水相，每1mL初始TRIZOL加0.5mL異丙醇，于15-30℃放置10分鐘；2-8℃，≤12000g離心10分鐘，得膠狀RNA沉淀；6.用75％乙醇≥1mL，振蕩，于2-8℃≤7500g離心5分鐘；7.干燥，但不要過分干燥，否則難溶(部分溶解的RNA A260/280≤1.6)，加無菌水溶解，上下吹打，55-60℃保溫助溶。
Southern雜交(參見分子克隆)提取植物總DNA，取10μg用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI消化過夜，電泳檢測是否酶切完全，以3V/cm恒壓電泳4-6小時。
采用不對稱PCR法標(biāo)記探針。根據(jù)Boehringer Mannheim公司的PCR DIG探針合成試劑盒進行如下操作50μL反應(yīng)體系中加入5μl 10×PCR buffer，5μl 10×PCR DIG mix，50pmol上游引物，5pmol下游引物，0.75μl酶混合物，100pg模板DNA，同時用未標(biāo)記DIG的dNTP作對照反應(yīng)。反應(yīng)條件根據(jù)不同的模板稍有變動。反應(yīng)結(jié)束后電泳檢測標(biāo)記效率，標(biāo)記后的探針應(yīng)比沒有標(biāo)記的產(chǎn)物分子量大，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> Northern雜交(參見分子克隆)實施例7轉(zhuǎn)基因植株的模擬干旱處理及葉片質(zhì)膜透性測定轉(zhuǎn)基因植株被鑒定后，通過無性繁殖獲得大量的無菌苗，在MS培養(yǎng)基上生根后，移至Hogland營養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。植株成活后選取生長一致的苗(5-7葉期)，進行PEG8000模擬干旱處理。在Hogland營養(yǎng)液中每天加入5％的PEG8000，直至PEG8000的濃度達到15％。處理前和處理48小時后分別用打孔器從葉片中打取小圓片測定葉片質(zhì)膜透性。
進行PEG6000的模擬干旱處理以每天遞增5％的速度在Hogland營養(yǎng)液中加入PEG6000，直至PEG6000的濃度達到10％。處理前、處理5天、10天后，對每個株系植株第3-5位展開葉，用便攜式CO2氣體分析儀(C1-301 CO2gasanalyzer，USA)測定凈光合速率，每處理重復(fù)3次。
實施例8轉(zhuǎn)基因植株的鹽脅迫處理及葉片質(zhì)膜透性、葉片葉綠素含量的測定轉(zhuǎn)基因植株獲得無性繁殖的無菌苗后，移至Hogland營養(yǎng)液中培養(yǎng)成活后選取生長一致的苗(5-7葉期)，進行NaCL脅迫處理。在Hogland營養(yǎng)液中以每天遞增25mM的速度加入NaCL，直至NaCL的濃度達到125mM。處理前及處理后每隔3天用打孔器從第3-5位葉片中打取小圓片測定葉片質(zhì)膜透性。處理20天后從第3-5位葉避開葉脈打取小圓片5片，放入研缽中，加MgCO3少許，加80％的丙酮，勻漿，定容至10mL。3000rpm離心10min。取上清，測定470、646.8、663.2、750nm處的吸光值，計算葉綠素含量。
實施例9轉(zhuǎn)基因植株的高溫脅迫處理選取長勢一致的各個轉(zhuǎn)基因株系的無菌苗，放入培養(yǎng)箱中，使培養(yǎng)箱的溫度緩慢上升至37℃，觀察植株的表現(xiàn)，每個轉(zhuǎn)基因株系選三個植株進行處理。處理10天后，未轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出明顯差異，未轉(zhuǎn)基因植株生長點壞死，葉片失綠白化，而轉(zhuǎn)基因植株基本上沒有明顯變化。
六、專利菌種說明此專利涉及的菌種已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，單位地址北京市中關(guān)村北一條街13號，郵編100080，該微生物分類名稱為大腸埃希氏菌(Escherichia coli DH5α)，保藏代號為BcBCP1，保藏編號為CGMCC 1380，保藏日期為2005年5月28日。
總之，本發(fā)明克隆了一個新的編碼區(qū)為606bp，編碼201個氨基酸的干旱相關(guān)藍銅蛋白類似基因BcBCP1，并且利用此基因構(gòu)建了植物表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)和基因槍法遺傳轉(zhuǎn)化獲得了耐旱、耐鹽轉(zhuǎn)基因植物。PCR檢測和Southern檢測證明該基因整合到轉(zhuǎn)基因植株基因組中，Northern檢測證明該基因能在植物中正常表達，模擬干旱、高鹽、高溫、低溫脅迫處理實驗和生理指標(biāo)的測定均證明轉(zhuǎn)基因株系比對照顯著提高了耐旱、耐鹽、耐高溫、低溫脅迫性能，轉(zhuǎn)基因植株T1代種子在模擬干旱條件下的萌發(fā)實驗更加證明了轉(zhuǎn)BcBCP1基因植株耐旱性能的提高。
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序列表<110>林忠平<120>厚葉旋蒴苣苔BcBCP1基因在培育耐旱耐鹽植物中的應(yīng)用<160>1<210>1<211>848<212>DNA<213>厚葉旋蒴苣苔(Boea crassifolia)<220>
<221>5’UTP<222>(1)...(50)<220>
<221>CDS<222>(51)...(656)<220>
<221>3’UTP<222>(657)...(848)<400>1acgagaaaag attgacaaac tatttttgga gagagaaaga aagctgaaa50atg ggg gga ctc aag gtt ttt gct tcg gtg ctg ttt ctt gta gcc gtt gct gta aag ggg 110Met Gly Gly Leu Lys Val Phe Ala Ser Val Leu Phe Leu Val Ala Val Cys Val Ser Gly15 10 5 20ctg gaa cag ctg gtt tca gcc gag acc cac cat cat gtt ggt gga gaa gaa ggt tgg aac 170Leu Glu Gln Leu Val Ser Ala Glu Thr His His His Val Gly Gly Glu Glu Gly Trp Asn25 30 35 40tcc gct tcc aac atc tcc tcg tgg ctg tcg ggt cgg gtt ttc agg gtt gga gac aag ttg 230Ser Ala Ser Asn Ile Ser Ser Trp Leu Ser Gly Arg Val Phe Arg Val Gly Asp Lys Leu45 50 55 60agg gtt tag cgt ccc ggc aac agc gga ctc cat tgt gga gct tca gag cct gga gga gct 290Gly Phe Ser Val Pro Ala Thr Ala Asp Ser Ile Val Glu Leu Gln Ser Leu Glu Glu Leu65 70 75 80agc aac atg tga tct gcg aaa ccc cat cag aat gta tgc tga tgg atc gaa cca cgt tac 350Ala Thr Cys Asp Leu Arg Asn Pro Ile Arg Met Tyr Ala Asp Gly Ser Asn His Val Thr85 90 95 100cct gga taa aga ggg gac tag gta ttt cag cag cgg gaa cct gga aag ctg caa gaa cgg 410Leu Asp Lys Glu Gly Thr Arg Tyr Phe Ser Ser Gly Asn Leu Glu Ser Cys Lys Asn Gly105 110 115 120gat gaa gct acc tgt gac cgt gca gaa tcg tca tga tga aga caa gcc tta ccg ccc tga 470Met Lys Leu Pro Val Thr Val Gln Asn Arg His Asp Glu Asp Lys Pro Tyr Arg Pro Asp125 130 135 140tcc acc agt gga gcc tta ccc tca tca cca tga tga aga cga gcc tta ccg ccc tga tcc 530Pro Pro Val Glu Pro Tyr Pro His His His Asp Glu Asp Glu Pro Tyr Arg Pro Asp Pro145 150 155 160Acc agt gga gcc tta ccc tca tcc ccc gcc tac aac tcc gca tcc cta tcc agc tgc agc 590Pro Val Glu Pro Tyr Pro His Pro Pro Pro Thr Thr Pro His Pro Tyr Pro Ala Ala Ala165 170 175 180cac agc ttt gaa tgt gtt ttt gtc cgt ggt gtt tgc tgg gct gtt cct ttc gtg tat tgg 650Thr Ala Leu Asn Val Phe Leu Ser Val Val Phe Ala Gly Leu Phe Leu Ser Cys Ile Gly185 190 195 200cat gta gatttgtttt tctaatatat tatatgcatg ttgttcgctg aagtgttttt agta 710Met *201ctatcagtat ccatcccctg tgtctgataa agcaactctt gtcttgttct tctgtttc 770taatgtcatg tttggatgtt ggaagctctt cagatgcact actaaataaa atgctgcttg 830gccattcaaa aaaaaaa 848
權(quán)利要求
1.從厚葉旋蒴苣苔中克隆的編碼區(qū)為606bp的干旱相關(guān)的藍銅蛋白類似基因BcBCP1，該基因的特征在于該基因編碼一條由201個氨基酸組成的多肽，在氨基末端具有一個信號肽，中部具有一個Cu2+結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，羧基末端含有一個植物細胞壁伸展蛋白所特有的PPR結(jié)構(gòu)，具有典型的小分子量的藍銅蛋白的結(jié)構(gòu)特征，BcBcp1基因在GenBank同源比較中發(fā)現(xiàn)，它與I型銅蛋白中的質(zhì)體藍素(Plastocyanin，Pc)的同源性最高。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干旱相關(guān)的藍銅蛋白類似基因BcBCP1基因的應(yīng)用，其特征在于將該基因用于構(gòu)建植物表達載體，并通過植物轉(zhuǎn)基因方法獲得具有耐旱、耐鹽、耐高溫、耐低溫效果的轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)基因寄主植物為煙草、矮牽牛、早熟禾、高羊茅、黑麥草、紫羊茅、剪股穎、結(jié)縷草、狗牙根、苜蓿、沙打旺、百脈根、畫眉草和冰草中的一種。
3.一種植物表達載體，其特征在于它含有權(quán)利要求1所述的干旱相關(guān)的藍銅蛋白類似基因BcBCP1。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物表達載體，其特征在于該植物表達載體具有圖1所述p3300-BcBCP1的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物表達載體，其特征在于該植物表達載體具有圖2所述pAHC-BcBCP1的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物表達載體，其特征在于該植物表達載體具有圖3所述pBcDh2-BcBCP1的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有p3300-BcBCP1質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的植物表達載體，其特征在于驅(qū)動BcBCP1基因的啟動子為CaMV 35S，終止子為Tnos，篩選標(biāo)記為Bar基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的具有pAHC-BcBCP1質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的植物表達載體，其特征在于驅(qū)動BcBCP1基因的啟動子為Ubiquitin，終止子為Tnos，篩選標(biāo)記為Bar基因。目的基因BcBCP1和篩選標(biāo)記基因Bar兩側(cè)有左邊界序列和右邊界序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的具有pBcDh2-BcBCP1質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的植物表達載體，其特征在于驅(qū)動BCBCP1基因的啟動子為BcDh2，終止子為Tnos，篩選標(biāo)記為Bar基因。目的基因BcBCP1和篩選標(biāo)記基因Bar兩側(cè)有左邊界序列和右邊界序列。
10.一種生產(chǎn)耐旱、耐鹽、耐高溫、耐低溫植物的方法，其特征在于將權(quán)利要求1所述的干旱相關(guān)的藍銅蛋白類似基因BcBCP1通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或基因槍法轉(zhuǎn)入植物中，在通過PCR鑒定、Southern雜交檢測和模擬干旱、鹽脅迫、高溫、低溫條件下生理指標(biāo)的測定篩選出耐旱、耐鹽、耐高溫、耐低溫的轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種旋蒴苣苔屬的606bp的干旱相關(guān)的藍銅蛋白類似基因(BcBCP1)及其應(yīng)用，該基因編碼201個氨基酸組成的多肽，在氨基末端具有質(zhì)膜導(dǎo)向信號肽，中部具有Cu
文檔編號C12N15/29GK1710076SQ200510073499
公開日2005年12月21日 申請日期2005年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月1日
發(fā)明者林忠平, 吳韓英, 胡鳶雷, 申業(yè) 申請人:林忠平