專利名稱：一種防病促生長植物內(nèi)生枯草芽孢桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對農(nóng)作物具有防病促生長作用的植物內(nèi)生細(xì)菌枯草芽孢桿菌Jaas ed3及其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，屬于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物內(nèi)生細(xì)菌是一個(gè)多樣性十分豐富的微生物類群，它們生活在健康植物的各種組織和器官內(nèi)部而不引起植物病變，是與寄主植物在長期的共同進(jìn)化過程中建立起互惠共存、相互制約的和諧聯(lián)合關(guān)系的一類微生物。內(nèi)生細(xì)菌對宿主植物具有廣泛的有益生物學(xué)作用，如促生、防病、抗逆等。內(nèi)生細(xì)菌可以通過生物固氮和產(chǎn)生促進(jìn)植物生長物質(zhì)如植物生長素、赤霉素以及細(xì)胞分裂素等，直接促進(jìn)植物生長；可以通過誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生植物激素，通過增強(qiáng)植物吸收N、P等營養(yǎng)元素以及其他礦物質(zhì)的吸收間接促進(jìn)植物生長；還可以通過改變寄主植物對霜凍等有害環(huán)境條件及有害病原生物的敏感性等促進(jìn)植物的生長。植物內(nèi)生細(xì)菌與從土壤中分離到的拮抗細(xì)菌相比，具有不易受環(huán)境條件的影響，在植物體內(nèi)具有穩(wěn)定的生存空間，可以在植物體內(nèi)獨(dú)立的分裂繁殖和傳遞等優(yōu)勢，篩選有益的內(nèi)生細(xì)菌有可能成為生物防治中最具潛力的微生物農(nóng)藥、增產(chǎn)菌或作為潛在的生防載體菌而加以利用。利用內(nèi)生細(xì)菌對土傳維管束病害進(jìn)行生物防治的優(yōu)勢更為突出，由于土傳維管束病害的病原菌侵染植株后，就在寄主植物維管束中生長、繁殖、為害，造成化學(xué)藥劑防治困難，效果不理想又污染環(huán)境，而內(nèi)生細(xì)菌可以通過在植物體內(nèi)定殖，與病原菌爭奪生存空間，產(chǎn)生拮抗物質(zhì)直接對病原菌作用等達(dá)到防病控病的目的。化學(xué)肥料和化學(xué)農(nóng)藥的污染已經(jīng)成為影響人類健康和造成環(huán)境惡化的重要原因之一，因而生物肥料和生物農(nóng)藥越來越引起人們的重視。內(nèi)生細(xì)菌作為生物防治的重要手段，能夠發(fā)揮其生態(tài)學(xué)、經(jīng)濟(jì)學(xué)和社會學(xué)效應(yīng)，符合保護(hù)環(huán)境、無污染和人類健康安全的觀念。植物內(nèi)生細(xì)菌能夠促進(jìn)植物生長、防治病蟲害發(fā)生，對于替代或減少化學(xué)肥料和化學(xué)農(nóng)藥的使用，改善農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)，保持植物微生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性，維護(hù)農(nóng)田生態(tài)平衡，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展將起到重要作用，因此，研究和利用植物內(nèi)生細(xì)菌具有廣闊而誘人的發(fā)展前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠?qū)Χ喾N病原菌具有拮抗作用、對農(nóng)作物具有防病促生長作用且能定殖在農(nóng)作物體內(nèi)的枯草芽孢桿菌Jaas ed3。利用該菌株可開發(fā)出新型的生防菌劑，滿足無公害農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)要求。本發(fā)明所提供的植物內(nèi)生細(xì)菌是2004年從中國江蘇省南京市的茄子組織中分離獲得，2012年對該菌株進(jìn)行了菌種鑒定，結(jié)果為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，命名為Jaas ed3，并于2012年9月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC No. 6576。該菌株具有下述性質(zhì)I、菌落形態(tài)特征
該菌株在NA培養(yǎng)基上生長良好，菌落不透明，乳白色，扁平微隆起，表面有褶皺，邊緣不規(guī)則。2、菌體形態(tài)特征菌體細(xì)胞桿狀，產(chǎn)生芽孢。3、主要生理生化特征革蘭氏反應(yīng)陽性；過氧化氫酶反應(yīng)陽性；利用阿拉伯糖、木糖、甘露醇、葡萄糖產(chǎn)酸；利用葡萄糖不產(chǎn)氣P反應(yīng)陽性；淀粉水解陽性；明膠液化陽性；分解酪素陽性。4、遺傳學(xué)特征性利用Eubac27F和Eubacl492R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增出16S rRNA基因的部分序列1511bp,并向GenBank提交,登錄號為JX849659。將該序列在www. ncbi. nlm. nih. gov網(wǎng)站上用BLAST工具與GenBank中已登錄的部分菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行相似性比較，結(jié)果表明與枯草芽孢桿菌的相似性達(dá)99%。因此，通過對該菌株進(jìn)行形態(tài)特征、生理生化特征和遺傳學(xué)特征性進(jìn)行鑒定，本發(fā)明所述的植物內(nèi)生細(xì)菌Jaas ed3屬于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。通過常規(guī)的微生物發(fā)酵方法可以培養(yǎng)本發(fā)明所述的植物內(nèi)生細(xì)菌，并制得以本發(fā)明所述的植物內(nèi)生細(xì)菌為有效成分的生防菌劑。該菌的最適PH為6. 0-8. 0，最適培養(yǎng)溫度為25-30°C，可用一般發(fā)酵工業(yè)中的通用發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。在制造以本發(fā)明所述的植物內(nèi)生細(xì)菌為生防菌劑時(shí)，可同樣使用該技術(shù)領(lǐng)域中已知生防菌劑通用的培養(yǎng)基，配制成水劑、粉劑等任意的劑型。本發(fā)明的所述的植物內(nèi)生枯草芽孢桿菌及制得的以其為有效成分的生防菌劑與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)。I、可以在植株體內(nèi)定殖傳導(dǎo)本發(fā)明所述的植物內(nèi)生枯草芽孢桿菌可以在西瓜、茄子等多種農(nóng)作物體內(nèi)定殖，并且可以在植株體內(nèi)傳導(dǎo)。2、可以促進(jìn)植株生長用本發(fā)明所述的植物內(nèi)生枯草芽孢桿菌菌液灌根西瓜苗，可顯著提高植株的株高和鮮重。3、對西瓜枯萎病具有突出的防治效果用本發(fā)明所述的植物內(nèi)生枯草芽孢桿菌菌液對植株進(jìn)行灌根對西瓜枯萎病有突出的防治效果。4、對多種作物病原真菌具有拮抗活性本發(fā)明所述的植物內(nèi)生枯草芽孢桿菌具有較廣的抑菌譜，對西瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、棉花枯萎病菌、茄子黃萎病菌、棉花黃萎病菌、小麥紋枯病菌、小麥赤霉病菌、番茄灰霉病菌、白菜黑斑病菌、水稻稻瘟病菌、萵苣菌核病菌、番茄早疫病菌等多種病原真菌都具有明顯的拮抗活性。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來進(jìn)一步詳述本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實(shí)施例I液體制劑
將植物內(nèi)生枯草芽孢桿菌Jaas ed3菌株接種到試管斜面上，培養(yǎng)基為NA，25°Cfl溫培養(yǎng)2-4天，獲得試管種。將試管種接種到NB培養(yǎng)基中，28°C恒溫振蕩培養(yǎng)過夜后，按O. I %的接種量轉(zhuǎn)接于NB培養(yǎng)基中，28°C恒溫振蕩培養(yǎng)14小時(shí)后的培養(yǎng)液即可為制劑。配方一、普通細(xì)菌NA培養(yǎng)基(重量％ )牛肉浸膏O. 3 %，酵母膏O. 1%，蛋白胨O. 5%，葡萄糖1.0%，瓊脂1.5-2. O %，pH6. 8-7. O0配方二、普通細(xì)菌NB培養(yǎng)基(重量％ )牛肉浸膏0.3%，酵母膏O. 1%，蛋白胨O. 5%，葡萄糖I. 0%，ρΗ6. 8-7. O。實(shí)施例2對西瓜苗的促生長作用將催芽的西瓜種子播種于溫室盆缽中，待西瓜苗長至2 3片真葉時(shí)，將稀釋后的植物內(nèi)生枯草芽孢桿菌Jaas ed3菌液澆于西瓜苗根際，20天后測量苗高并稱鮮重，試驗(yàn)結(jié)果表明該菌株對西瓜苗具有明顯的促生長作用，株高比對照增長27.5%，鮮重比對照增長48. 4%。實(shí)施例3對西瓜枯萎病的防治作用將催芽的西瓜種子播種于溫室里裝有病土的盆缽中，待西瓜苗長至2片真葉期時(shí)，對西瓜苗根部每隔5天用稀釋后的植物內(nèi)生枯草芽孢桿菌Jaas ed3進(jìn)行灌根處理，連用3次，以不接種本發(fā)明所述的內(nèi)生細(xì)菌為對照，最后一次處理后23天調(diào)查枯萎病的病情。本發(fā)明所述的內(nèi)生細(xì)菌對西瓜枯萎病的防治效果為63. 2%。在大棚中，待西瓜苗長至3 4片真葉期時(shí)，對西瓜苗根部灌澆西瓜枯萎病菌孢子液，第2天再用稀釋后的植物內(nèi)生枯草芽孢桿菌Jaas ed3進(jìn)行灌根處理，以不接種本發(fā)明所述的內(nèi)生細(xì)菌為對照，20天后調(diào)查枯萎病的病情。本發(fā)明所述的內(nèi)生細(xì)菌對西瓜枯萎病的防治效果為45.8%。實(shí)施例4對多種病原真菌的拮抗作用在PDA平板中心處接直徑為5mm病原真菌菌餅，25°C，培養(yǎng)1_3天后，在菌落邊緣
I.5cm處接活化好的植物內(nèi)生枯草芽孢桿菌Jaas ed3，6_7天后測量抑菌圈。結(jié)果表明本發(fā)明所述的植物內(nèi)生多粘類芽孢桿菌具有較廣的抑菌譜，對西瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、棉花枯萎病菌、茄子黃萎病菌、棉花黃萎病菌、小麥紋枯病菌、小麥赤霉病菌、番茄灰霉病菌、白菜黑斑病菌、水稻稻瘟病菌、萵苣菌核病菌、番茄早疫病菌等多種病原真菌都具有明顯的拮抗活性。實(shí)施例5在西瓜、茄子植株體內(nèi)定殖將催芽的西瓜或茄子種子播種于溫室盆缽中，待西瓜或茄子苗長至2 3片真葉時(shí)，將稀釋后的經(jīng)利福平標(biāo)記后的植物內(nèi)生枯草芽孢桿菌Jaas ed3菌液澆于西瓜苗或茄子苗的根際。每隔3天取距土表Icm的地上莖組織，用表面消毒-研磨-鋪平板技術(shù)再分離回收經(jīng)利福平標(biāo)記的菌株，以檢測內(nèi)生細(xì)菌在植株體內(nèi)的定殖情況，試驗(yàn)結(jié)果表明該菌株在西瓜苗或茄子苗中可以定殖12天以上。
權(quán)利要求
1.一種具有防病促生長作用的植物內(nèi)生細(xì)菌Jaas ed3，其特征在于該菌是一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),已于2012年9月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC No. 6576。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種植物內(nèi)生細(xì)菌，其特征在于，該菌株在NA培養(yǎng)基上生長良好，菌落不透明，乳白色，扁平微隆起，表面有褶皺，邊緣不規(guī)則；菌體細(xì)胞桿狀，產(chǎn)生芽孢；革蘭氏反應(yīng)陽性；過氧化氫酶反應(yīng)陽性；利用阿拉伯糖、木糖、甘露醇、葡萄糖產(chǎn)酸；利用葡萄糖不產(chǎn)氣；V.P反應(yīng)陽性；淀粉水解陽性；明膠液化陽性；分解酪素陽性；用抗利福平與拮抗病原真菌雙標(biāo)記進(jìn)行 內(nèi)生測定，從植株體內(nèi)回收分離的菌株，在含利福平培養(yǎng)基上出現(xiàn)相同的菌落。
3.權(quán)利要求I或2所述植物內(nèi)生細(xì)菌在制劑生產(chǎn)中的應(yīng)用，其中以權(quán)利要求I或2所述植物內(nèi)生細(xì)菌為生產(chǎn)菌株來生產(chǎn)制劑。
4.以權(quán)利要求I或2所述植物內(nèi)生細(xì)菌為有效成分的制劑在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對農(nóng)作物具有防病促生長作用的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Jaased3及其應(yīng)用，屬于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用的菌株Jaas ed3已于2012年9月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC No.6576。該菌株對西瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、萵苣菌核病菌、茄子黃萎病菌等多種病原真菌具有拮抗活性；并且可在較低的菌液濃度下進(jìn)入西瓜、茄子等植株體內(nèi)，并能在農(nóng)作物體內(nèi)定殖和傳導(dǎo)；對農(nóng)作物具有促進(jìn)生長、防治病害的作用，尤其對土傳維管束病害具有良好的防治效果。將該菌株用于制劑生產(chǎn)成本低廉，操作簡單，有利于保護(hù)農(nóng)田生態(tài)環(huán)境，減少農(nóng)藥殘留，適合于我國無公害農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)的要求。
文檔編號A01P3/00GK102925394SQ201210460840
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者林玲, 王卿, 張昕, 鄧晟 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院