專利名稱：一個旋蒴苣苔的抗旱、耐鹽相關(guān)基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因及其編碼蛋白與應(yīng)用，特別是涉及一個來源于旋蒴苣苔的抗旱、耐鹽相關(guān)基因及其編碼蛋白與其在培育抗旱、耐鹽性提高的植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物在干旱鹽害脅迫的條件下，除了引起代謝的變化以外，還可以激活體內(nèi)一些其它基因的表達，使植物的營養(yǎng)組織中產(chǎn)生新的蛋白積累。這些蛋白的累積可提高植物對不良環(huán)境的適應(yīng)能力，如LEA蛋白，就是一種受干旱鹽害誘導(dǎo)基因的編碼產(chǎn)物(俞嘉寧，山侖.LEA蛋白與植物的抗旱性生物工程進展2002，22(2)10-14)。LEA蛋白具有高度的親水性，在植物受干旱鹽害脅迫下可以將大量的水分子捕獲導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)，保護細(xì)胞中的生物大分子，維持細(xì)胞的特定結(jié)構(gòu)，提高植物對環(huán)境脅迫的耐性和抗性。目前已在很多植物中發(fā)現(xiàn)LEA蛋白，并根據(jù)這些的LEA蛋白的結(jié)構(gòu)特點將其分為5組，均與植物的抗旱、耐鹽密切相關(guān)(俞嘉寧，山侖.LEA蛋白與植物的抗旱性，生物工程進展，2002，22(2)10-14；Michael J Wise.LEAping to conclusionsAcomputational reanalysis of late embryogenesis abundant proteins and theirpossible roles.BMC Bioinformatics 2003，452；俞嘉寧，張勁松，山侖，陳受宜.小麥中兩個新的第三組LEA基因及酵母中功能分析2005，47(11)1372-1381)。該基因?qū)χ参锟鼓娣磻?yīng)的重要性及其在植物抗逆基因工程領(lǐng)域的應(yīng)用價值已被普遍關(guān)注。在我國雖然利用抗逆基因培育作物、林草等的抗逆品系已成為植物育種的主要思路，但擁有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的抗逆資源基因還十分缺少。因此深入了解該基因的作用機制，一方面可以為研究植物抗旱的生理生化機制提供理論基礎(chǔ)，另一方面，可以為培育抗逆植物品種提供擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗逆資源基因。
絕大多數(shù)植物(包括主要農(nóng)作物品種和模式植物)不能忍受嚴(yán)重的干旱和鹽脅迫。只有更蘇植物可以忍受極度干旱的條件，待水份充足時就能很快恢復(fù)正常的生命活動，因此是研究耐旱機制和提供耐旱基因的極好的植物資源。已知被子植物中的更蘇植物很少，且主要分布在南非、南美和澳大利亞。苦苣苔科植物旋蒴苣苔(Boeahygrometrica)是第一種在我國展開分子和生理水平系統(tǒng)研究的更蘇植物。該植物的葉片具有很強的耐旱復(fù)蘇能力，在室溫、相對空氣濕度均為0的條件下實施干旱脅迫72小時后，葉片相對含水量降至約3％，葉片皺縮至原葉面積的1/3以下，光合作用基本停止，只要重新給水，葉片就可以吸水伸展，并恢復(fù)成未處理前的葉片表觀狀態(tài)和生理狀態(tài)(包括光合作用的恢復(fù))(Deng X，Wang H，Hu Z，mRNA differential displayvisualized by silver staining tested on gene expression in resurrection plantBoea hygrometrica.Plant Moecular Biology Reporter 17279.1999；Deng X，Hu Z，Wang H，Wen X，Kuang T.A comparison of photosynthetic apparatus of thedetached leaves of the resurrection plant Boea hygrometrica with itsnon-tolerant relative Chirita heterotrichia in response to dehydration andrehydration.Plant Science.165851-861.2003)。利用該植物，已有多個抗旱相關(guān)基因被鑒定和克隆(未發(fā)表數(shù)據(jù))。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個來源于旋蒴苣苔的抗旱、耐鹽相關(guān)基因。
本發(fā)明所提供的抗旱、耐鹽相關(guān)基因，名稱為BhLeal，來源于苦苣苔科旋蒴苣苔屬旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2的氨基酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №1由588個堿基組成，其編碼序列為自5’端第43-432位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明BhLeal基因所編碼的蛋白(BHLeal)，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)控植物抗旱、耐鹽能力的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID №2由129個氨基酸殘基組成。
含有本發(fā)明基因的表達載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
擴增BhLeal中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種提高植物抗旱、耐鹽性的方法。
本發(fā)明所提供的提高植物抗旱、耐鹽性的方法，是將所述旋蒴苣苔的抗旱、耐鹽相關(guān)基因?qū)胫参锝M織或細(xì)胞，得到抗旱、耐鹽性提高的植物。
所述旋蒴苣苔的BhLeal基因可通過含有所述旋蒴苣苔的BhLeal基因的植物表達載體導(dǎo)入外植體；用于構(gòu)建所述植物表達載體的出發(fā)載體可為任意一種雙元農(nóng)桿菌載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如pBin19、pBI121、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300或其它衍生植物表達載體。
使用BhLeal基因構(gòu)建植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、泛生素基因Ubiquitin啟動子(pUbi)等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
攜帶有本發(fā)明BhLeal基因的植物表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是水稻、小麥、大豆、煙草、玉米、油菜、高粱、棉花等農(nóng)作物，還可以是苜蓿、三葉草、冰草等牧草以及草莓、西紅柿等果蔬花卉植物。
本發(fā)明所提供的旋蒴苣苔的抗旱相關(guān)基因BhLeal，可調(diào)控植物的耐旱復(fù)蘇能力，從而顯著提高植物的耐旱性。該基因及其編碼蛋白對于培育耐旱的作物、林草新品種具有重要的理論及實際意義，可應(yīng)用于農(nóng)牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理所需的抗性植物品種的培育與鑒定，具有較高的實際應(yīng)用價值。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。
圖1為Northern雜交檢測BhLeal表達模式的結(jié)果圖2為BhLeal原核表達載體pGEX-4T-1/BhLeal的物理圖譜圖3為過量表達BhLeal基因的原核細(xì)胞的抗旱能力得到顯著提高的驗證實驗的結(jié)果圖4為過量表達BhLeal基因的原核細(xì)胞的耐鹽能力得到顯著提高的驗證實驗的結(jié)果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物及探針均由上海生工合成。
實施例1、旋蒴苣苔的抗旱、耐鹽相關(guān)基因BhLeal的獲得提取經(jīng)干旱脅迫8小時的旋蒴苣苔葉片的總RNA，利用ZAP-cDNA文庫構(gòu)建試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA)構(gòu)建cDNA文庫。從中隨機挑選4800個基因，用BioGrid robot(BioRobotics Ltd，Cambridge，UK)自動化點樣在Hybond-N+尼龍膜(Amersham Biosciences，F(xiàn)reiburg，Germany)上，制成cDNA微陣列(cDNA芯片)。將芯片與未經(jīng)干旱處理正常生長的旋蒴苣苔葉片和經(jīng)干旱脅迫8小時的旋蒴苣苔葉片的polyA-RNA所制備的33P標(biāo)記的探針雜交，分析它們在正常條件及干旱誘導(dǎo)后基因表達的動態(tài)變化。對干旱誘導(dǎo)后基因進行測序，測序結(jié)果表明有1個干旱誘導(dǎo)上調(diào)的基因克隆，該基因具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №1由588個堿基組成，其編碼序列為自5’端第43-432位堿基，編碼具有序列表中SEQID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，將該基因命名為BhLeal，將其編碼蛋白命名為BHLeal。
實施例2、BhLeal的表達模式分析實驗分別提取未受脅迫處理，經(jīng)干旱脅迫2、8、24、72小時，及0.2M NaCl脅迫和水淹脅迫9小時的旋蒴苣苔葉片的總RNA并測定濃度，取等量的各個樣品進行1％瓊脂糖凝膠電泳，待經(jīng)嗅酚藍(lán)染色的樣品遷移到凝膠距點樣孔2/3處，將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，在80℃下烤膜120分鐘，再將轉(zhuǎn)有上述RNA的尼龍膜放入雜交管中，經(jīng)65℃預(yù)雜交2.5h后，加入經(jīng)純化、變性的熒光素標(biāo)記的BhLeal探針(序列表中SEQID №1中自5’端第1至588堿基位核苷酸序列)，65℃雜交24小時，倒出雜交液，用2×SSC、0.1％SDS、0.1×SSC和0.1％SDS溶液在65℃下，各洗膜30min，最后用Gene Images CDP-Star Detection Module(Amersham Phamacia Biotech，Little Chalfont Buckinghamshire，UK)檢測雜交信號的位置和強度。部分檢測結(jié)果如圖1所示，表明BhLeal的mRNA在未受干旱脅迫的及水淹脅迫的旋蒴苣苔葉片中檢測不到表達，經(jīng)干旱脅迫8小時及鹽脅迫9小時后可誘導(dǎo)其大量表達。
實施例3 BhLeal的細(xì)胞學(xué)定位利用PSORT計算機程序分析軟件(Nakai and Kanehisa，Expert system for predicting protein localization sites in gram-negative bacteria.Proteins.11(2)95-110，1991)對BhLeal所編碼的蛋白質(zhì)BhLeal進行細(xì)胞學(xué)定位，結(jié)果表明BhLeal定位于旋蒴苣苔葉細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。
實施例4、BhLeal的抗旱功能驗證實驗先以經(jīng)干旱脅迫8小時的旋蒴苣苔葉片的總RNA為模板，由oligo-dT反轉(zhuǎn)錄合成其cDNA，再以此cDNA為模板，在引物OB-44-full-f(5’-AGAATTCATGCAGACTGCGAAGC-3’)和OB-44-full-r(5’-ACTCGAGCTACTGAGTCGGAGCT-3’)的引導(dǎo)下，擴增BhLeal基因的全長片段，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I酶切后，與經(jīng)相同酶雙酶切的原核表達載體pGEX-4T-1(Pharmacia公司)連接，得到BhLeal基因的原核表達載體，命名為pGEX-4T-1/BhLeal，其物理圖譜如圖2所示，使BhLeal與GST融合基因的表達受到IPTG誘導(dǎo)型啟動子tac的調(diào)控。將構(gòu)建好的BhLeal基因的原核表達載體和pGEX-4T-1空載體分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，接種于含50μg/mL氨芐青霉素的2mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h(150轉(zhuǎn)/min)后，按1∶100稀釋，再37℃振蕩培養(yǎng)1-2h，至OD600值為0.3-0.6后，誘導(dǎo)表達并檢測BhLeal基因在原核細(xì)胞中過量表達對原核細(xì)胞耐旱能力(以不同濃度的PEG6000模擬干旱)的影響，具體方法為收集5mL OD600值為0.3-0.6的菌液，離心(8000轉(zhuǎn)/min)1min，收集菌體，將沉淀分別重懸于分別含3.75％、7.5％、15％、30％的PEG6000及50μg/mL氨芐青霉素的5mL LB培養(yǎng)液中，同時加入終濃度為0.01mm/L IPTG開始誘導(dǎo)培養(yǎng)，37℃振蕩培養(yǎng)(150轉(zhuǎn)/min)，1小時后分別測OD600值，并收集1.5mL菌體，離心(4000轉(zhuǎn)/min)收集菌體，將沉淀重懸于100μl 2×SDS凝膠加樣緩沖液中，沸水10min，12000g離心10min，收集上清，每樣品上樣5μl，進行SDS-PAGE電泳檢測，檢測結(jié)果表明BhLeal基因在原核細(xì)胞中得到了過量表達，其蛋白質(zhì)表達水平在0.01mm/L IPTG誘導(dǎo)下增加，同時相對于轉(zhuǎn)空載體的細(xì)菌，轉(zhuǎn)BhLeal基因的細(xì)菌在7.5％PEG6000存在下的存活能力具有一定程度的提高，如圖3所示(以轉(zhuǎn)入空載體pGEX-4T-1的細(xì)菌為對照；縱坐標(biāo)為存活率，以百分?jǐn)?shù)表示)，而且在蛋白質(zhì)水平上，轉(zhuǎn)BhLeal基因的細(xì)菌與對照相比，耐PEG的能力也得到提高。本實驗在原核細(xì)胞表達體系中證明BhLeal基因可提高細(xì)胞的耐旱能力。
實施例5、BhLeal的抗鹽功能驗證實驗以與上述相同的方法得到BhLeal基因的原核表達載體，pGEX-4T-1/BhLeal，其物理圖譜如圖2所示，使BhLeal與GST融合基因的表達受到IPTG誘導(dǎo)型啟動子tac的調(diào)控。將構(gòu)建好的BhLeal基因的原核表達載體和pGEX-4T-1空載體分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，接種于含50μg/mL氨芐青霉素的2mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h(150轉(zhuǎn)/min)后，按1∶100稀釋，再37℃振蕩培養(yǎng)1-2h，至OD600值為0.3-0.6后，誘導(dǎo)表達并檢測BhLeal基因在原核細(xì)胞中過量表達對原核細(xì)胞耐旱能力的影響，具體方法為收集5mL OD600值為0.3-0.6的菌液，離心(8000轉(zhuǎn)/min)1min，收集菌體，將沉淀分別重懸于分別含0.3M、0.6M、0.9M和1.8M的NaCl及50μg/mL氨芐青霉素的5mL LB培養(yǎng)液中，同時加入終濃度為0.01mm/L IPTG開始誘導(dǎo)培養(yǎng)，在37℃振蕩培養(yǎng)(150轉(zhuǎn)/min)，1小時后分別測OD600值，并收集1.5mL菌體，離心(4000轉(zhuǎn)/min)收集菌體，將沉淀重懸于100μl 2×SDS凝膠加樣緩沖液中，沸水10min，12000g離心10min，收集上清，每樣品上樣5μl，進行SDS-PAGE電泳檢測，檢測結(jié)果表明BhLeal基因在原核細(xì)胞中得到了過量表達，其蛋白質(zhì)表達水平在0.01mm/L IPTG誘導(dǎo)下增加，同時相對于轉(zhuǎn)空載體的細(xì)菌，轉(zhuǎn)BhLeal基因的細(xì)菌在0.3M、0.6M和0.9M NaCl存在下的存活能力具有一定程度的提高，如圖4所示(以轉(zhuǎn)入空載體pGEX-4T-1的細(xì)菌為對照；縱坐標(biāo)為存活率，以百分?jǐn)?shù)表示)，而且在蛋白質(zhì)水平上，轉(zhuǎn)BhLeal基因的細(xì)菌與對照相比，耐NaCl的能力也得到提高。本實驗在原核細(xì)胞表達體系中證明BhLeal基因可提高細(xì)胞的耐鹽能力。
序列表<160>2<210>1<211>588<212>DNA<213>旋蒴苣苔屬旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)<400>1cattacaact ttatatttca tattaaataa aaccaataaa atattcatac ttctaatcaa 60aatattatct attcttcttc ttcatccaat tatctttttt atttccttaa atccaaatct120taatttaatt cttataaaac tatttcaatt tctaattaat acaaataatt ttccaattaa180cataataatt ctaaataatc ttaatccaat tttattaatc attaatataa ttcctataat240tctaccttcc attttcattc taatcatcat ttacaatttt ttcatcatta tcttcacttt300tctttttctt ctccttctac tcaattcaat cattatccct catttttatc cactcatatt360ccaccttatt aatcttcttc ccattattat cattcttcac cttttactaa cccttcatct420cctactcatt atcatcacct ctctttcctt tatttaattt ttcatctttt tattaattta480ctcttattta ttttttctat ttctttcttt cctctttcca tcttttaatt tttctttttt540atatttttta tctcttcttt tttatttttt aataaattca tttattac 588<210>2<211>129<212>PRT<213>旋蒴苣苔屬旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)<400>2Met Gln Thr Ala Lys Gln Lys Met Ser Asp Ala Ala Ala Ser Ala Lys1 5 10 15Glu Arg Val Asp Val Leu Lys Ala Lys Ala Glu Gly Lys Ala Asp Lys20 25 30Thr Met Ala Ser Ser Lys Glu Asp Lys Glu Val Ala Lys Glu Gln Lys
35 40 45Lys Ala Lys Glu Ala Glu Ala Lys Val Arg Lys His Glu Glu Lys Ala50 55 60Asp Asn Ala Thr Gly His Leu Gln Ala Lys His Gln Gly Gln Phe Gly65 70 75 80Gln Gln Asp Leu His Gly Ala Gly Ala Ala Pro Ala Thr Gln Gly Asn85 90 95Gln Tyr Pro Ala Gly Gly Ala Thr Gln Ile Pro Pro Glu Glu Ala Ala100 105 110Ala Gln Tyr Glu Gln Ala Ala Pro Gly Thr Asn Pro Ala Ala Pro Thr115 120 125Gln
權(quán)利要求
1.旋蒴苣苔的抗旱、耐鹽相關(guān)基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2的氨基酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的旋蒴苣苔的抗旱、耐鹽相關(guān)基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID №1的DNA序列。
3.權(quán)利要求1所述的旋蒴苣苔抗旱、耐鹽相關(guān)基因的編碼蛋白，其特征在于所述蛋白是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)控植物抗旱、耐鹽復(fù)蘇能力的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的旋蒴苣苔抗旱、耐鹽相關(guān)基因的編碼蛋白，其特征在于所述蛋白具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列。
5.含有權(quán)利要求1所述基因的表達載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。
6.一種提高植物抗旱、耐鹽性的方法，是將權(quán)利要求1所述的旋蒴苣苔的抗旱、耐鹽相關(guān)基因?qū)胫参锝M織或細(xì)胞，得到抗旱、耐鹽性提高的植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述旋蒴苣苔的抗旱、耐鹽相關(guān)基因通過含有所述旋蒴苣苔抗旱、耐鹽相關(guān)基因的植物表達載體導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞；用于構(gòu)建所述植物表達載體的出發(fā)載體為pBin19、pBI121、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301或pCAMBIA1300。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述植物宿主為水稻、小麥、大豆、煙草、玉米、油菜、高粱、棉花、苜蓿、三葉草、冰草、草莓或西紅柿。
全文摘要
本發(fā)明公開了旋蒴苣苔的抗旱、耐鹽相關(guān)基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。其目的是提供一個旋蒴苣苔的抗旱、耐鹽相關(guān)基因及其編碼蛋白與其在培育抗旱性提高的植物中的應(yīng)用。該基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2的氨基酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明的旋蒴苣苔的抗旱、耐鹽相關(guān)基因BhLeal可調(diào)控植物的抗旱、耐鹽能力，從而顯著提高植物的抗旱、耐鹽性，該基因及其編碼蛋白對于培育抗旱、耐鹽的作物、林草新品種具有重要的理論及實際意義。
文檔編號C07K14/415GK1775797SQ20051012788
公開日2006年5月24日 申請日期2005年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月6日
發(fā)明者鄧馨, 馬克平, 王麗麗, 王智, 劉霞 申請人:中國科學(xué)院植物研究所