專(zhuān)利名稱(chēng)：白細(xì)胞介素10的編碼基因及其在大腸桿菌中的表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因及其表達(dá)方法，特別是涉及一個(gè)白細(xì)胞介素10基因及其在大腸桿菌中的表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
基因工程的最終目的是在一個(gè)合適的系統(tǒng)中，使外源基因高效表達(dá)，從而生產(chǎn)出具有重要價(jià)值的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。大腸桿菌系統(tǒng)因具有如下特點(diǎn)1)遺傳背景清楚，可供選擇的功能載體和宿主菌較多；2)生產(chǎn)成本低廉，可以發(fā)酵方式快速、高效合成基因產(chǎn)物；3)表達(dá)量高，表達(dá)的目的蛋白可超過(guò)菌體蛋白總量的30％以上，現(xiàn)已成為目前應(yīng)用最為廣泛的表達(dá)系統(tǒng)。在大腸桿菌中表達(dá)外源基因的方式分為融合型表達(dá)和非融合型表達(dá)。表達(dá)非融合型蛋白的優(yōu)點(diǎn)在于它具有非常近似于真核生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，因此表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)功能也就更接近于生物體內(nèi)的天然蛋白質(zhì)。
如何使外源基因在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)是基因工程重組DNA技術(shù)的重點(diǎn)。從翻譯水平提高外源基因的表達(dá)策略主要有兩種方法一、優(yōu)化密碼子的使用；二、翻譯起始區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改造。盡管大腸桿菌有超強(qiáng)的產(chǎn)生大量蛋白的能力，但由于重組外源基因的信使核糖核酸(mRNA)中的密碼子與大腸桿菌宿主細(xì)胞使用的密碼子不同而使蛋白的表達(dá)受到限制，一些稀有密碼子的表達(dá)常常會(huì)導(dǎo)致翻譯的中止或錯(cuò)誤。1997年歐洲生物化學(xué)雜志和2000年美國(guó)的生物化學(xué)雜志分別報(bào)道了通過(guò)將外源基因中的稀有密碼子優(yōu)化為大腸桿菌偏愛(ài)密碼子而成功表達(dá)了單純皰疹病毒1蛋白酶(herpes simplex virus 1 protease)(H.Apeler，Eur.J.Biochem.247(3)，891-895)和人磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(human phosphatidylcholine transfer protein)(L.Feng，Biochemistry 39 15399-15409)。又有研究表明將結(jié)核桿菌Ag85B基因中的5個(gè)密碼子替換為大腸桿菌偏愛(ài)密碼子后重組蛋白的產(chǎn)量增加了54倍(Infect Immun.2000Jan；68(1)233-8.)。1985年英國(guó)核酸研究雜志報(bào)道改變5’端的二級(jí)結(jié)構(gòu)使其在起始密碼子附近形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開(kāi)可以使人胰島素樣生長(zhǎng)因子的表達(dá)量提高24-46倍。(G.Buell，Nucleic Acids Res.13(6)1923-1928)。
外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)水平受啟動(dòng)子強(qiáng)度、載體性質(zhì)、表達(dá)類(lèi)型、mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、稀有密碼子、終止密碼等多種因素影響。通常選用的高效表達(dá)載體已具有強(qiáng)的啟動(dòng)子、強(qiáng)的SD序列及合適的SD-AUG間隔，因此對(duì)于某一特定基因在大腸桿菌中的表達(dá)應(yīng)主要從密碼子的使用和翻譯起始區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改造來(lái)進(jìn)行優(yōu)化。在用無(wú)細(xì)胞的大腸桿菌核糖體提取物進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證實(shí)基因中稀有密碼子的存在會(huì)導(dǎo)致核糖體在翻譯過(guò)程中的停頓，特別是稀有密碼子精氨酸(AGG，AGA，CGG，CGA)、亮氨酸(CUA)、異亮氨酸(AUA)、脯氨酸(CCC)常常導(dǎo)致讀碼錯(cuò)誤并最終影響翻譯的正常進(jìn)行。而李伍舉等(李伍舉等，病毒學(xué)報(bào)1997，13(2)126-133)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，外源基因5’端-30～39區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能與表達(dá)水平具有顯著的相關(guān)性。翻譯起始區(qū)存在著穩(wěn)定、復(fù)雜的莖環(huán)結(jié)構(gòu)將會(huì)阻礙核糖體與核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的結(jié)合，影響蛋白質(zhì)的翻譯表達(dá)。
白細(xì)胞介素是一類(lèi)介導(dǎo)白細(xì)胞間相互作用的細(xì)胞因子，目前已發(fā)現(xiàn)二十多種。白細(xì)胞介素10最初是Fiorentino在1989年發(fā)現(xiàn)由鼠輔助性T細(xì)胞Th2亞型細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，能抑制Th1亞型細(xì)胞分泌的腫瘤壞死因子γ(tumor necrosis factor γ，TNF-γ)等細(xì)胞因子，所以最初被命名為細(xì)胞因子合成抑制因子(cytokine synthesisinhibitory factor，CSIF)。白細(xì)胞介素10被認(rèn)為是體內(nèi)最重要的抗炎細(xì)胞因子，對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控起非常重要的作用。由于具有抗炎作用和免疫抑制效應(yīng)，白細(xì)胞介素10潛在的臨床應(yīng)用前景得到了關(guān)注。重組人白細(xì)胞介素10對(duì)于急性肺損傷、炎性腸病、實(shí)驗(yàn)性膿毒敗血癥休克、銀屑病、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、丙型肝炎、再灌注損傷等疾病的治療作用已開(kāi)展了廣泛的研究，并取得了一定的進(jìn)展，其中白細(xì)胞介素10在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和炎性腸病中的應(yīng)用已進(jìn)入三期臨床試驗(yàn)，對(duì)銀屑病和炎性腸病中的潰瘍性結(jié)腸炎的治療已進(jìn)入二期臨床試驗(yàn)，對(duì)丙型肝炎、多發(fā)性硬化和再灌注損傷的治療正在進(jìn)行一期臨床試驗(yàn)。
目前，國(guó)內(nèi)外的人白細(xì)胞介素10基因工程產(chǎn)品主要是由大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的，但僅通過(guò)單純的密碼子的優(yōu)化，即使用以替換白細(xì)胞介素10基因序列中的稀有堿基為大腸桿菌偏愛(ài)密碼子而增加人白細(xì)胞介素10的表達(dá)量，或者以融合蛋白的形式來(lái)表達(dá)，但這些方法都難以實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。目前，其表達(dá)產(chǎn)率一般在10mg/L以下。因此，人白細(xì)胞介素10至今都是一種難以獲得低成本、高表達(dá)的基因工程產(chǎn)品，致使重組人白細(xì)胞介素10的市場(chǎng)價(jià)格仍高達(dá)30-100美元/微克。鑒于人白細(xì)胞介素10潛在而巨大的市場(chǎng)應(yīng)用前景，開(kāi)發(fā)一種促進(jìn)白細(xì)胞介素10在大腸桿菌系統(tǒng)高效，低成本表達(dá)的方法將極大地促進(jìn)這一細(xì)胞因子藥物在臨床中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)白細(xì)胞介素10基因及其在大腸桿菌中的表達(dá)的方法。
本發(fā)明所提供的白細(xì)胞介素10基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；
2)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1或SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
具有序列表中SEQ ID №1 DNA序列的白細(xì)胞介素10基因，命名為ILRP，由486個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-486位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID№3的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)；具有序列表中SEQ ID №2 DNA序列的白細(xì)胞介素10基因，命名為ILRP5’，由486個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-486位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增ILRP或ILRP5’中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種白細(xì)胞介素10的表達(dá)方法。
本發(fā)明所提供的白細(xì)胞介素10的表達(dá)方法，是構(gòu)建含有白細(xì)胞介素10基因的大腸桿菌表達(dá)載體，將構(gòu)建的大腸桿菌表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中，獲得重組大腸桿菌，發(fā)酵重組大腸桿菌得到白細(xì)胞介素10。
用于構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種可在大腸桿菌中表達(dá)外源基因的原核表達(dá)載體，如pCRT7/CT-TOPO、pET101/D-TOPO、pQE30或pBV220，優(yōu)選為含有T7啟動(dòng)子的原核表達(dá)載體，如pCRT7/CT-TOPO或pET101/D-TOPO，尤其優(yōu)選為pCRT7/CT-TOPO。
以pCRT7/CT-TOPO為出發(fā)載體構(gòu)建的重組大腸桿菌表達(dá)載體為pCRT7/CT-TOPO/ILRP或pCRT7/CT-TOPO/ILRP5’。
上述重組大腸桿菌表達(dá)載體均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。
所述大腸桿菌為適于蛋白表達(dá)的大腸桿菌菌株，如E.coli BL21-Gold(DE3)、E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21 Codon plus-RP、E.coli BL21 Codon plus-RIL或E.coli DH5α。
將大腸桿菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法可為生物工程領(lǐng)域中常用的轉(zhuǎn)化方法，如熱激法、電轉(zhuǎn)化法、接合轉(zhuǎn)化法PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法等。
發(fā)酵重組大腸桿菌時(shí)需加入IPTG誘導(dǎo)劑，所加入IPTG的濃度為0.8-1.2mM，誘導(dǎo)溫度為30-37℃，誘導(dǎo)時(shí)間為2-4小時(shí)。
本發(fā)明提供了一種提高白細(xì)胞介素10基因在大腸桿菌非融合表達(dá)的方法，通過(guò)將白細(xì)胞介素10基因中編碼精氨酸(AGG，AGA，CGG，CGA)、亮氨酸(CUA)、異亮氨酸(AUA)和脯氨酸(CCC)的稀有密碼子及終止密碼子(TGA)替換為大腸桿菌偏愛(ài)密碼子的同時(shí)，將核糖體結(jié)合位點(diǎn)區(qū)至5’端編碼區(qū)的前50個(gè)堿基的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化改造而獲得改型白細(xì)胞介素10。經(jīng)過(guò)改型后的白細(xì)胞介素10可以在大腸桿菌中得到高效表達(dá)，表達(dá)率可達(dá)20-30mg/L。本發(fā)明主要應(yīng)用于白細(xì)胞介素10基因在大腸桿菌系統(tǒng)中的表達(dá)。本發(fā)明的特征在于本發(fā)明所提供的經(jīng)密碼子優(yōu)化的白細(xì)胞介素10基因，是將從翻譯水平提高外源基因表達(dá)的兩種主要方法，即優(yōu)化密碼子的使用和翻譯起始區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改造結(jié)合使用的產(chǎn)物，但這種結(jié)合并非是簡(jiǎn)單的相加，而是在前兩者基礎(chǔ)上通過(guò)改造及簡(jiǎn)化而形成一種新的技術(shù)方案。首先將原有白細(xì)胞介素10基因中的稀有密碼子，尤其是精氨酸(AGG，AGA，CGG，CGA)、亮氨酸(CUA)、異亮氨酸(AUA)、脯氨酸(CCC)替換為大腸桿菌偏愛(ài)密碼子作為確保蛋白翻譯的基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上利用計(jì)算機(jī)軟件模擬四種密碼子經(jīng)優(yōu)化的白細(xì)胞介素10基因5’編碼區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并在不改變氨基酸序列的前提下根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性來(lái)優(yōu)化5’編碼區(qū)前40-60個(gè)堿基的二級(jí)結(jié)構(gòu)，減少翻譯起始區(qū)mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，降低翻譯起始區(qū)mRNA的穩(wěn)定性，取消其對(duì)核糖體結(jié)合位點(diǎn)的空間位阻效應(yīng)，利于蛋白質(zhì)的表達(dá)。從而可使翻譯效率提高又可以避免稀有密碼子大量存在而導(dǎo)致的錯(cuò)誤翻譯，使難以在大腸桿菌表達(dá)的白細(xì)胞介素10基因得到高效非融合表達(dá)。選擇對(duì)5’端編碼區(qū)前40-60個(gè)堿基中的密碼子進(jìn)行優(yōu)化改造的策略能使翻譯起始區(qū)mRNA的穩(wěn)定性降低，但不影響mRNA整體的穩(wěn)定性。只選擇前40-60個(gè)堿基中的密碼子進(jìn)行優(yōu)化還能減少改造基因的難度和復(fù)雜性。本發(fā)明為高效、大量、低成本生產(chǎn)白細(xì)胞介素10提供了一種有效方法，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。


圖1為從核糖體結(jié)合位點(diǎn)至基因5’編碼序列中前50個(gè)堿基的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬2為從核糖體結(jié)合位點(diǎn)至基因5’編碼序列中前50個(gè)堿基的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬3為含有經(jīng)改型的白細(xì)胞介素10基因的重組表達(dá)載體的物理圖譜圖4為改型的人白細(xì)胞介素10基因在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)后的SDS-PAGE電泳圖譜圖5為三種人白細(xì)胞介素10基因表達(dá)產(chǎn)物的Western Blot免疫印跡6為ELISA法檢測(cè)ILRP、ILRP5’與白細(xì)胞介素10標(biāo)準(zhǔn)品抑制經(jīng)LPS刺激后的巨噬細(xì)胞分泌IL-6的功能的結(jié)果
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。所用引物及核苷酸序列均由上海生工合成。
實(shí)施例1、人白細(xì)胞介素10改型基因的獲得1、根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性，通過(guò)引物重疊延伸法，在不改變氨基酸序列的前提下將野生型的人白細(xì)胞介素10基因(命名為wt，序列表中的SEQ ID №4)中異亮氨酸I(AUA)、亮氨酸L(CUA)、精氨酸R(AGG，AGA，CGG，CGA)、脯氨酸P(CCC)的密碼子以及終止密碼子(TGA)替換為大腸桿菌的偏愛(ài)密碼子，得到的人白細(xì)胞介素10基因序列，它具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列，由486個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-486位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，將該經(jīng)過(guò)改型的人白細(xì)胞介素10基因命名為ILRP，用核酸分析軟件(如mfold 3.1版)模擬其核糖體結(jié)合位點(diǎn)區(qū)至5’端編碼區(qū)前50個(gè)堿基的mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)并作自由能分析，結(jié)果如圖1所示，自由能為-15.62kJ·mol-1(原先為-18.7kJ·mol-1)，表明ILRP密碼子的優(yōu)化對(duì)翻譯起始區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性無(wú)影響。
2、根據(jù)步驟1所模擬的ILRP的核糖體結(jié)合位點(diǎn)區(qū)至5’端編碼區(qū)前50個(gè)堿基的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和自由能分析結(jié)果設(shè)計(jì)引物，按照密碼子的簡(jiǎn)并性通過(guò)引物重疊延伸法使其核糖體結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域至5’端編碼區(qū)前40-60個(gè)堿基中的密碼子得到無(wú)義誘變，將在40-60個(gè)堿基中的稀有密碼子部分替換為大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，從而使其在不改變氨基酸序列的前提下減少二級(jí)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，提高自由能，降低mRNA的穩(wěn)定性，利于核糖體與核糖體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。將在ILRP基礎(chǔ)上用上述方法進(jìn)行5’端編碼區(qū)改造后獲得的人白細(xì)胞介素10基因命名為ILRP5’，該基因具有序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列，由486個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-486位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。用核酸分析軟件(如mfold 3.1版)模擬其核糖體結(jié)合位點(diǎn)區(qū)至5’端編碼區(qū)前50個(gè)堿基的mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)并作自由能分析，結(jié)果如圖2所示，經(jīng)改造后ILRP5’的翻譯起始區(qū)mRNA的自由能由改造前的ΔG＝-15.62kJ·mol-1，升高到ΔG＝-4.27kJ·mol-1。
實(shí)施例2、含有人白細(xì)胞介素10改型基因的重組表達(dá)載體的構(gòu)建選用Invitrogen公司的pCRT7 TOPOTA表達(dá)試劑盒并參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行含有人白細(xì)胞介素10改型基因的重組表達(dá)載體的構(gòu)建，具體方法為1、人白細(xì)胞介素10改型基因的擴(kuò)增以實(shí)施例1獲得的人白細(xì)胞介素10改型基因ILRP為模版，在引物5和引物6(引物5ATGAGCCCAGGCCAGGGCAC，引物6TTAGTTTCGGATCTTCATTG)的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以實(shí)施例1獲得的人白細(xì)胞介素10改型基因ILRP5’為模版，在引物6和引物7(引物7ATGAGTCCAGGACAAGGTAC)的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上述PCR擴(kuò)增的條件為先95℃3分鐘；再94℃30秒，58℃45秒，72℃45秒，共33個(gè)循環(huán)；最后72℃7分鐘。
2、連接將步驟1獲得兩種PCR產(chǎn)物分別與載體pCRT7/CT-TOPO連接，方法為PCR反應(yīng)結(jié)束后，取3微升PCR產(chǎn)物，加入1微升的鹽溶液(試劑盒自帶)，用三蒸水將反應(yīng)體系補(bǔ)至5微升，再加入1微升的載體pCRT7/CT-TOPO(美國(guó)，Invitrogen公司)后輕輕混勻，室溫22-23℃下孵育5分鐘，將克隆反應(yīng)物置于冰上，轉(zhuǎn)化備用。
3、轉(zhuǎn)化上述兩種克隆反應(yīng)物分別進(jìn)行轉(zhuǎn)化，方法為取步驟2獲得克隆反應(yīng)物2微升，加入30微升的One Shot TOP10F’感受態(tài)細(xì)胞(美國(guó)，Invitrogen公司)(化學(xué)法)中，輕輕混勻后冰浴20分鐘；再在42℃水中靜置60秒，熱休克后立即置于冰上；4分鐘后加入室溫的SOC培養(yǎng)基(美國(guó)，Invitrogen公司)250微升，在37℃、200轉(zhuǎn)/分鐘空氣浴搖床上水平震蕩40分鐘；取30微升轉(zhuǎn)化物涂于含100微克/毫升氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板上，37℃培養(yǎng)12-24小時(shí)。
4、質(zhì)粒的提取及鑒定長(zhǎng)出菌落后，按下述方法提取上述兩種轉(zhuǎn)化物的質(zhì)粒，方法為挑取10-15個(gè)單菌落分別接種于含75微克/毫升氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-24小時(shí)。用維特潔生物技術(shù)公司的超純質(zhì)粒DNA純化試劑盒分離質(zhì)粒DNA，步驟如下1)用2毫升Microfuge Tube(試劑盒自帶)收集3毫升步驟3的培養(yǎng)菌液，12000g離心30秒，棄盡上清。
2)用250微升已加入RNase A1的緩沖液S1(試劑盒自帶)充分懸浮細(xì)菌沉淀。
3)加入250微升緩沖液S2(試劑盒自帶)，溫和但充分地上下翻轉(zhuǎn)混合4-6次，此步驟不宜超過(guò)5分鐘。
4)加入450微升4℃預(yù)冷的緩沖液N(試劑盒白帶)，上下翻轉(zhuǎn)，使溶液形成混濁的乳濁液，12000g離心1分鐘。
5)吸棄藍(lán)色上相，將無(wú)色下相轉(zhuǎn)移至Filter(置于1.5毫升離心管中)，12000g離心1分鐘，棄Filter，在濾液中加入450微升緩沖液B(試劑盒自帶)，混合均勻。
6)將DNA-prep Tube(試劑盒自帶)置于2毫升Microfuge Tube中，將步驟中的混合液加DNA-prep Tube棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2毫升Microfuge Tube中，加入500微升緩沖液W1，1000g離心1分鐘。
7)棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2毫升Microfuge Tube中，加入700微升已添加無(wú)水乙醇的緩沖液W2(試劑盒自帶)，1000g離心1分鐘，以同樣的方法再用700微升緩沖液W2洗滌一次。
8)將DNA-prep Tube置于1.5毫升離心管中，12000g離心1分鐘。
9)將DNA-prep Tube置于另一潔凈的1.5毫升離心管中，在silia膜(試劑盒自帶)中央加60微升去離子水，室溫靜置1分鐘，12000g離心1分鐘洗脫DNA，得到的沉淀即為質(zhì)粒。
5、ILRP和ILRP5’的重組表達(dá)載體的鑒定1、用限制性?xún)?nèi)切酶XbaI和HindIII對(duì)步驟4提取的ILRP的重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化物的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，出現(xiàn)2649bp和539bp條帶的可初步鑒定為陽(yáng)性克隆重組子，再以其為模板，在引物5和引物6的引導(dǎo)下，進(jìn)行進(jìn)一步的PCR鑒定，可擴(kuò)增出486bp條帶的為陽(yáng)性克隆重組子，最后對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，表明獲得了插入位置及序列正確的含ILRP的重組表達(dá)載體，命名為pCRT7/CT-TOPO/ILRP，pCRT7/CT-TOPO的物理圖譜及ILRP在載體中的位置如圖3所示。
2、用限制性?xún)?nèi)切酶XbaI和HindIII對(duì)步驟4提取的ILRP5’的重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化物的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，出現(xiàn)2649bp和539bp條帶的可初步鑒定為陽(yáng)性克隆重組子，再以其為模板，在引物7和引物6的引導(dǎo)下，進(jìn)行進(jìn)一步的PCR鑒定，可擴(kuò)增出486bp條帶的為陽(yáng)性克隆重組子，最后對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，表明獲得了插入位置及序列正確的含ILRP5’的重組表達(dá)載體，命名為pCRT7/CT-TOPO/ILRP5’，pCRT7/CT-TOPO的物理圖譜及ILRP5’在載體中的位置如圖3所示。
實(shí)施例3、重組人白細(xì)胞介素10的表達(dá)及檢測(cè)1、重組人白細(xì)胞介素10的表達(dá)參照Stratagene公司的大腸桿菌BL21-Gold(DE3)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化說(shuō)明書(shū)所提供的方法，將質(zhì)粒pCRT7/CT-TOPO/ILRP和pCRT7/CT-TOPO/ILRP5’分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-Gold(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，37℃孵育12-24小時(shí)，經(jīng)篩選得到分別含有pCRT7/CT-TOPO/ILRP和pCRT7/CT-TOPO/ILRP5’的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子。利用IPTG誘導(dǎo)兩種重組人白細(xì)胞介素10進(jìn)行表達(dá)，具體過(guò)程包括以下步驟1)挑取陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子接種至1毫升含有50微克氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，220-250轉(zhuǎn)/分、37℃震蕩培養(yǎng)12-24小時(shí)。
2)吸取50微升培養(yǎng)物加至1毫升LB培養(yǎng)基中，220-250轉(zhuǎn)/分37℃震蕩培養(yǎng)2小時(shí)。
3)吸取100微升培養(yǎng)物置于1.5毫升離心管中，置于冰上，SDS-PAGE電泳分析備用。
4)其余的培養(yǎng)物中加入終濃度為1mM的IPTG，220-250轉(zhuǎn)/分、37℃震蕩培養(yǎng)2-4小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束后立即置于冰上。
2、SDS-PAGE電泳檢測(cè)及Western Blot鑒定1、SDS-PAGE電泳檢測(cè)吸取20微升經(jīng)誘導(dǎo)后的培養(yǎng)物加至1.5毫升潔凈的離心管中，加入20微升2×SDS上樣緩沖液。以誘導(dǎo)前的培養(yǎng)物為對(duì)照，并用同樣方法處理。95-100℃煮沸5分鐘后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖4所示(泳道M為低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為未改型人白細(xì)胞介素10基因wt的表達(dá)產(chǎn)物，泳道2為四種密碼子經(jīng)優(yōu)化的人白細(xì)胞介素10改型基因ILRP的表達(dá)產(chǎn)物，泳道3為四種密碼子優(yōu)化同時(shí)進(jìn)行5’編碼序列中前50個(gè)堿基的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)改造的人白細(xì)胞介素10改型基因ILRP5’的表達(dá)產(chǎn)物)，用Glyko BandScan 4.5軟件分析經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的重組人白細(xì)胞介素10的表達(dá)條帶。由未改造的野生型人白細(xì)胞介素10基因wt表達(dá)的蛋白條帶占全菌總蛋白的5.1％。異亮氨酸I、亮氨酸L、精氨酸R、脯氨酸P的密碼子以及終止密碼子(TGA)經(jīng)優(yōu)化后的人白細(xì)胞介素10改型基因ILRP達(dá)的蛋白條帶占全菌總蛋白的5.4％。在ILRP基礎(chǔ)上進(jìn)行的5’端編碼區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)化后獲得的基因ILRP5’的蛋白表達(dá)量占全菌總蛋白的31.3％，表達(dá)量是未經(jīng)優(yōu)化的人白細(xì)胞介素10基因表達(dá)量的6倍。
2、Western Blot鑒定按常規(guī)方法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物作進(jìn)一步的Western Blot鑒定，濃縮膠選用5％聚丙烯胺凝膠，分離膠選用15％聚丙烯胺凝膠，人白細(xì)胞介素10抗體選用Santa Cruz公司的多克隆抗體，結(jié)果如圖5所示(泳道1為人白細(xì)胞介素10，泳道2為ILRP，泳道3為ILRP5’)，表明經(jīng)改型的人白細(xì)胞介素10基因的蛋白表達(dá)量得到顯著提高。
3、活性鑒定對(duì)用上述方法表達(dá)得到的ILRP和ILRP5’進(jìn)行活性檢測(cè)，通過(guò)其抑制經(jīng)LPS刺激后的巨噬細(xì)胞分泌IL-6的功能確定其活性高低，白細(xì)胞介素10(IL-10)標(biāo)準(zhǔn)品為參照。具體方法如下1)在24孔板的每孔中加入0.5毫升含10％馬血清以及終濃度均為100U的青霉素和鏈霉素的完全DMEM培養(yǎng)基。
2)將白細(xì)胞介素10標(biāo)準(zhǔn)品(UPSTATE公司)和按照常規(guī)方法復(fù)性后的樣品進(jìn)行倍比稀釋。
3)用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基洗滌PU5-1.8細(xì)胞3次，并重懸于完全DMEM培養(yǎng)基中，調(diào)細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL。每孔接種0.5毫升細(xì)胞懸液。
4)在37℃、5％CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。
5)每孔再加入10微克/毫升的LPS，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。
6)收集上清用ELISA法(IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)BenderMedsystems公司)檢測(cè)上清中IL-6的濃度。
結(jié)果如圖6所示，ILRP、ILRP5’與白細(xì)胞介素10標(biāo)準(zhǔn)品抑制經(jīng)LPS刺激后的巨噬細(xì)胞分泌IL-6的功能相當(dāng)，表明ILRP和ILRP5’的活性與白細(xì)胞介素10標(biāo)準(zhǔn)品活性相同。
序列表<160>4<210>1<211>486<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1atgagcccag gccagggcac ccagtctgag aacagctgca cccacttccc aggcaacctg 60cctaacatgc ttcgagatct ccgagatgcc ttcagccgag tgaagacttt ctttcaaatg120aaggatcagc tggacaactt gttgttaaag gagtccttgc tggaggactt taagggttac180ctgggttgcc aagccttgtc tgagatgatc cagttttacc tggaggaggt gatgccacaa240gctgagaacc aagacccaga catcaaggcg catgtgaact ccctggggga gaacctgaag300accctccggc tgcggctgcg gcgctgtcat cgatttcttc catgtgaaaa caagagcaag360gccgtggagc aggtgaagaa tgcctttaat aagctccaag agaaaggcat ctacaaagcc420atgagtgagt ttgacatctt catcaactac atcgaagcct acatgacaat gaagatccga480aactaa 486<210>2<211>486<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2
atgagtccag gacaaggtac acaatctgag aacagctgca cccacttccc aggcaacctg 60cctaacatgc ttcgagatct ccgagatgcc ttcagccgag tgaagacttt ctttcaaatg120aaggatcagc tggacaactt gttgttaaag gagtccttgc tggaggactt taagggttac180ctgggttgcc aagccttgtc tgagatgatc cagttttacc tggaggaggt gatgccacaa240gctgagaacc aagacccaga catcaaggcg catgtgaact ccctggggga gaacctgaag300accctccggc tgcggctgcg gcgctgtcat cgatttcttc catgtgaaaa caagagcaag360gccgtggagc aggtgaagaa tgcctttaat aagctccaag agaaaggcat ctacaaagcc420atgagtgagt ttgacatctt catcaactac atcgaagcct acatgacaat gaagatccga480aactaa 486<210>3<211>161<212>PRT<213>人屬人(Homo sapiens)<400>3Met Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe1 5 10 15Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser20 25 30Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu35 40 45Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln50 55 60Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln65 70 75 80Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly85 90 95Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe100 105 110Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala115 120 125
Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe130 135 140Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg145 150 155 160Asn<210>4<211>486<212>DNA<213>人屬人(Homo sapiens)<220>
<223>
<400>4atgagcccag gccagggcac ccagtctgag aacagctgca cccacttccc aggcaacctg 60cctaacatgc ttcgagatct ccgagatgcc ttcagcagag tgaagacttt ctttcaaatg120aaggatcagc tggacaactt gttgttaaag gagtccttgc tggaggactt taagggttac180ctgggttgcc aagccttgtc tgagatgatc cagttttacc tggaggaggt gatgccccaa240gctgagaacc aagacccaga catcaaggcg catgtgaact ccctggggga gaacctgaag300accctcaggc tgaggctacg gcgctgtcat cgatttcttc cctgtgaaaa caagagcaag360gccgtggagc aggtgaagaa tgcctttaat aagctccaag agaaaggcat ctacaaagcc420atgagtgagt ttgacatctt catcaactac atagaagcct acatgacaat gaagatacga480aactga 48權(quán)利要求
1.白細(xì)胞介素10基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1或SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白細(xì)胞介素10基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID №1的DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白細(xì)胞介素10基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
4.含有權(quán)利要求1或2或3所述基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌。
5.一種白細(xì)胞介素10的表達(dá)方法，是構(gòu)建含有序列表中SEQ ID №1或SEQ ID№2 DNA序列的大腸桿菌表達(dá)載體，將構(gòu)建的大腸桿菌表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中，獲得重組大腸桿菌，發(fā)酵重組大腸桿菌得到白細(xì)胞介素10。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述用于構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體的出發(fā)載體為pCRT7/CT-TOPO或pET101/D-TOPO。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述用于構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體的出發(fā)載體為pCRT7/CT-TOPO。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述構(gòu)建的重組大腸桿菌表達(dá)載體為pCRT7/CT-TOPO/ILRP或pCRT7/CT-TOPO/ILRP5’。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6或7或8所述的方法，其特征在于所述大腸桿菌為E.coliBL21-Gold(DE3)、E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21 Codon plus-RP、E.coli BL21 Codonplus-RIL或E.coli DH5α。
10.根據(jù)權(quán)利要求5或6或7或8所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵重組大腸桿菌時(shí)需加入IPTG誘導(dǎo)劑，所加入IPTG的濃度為0.5-2.0mM，誘導(dǎo)溫度為30-37℃，誘導(dǎo)時(shí)間為2-4小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種白細(xì)胞介素10基因及其在大腸桿菌中的表達(dá)方法。該基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1或SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。一種白細(xì)胞介素10的表達(dá)方法，是構(gòu)建含有序列表中SEQ ID №1或SEQ ID №2 DNA序列的大腸桿菌表達(dá)載體，將構(gòu)建的大腸桿菌表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中，獲得重組大腸桿菌，發(fā)酵重組大腸桿菌得到白細(xì)胞介素10。本發(fā)明為高效、大量、低成本生產(chǎn)白細(xì)胞介素10提供了一種有效方法，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/19GK1687415SQ20051007338
公開(kāi)日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月2日
發(fā)明者田志剛, 張慰慈, 肖衛(wèi)華, 魏海明 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)