專利名稱：Cd40結(jié)合分子和ctl肽在用于治療腫瘤的藥物組合物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及CD40結(jié)合分子和CTL肽在用于治療腫瘤的藥物組合物中的用途背景技術(shù)許多腫瘤逃避了我們免疫系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)。在癌癥患者體內(nèi)其消除腫瘤細(xì)胞的免疫系統(tǒng)的特異機(jī)制在數(shù)量和/或質(zhì)量上存在明顯的缺陷，細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)可以識(shí)別和殺死被病毒感染或轉(zhuǎn)變成癌細(xì)胞的細(xì)胞是這些機(jī)制之一。以前假定樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)刺激T-輔助細(xì)胞，該輔助細(xì)胞再使CTL活化。本發(fā)明人已證實(shí)，T-輔助細(xì)胞并不直接對(duì)該CTL提供輔助信號(hào)(通過(guò)分泌IL2)，而是T-輔助細(xì)胞提供信號(hào)給DC誘導(dǎo)其產(chǎn)生非特征的細(xì)胞表面和/或可溶性分子，從而使DC能夠在沒(méi)有T-輔助細(xì)胞存在的情況下激活CTL。該T-輔助細(xì)胞給DC提供的信號(hào)是通過(guò)CD40L-CD40的相互作用來(lái)介導(dǎo)。這一新發(fā)現(xiàn)為癌癥免疫療法提供了一個(gè)極難得的機(jī)會(huì)。
當(dāng)自身細(xì)胞受到病毒感染時(shí)或者當(dāng)它們轉(zhuǎn)變成癌細(xì)胞時(shí)，免疫系統(tǒng)能夠殺死這些自身細(xì)胞。這種潛在危險(xiǎn)的機(jī)理必需清楚地在嚴(yán)格控制之下。該免疫系統(tǒng)的CTL以無(wú)活性前體循環(huán)。為了將其激活，該前體T-殺傷細(xì)胞必需識(shí)別其特異的抗原肽，該抗原肽以MHC I型分子存在于專職APC上。然而，為了引發(fā)這些T細(xì)胞，該APC還必需通過(guò)共同刺激的表面分子B7.1和B7.2以及淋巴因子IL-12提供的合適共同刺激的環(huán)境呈遞該抗原。
直到最近，據(jù)信需要一在相同APC上識(shí)別相同抗原的T-輔助細(xì)胞完全激活該CTL。該特異T-輔助細(xì)胞應(yīng)提供如IL-2的細(xì)胞因子來(lái)活化該CTL。然而，Guerder和Matzinger(J.Exp.Med.176553(1992))提出了用于CTL活化的“特許”模型。在該模型中，暗示當(dāng)T-輔助細(xì)胞在專職APC上識(shí)別其抗原時(shí)，該T-輔助細(xì)胞將對(duì)該APC傳遞活化信號(hào)，結(jié)果隨后能夠在不需要T-輔助細(xì)胞存在的情況下激活CTL。就在不久前，已對(duì)該特許模型的分子機(jī)理進(jìn)行了解釋。Schoenberger等人(Nature393480(1998))描述了該CD40L-CD40途徑在該特許模型中的作用。T-輔助細(xì)胞和DC之間通過(guò)該CD40-CD40L結(jié)合的相互作用致使該DC活化，因此使該DC能夠有效地引發(fā)原初CTL。
DC通過(guò)我們身體的組織循環(huán)并以這種方式能夠收集、加工和呈遞抗原。收集抗原之后，它們移動(dòng)到該引流淋巴結(jié)，在其中它們向該T細(xì)胞呈遞抗原。眾所周知，DC需要最適地被激活。靜息DC僅表達(dá)普通水平的MHC和共同刺激的分子并且為T(mén)細(xì)胞的弱刺激物。DC能夠被炎癥細(xì)胞因子和細(xì)菌產(chǎn)物激活，這將導(dǎo)致MHC和共同刺激的分子正調(diào)節(jié)。DC活化成完全成熟的DC、表達(dá)最佳水平的MHC分子、共同刺激的分子和如IL-12這樣的淋巴因子，這需要通過(guò)該CD40受體另外觸發(fā)這些細(xì)胞。因此，在吸收抗原位置處的炎癥細(xì)胞因子和T-輔助細(xì)胞相互作用過(guò)程中的CD40L-CD40相互作用的組合致使特許該DC活化CTL的能力達(dá)到最佳。
許多腫瘤能夠通過(guò)特異的CTL機(jī)制逃避免疫監(jiān)測(cè)。如果DC在沒(méi)有炎癥的條件下收集腫瘤抗原，那么被激活的T-輔助細(xì)胞的數(shù)量將太少，以至于不能誘導(dǎo)足夠的CTL激活并產(chǎn)生適當(dāng)?shù)目鼓[瘤反應(yīng)。這一概念提示研究人員通過(guò)給藥直接刺激CTL活性的例如IL-2和IL-12的細(xì)胞因子或通過(guò)給藥用GM-CSF轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞加強(qiáng)抗原呈遞來(lái)幫助該免疫系統(tǒng)。這些方法已得到多種但都令人振奮的結(jié)果。
很顯然，仍有很大需求尋找產(chǎn)生和/或提高涉及細(xì)胞和體液免疫的保護(hù)性抗腫瘤反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)該CD40活化途徑是一種產(chǎn)生一級(jí)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)的主要免疫調(diào)節(jié)途徑。如上所述，在DC上的該CD40途徑擔(dān)負(fù)著誘導(dǎo)抗腫瘤CTL反應(yīng)。此外，在巨噬細(xì)胞上的CD40活化途徑可刺激產(chǎn)生強(qiáng)的殺腫瘤活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明包括藥物組合物中的CD40結(jié)合分子和激活CTL的肽，包括腫瘤抗原。將這種組合物用于提高肽腫瘤疫苗的抗腫瘤效應(yīng)，或者用于另外激活的CTL，以便該激活的CTL能夠起到抵抗腫瘤細(xì)胞或被感染細(xì)胞的作用。該CD40結(jié)合分子可以包括抗體分子，及其同系物、類似物和其修飾或衍生形式，包括象Fab、(Fab′)2和Fv的免疫球蛋白片段，以及結(jié)合在CD40上并激活該CTL反應(yīng)的物質(zhì)，包括肽、低聚核苷酸、模擬肽和有機(jī)化合物。激活CTL的肽包括來(lái)自腺病毒且具有序列SGPSNTPPEI(SEQ ID NO2)的E1A-肽和來(lái)自人乳頭瘤病毒16型且具有序列RAHYNIVTF(SEQ ID NO3)的HPV16E7-肽。
可以通過(guò)包括注射在內(nèi)的適宜方式將該CD40結(jié)合分子和激活CTL的肽給藥到患者，或者可以把編碼這種分子和肽的基因構(gòu)建體給藥，然后在體內(nèi)或非體內(nèi)生產(chǎn)該分子和肽。根據(jù)本領(lǐng)域中眾所周知的方法進(jìn)行這種基因療法。如果在非體內(nèi)進(jìn)行該基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染或感染的話，可以向該患者給藥該被感染或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，或者可以在體內(nèi)進(jìn)行這些步驟，由此內(nèi)源性地生產(chǎn)該分子和肽。如果在非體內(nèi)進(jìn)行，可以通過(guò)包括電穿孔、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、微注射的傳統(tǒng)方法或者通過(guò)將該基因構(gòu)建體摻入適宜脂質(zhì)體中進(jìn)行轉(zhuǎn)染或感染。可以使用包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或細(xì)小病毒的載體或質(zhì)粒插入該基因構(gòu)建體，然后它們?cè)隗w內(nèi)或非體內(nèi)表達(dá)。
本文證實(shí)，T-細(xì)胞對(duì)CTL的輔助活化是通過(guò)CD40-CD40配體(CD40L)相互作用介導(dǎo)的，缺乏CD4+T細(xì)胞時(shí)CTL的不活化狀態(tài)能夠在下述情況下恢復(fù)在包括腫瘤抗原在內(nèi)的CTL激活肽的存在下，由單克隆抗體(mAb)調(diào)節(jié)CD40以活化骨髓源的APC。而且，由CD4+T細(xì)胞表達(dá)的對(duì)CD40L的阻斷可以阻斷CTL免疫途徑。這種缺陷可以通過(guò)體內(nèi)CD40-觸發(fā)來(lái)克服，CD40的體內(nèi)觸發(fā)可以明顯地提高以肽為基礎(chǔ)的抗腫瘤疫苗的功效，或者另外激活CTL，從而誘導(dǎo)抗腫瘤或抗感染的細(xì)胞反應(yīng)。
還應(yīng)指出的是，激活CTL的肽能夠成為產(chǎn)生耐受的，意思是在沒(méi)有抗-CD40的情況下抵抗表達(dá)這種肽的細(xì)胞的寄主反應(yīng)受到抑制。然而，這種肽與激活抗-CD40的抗體組合將耐受性轉(zhuǎn)變成強(qiáng)的CTL活性。而且，如上所述，CD40連接反應(yīng)能夠賦予已經(jīng)保護(hù)的腫瘤-特異性肽疫苗以在帶有腫瘤的小鼠中誘導(dǎo)治療CTL免疫的能力。
這些發(fā)現(xiàn)一起證明了，CD40-CD40配體對(duì)可以起到類似開(kāi)關(guān)的作用，決定原初邊緣CTL是被激活還是保持沉默，因此可以有效地將CD40結(jié)合劑(例如單克隆抗體和其它刺激配體)用于與CTL激活的肽組合。


圖1.E1B特異性CTL的交叉引發(fā)需要CD4+T輔助細(xì)胞在不同效應(yīng)物/靶比值下檢測(cè)用Ad5E1-BALB/c MEC免疫的正常(a)或缺失CD4的B6(b)的小鼠的脾細(xì)胞在載有E1B192-200肽(實(shí)線)或Dd受限制的對(duì)照肽HPV-16E749-57(虛線)時(shí)的同源MEC靶細(xì)胞的溶胞作用，該E1B192-200肽來(lái)自人體腺病毒并具有序列VNIRNCCYI(SEQ ID NO1)。每條線代表一只小鼠。所示數(shù)據(jù)代表了具有相似結(jié)果的三個(gè)試驗(yàn)之一。
圖2CD40激活替換CD4+T輔助細(xì)胞將缺失CD4的(a，b)或II型有缺陷的I-Ab敲除(KO)的(c，d)B6小鼠的脾細(xì)胞用Ad5E1-BALB/c MEC免疫并用激活CD40的抗體(Ab)FGK45(a，c)或同種型對(duì)照抗體(b，d)處理。檢測(cè)這些脾細(xì)胞對(duì)載有E1B192-200肽(實(shí)線)或HPV-16E749-57對(duì)照肽(虛線)的同源MEC靶細(xì)胞的E1B特異性CTL活性。每條線代表一只小鼠。所示數(shù)據(jù)來(lái)自兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。E/T比為效應(yīng)物/靶比值。
圖3B細(xì)胞對(duì)交叉引發(fā)APC或交叉引發(fā)的抗-CD40介導(dǎo)的恢復(fù)不是必需的從未經(jīng)處理的(a)、缺失CD4且B細(xì)胞有缺陷的B6MT小鼠(b，c)中取出脾細(xì)胞，這些小鼠是用Ad5E1-BALB/c MEC免疫并接受過(guò)同種型對(duì)照抗體(b)或激活CD40的抗體FGK45(c)。檢測(cè)這些脾細(xì)胞對(duì)載有E1B192-200肽(實(shí)線)或HPV E749-57對(duì)照肽(虛線)的同源MEC靶細(xì)胞的E1B特異性CTL活性。每條線代表一只小鼠。所示數(shù)據(jù)代表兩個(gè)具有相似結(jié)果的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)之一。
圖4CD40L阻斷阻止E1B特異件CTL的交叉引發(fā)從用Ad5E1-BALB/c MEC免疫并用阻斷CD40L的抗體MR-1(a)或?qū)φ湛贵w(b)處理的B6小鼠、或從免疫24小時(shí)后用阻斷CD40L的抗體MR-1與激活CD40的抗體FGK45一起處理的小鼠(c)中取出脾細(xì)胞。檢測(cè)這些脾細(xì)胞對(duì)載有E1B192-200肽(實(shí)線)或HPV E749-57對(duì)照肽(虛線)的同源MEC靶細(xì)胞的E1B特異性CTL活性。每條線代表一只小鼠。所示數(shù)據(jù)代表具有相似結(jié)果的三個(gè)實(shí)驗(yàn)之一。E/T比為效應(yīng)物/靶比值。
圖5皮下注射有E1A-肽的小鼠不再能增加E1A-特異件CTL用IFA中的20μg E1A-肽(a，b)或?qū)φ针?c，d)給C57BL/6小鼠皮下注射2次(間隔1周)，1天后用SAMB7腹膜內(nèi)注射攻擊(b，d)，該SAMB7為表達(dá)大量E1A-肽的細(xì)胞系。檢測(cè)來(lái)自這些小鼠的大批培養(yǎng)物對(duì)用E1A-肽(-■-)或HPV16E7-肽(-○-)脈沖的靶細(xì)胞的E1A-特異性細(xì)胞毒性。顯示了在不同效應(yīng)物靶(E/T)比值下典型大批培養(yǎng)物的溶胞率。將該實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，從而獲得可比較的結(jié)果。
圖6耐受的E1A-肽用IFA皮下注射之后可快速在全身分布將從未經(jīng)處理的C57BL/6小鼠(-)或從16個(gè)小時(shí)以前經(jīng)皮下注射了IFA中的100μg E1A-肽或HPV16 E7-肽的小鼠獲得的脾細(xì)胞用作用于E1A-特異性CTL克隆的刺激細(xì)胞。顯示了在沒(méi)有扣除本底計(jì)數(shù)的情況下不同效應(yīng)物刺激物濃度的[3H]-胸腺嘧啶摻入(cpm)+/-S.E.M。結(jié)果為5個(gè)單獨(dú)試驗(yàn)的代表。
圖7CD40在體內(nèi)觸發(fā)之后將CTL耐受誘導(dǎo)恢復(fù)成CTL引發(fā)對(duì)野生型C57BL/6小鼠(a，b)和H-2bCD40-/-小鼠(c，d)僅經(jīng)皮下注射IFA中的20μg的E1A-肽、與大鼠IgG2a對(duì)照抗體一起注射(a)、或者與抗-CD40mAb FGK-45一起注射(b，d)。檢測(cè)來(lái)自這些小鼠的大批培養(yǎng)物對(duì)用E1A-肽(-■-)、HPV16 E7-肽(-○-)或Ad5E1轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞(-◆-)脈沖的靶細(xì)胞的E1A-特異性細(xì)胞毒性。顯示了在不同E/T比值下典型大批培養(yǎng)物的溶胞率。分別將該實(shí)驗(yàn)重復(fù)18次(B6小鼠)和2次(CD40-/-小鼠)，從而獲得可比較的結(jié)果。在(e)中顯示了在E/T為60時(shí)從僅注射了IFA中的E1A-肽(左邊)或注射了IFA中的E1A-肽和抗-CD40mAb(右邊)的B6小鼠中分別獲得的23塊、37塊CTL培養(yǎng)物的溶胞率％。顯示了每組的平均正標(biāo)準(zhǔn)偏差(E1A相對(duì)E1A+抗-CD40p＜0.01，學(xué)生t檢驗(yàn))。
圖8通過(guò)肽與體內(nèi)CD40觸發(fā)一起聯(lián)合治療HPV16 E6和E7轉(zhuǎn)化細(xì)胞的療法對(duì)小鼠經(jīng)皮下注射25.000HPV16轉(zhuǎn)化同源細(xì)胞(TC-1)。將C57BL/6小鼠保持未被處理(-○-)或在6天后以IFA腹膜內(nèi)注射接受100μg HPV16E7-肽(-□-)、以IFA腹膜內(nèi)注射接受100μg HPV16 E7-肽和抗-CD40mAb FGK-45(-■-)或以IFA腹膜內(nèi)注射接受對(duì)照肽和抗-CD40mAb FGK-45(-●-)。在(a)中描述了不同處理組(n＝10)中產(chǎn)生腫瘤的小鼠的百分比。經(jīng)統(tǒng)計(jì)用HPV16-肽和抗-CD40mAb處理的組與其它三個(gè)組之間的差異很大(p＜0.01)(Log-Rank試驗(yàn))。在(b)中顯示了存活動(dòng)物的百分比(E7-肽處理組E7-肽和抗-CD40處理組p＜0.002，Log-Rank試驗(yàn))。
具體實(shí)施例方式
可以通過(guò)傳統(tǒng)生產(chǎn)和篩選技術(shù)制備本發(fā)明的CD40結(jié)合分子。在Nature 393474-77(1998)中分別描述了大鼠和倉(cāng)鼠抗小鼠CD40單克隆抗體(″Mab″)并可商購(gòu)獲得(Pharmingen，Inc.，CA)。Rolink.A等人在Immunity 5，319-330(1996)中描述了該抗鼠CD40MAb，叫做FGK45，將其用于下述實(shí)驗(yàn)。可以通過(guò)本領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)制備抗人CD40MAb，并已由G.Khler和C.Milstein述及(Nature，1975256495-497)?？梢酝ㄟ^(guò)用原初CD40免疫嚙齒動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠和豚鼠)產(chǎn)生MAb，該原初CD40是在細(xì)胞上表達(dá)的或是從人血漿或尿中純化的，或者在真核或原核系統(tǒng)中表達(dá)的重組CD40或其片段。可以將其它動(dòng)物用于免疫，例如非人靈長(zhǎng)類、表達(dá)人免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠和用人B淋巴細(xì)胞移植的重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠。如G.Khler和C.Milstein，出處同上，所述，通過(guò)融合來(lái)自用骨髓瘤細(xì)胞(例如Sp2/0和NS0)免疫過(guò)的動(dòng)物的B淋巴細(xì)胞的傳統(tǒng)方法可以產(chǎn)生雜交瘤。此外，通過(guò)從噬菌體展示系統(tǒng)中的人B淋巴細(xì)胞中篩選重組單鏈Fv或Fab庫(kù)，能夠產(chǎn)生抗-CD40MAb。該MAb對(duì)CD40的特異性可以通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡法或其它免疫化學(xué)技術(shù)檢測(cè)。抗體在CTL上的激活活性以及激活CTL的肽可以使用下面實(shí)施例中所述的測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)。
為了治療人體，應(yīng)優(yōu)選將該抗-CD40MAb以嵌合的、去免疫的、人源化的或人抗體使用。這些抗體可以降低免疫原性，因此避免了人抗小鼠抗體(HAMA)反應(yīng)。優(yōu)選該抗體為IgG4、IgG2或其它不增加抗體依賴型細(xì)胞的細(xì)胞毒性(S.M.Canfield和S.L.Morrison，J.Exp.Med.，19911731483-1491)和補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解(Y.Xu等人，J.Biol.Chem.，19942693468-3474；V.L.Pulito等人，J.Immunol.，1996；1562840-2850)的遺傳變異的IgG或IgM。
嵌合抗體是通過(guò)本領(lǐng)域中眾所周知的重組法生產(chǎn)的，并具有動(dòng)物可變區(qū)和人恒定區(qū)。人源化抗體比嵌合抗體具有更大程度的人肽序列。在人源化抗體中，僅負(fù)責(zé)抗原結(jié)合和特異性的互補(bǔ)性決定區(qū)域是來(lái)自動(dòng)物且具有與該動(dòng)物抗體相應(yīng)的氨基酸序列的，并且該分子中剩余部分基本上全部(在某些情況下除可變區(qū)中小部分的構(gòu)架區(qū)之外)都是來(lái)自人體且相應(yīng)于人抗體的氨基酸序列。參見(jiàn)L.Riechmann等人的Nature，1988；332323-327；G.Winter的US5225539；C.Queen等人的US5530101。
去免疫的抗體為已剔除T和B細(xì)胞表位的抗體，如國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/GB98/01473中所述。當(dāng)將它們用于體內(nèi)時(shí)它們降低了免疫原性。
可以通過(guò)幾種不同方式制備人抗體，包括使用人免疫球蛋白表達(dá)庫(kù)(Stratagene Corp.，La Jolla，Califomia)以生產(chǎn)人抗體片段(VH、VL、Fv、Fd、Fab或(Fab′)2，以及使用這些片段采用與生產(chǎn)嵌合抗體相似的技術(shù)構(gòu)建整個(gè)人抗體。還可以在具有人免疫球蛋白基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠中生產(chǎn)人抗體。這些小鼠可以從Abgenix，Inc.，F(xiàn)remont，California和Medarex，Inc.，Annandale，New Jersey獲得。
人們還可以構(gòu)建連接重鏈和輕鏈Fv區(qū)的單肽鏈結(jié)合分子。在US4946778中描述了單鏈抗體(″ScFv″)和其構(gòu)建方法?；蛘撸梢酝ㄟ^(guò)相似方式構(gòu)建和表達(dá)Fab(M.J.Evans等人的J.Immunol.Meth.，1995；184123-138)。全部和部分的人抗體所有的免疫原性都比不上整個(gè)鼠MAb的免疫原性，并且這些片段和單鏈抗體也幾乎沒(méi)有免疫原性。因此所有這些類型的抗體都不可能引起免疫或變態(tài)反應(yīng)。因此，它們比整個(gè)動(dòng)物抗體更適宜在人體內(nèi)給藥，特別是當(dāng)必需重復(fù)或長(zhǎng)期給藥時(shí)。此外，更小尺寸的抗體片段可以幫助改善組織生物利用率，而該生物利用率可能對(duì)急性病適應(yīng)癥如腫瘤治療中更好地藥量積聚是至關(guān)重要的。
基于抗-CD40mAb或已知激活CTL的肽的可變區(qū)的分子結(jié)構(gòu)，人們能夠使用分子模型和合理的分子設(shè)計(jì)產(chǎn)生和篩選分別模擬所述抗體或肽的結(jié)合區(qū)的分子結(jié)構(gòu)且激活CTL的分子。這些小分子可以是肽、模擬肽、低聚核苷酸或其它有機(jī)化合物。可以使用這些模擬分子治療癌癥和感染。另外，人們可以使用本領(lǐng)域中常用的大規(guī)模篩選步驟從化合物庫(kù)中分離適宜分子。
可以從下述的體內(nèi)試驗(yàn)和測(cè)定、或者從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或從人體臨床試驗(yàn)通過(guò)推斷容易地確定本發(fā)明分子的劑量。在為抗體或蛋白質(zhì)時(shí)，盡管某些小分子可能適宜口服，但是本發(fā)明的分子優(yōu)選通過(guò)注射給藥。下面描述證明本發(fā)明效果的測(cè)定和試驗(yàn)。
實(shí)施例1存引發(fā)CTL時(shí)通過(guò)CD40發(fā)出的信號(hào)能夠代替CD4+輔助T細(xì)胞使用一完全鑒定的模型系統(tǒng)探測(cè)T-細(xì)胞幫助在體內(nèi)一級(jí)活化CD8+CTL反應(yīng)的機(jī)理。用表達(dá)人腺病毒5型早期區(qū)域1(Ad5EI-BALB/c MEC)的異源BALB/c(H-2d)鼠胚細(xì)胞(MEC)免疫的C57BL/6(具有主要組織相容性復(fù)合體(MHC)H-2b)小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗腺病毒EIB蛋白(EIB192-200)的H-2Db限制性表位的CTL反應(yīng)(圖1a)。由于通過(guò)Ad5EI-BALB/c MEC表達(dá)的異源H-2dMHC分子不能引發(fā)H-2b限制性宿主CTL，因此必需交叉引發(fā)才能產(chǎn)生E1B特異性CTL，即，通過(guò)宿主APC吸收并H-2b限制性再呈遞抗原。由于缺失CD4+T-輔助(Th)細(xì)胞的小鼠在免疫之前不再增加E1B特異性CTL反應(yīng)，因此EIB特異性CTL的交叉引發(fā)為嚴(yán)格輔助依賴型(圖1b)。
為了研究通過(guò)CD40發(fā)出的信號(hào)是否能夠替代CTL引發(fā)中的CD4+輔助T細(xì)胞，在用Ad5EIBALB/c MEC免疫之前在體內(nèi)使小鼠缺失CD4+T細(xì)胞。免疫一天后，這些小鼠接受活化抗體抗小鼠CD40mAb FGK45或同種型匹配的對(duì)照抗體的單次注射。向缺失CD4的經(jīng)過(guò)免疫的小鼠給藥FGK45，導(dǎo)致有效地恢復(fù)了E1B特異性CTL反應(yīng)(圖2a)，然而用對(duì)照抗體的處理沒(méi)有此現(xiàn)象(圖2b)。在單用FGK45處理的原初小鼠中未檢測(cè)到E1B特異性CTL的激活(未顯示)。為了解釋FGK45的效果是通過(guò)用抗-CD4抗體處理沒(méi)有缺失的剩余D4+細(xì)胞介導(dǎo)的可能性，將缺少成熟功能性CD4+周圍T細(xì)胞的B6I-Ab敲除的小鼠用Ad5EI-BALB/c MEC免疫。在這些小鼠中的該免疫反應(yīng)反映出CD4耗盡的小鼠中所看到的，其中僅在接受激活CD40的抗體的小鼠中可以檢測(cè)出E1B特異性CTL(圖2c)，并且在接受對(duì)照抗體中不能檢出(圖2d)。
還研究了在CD4耗盡的小鼠中激活CTL時(shí)對(duì)抗-CD40抗體的需要是否能被促炎細(xì)胞因子的有效誘導(dǎo)劑細(xì)菌性脂多糖(LPS)(50μg靜脈內(nèi))，或通過(guò)用Ad5EI-BALB/c MEC免疫之后給藥IL-2(在不完全弗氏佐劑中1×105U，皮下)取代。然而用FGK45處理的缺失CD4的小鼠呈現(xiàn)出強(qiáng)的E1B特異性CTL活性，LPS和IL-2處理都不能導(dǎo)致可檢出的CTL引發(fā)(未顯示)。
CD40在B細(xì)胞上的連接反應(yīng)正調(diào)節(jié)它們的共同刺激活性，這暗示這些細(xì)胞在通過(guò)用激活CD40的抗體處理恢復(fù)引發(fā)CTL中的作用。為了解釋該問(wèn)題，將缺少成熟B細(xì)胞的B6MT小鼠用異源Ad5EI-BALB/c MEC免疫。E1B特異性CTL的交叉引發(fā)不需要成熟B細(xì)胞(圖3a)。但是，當(dāng)缺失CD4+細(xì)胞時(shí)，該B細(xì)胞有缺陷的小鼠不產(chǎn)生E1B特異性CTL反應(yīng)(圖3b)。用FGK45單克隆抗體通過(guò)CD40的激活完全恢復(fù)了CD4缺失型的能力。MT小鼠引發(fā)E1B特異性CTL(圖3c)。因此不需要B細(xì)胞作為APC或用于這種模型系統(tǒng)中交叉引發(fā)的輔助細(xì)胞，它們也不需要在沒(méi)有CD4+輔助T細(xì)胞的情況下交叉引發(fā)CTL時(shí)CD40所介導(dǎo)的恢復(fù)。這些結(jié)果證明了通過(guò)CD40的來(lái)自骨髓的APC的激活在E1B特異性CTL的交叉引發(fā)中可以回避對(duì)CD4+T-輔助細(xì)胞的需要。
實(shí)施例2通過(guò)CD40L-CD40途徑阻斷CD4+輔助T細(xì)胞與APC的相互作用防止在正常小鼠中發(fā)生抗原特異的CTL反應(yīng)如果該CD40L-CD40相互作用代表幫助CTL的CD4+輔助T細(xì)胞所用的生物途徑，那么希望阻斷CD4+T細(xì)胞通過(guò)CD40L-CD40相互作用與APC相互作用的能力，從而消除E1B特異性CTL反應(yīng)在正常小鼠中引發(fā)。將B6小鼠用Ad5EI-BALB/c MEC免疫，然后或者用CD40L封閉的抗體MR1或者用對(duì)照抗體處理。與接受對(duì)照抗體的小鼠中看到的有效CTL引發(fā)(圖4b)相比，CD40L封閉的結(jié)果大大地降低了E1B特異性CTL反應(yīng)(圖4a)。CD40通過(guò)FGK45發(fā)出信號(hào)之后，CD40L封閉所誘導(dǎo)的引發(fā)缺陷完全得到恢復(fù)(圖4c)。因此通過(guò)CD40L誘導(dǎo)的CTL引發(fā)的缺陷在于TH細(xì)胞不能傳遞(而不是接收)CD40L所介導(dǎo)的信號(hào)。
實(shí)施例3將肽給藥后E1B特異性CTL的無(wú)應(yīng)答性使用前面描述的模型系統(tǒng)(Toes等人，J.Immunol.1563911(1996))。已說(shuō)明用IFA中的來(lái)自Ad5E1A的CTL表位SGPSNTPPEI(SEQ ID NO2)皮下接種疫苗防止了小鼠長(zhǎng)出表達(dá)Ad5E1A的腫瘤。這說(shuō)明該E1A/IFA疫苗誘導(dǎo)抑制而不是誘導(dǎo)E1A-特異性CTL免疫。而且，向T細(xì)胞受體(TCR)轉(zhuǎn)基因的小鼠給藥該E1A/IFA，這樣表達(dá)E1A-特異性CTL克隆的TCRα和β鏈，因此強(qiáng)烈地抑制了腫瘤-特異性CTL所介導(dǎo)的免疫。這些試驗(yàn)檢測(cè)了肽給藥到單克隆CTL群體的效果。為了證實(shí)在多克隆CTL水平皮下接種E1A-肽疫苗是否也誘導(dǎo)E1A-特異性CTL耐受性，向野生型(wt)C57BL/6小鼠注射E1A-肽(圖5a和5b)或?qū)φ针?圖5c和5d)。一天后對(duì)這些小鼠用在其表面表達(dá)高水平E1A-肽的同源細(xì)胞系加強(qiáng)(圖5b和5d)。將該細(xì)胞系注射到用對(duì)照肽引發(fā)的小鼠中容易地誘導(dǎo)E1A-特異性免疫(圖5d)。但是，在注射該E1A/IFA疫苗之后小鼠增加E1A-特異性CTL反應(yīng)的能力被廢除(圖5b)。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，注射該E1A-肽不僅導(dǎo)致在TCR-轉(zhuǎn)基因小鼠中而且在表達(dá)多克隆E1A-特異性T細(xì)胞所有組成成分的小鼠中的E1A-特異性耐受性。
由于皮下注射該E1A/IFA疫苗導(dǎo)致了全身CTL耐受性，因此研究了該E1A-肽是否分散全身并呈遞到周邊的前體CTL上。因此，對(duì)小鼠皮下注射乳化于IFA中的E1A-肽或來(lái)自人乳頭瘤病毒(HPV)16E7的對(duì)照肽。16個(gè)小時(shí)后從這些小鼠中分離脾細(xì)胞并將其用作體內(nèi)E1A-特異性CTL克隆的刺激細(xì)胞。來(lái)自皮下注射有E1A-肽的小鼠的脾細(xì)胞誘導(dǎo)特異性繁殖，然而來(lái)自皮下注射有E7-肽的小鼠的脾細(xì)胞不能這樣做(圖6)。而且，對(duì)照CTL克隆在來(lái)自注射有E1A的小鼠的脾細(xì)胞上不繁殖(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。因此，這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，皮下注射的IFA中的E1A-肽主要通過(guò)脾細(xì)胞向外周系統(tǒng)地分布。
從上面所述的E1A-肽疫苗的耐受性效果的角度來(lái)看，存在一問(wèn)題，CD40在體內(nèi)的觸發(fā)是否足夠地防止了CTL的周邊耐受性并恢復(fù)了CTL引發(fā)。因此，研究了耐受性肽的注射與體內(nèi)CD40觸發(fā)一起是否能夠防止導(dǎo)致腫瘤-特異性CTL免疫的周圍CTL耐受性的誘導(dǎo)。
在實(shí)施例1和2中已顯示了，體內(nèi)CD40的觸發(fā)能夠代替引發(fā)輔助依賴性CTL反應(yīng)時(shí)對(duì)CD4+T輔助細(xì)胞的需求。由于在防止周圍CTL耐受性誘導(dǎo)時(shí)已包含CD4+T細(xì)胞所介導(dǎo)的輔助活性，因此本發(fā)明人解決了體內(nèi)CD-40的觸發(fā)是否足夠防止周圍E1A-特異性CTL的耐受性的問(wèn)題。為此，對(duì)小鼠注射該E1A/IFA疫苗和活化抗-CD40mAb FGK-45。接受這種組合的小鼠的E1A-特異性CTL反應(yīng)急劇增加(圖7b和7e)，然而僅僅接受該E1A/IFA疫苗(圖7e)或mAb的小鼠沒(méi)有增加(未顯示)。E1A/IFA疫苗和抗-CD40mAb的組合在CD40-有缺陷的小鼠中不能引出CTL(圖7c和7d)。而且，該E1A/IFA疫苗與同種型配對(duì)的對(duì)照mAb(圖6a)或IL-2的共注射不能將該E1A/IFA疫苗誘導(dǎo)的CTL耐受性轉(zhuǎn)變成CTL引發(fā)(未顯示)。在僅用E1A-肽、或者E1A-肽加抗-CD40接種疫苗的動(dòng)物中對(duì)該E1A-表位的反應(yīng)的范圍和差異顯示在圖7e中。這樣，全身CD40的激活能夠?qū)㈦乃T導(dǎo)的周圍CTL耐受性倒轉(zhuǎn)成肽和腫瘤-特異性CTL所介導(dǎo)的免疫。
E1A-特異性免疫的誘導(dǎo)與用含有E1A-肽的與PE共軛的H-2-Db-四聚體(Db/E1A)染色的接種疫苗的小鼠的脾臟中存在CD8+T細(xì)胞有很大關(guān)系。接種疫苗后10天內(nèi)，通過(guò)流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)能夠在注射E1A-肽和抗-CD40mAb的小鼠中檢測(cè)出用Db/E1A四聚體染色的CD8+T細(xì)胞，但在僅注射E1A-肽的小鼠中不能檢出(未顯示)。在注射E1A-肽的小鼠中，用Db/E1A四聚體染色的CD8+細(xì)胞的百分比為約3％。在用整腺病毒(它誘導(dǎo)有效E1A-特異性免疫)接種疫苗的小鼠中，檢測(cè)出可比較量的Db/E1A四聚體反應(yīng)性CD8+脾臟細(xì)胞。這些結(jié)果說(shuō)明，E1A-特異性CD8+T細(xì)胞在接受E1A/IFA疫苗和抗-CD40mAb的小鼠中的擴(kuò)展大致為或等于在接種病毒的動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的。
實(shí)施例4CD40的觸發(fā)大大提高了肽基抗癌疫苗的功效盡管上述的發(fā)現(xiàn)顯示了通過(guò)CD40觸發(fā)的幫助足夠防止了給藥耐受原肽疫苗之后CTL的耐受性，但是他們沒(méi)有解決正常誘導(dǎo)保護(hù)性免疫而不是耐受性的抗癌疫苗的功效是否能通過(guò)CD40的激活得到提高。檢測(cè)了體內(nèi)CD40的觸發(fā)對(duì)用來(lái)自HPV16 E7的肽的接種疫苗的結(jié)果是否有益。用這種肽接種疫苗將誘導(dǎo)抗用HPV16轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞攻擊的保護(hù)性CTL所介導(dǎo)的免疫。而且，當(dāng)該肽負(fù)載在體外激活的DC上時(shí)能夠?qū)⒃撾挠糜谥委煼桨?，這暗示當(dāng)該抗腫瘤反應(yīng)通過(guò)激活的DC呈遞時(shí)其強(qiáng)度得到加強(qiáng)。
與僅用E7-肽處理的小鼠(未顯示)相比，接受E7-肽并伴隨CD40觸發(fā)的小鼠引起了更有效的CTL反應(yīng)，這說(shuō)明CD40觸發(fā)也提高了HPV16 E7-肽疫苗的功效，并證實(shí)了具有上述E1A肽的發(fā)現(xiàn)。而且，經(jīng)皮下注射僅帶有HPV16 E7-肽(空心方框)的CD40-HPV16 E6/E7轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞處理6天后的小鼠能夠使腫瘤生長(zhǎng)減慢，但是最終大多數(shù)動(dòng)物死于腫瘤(圖8)。但是，當(dāng)將HPV16E7-肽接種疫苗與抗-CD40mAb的注射相結(jié)合時(shí)，腫瘤的生長(zhǎng)明顯降低，并且10只小鼠中有7只排斥腫瘤，然而注射有對(duì)照肽和抗-CD40mAb的動(dòng)物不能控制腫瘤生長(zhǎng)。這些結(jié)果顯示了當(dāng)免疫與體內(nèi)CD40觸發(fā)組合時(shí)能夠明顯提高接種機(jī)制的效果。這些數(shù)據(jù)為癌癥患者提供了開(kāi)發(fā)極有效并新穎的抗腫瘤疫苗的基礎(chǔ)。
前面的描述、術(shù)語(yǔ)、解釋和實(shí)施例僅為舉例并不是限制性的。本發(fā)明包括前述實(shí)施方式的所有已知和未知的等價(jià)物。本發(fā)明僅通過(guò)以下的權(quán)利要求書(shū)而不是通過(guò)本文的任意其它部分或任意其它文獻(xiàn)中的任意描述來(lái)限制。
序列表<110>考內(nèi)里斯J.M.梅烈夫瑞因克.歐夫林加瑞內(nèi).托艾斯史蒂芬P.斯考因伯格馬克.德.鮑爾<120>用于治療腫瘤的CD40結(jié)合分子和CTL肽<130>98-4-pct<150>06/086,625<151>1998-05-23<160>3<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>9<212>PRT<213>小鼠<220>
<400>1Val Asn Ile Arg Asn Cys Cys Tyr Ile1 5<210>2<211>10<212>PRT<213>小鼠<400>2Ser Gly Pro Ser Asn Thr Pro Pro Glu Ile1 5 10<210>3<211>9<212>PRT<213>乳頭瘤病毒<400>3Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe1 權(quán)利要求
1.一種CD40結(jié)合分子在用于治療腫瘤或傳染病的藥用組合物的制備中的用途，其中，所述治療還包括激活CTL的肽的給藥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述CD40結(jié)合分子和激活CTL的肽被單獨(dú)給藥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中，所述CD40結(jié)合分子為抗CD40抗體或其片斷、肽、寡核苷酸或有機(jī)分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其中，所述抗CD40抗體為選自由VH、VL、Fv、Fd、Fab、(Fab)2和scFc片斷所組成的組中的抗體的片斷。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其中，所述抗CD40抗體為人、人源化、嵌合或去免疫抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，所述CD40結(jié)合分子直接給藥到腫瘤。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，所述激活CTL的肽以基因構(gòu)建體的形式給藥，所述基因構(gòu)建體用于編碼激活CTL的肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中，所述基因構(gòu)建體被插入到逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或細(xì)小病毒中，或者，其中所述基因構(gòu)建體被插入到適宜脂質(zhì)體中，或者可選擇地為被插入到病毒或質(zhì)粒載體中的基因構(gòu)建體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，激活CTL的肽為來(lái)自腺病毒且具有序列SGPSNTPPEI的序列編號(hào)為SEQ ID NO2的EIA肽或來(lái)自人體乳頭瘤病毒16型且具有序列RAHYNIVTF的序列編號(hào)為SEQ ID NO3的HPV16 E7肽。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種治療腫瘤或傳染病的方法和組合物，其中該組合物包括CD40結(jié)合分子以及CTL活化肽，例如，腫瘤抗原。該組合物用于增強(qiáng)肽腫瘤疫苗的抗腫瘤效力，或者用于活化CTL以便活化的CTL可起抗腫瘤細(xì)胞或感染細(xì)胞的作用。CD40結(jié)合分子包括抗體分子，以及其同源物，類似物和修飾的或衍生的形式，包括如Fab，(Fab’)
文檔編號(hào)C12N15/86GK1762492SQ20051007527
公開(kāi)日2006年4月26日 申請(qǐng)日期1999年5月21日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月23日
發(fā)明者考內(nèi)里斯J·M·梅烈夫, 瑞因克·歐夫林加, 瑞內(nèi)·托艾斯, 史蒂芬P·斯考因伯格 申請(qǐng)人:萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心, 泰諾士公司