專利名稱：包含彈性肽的生物分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及已插入了彈性肽從而當(dāng)該肽收縮或伸展時特征改變的生物分子，尤其是抗體。本發(fā)明還涉及編碼這種生物分子的DNA以及使用這種生物分子的方法。
能夠可逆收縮和伸展的彈性結(jié)構(gòu)在自然界是眾所周知的，在例如肌肉、動脈、肺、韌帶和皮膚中均有發(fā)現(xiàn)。收縮和伸展由構(gòu)成彈性結(jié)構(gòu)的分子(如彈性蛋白)的二級結(jié)構(gòu)的改變引起。已經(jīng)進行了可觀的工作以闡述這種改變的本質(zhì)和發(fā)生轉(zhuǎn)變的肽序列。例如，彈性蛋白包含重復(fù)的疏水性單體，典型的有(VPGVG)n，其中n在豬和雞中為11-13。
Urry已經(jīng)廣泛地研究了合成的彈性蛋白聚合物，而且在“酶學(xué)方法”(Methods in Enzymology，1982，Sidney Colowick和Nathan Kaplan主編，學(xué)術(shù)出版社，p673-716)、生物物理學(xué)和分子生物學(xué)進展(Prog.Biophys.Molec.Biol.，57，p23-57)和Angew.Chem.Int.Ed.Engl.(1993，32，p819-841)中回顧了結(jié)果。由彈性蛋白五肽形成的合成性彈性蛋白聚合物在溫度低于24℃時是可溶的(當(dāng)n＝150時)，但是在更高的溫度下沉淀形成凝聚層(稠密的粘彈性狀態(tài))。凝聚過程是容易逆轉(zhuǎn)的。水分子與蛋白質(zhì)疏水部分的結(jié)合是放熱過程。因此，當(dāng)熱量增加超過特定的轉(zhuǎn)變溫度時，將導(dǎo)致結(jié)合的水分子釋放以及分子內(nèi)和分子間疏水相互作用增強。
在彈性蛋白的情況中，加熱破壞了伸展的更無序的疏水性水合結(jié)構(gòu)而且聚合物在分子內(nèi)收縮。收縮如下產(chǎn)生首先折疊形成重復(fù)的II型β-轉(zhuǎn)角，形成每圈含大約3個VPGVG五聚體的β-螺旋，然后形成分子間纏繞纖維。多肽隨溫度升高而有序性增加的這種現(xiàn)象叫做反向溫度轉(zhuǎn)變，而且對于特定的分子在特定的溫度發(fā)生。然而，如果其它環(huán)境參數(shù)改變了，這個溫度也會改變。
通過改變彈性聚合物本身或其環(huán)境從而改變其疏水性，可以控制轉(zhuǎn)變溫度(Tm)(Urry等人，1991，美國化學(xué)協(xié)會雜志(J.Am.Chem.Soc.)，113，p4346-4348；Luan等人，1990，生物聚合物(Biopolymers)，29，p1699-1706)。因而，Tm可以通過以下方法改變，如磷酸化(Pattanaik等人，1991，生物化學(xué)及生物物理學(xué)研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Comm.)，178，p539-545)、輔基的電化學(xué)或化學(xué)還原(Urry等人，1992，生物化學(xué)及生物物理學(xué)研究通訊，188，p611-617；Urry等人，1995，生物化學(xué)及生物物理學(xué)研究通訊，210，p1031-1039；Urry等人，1994，生物化學(xué)及生物物理學(xué)研究通訊，204，p230-237)或光化學(xué)反應(yīng)，通過改變壓力(Urry等人，1993，化學(xué)物理學(xué)通信(Chemical Physics Letters)，201，p336-340)、pH(Urry等人，1988，美國國家科學(xué)院進展(Proc.Natl.Acad.Sci.)，85，p3407-3411)、聚合物濃度或聚合物組成(Urry等人，1992，生物聚合物，32，p1243-1250；Urry等人，1986，生物化學(xué)及生物物理學(xué)研究通訊，141，p749-755)或者通過加入鹽(Luan等人，1991，生物聚合物，31，p465-475)或有機溶質(zhì)(Urry，1992，生物物理學(xué)及分子生物學(xué)進展，57，p23-57和Urry，1993，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，32，p819-841)。
由于Tm改變，特定系統(tǒng)的溫度可以維持恒定，而由上述參數(shù)之一的改變引發(fā)在不同狀態(tài)間的轉(zhuǎn)變，從而轉(zhuǎn)變溫度低于(或高于)系統(tǒng)溫度，發(fā)生收縮(或伸展)。因而，如pH或壓力的變化可以用來引發(fā)或誘導(dǎo)彈性肽的收縮或伸展。
也已經(jīng)鑒定了具有相似性質(zhì)的非肽聚合物，可以利用環(huán)境參數(shù)(包括溫度)，在轉(zhuǎn)變溫度以上誘導(dǎo)狀態(tài)轉(zhuǎn)變以形成不溶的聚集體。這也是由疏水相互作用引起的(Feil等人，1993，高分子(Macromolecules)，26，p2496-2500)。
特別地，聚N-異丙基丙烯酰胺(polyNIPAAm)聚合物已經(jīng)用于多種用途，包括結(jié)合到多肽上以產(chǎn)生多肽-聚合物偶聯(lián)物。這種偶聯(lián)物被建議通過利用狀態(tài)轉(zhuǎn)變并因此導(dǎo)致的結(jié)合在多肽上的聚合物的不溶性而用來分離來自實驗系統(tǒng)的多肽(如純化中)，或者用來送遞藥物(Ding等人，1996，生物偶聯(lián)物化學(xué)(Bioconjugate Chem.)，7，p121-125；Matsukata等人，1996，生物偶聯(lián)物化學(xué)，7，p96-101；Chen和Hoffman，1995，高分子化學(xué)及物理學(xué)(Macromol.Chem.Phys.)，196，p1251-1259；Chen和Hoffman，1995，自然，373，p49-52；Chen和Hoffman，1993，生物偶聯(lián)物化學(xué)，4，p509-514以及Park和Hoffman，1993，生物材料科學(xué)雜志聚合物版(J.Biomater.Sci.Polymer Edn.)，4(5)，p493-504)。Stayton等人(1995，自然，378，p472-474)已經(jīng)將polyNIPAAm偶聯(lián)到鏈霉親和素上，當(dāng)收縮時可以通過聚合物的折疊到達活性位點上，避免配基生物素進入，從而防止其結(jié)合到活性位點上。
當(dāng)彈性肽收縮時，長度縮短50％以上。彈性蛋白聚合物可以提起超過它們干重1000倍的重量、進行工作和產(chǎn)生動作。一個單體VPGVG發(fā)生轉(zhuǎn)變涉及的能量，據(jù)報道為2.0kcal/mol左右(Chang和Urry，1988，化學(xué)物理學(xué)通信，147，p395-400)。有人提出，彈性肽將熱量/化學(xué)能轉(zhuǎn)變成動作的能力使得它們具有實用性，例如在藥物送遞中用作彈性生物分子機器、用于生物分子的脫鹽作用和用作機械化學(xué)引擎等(Urry，1993，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，32，p819-841；Urry，1995，科學(xué)美國人(Scientific American)，272，p44-49)。然而這些分子的作用被限制于使用幾乎完全由彈性多肽組成的合成材料，只涉及它們的彈性、能障、模板和修補性質(zhì)的應(yīng)用。
現(xiàn)已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，可以將彈性肽摻入到生物分子中，當(dāng)肽在伸展和收縮狀態(tài)之間轉(zhuǎn)變時，生物分子的三級結(jié)構(gòu)改變，因此影響生物分子的特征或性質(zhì)。這可能是通過改變蛋白質(zhì)有關(guān)區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)或通過改變生物分子內(nèi)某些結(jié)構(gòu)域相互之間的空間關(guān)系，或者兩事件的組合而產(chǎn)生的。
因此，從一方面看，本發(fā)明提供了含有功能性部分和至少一個插入的氨基酸序列(包含在一個或多個環(huán)境參數(shù)適當(dāng)變化時可收縮的彈性肽)的生物分子，其中當(dāng)誘導(dǎo)插入序列收縮或伸展時，功能性部分的性質(zhì)或特征改變。
或者可以這樣看，本發(fā)明在這個方面提供了含有插入了至少一個氨基酸序列的第一部分的生物分子，所述氨基酸序列中包含當(dāng)一個或多個環(huán)境參數(shù)適當(dāng)變化時可收縮的彈性肽，其中當(dāng)誘導(dǎo)該插入序列收縮或伸展時所述第一部分的性質(zhì)或特征改變，或者可替代地，本發(fā)明提供因插入至少一個氨基酸序列而修飾的生物分子，所述氨基酸序列中包含當(dāng)一個或多個環(huán)境參數(shù)適當(dāng)變化時可收縮的彈性肽，其中當(dāng)誘導(dǎo)該插入序列收縮或伸展時所述生物分子的性質(zhì)或特征改變。
正如以前提到的，只有大的彈性聚合物被認(rèn)為具有某些實用性，而且它們已經(jīng)被用于這樣的應(yīng)用中，如藥物送遞或修補物質(zhì)(例如血管修補)。這種明顯的限制已經(jīng)必然地限制了彈性聚合物被認(rèn)為有用的應(yīng)用。例如，生物分子諸如蛋白質(zhì)中，可以插入彈性聚合物而不破壞蛋白質(zhì)要求的二級和三級排列的區(qū)域有限。因此，以前認(rèn)為不可能將彈性肽引入這些生物分子中而不會完全改變分子的結(jié)構(gòu)和/或功能。
然而出乎意料地發(fā)現(xiàn)，具有少至單個彈性肽重復(fù)單位(或可收縮單位)的小寡聚體仍以與具有多個重復(fù)單位的大聚合物相似的方式應(yīng)答外部刺激，進行伸展和收縮。例如，可以使用含有1-10個(如1-5個)“可收縮單位”的彈性肽，其中每個“可收縮單位”包含3-6個氨基酸。因此這些小的寡聚體可以插入到生物分子中而不顯著影響生物分子的完整性，而且還將可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)變機制引入到分子中。
“生物分子”意指任何分子或分子的集合，如展示生物功能并包含天然產(chǎn)生的組分或者它們的類似物或衍生物的復(fù)合物。此處定義的生物分子至少含有兩個部分，第一部分如上文定義發(fā)揮生物功能，在此處稱作“功能部分”。此功能性可能由一個或多個分子產(chǎn)生，如酶的亞基。第二部分是插入的彈性肽。這些功能包括酶促活性、結(jié)合、結(jié)構(gòu)、活化和抑制作用。因此，本發(fā)明的生物分子的功能部分包括例如，酶、受體、抗體、輔因子、抑制劑、展示獨特表位的抗原、調(diào)控蛋白及其肽(功能變體)或者具有這些功能的衍生物或類似物。
生物分子不限于多肽，還包括例如核酸分子，如插入了具有期望的彈性性質(zhì)的肽的DNA模板序列或引物。生物分子可以具有一種以上功能，而且可以包含不同部分，如融合蛋白、或連接到多肽上的核酸序列、或連接到小化學(xué)成分(諸如半抗原)上的多肽。正如上文提到的，生物分子可以具有多于一種組成分子或成分。它們可以是也可以不是獨立具有生物功能，例如包含一條以上多肽鏈的蛋白質(zhì)。
天然組分的類似物和衍生物包括那些具有相似性質(zhì)的，諸如使用非天然氨基酸衍生得到的多肽。
優(yōu)選本發(fā)明生物分子的第一部分是天然分子，例如抗體。這些分子包括它們的功能部分、區(qū)域或結(jié)構(gòu)域(功能變體)，諸如抗體的可變結(jié)構(gòu)域或可變區(qū)，或者可以小如肽，例如抗原決定簇。這些天然產(chǎn)物的衍生物和類似物及其變體可以通過使用非天然組分、改變天然序列而產(chǎn)生，并且可以通過合成方法產(chǎn)生。天然序列可以通過取代一個或多個它們的組成成分(如氨基酸或核酸)，或通過改變不同結(jié)構(gòu)域的相對排列(可選擇地加入其它序列)而改變，如單鏈抗體的產(chǎn)生。本發(fā)明的功能部分和生物分子優(yōu)選地包含一或多個多肽。
“插入的”，正如此處使用的，指包括氨基酸序列作為生物分子結(jié)構(gòu)一部分。因此“插入的”氨基酸序列可以連接到分子(或構(gòu)成生物分子的分子之一)的末端，與其一起形成生物分子；或者插入物可以連接到分子內(nèi)。當(dāng)生物分子內(nèi)存在多于一個分子時，氨基酸插入物可以連接或不連接到提供功能部分的分子上。優(yōu)選的連接是共價的。尤其優(yōu)選地，氨基酸序列被插入到組成成分如氨基酸或核酸之間，形成至少是與剩余生物分子一部分成為連續(xù)鏈的一條鏈。
可以理解，在對生物分子結(jié)構(gòu)破壞最低限度化的許多情況中，插入的氨基酸序列應(yīng)當(dāng)取代被插入分子的一部分，例如取代功能部分的一部分。這方面形成本發(fā)明優(yōu)選的特征。例如，在多肽生物分子的情況中，插入的序列可以取代從宿主多肽中去掉的相同或相似數(shù)目的氨基酸殘基，由此保持氨基酸數(shù)目大致相同，并且使得生物分子甚至在插入彈性肽之后仍有正?？臻g排列。這當(dāng)然要求插入的位置是適當(dāng)選擇的，這將在下文中更詳細(xì)的考慮。
用于插入的“氨基酸序列”，正如上文敘述的，包括彈性肽，但沒有必要只由彈性肽組成。因此可以在肽的一側(cè)或兩側(cè)使用側(cè)翼區(qū)域，以便例如促進與待插入該序列的分子的結(jié)合，提供親合目的的識別位點，提供切割易受攻擊區(qū)域(如蛋白酶或酸/堿敏感)，模擬插入序列將取代的區(qū)域，或者為了方便。這些側(cè)翼區(qū)域優(yōu)選比較小，例如長度為1-100個氨基酸，尤其優(yōu)選長度為1-20個氨基酸殘基。尤其優(yōu)選N末端的側(cè)翼區(qū)域是GVG或GGVG。雖然不希望被理論束縛，但看來這種序列可能能夠成核折疊β-轉(zhuǎn)角。
正如此處使用的，“彈性肽”指展示可誘導(dǎo)的、由伸展?fàn)顟B(tài)到收縮狀態(tài)的可逆收縮的肽，這種收縮通過減少每個可收縮單位的肽主鏈末端之間的距離實現(xiàn)，由溫度、pH或壓力的變化誘導(dǎo)，如升高溫度時收縮。應(yīng)當(dāng)注意當(dāng)“彈性肽”在生物分子內(nèi)原位展示可逆收縮時，進行可逆收縮的自由度可能受限制，導(dǎo)致完全或部分不可逆性。優(yōu)選收縮達到全長減小大于20％。尤其優(yōu)選達到減少＞40％。每個可收縮單位(或重復(fù)單位)指當(dāng)誘導(dǎo)時能夠收縮的最小肽序列，如VPGVG，它可以與相同或不同序列連接。
可以被改變來誘導(dǎo)肽的收縮或伸展的“環(huán)境參數(shù)”，包括那些已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能引起合成的彈性蛋白聚合物發(fā)生狀態(tài)轉(zhuǎn)變的參數(shù)，諸如溫度、壓力、pH的變化、加入鹽或有機溶質(zhì)(如改變分析物濃度)、或者通過光化學(xué)反應(yīng)或電化學(xué)或化學(xué)還原。環(huán)境，正如此處提及的，表示生物分子的局部環(huán)境，即溶液或它所處的其它載體的物理參數(shù)。這些參數(shù)可以提供局部環(huán)境的各種變化的指示劑，如由于分析物濃度的變化引起的電流或顏色的變化。
應(yīng)當(dāng)理解，引起誘導(dǎo)要求的特殊變化將依賴于其它環(huán)境參數(shù)的狀態(tài)，因為它們在影響肽的疏水性相互作用中存在相互關(guān)系，而且將受本發(fā)明的生物分子中選擇的彈性肽的影響。
當(dāng)誘導(dǎo)插入的肽收縮或伸展時，功能部分的“性質(zhì)或特征改變”包括功能部分的結(jié)構(gòu)或幾何學(xué)發(fā)生可逆的和不可逆的變化，以至于那個區(qū)域產(chǎn)生的生物活性受到影響。這包括活性的喪失、活性的升高或降低、或者活性的改變，以至于具有不同的特征，如對特殊的酶促或結(jié)合反應(yīng)展示不同的動力學(xué)參數(shù)。
誘導(dǎo)收縮或伸展還可能引起功能部分的以前沒有觀察到的活性，其潛在的或受抑制的活性被引發(fā)或增強。這可能是由于功能部分各不同結(jié)構(gòu)域(可能在一個或多個分開的分子上)之間相互作用的空間改變引起的，通過功能部分單個結(jié)構(gòu)域的修飾而影響它與其它離散分子(如結(jié)合伙伴)的相互作用引起的，或通過改變功能部分與彈性肽的空間關(guān)系進行修飾引起的。
通過例如適當(dāng)選擇彈性肽，使得肽的誘導(dǎo)引入不能逆轉(zhuǎn)成伸展?fàn)顟B(tài)的β-轉(zhuǎn)角，可以引起不可逆變化。
適用于本發(fā)明的合適的彈性肽變化很大，而且只要求它們具有上述可誘導(dǎo)的可收縮特征，肽優(yōu)選地具有序列(XP/G(X)m)n，其中XP/G(X)m代表可收縮單位，其中的P/G是脯氨酸或甘氨酸，每個X是任何氨基酸而且可以是相同的或不同的，m是1-10的整數(shù)，n是1-100的整數(shù)，序列中的每個單位可以是相同的或不同的。
優(yōu)選地每個X選自甘氨酸、纈氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸以及它們的衍生物，如β-丙氨酸，或其它疏水氨基酸殘基，優(yōu)選脂族疏水氨基酸殘基。尤其優(yōu)選地，X是甘氨酸、纈氨酸或異亮氨酸。因此，在一個優(yōu)選的方面中，該通式序列可以是(XPGXG)n(即(X)m＝GXG)或(XPGX)n(即(X)m＝GX)。尤其優(yōu)選地，序列XP/G(X)m是序列VPGVG(即(X)m＝GVG)、VPGV或IPGVG?？梢岳斫猓热皇褂玫膹椥噪膽?yīng)具有獨特的收縮轉(zhuǎn)變溫度(取決于它的序列)，因此可以相應(yīng)地修飾一個或多個X殘基來達到期望的收縮溫度，如使用更多的親水氨基酸殘基。
其它可用于本發(fā)明的合適的彈性肽具有序列(PEXK)n或(XKEXPEKX)n(分別衍生自可收縮的肌蛋白質(zhì)tintin的序列和已知會發(fā)生冷變性并且當(dāng)加熱時形成α-螺旋的人造多肽)，其中P、E和K分別指脯氨酸、谷氨酸和賴氨酸，而且每個X可以是相同的或不同的，n如上文說明的。優(yōu)選在后一個序列中X是亮氨酸或纈氨酸。尤其優(yōu)選序列PEXK是PEVK，序列XKEXPEKX是LKELPEKL。
優(yōu)選m是1-6，尤其優(yōu)選1-3。優(yōu)選n＝1-10，尤其優(yōu)選1-5。尤其優(yōu)選彈性肽的長度是5-25個氨基酸，如5、15或25。特別優(yōu)選使用長度為5-100個氨基酸、特別是8-20個氨基酸的氨基酸插入物。
本發(fā)明的生物分子可以通過化學(xué)合成產(chǎn)生，例如通過手工或自動合成適當(dāng)多肽鏈或多肽/核酸分子而產(chǎn)生。合成可以在溶液中或在固相支持物上(使用本領(lǐng)域已知的合適固相)進行。合成或天然產(chǎn)生的完整分子的各個分立部分，可以通過化學(xué)反應(yīng)共價連接起來。或者，當(dāng)生物分子完全由一條多肽鏈組成時，則可以通過表達編碼該生物分子的DNA序列產(chǎn)生。含有編碼本發(fā)明生物分子的序列的核酸分子形成本發(fā)明的另一方面。含有這些核酸分子的載體DNA形成本發(fā)明的又一特征。這些載體可以用來表達本發(fā)明的生物分子。
本發(fā)明生物分子的應(yīng)用極其多樣，而且是建立在要求生物功能發(fā)生變化的任何應(yīng)用基礎(chǔ)之上的，這些應(yīng)用形成本發(fā)明的又一方面。由于這種變化可以通過，例如，壓力、溫度或pH的變化誘導(dǎo)，所以可以將誘導(dǎo)型觸發(fā)引入到甚至最敏感的系統(tǒng)中。這些應(yīng)用中的大多數(shù)涉及引入彈性肽轉(zhuǎn)換器到多肽中。這樣，當(dāng)肽收縮或伸展時，這些多肽的功能部分提供的生物活性可以被修飾(改變(如改變特異性)、增高或降低活性)。
正如前面提及的，優(yōu)選將彈性肽插入到生物分子的分子(之一)中不影響該分子功能的位點處。因此，例如，當(dāng)將插入物置于這些分子內(nèi)并與它們形成連續(xù)鏈時，插入點通常是不會顯著影響構(gòu)成功能部分的結(jié)構(gòu)域的三級結(jié)構(gòu)的位點。在蛋白質(zhì)中，這可以是表面環(huán)(Hawrani等人，1994，Tibtech，12，p207-211)，或在下文描述的單鏈抗體實例中是接頭區(qū)。表面環(huán)長度通常為2-12個氨基酸，可以被相似大小的彈性肽取代。
正如此處實施例描述的，基于葡萄球菌蛋白A的IgG結(jié)合性結(jié)構(gòu)域B的Fc結(jié)合性三螺旋束Z結(jié)構(gòu)域(Nilsson等人，1987，蛋白質(zhì)工程(ProteinEngng.)，1，p107-113)具有可以容易地被取代而不顯著影響該分子表面幾何性質(zhì)或功能的表面區(qū)域。
被引入彈性肽的多肽可以是，例如，當(dāng)收縮或伸展時轉(zhuǎn)變成有活性或無活性的形式、或者活性更高/更低的形式、或改變對特殊底物、抑制劑、激活劑或輔助因子的特異性的酶。這可能是由酶或酶的相關(guān)結(jié)構(gòu)域的二級或三級結(jié)構(gòu)改變引起的，或者由影響酶內(nèi)各結(jié)構(gòu)域的相對排列或酶結(jié)構(gòu)域的可接近程度引起的，由酶的其它部分或收縮的/伸展的彈性肽本身引起的。
有來自各種生物體的、具有明確活性的越來越多的酶可供利用，這使得這些催化劑在許多體外和體內(nèi)系統(tǒng)中被廣泛使用。值得注意地，分子生物學(xué)領(lǐng)域中的檢測和分析方法要求使用至少一種涉及DNA/RNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的酶。精確控制這些酶的活性通常由精確了解它們對pH、溫度、離子強度和輔助因子的要求并考慮對它們的活性比較重要的其它標(biāo)準(zhǔn)來實現(xiàn)。不只是控制這些酶激活的能力是重要的，滅活這些酶的能力(通常是可逆的)也是重要的。開啟和關(guān)閉酶活性的能力對特定分析或診斷實驗的正確進行通常是至關(guān)重要的。
作為此處描述的發(fā)明的結(jié)果，酶反應(yīng)的生物活性現(xiàn)在可以由轉(zhuǎn)換器機制來控制，從而這些反應(yīng)可以由改變插入肽的狀態(tài)來開啟或關(guān)閉。這避免了以某些其它方式除去酶或引入抑制劑或滅活酶(通常是不可逆的)。實例包括聚合酶在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中的使用，和反應(yīng)起始后只需要在反應(yīng)已經(jīng)達到某個溫度時才顯示它們的活性以降低非均質(zhì)產(chǎn)物產(chǎn)量的相關(guān)技術(shù)。這通常通過使用熱啟動方法克服，其中聚合酶只在溫度升高后被激活，這可以通過在達到該溫度時向反應(yīng)混合物中加入聚合酶或至關(guān)重要的組分而完成。本發(fā)明提供了另一種可供選擇的熱啟動方法。
此外，存在幾種由涉及鉸鏈移動的構(gòu)象變化調(diào)控的酶，如乳酸脫氫酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、甘油三酯脂肪酶、腺苷酸激酶(Gerstein，M.，等人，1993，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)，229，p494-501，及其參考文獻)。彈性肽可以用于取代環(huán)、鉸鏈和連接處，此后它將對溫度或其它環(huán)境改變產(chǎn)生應(yīng)答。熱穩(wěn)定性和/或熱不穩(wěn)定性也可以通過將彈性肽引入到具有熱敏感性的蛋白質(zhì)中取代合適的區(qū)域而改善。
酶反應(yīng)的持續(xù)時間也可以通過在最初的混合后使特定環(huán)境參數(shù)(如溫度、壓力或pH)在嚴(yán)格控制的一段時間內(nèi)改變，從而誘導(dǎo)達到精確控制。這特別適用于參數(shù)可以容易地改變或作為該方法的結(jié)果而變化的方法中。這樣，生物分子可以在某些溫度誘導(dǎo)從而提供滿意的活性，如酶活性，這種活性可以用于諸如溫度具有變化的發(fā)酵等工藝中。
或者，如果功能部分提供結(jié)合功能，諸如在抗體(優(yōu)選單鏈抗體)的情況中，則結(jié)合可以將按需要被開啟或關(guān)閉，或者可逆地或不可逆地改變。許多應(yīng)用就來自這種可能性。例如，可以通過將具有結(jié)合功能的生物分子結(jié)合在固體支持物上而制成親和柱。然后將含有結(jié)合對中要提取的另一個成員的樣品與固體相在結(jié)合可以發(fā)生的條件下接觸。經(jīng)過清洗或其它步驟之后，可以通過其中含有的彈性肽的收縮/伸展適當(dāng)?shù)馗淖兩锓肿拥慕Y(jié)合作用而釋放結(jié)合的分析物。因此生物分子可以用于純化和提取目的，從而提供結(jié)合對中的一個成員，如果需要的話它可以被固定化。
大量適用于這種目的的固相支持物在本領(lǐng)域是眾所周知的而且在文獻中有廣泛描述，通常說來，固相支持物可以是在化學(xué)或生物化學(xué)方法中被廣泛用于或建議用于固定、分離等的任何熟知的支持物或基質(zhì)。因此例如，固相支持物可以具有顆粒、片層、凝膠、濾器、膜、微纖維束、管或板、纖維或毛細(xì)管的形式，由例如聚合物材料，如瓊脂糖、纖維素、海藻酸鹽、聚四氟乙烯、乳膠或聚苯乙烯制成。微粒物質(zhì)，如小珠，通常是優(yōu)選的。
固相支持物可以方便地包含磁性顆粒，從而可以通過磁性聚合容易地分離固定化的物質(zhì)。這些磁性顆粒優(yōu)選是超順磁性的，以避免磁性的剩磁并由此成團，而且有利的是單分散的以提供均勻的動力學(xué)和分離。超順磁單分散顆粒的制備由Sintef在EP-A-106873中描述。由DynalAS(Oslo，挪威)出售的商品名為DYNABEADS的單分散多聚超順磁珠是市售磁性顆粒的例子，可以根據(jù)本發(fā)明使用或經(jīng)修飾后使用。
其中功能部分具有結(jié)合功能的生物分子的實例是單鏈抗體，正如在Ladner等人的US 4946778和5260203；Creative Biomolecules Inc.的WO88/09344；和Enzon公司的WO93/11161和WO94/12520中描述的，其中抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)通過一個或多個接頭區(qū)連接。在正常構(gòu)象中，這些分子采取的排列方式使單鏈形成兩個分離的結(jié)構(gòu)域，由接頭區(qū)連接，其中結(jié)構(gòu)域一起相互作用以形成與天然抗體中相同的結(jié)合位點。
接頭區(qū)優(yōu)選長度為10-30個氨基酸，尤其優(yōu)選12-15個殘基可以被具有此處所述彈性肽的氨基酸序列至少部分地取代以形成本發(fā)明的生物分子。當(dāng)誘導(dǎo)收縮時，接頭的長度將變短，使任一末端的結(jié)構(gòu)域被迫改變它的正常構(gòu)象，導(dǎo)致結(jié)合位點改變，從而防止或改變抗原結(jié)合。
可替代地，接頭可以被在伸展?fàn)顟B(tài)時相對更長的彈性肽取代，從而結(jié)構(gòu)域仍不能適當(dāng)?shù)叵嗷プ饔谩．?dāng)誘導(dǎo)收縮時，肽將縮短至合適的長度，使結(jié)構(gòu)域接觸，由此增加與抗原的親合力。另外可替代的是，如果少于10個氨基酸的彈性肽被用于取代接頭，則若這個區(qū)域足夠短，接觸將可以導(dǎo)致二聚體的形成，其中兩條單鏈抗體變成二聚體，從而形成抗原結(jié)合位點。以這種方式可逆產(chǎn)生二聚體和由此形成的二聚體是本發(fā)明優(yōu)選的方面。因此將看到，可以利用收縮和伸展以積極的或消極的方式影響功能，這依賴于選擇的彈性肽的性質(zhì)，如長度。
在進一步的實施例中，彈性肽可以插入到亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)中?？梢赃x擇合適的肽，使得收縮或伸展導(dǎo)致分離的結(jié)構(gòu)域開始接觸或不接觸。
本發(fā)明的非多肽生物分子包括插入了氨基酸序列的核酸分子。
本發(fā)明的生物分子可以由彈性肽及它所連接的兩個獨立結(jié)構(gòu)域(諸如配基受體、抑制劑酶或核酸模板阻遏子對)組成?？梢岳谜T導(dǎo)收縮或伸展使各對的適當(dāng)結(jié)合區(qū)域開始接觸或不接觸，從而可以起始、終止或改變由相互作用產(chǎn)生的結(jié)果。
本發(fā)明的生物分子可以用作生物傳感器，來檢測或監(jiān)控生物分子局部環(huán)境參數(shù)的變化，諸如溫度或分析物濃度。對于這些目的，優(yōu)選使用可逆誘導(dǎo)型生物分子。在這種情況下，當(dāng)這樣的參數(shù)變化時，彈性肽將適當(dāng)?shù)貞?yīng)答，選擇它所插入的生物分子，使得可以檢測出它的特征改變，如產(chǎn)生有色產(chǎn)物的酶活性的激活。
如果得到被修飾的抗體(或其它結(jié)合蛋白)，則可以通過誘導(dǎo)對確定的物理刺激發(fā)生反應(yīng)而破壞活性位點，從而控制它們與抗原的結(jié)合。這些蛋白質(zhì)在純化和檢測過程中有用處，如可用于ELISA或其它結(jié)合實驗中。也可以應(yīng)用于大量篩選中。這些實驗方法和進行它們的試劑盒形成本發(fā)明的又一些方面。
此外，本發(fā)明的生物分子可以用來構(gòu)建如表達隨機肽的文庫，諸如細(xì)菌噬菌體或RNA翻譯衍生文庫。因此該文庫的每個成員將包含融合分子，其中彈性肽與用來表達的肽(或寡核苷酸)相連。因此，通過例如將特異性結(jié)合性質(zhì)可逆地引入文庫成員中，這些融合分子的性質(zhì)可以通過彈性肽的收縮或伸展而改變，從而例如有助于篩選過程中的淘選。
具體地說，本發(fā)明的生物分子在診斷實驗中的使用形成本發(fā)明的優(yōu)選方面。
此外，本發(fā)明的生物分子可以用于治療應(yīng)用。因此，例如，可以修飾具有有益治療性質(zhì)的分子以產(chǎn)生本發(fā)明的生物分子，其中至少該生物分子的一部分可以通過它們所處環(huán)境的環(huán)境參數(shù)影響。
在這方面，可以使用具有一個以上功能的生物分子。可誘導(dǎo)的功能可以是期望的治療活性或可以是生物分子中可以變化以協(xié)助治療處理的一方面，如可以用來可誘導(dǎo)定位到特定區(qū)域，如用來將治療活性定位或用來從身體部分或流體中除去生物分子。
例如，本發(fā)明的生物分子可以用于體液的體外處理，通過改變它們所處體液或者體液的狀態(tài)，如壓力或溫度，可以使它們的活性升高、降低或適當(dāng)?shù)馗淖?。作為進一步的實施例，本發(fā)明的生物分子可以局部地或系統(tǒng)地施用于人或動物體，使它們因身體的局部環(huán)境參數(shù)改變，如通過胃腸道過程的pH變化，或溫度波動，如達到37℃，或在感染位點達到更高溫度而發(fā)生功能變化?；蛘撸梢愿淖兩锓肿泳植凯h(huán)境的變化，從而引起生物分子中彈性肽收縮或伸展，并由此改變它的功能性。因此，例如，生物分子(例如具有在不收縮時不具備的酶活性)可以局部地或系統(tǒng)地應(yīng)用，并例如通過表面或體內(nèi)加熱處理該位點以改變此處環(huán)境參數(shù)從而被激活。
應(yīng)當(dāng)理解，醫(yī)療用途的生物分子應(yīng)當(dāng)根據(jù)已知的技術(shù)和特異于生物分子的治療功能性的服用方法給藥。
因此，本發(fā)明還提供本發(fā)明作為藥物使用的生物分子?；蛘?，本發(fā)明提供使用有效量的本發(fā)明生物分子來治療人或動物體疾病或紊亂的方法。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的是，上文描述的發(fā)明的應(yīng)用是相當(dāng)多的，不受上文描述的少數(shù)實例所限制。
現(xiàn)在，本發(fā)明將參照下列非限制性實施例進行描述，其中

圖1顯示了H-GGVG(VPGVG)-OH(D肽)在10mM磷酸鹽緩沖液(pH7)中的CD波長掃描；圖2顯示了E肽(圖中用空心方框表示，Ac-GVGVPGVG-NH2)、G肽(圖中用圓圈表示，Ac-GGVGVPGVG-NH2)和H肽(圖中用實心圓表示，Ac-GGVGVPGVG-OH)在10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中的熔解曲線；圖3顯示了D肽(H-GGVGVPGVG-OH)在不同pH(圖中的空心方框表示pH7.0，200nm；圓圈表示pH4，198nm；實心圓表示pH9.5，200nm)的熔解曲線；圖4顯示了J肽(圖中用圓圈表示)和N肽(圖中用實心圓表示)在10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中的熔解曲線；圖5顯示了Ac-GVG(VPGVG)3IL-NH2(N肽)在10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中的可逆性，其中顯示了在20℃(圖中用實線表示)或在70℃溫育后轉(zhuǎn)移到20℃(圖中用虛線表示)時的結(jié)果；圖6顯示了L肽在15.5℃的濃度依賴性，插入的小圖顯示了MRE在199nm(圖中用圓圈表示)和210nm(圖中用實心圓表示)隨濃度的變化；圖7顯示了L肽在62.5℃的濃度依賴性，插入的小圖顯示了MRE在199nm(圖中用圓圈表示)和210nm(圖中用實心圓表示)隨濃度的變化；圖8顯示了SDS和TFE對E肽的影響；圖9顯示了SDS和TFE對L肽的影響；圖10顯示了TFE濃度升高對L肽的影響，a)在各種濃度下的影響；b)在198nm(圖中用圓圈表示)、206nm(圖中用實心圓表示)或213nm(圖中用空心方框表示)測量的在不同TFE濃度下的影響；圖11顯示了溫度和TFE在a)6.8℃或b)58.6℃對L肽的影響；圖12顯示了D肽和L肽于10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中在不同溫度下的CD波長掃描；(a)在1.1℃(圖中用圓圈表示)、15.4℃(圖中用實心圓表示)、25.0℃(圖中用空心方框表示)、34.5℃(圖中用實心方框表示)、43.8℃(圖中用三角框表示)、53.0℃(圖中用黑三角表示)、63.0℃(圖中用倒三角框表示)和81.5℃(圖中用黑倒三角表示)記錄D肽(49.1μM)；(b)在1.3℃(圖中用圓圈表示)、15.4℃(圖中用實心圓表示)、34.0℃(圖中用空心方框表示)、48.4℃(圖中用實心方框表示)和76.6℃(圖中用三角框表示)掃描L肽(20.7μM)；圖13顯示了八或九肽的C肽(37.1μM)、D肽(49.1μM)、E肽(38.5μM)、G肽(41.8μM)和H肽(31.3μM)以及更長的J肽(16.4μM)、L肽(20.7μM)和N肽(17.9μM)在10mM乙酸鹽或硼酸鹽緩沖液(圖a)中，或者在10mM磷酸鹽緩沖液(圖b和c)中，在不同溫度下從190-240/260nm掃描得到的熔解曲線，其中將位于或接近200nm的平均殘基橢圓率(mean residualellipticity)對溫度作圖，圖中還顯示了范特霍夫擬合；(a)九肽C肽(圖中用圓圈表示，201nm，pH4.0)、D肽(圖中用實心圓表示，200nm，pH9.5)和G肽(圖中用空心方框表示，201nm，pH9.5)的熔解；(b)八和九肽的H肽(圖中用實心方框表示，202nm)、E肽(圖中用三角框表示，199nm)和D肽(圖中用黑三角表示，200nm)的熔解；(c)18-21肽的N肽(圖中用倒三角框表示)、J肽(圖中用黑倒三角表示)和L肽(圖中用菱形框表示)在199nm的熔解；圖14顯示了在pH7.0的可逆性和濃度依賴性；(a)18肽L肽(91μM，于10mM磷酸鹽緩沖液)在加熱前于20.6℃的掃描(0.5mm比色杯，0.5nm間隔，，掃描4次，每次1sec整合時間)(圖中用實線表示)，和在70℃溫育30分鐘后再迅速冷卻到20.6℃的掃描(圖中用虛線表示)。(b)和(c)顯示了MRE的濃度依賴性。使用不同的石英比色杯(0.5mm、2mm和10mm)，L肽的濃度在4.6-264μM范圍內(nèi)變化(b)，并且相似地，8肽的E肽在45-855μM范圍內(nèi)變化(c)。顯示了L肽在15.5℃或E肽在15.6℃(圖中用圓圈表示在199nm，用實心圓表示在210nm)和L肽在62.5℃或E肽在48.3℃(圖中用三角框表示在199nm，用空心方框表示在210nm)的平均殘基橢圓率的變化；圖15顯示了B肽在10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中的熔解曲線的擬合；通過優(yōu)化相關(guān)范特霍夫特征圖的線性，將199nm處的CD數(shù)據(jù)(圖中用空心方框表示)擬合宏觀的可逆兩相模型。通過使用來自最初模型(在圖(a)中用虛線表示)的擬合轉(zhuǎn)變終點[θ]F和[θ]U，構(gòu)建相應(yīng)的范特霍夫特征圖(在圖(b)中用圓圈、虛線表示)，其線性相關(guān)系數(shù)(r)為-0.91。固定[θ]F之后，范特霍夫特征圖的相關(guān)系數(shù)提高到-0.98。圖(b)和圖(a)分別顯示了相關(guān)線的數(shù)據(jù)(在圖中用實心圓和實線表示)及其當(dāng)[θ]F固定時MRE數(shù)據(jù)對溫度的相應(yīng)擬合(在圖中用實線表示)；圖16顯示了8和9肽彈性蛋白肽熱轉(zhuǎn)變的平均熔解溫度，其中大數(shù)字代表來自表6的8肽(A肽、B肽、E肽和F肽)和9肽(C肽、D肽、G肽和H肽)的平均TM值?！暗蚑M”值是A肽和F肽(或9肽的C肽和H肽)在pH4.0或pH9.5以及E肽(9肽為G肽)在pH4和9.5的最低熔解溫度的平均值——形成不帶電荷分子的pH值。相似地，“高TM”值代表A肽和F肽(C肽和H肽)，以及B肽(9肽為D肽)在pH4和pH9.5的高TM的平均值——形成帶電荷分子的pH值。斜體的小數(shù)字代表平均TM值間的差異；圖17顯示了SDS和TFE對E肽和L肽的影響，其中在水中(圖中用圓圈表示)、在2mM SDS中(圖中用實線表示)、在25mM SDS中(圖中用等長虛線表示)和在87％(v/v)TFE中(圖中用不等長虛線表示)，于20.5℃下，用0.5mm石英比色杯掃描(掃描4次，0.5nm間隔，1sec整合時間)(a)E肽(218μM)和(b)L肽(91μM)。(c)也在不同濃度TFE中，于15.7℃，在2mm比色杯中，測試了L肽(20.7μM)，圖中顯示了在198nm(圖中用實心圓表示)、在206nm(圖中用空心方框表示)和在213nm(圖中用實心方框表示)處平均殘基橢圓率隨TEE濃度的變化；圖18顯示了1-4號肽在磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中的圓二色性波長掃描，其中在10mM緩沖液中，在6.4℃，用0.2cm密閉比色杯，對肽進行一次掃描(5sec整合時間，0.5nm步長，2.0nm狹縫)。濃度分別為1號肽21.4μM、2號肽26.9μM、3號肽29.7μM和4號肽21.1μM；圖19顯示了三氟乙醇(TFE)濃度對肽的影響，其中顯示了磷酸鹽緩沖液中TFE濃度增加對1號肽(a)和2號肽(b)的影響。在6.4℃對肽進行一次掃描，其中實驗條件和肽濃度與圖18中所述相同。圖(c)顯示了對1號肽(圖中用圓圈表示)、2號肽(圖中用實心圓表示)、3號肽(圖中用空心方框表示)和4號肽(圖中用實心方框表示)在222nm處的平均殘基橢圓率的影響；圖20顯示了在緩沖液和三氟乙醇(TFE)中溫度對肽的影響，其中圖(a)顯示了1號肽在不同溫度下的CD波長掃描(實驗條件如圖18所述)。插圖是1號肽在10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中的掃描，而大圖顯示了肽在30％(v/v)TFE的磷酸鹽緩沖液中的掃描。使用三次獨立掃描(整合時間5sec，在0.2cm比色杯中，2.0狹縫)的平均值，追蹤肽在222nm的熔解。圖(b)顯示了在不同溶劑中，溫度對1號肽的影響。分別為含20％(v/v)TFE(圖中用圓圈表示)、60％TFE(圖中用實心圓表示)和25mMSDS(圖中用實心方框表示)的磷酸鹽緩沖液和只有磷酸鹽緩沖液(圖中用空心方框表示)。圖(c)顯示了1號肽(圖中用三角框表示)、2號肽(圖中用黑三角表示)、3號肽(圖中用倒三角框表示)和4號肽(圖中用黑倒三角表示)在60％(v/v)TFE中的熔解。將圖(b)和圖(c)中的數(shù)據(jù)擬合具有固定轉(zhuǎn)變前終點的兩相轉(zhuǎn)變(詳見方法部分)。測試了熔解的可逆性，如圖(a)所示(圖中用虛線表示)；圖21顯示了結(jié)合動力學(xué)擬合表面等離子體振子共振(surfaceplasmon resonance)結(jié)合數(shù)據(jù)以構(gòu)建適當(dāng)?shù)膭恿W(xué)模型，其中各小圖分別顯示了1號肽(0.32μM)在15℃的結(jié)合動力學(xué)數(shù)據(jù)擬合單組分(A+B＝AB)模型(a)或雙組分(A+B1+B2＝AB1+AB2)模型(b)。粗線是對原始數(shù)據(jù)(圖中用圓圈表示)和用于擬合的相關(guān)殘基(圖中用實心圓表示)的擬合；圖22顯示了1號肽和2號肽在19.9℃結(jié)合Fc-IgG2a的動力學(xué)參數(shù)的測定，其中1號肽結(jié)合Fc-IgG2a的結(jié)合速率通過將ks1(圖中用圓圈表示)和ks2(圖中用實心圓表示)對所測最低濃度繪圖得到，圖(a)(III)，2.5μM；(IV)1.25μM；(V)0.63μM；(VI)0.31μM(詳見插圖)。結(jié)合速率由上述數(shù)據(jù)線性擬合的斜率得到。只有ks2對肽濃度的擬合得到顯著的結(jié)合速率，ks2＝148，396M-1s-1(線性相關(guān)系數(shù)(r)＝-0.98)。用最高濃度(I)25μM或(II)5μM，也測定解離速率200秒鐘左右(大圖)。在這種情況下，5μM給出了最高解離速率，分別為koff1＝2.4×10-3s-1和kOff1＝0.237 s-1。相似地，通過將ks1(圖中用圓圈表示)和ks2(圖中用實心圓表示)對分析物的各自濃度繪圖，得到2號肽的結(jié)合速率(圖b的插圖)[(II)，773.6μM；(III)，386.8μM；(IV)200.8μM；(V)193.4μM；(VI)150.63μM；(VII)，100.5μM；(VIII)，96.7μM]。kon1為74M-1s-1，相關(guān)系數(shù)(r)＝0.3；kon2為502M-1s-1，相關(guān)系數(shù)(r)＝0.98。1.547mM解離相(I)200秒鐘左右得到解離速率為0.367s-1和8.9×10-6s-1；圖23顯示了1號肽和2號肽快速動力學(xué)常數(shù)的溫度依賴性，其中1號肽(圖中用圓圈表示)和2號肽(圖中用實心圓表示)各自的動力學(xué)常數(shù)顯示于圖a、圖b和圖c。圖a)顯示了快速解離速率，圖b)顯示了快速結(jié)合速率，而圖c)顯示了在不同溫度下它們各自的快速解離常數(shù)(＝koff/kon)。使用BIAevaluation2.1擬合解離速率，使用BIAevaluation2.1和GRAFIT(Leatherbarrow，1989，Grafit3.01版，Erithacus軟件有限公司)擬合結(jié)合速率。結(jié)合速率和解離速率都顯示它們的擬合標(biāo)準(zhǔn)誤差。解離常數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差根據(jù)kon和koff的SE人工計算；圖24顯示了2號肽相對于1號肽的結(jié)合自由能(ΔΔG)的溫度依賴性，其中如方法部分中所述計算不同溫度的結(jié)合自由能，顯示了相對不同溫度的ΔΔG(ΔΔG＝+RTXln[KD(2號肽于TX)/KD(1號肽于TX)])。使用GRAFIT(Leatherbarrow，1989，見上文)的數(shù)據(jù)線性擬合得到線性相關(guān)系數(shù)(r)為-0.99，斜率為-0.0570±0.007kcal·mol-1·K-1(截距20.2±2.0)；圖25顯示了2號肽和4號肽在緩沖液中的溫度CD波長掃描，其中對2號肽(163.4μM)溶于加入了0.005％(v/v)表面活性劑P20的Hepes緩沖鹽溶液(HBS)中的溶液，在不同溫度下，從198nm到260nm掃描一次(0.05cm石英比色杯，5s整合時間，2.0nm狹縫，0.5nm步長)，如圖a)所示。相似地，在不同溫度下，于10mM磷酸鹽緩沖液(pH7)中，用0.2cm比色杯對2號肽(31.8μM)和4號肽(24.1μM)進行掃描，2號肽顯示于圖b)，4號肽顯示于圖c)。粗虛線顯示了加熱到60-80℃后在25℃左右再次掃描的掃描可逆性；圖26顯示了2-4號肽在磷酸鹽緩沖液和HBS中的熔解，其中通過在不同溫度下測量222nm/260nm的CD橢圓率(0.2cm比色杯，2.0nm狹縫)，平均三次的獨立掃描(整合時間5s)，由此追蹤不同肽的熔解。圖a)顯示了2號肽(圖中用圓圈表示，31.8μM)、3號肽(圖中用實心圓表示，32.7μM)和4號肽(圖中用三角框表示，24.1μM)在10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中的熔解。同樣地，圖b)是2號肽(圖中用實心方框表示，27.0μM)和4號肽(圖中用空心方框表示，24.1μM)在含有0.005％表面活性劑P20的Hepes緩沖鹽溶液(pH7.4)中的熔解曲線；圖27圖(a)顯示了pDAP2質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，圖(b)顯示了pUC119His6mycXba的結(jié)構(gòu)；圖28顯示了3D6基因接頭區(qū)的序列；圖29顯示了3D6基因和質(zhì)粒中相關(guān)引物的結(jié)構(gòu)和位置。RBS是核糖體結(jié)合位點的縮寫，ALK.PHOSPHAT是堿性磷酸酶的縮寫；圖30顯示了接頭區(qū)(I)的裝配；圖31顯示了接頭區(qū)(II)的裝配；圖32顯示了接頭區(qū)(III)的裝配；圖33顯示了接頭區(qū)(I)和(III)的結(jié)構(gòu)；圖34顯示了在本發(fā)明中使用的各種寡核苷酸的序列；圖35顯示了用固相肽合成法合成的5號肽和6號肽的序列；圖36顯示了6號肽在不同溶劑中的CD掃描。在0.01mm石英比色杯中，25℃，10秒整合時間，0.5nm間隔，對1.5mM肽進行掃描；圖37顯示了通過在不同溫度下結(jié)合到固定化Fc-561(3400RU)上，而在BIAcore2000上分析5號肽(1μM)(圖A)。流速含0.005％P20的HBS30μl/min。圖B顯示了同樣的500nM 6號肽與Fc-561的結(jié)合；以及圖38顯示了5號肽和6號肽在不同溫度下的快速結(jié)合和解離速率(以及解離常數(shù))(如實施例3所述進行分析)。
實施例1短彈性肽的設(shè)計合成短彈性蛋白肽(5-25肽，具有3-6個氨基酸的側(cè)翼序列)，并用圓二色性法(Circular Dichroism，CD)進行分析。通過監(jiān)測在197-200nm和205-212nm處CD振幅的減小，測定這些肽折疊的轉(zhuǎn)變溫度(Tm)。縮寫CD，圓二色性法；ESP/MS，正電噴霧質(zhì)譜法；Fmoc，Nα-9-芴甲氧基羰基；Fmoc-PAL，5-[4-(9-芴甲氧基羰基)-氨甲基-3，5-二甲氧基苯氧基]戊酸；HOBT，1-羥基苯并三唑水合物；HPLC，高效液相色譜法；PEG，聚乙二醇；PS，聚苯乙烯；TFA，三氟乙酸；TFE，三氟乙醇；SDS，十二烷基硫酸鈉；[θ]M，MRE，平均殘基橢圓率。材料和方法材料肽合成試劑等級的Fmoc氨基酸和Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂購自Perspective Biosystems GmbH公司(漢堡，德國)。反式雄甾酮和二噁烷購自Fluka。乙酸酐和甲醇為肽合成等級購自Applied Biosystems公司(現(xiàn)為Perkin Elmer公司Applied Biosystems部)。
肽的合成和純化A-O肽(詳見表1)在Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂(得到酰胺化C末端的肽)或在Fmoc-Gly-PEG-PS樹脂(Millipore公司，Watford，英國；得到游離C末端)上，使用MilliGen/Biosearch 9050肽合成儀(Millipore公司，Bedford，MA)，用固相Fmoc化學(xué)法，在0.1mmol水平進行合成。使用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)法(Fmoc/HOBT活化)和步驟，但是由于其偶聯(lián)動力學(xué)較慢，因此第一個氨基酸(Gly)要求多于12小時偶聯(lián)到Fmoc-PAL-PEG-PS上。其它氨基酸用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)法和供應(yīng)商提供的方案偶聯(lián)，通常每一個氨基酸需要89分鐘的周期。偶聯(lián)效率通過使用Acid Violet 17染料顏色記錄544nm的吸收值進行連續(xù)跟蹤，結(jié)果產(chǎn)量超過95％。在DMF中用乙酸酐將樹脂乙?；?用于N末端受保護的肽)后，依次用二氯甲烷、甲醇、乙醚清洗樹脂，然后用N2干燥。
從樹脂上切下肽，并用含5％茴香硫醚、3％1，2-乙二硫醇和2％苯甲醚的TFA作為清除劑處理(于20℃處理4-6小時)進行去保護。切下的肽加入10倍過量的汽油醚清洗，然后在過量乙醚中沉淀。將固體肽溶于去離子水并凍干。
將從TFA切下的粗品肽加到分析用的HPLC(LKB公司，Bromma，瑞典)上。用含乙腈梯度4.5-54％的0.1％TFA，于20℃，經(jīng)91分鐘，在C18柱(Vydac，250×5mm，10μm孔)上，對它們進行分析。在214nm檢測到A-O肽并分別洗脫(0.7ml/min)A-H18-20.5％乙腈；I33％；J32％；K31％；L29％；M31％；N33％；以及O36％乙腈。大量純化使用WatersHPLC(Water公司，英國)，于20℃，用范圍較窄的梯度進行洗脫，如對于A-H肽，使用含乙腈梯度13.5-22.5％的0.1％TFA經(jīng)90分鐘洗脫。以10ml/min流速使用制備性240×24mm Vydac C18柱(10μm孔)對肽進行層析，并在214nm檢測，然后凍干。
將經(jīng)純化的肽以10ng/μl的濃度溶于含1.0％乙酸的1∶1水/甲醇，并在ESP/MS(配備了VG Ahalytical Electrospray的VG Autospec，F(xiàn)ison公司，英國)上分析純度和均一性。對樣品進行定量和定性的氨基酸分析(將樣品在N2氣下在HCl中于110℃水解24小時，然后凍干，溶于pH2.2的檸檬酸鹽緩沖液，并在Pharmacia AlphaPlus II氨基酸分析儀上進行分析)。
圓二色性研究用異雄甾酮(ISO)的二噁烷溶液(1.25mg/ml)或(+)-10-樟腦磺酸(CSA)的水溶液校準(zhǔn)Jobin-Yvon CD6型二色譜儀(Instruments S.A.英國有限公司，Stanmore，英國)，記錄CD光譜(Johnson，1990，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，功能，遺傳學(xué)(ProteinsStruct.，F(xiàn)unct.，Genet.)，7，p205-214)。ISO校準(zhǔn)根據(jù)供應(yīng)商的說明書在304nm進行(使用1.0cm石英比色杯得到強度142.5ΔA)。
使用購自Hellma的石英比色杯(0.5-2mm，帶帽)，并且在分析過程中用水浴對CD儀進行溫度控制并用N2持續(xù)凈化。將樣品冷卻至1℃然后逐步提高溫度，使樣品平衡于1-85℃范圍內(nèi)的每個溫度達5分鐘，從而進行溫度CD掃描。用Fluke 51 K/J數(shù)字溫度計測量比色杯的溫度。
收集190-260nm掃描結(jié)果(間隔0.5或1.0nm，帶寬2.0nm，整合時間1秒)，完成掃描。在電腦上處理掃描結(jié)果，使用1.1版DichrographSoftware(Jobin-Yvon/Instruments S.A.，法國)中的Sabitzky Golay算法修正4-15次掃描的平均值。用0.22mm濾器過濾緩沖液(10mM)并以13000rpm離心除去塵土和空氣。所有光譜用240/260nm的橢圓率對緩沖液和離軸偏移(off-axis drift)進行基線校正。將經(jīng)純化的肽溶于去離子水，然后在10mM緩沖液中稀釋44倍，確保比色杯中肽的濃度始終低于80μM(以使樣品在所有光譜區(qū)域中的吸收值低于1.0)。
使用定量氨基酸分析法測定肽母液的濃度。將每個波長的數(shù)據(jù)除以肽的殘基數(shù)，從而將肽摩爾橢圓率轉(zhuǎn)換成平均殘基摩爾橢圓率([θ]，度·Gm2/dmol)。
將波長掃描(190-240/260nm)的單個波長對不同溫度作圖。使用觀察得到的CD數(shù)據(jù)([θ]obs)、溫度(T)和轉(zhuǎn)變的固定終點(高溫折疊形式[θ]F和低溫未折疊形式[θ]U)，將在較高溫度下轉(zhuǎn)變成折疊形式所需的自由能擬合成宏觀的、可逆的兩相模型(1)。
ΔGU-F＝-RT ln[([θ]obs-[θ]U)/([θ]F-[θ]obs)](1)由于肽的分子量低，將熱容量設(shè)為零，由此用方程(2)和(3)、或?qū)τ?8-28肽使用(2)和(4)，將所有數(shù)據(jù)擬合成范特霍夫圖。對于折疊前和折疊后基線具有斜率的轉(zhuǎn)變，方程(4)考慮了斜率的影響(m)和離軸調(diào)整(off)。
ΔGU-F＝ΔHU-F-TΔSU-F(2)[θ]obs＝([θ]U+[θ]F×exp-(ΔGU-F/RT))/(1+exp-(ΔGU-F/RT)) (3)[θ]obs＝([θ]U+[θ]F×exp-(ΔGU-F/RT))/(1+exp-(ΔGU-F/RT))+m×T+off (4)用Grafit軟件(Leatherbarrow，1989，見上文)，采用最小二乘擬合(least squares fitting)對數(shù)據(jù)進行分析，并且使用CD的數(shù)據(jù)[θ]obs以及前面擬合的轉(zhuǎn)變終點[θ]U和[θ]F，繪制范特霍夫圖(lnK對1/T作圖，其中K＝([θ]obs-[θ]U/([θ]F-[θ]obs)。在最初的自由擬合使范特霍夫圖的線性相關(guān)系數(shù)較低(r＜|-0.90--0.93|)的某些情況下，使用最初擬合的值作為終點和起點并固定[θ]U和[θ]F中的一個或者兩個，將數(shù)據(jù)重新擬合。這使得相關(guān)系數(shù)更接近-1。通過固定來自最好的范特霍夫圖的[θ]U和[θ]F，由方程(2)-(4)得到新的ΔH和ΔS的擬合。使用關(guān)系式Tm＝ΔH/ΔS計算所有肽的轉(zhuǎn)變溫度Tm。
肽的電腦模擬通過從分子動力學(xué)模擬中求出φ(phi)和
(psi)角，建立類彈性蛋白肽高溫和低溫形式的模型(Wasserman和Salemme，1990，生物聚合物(Biopolymer)，29，p1613-1631)。所有的模擬都是在Silicon GraphicsIndy上使用Insight 95和Discover 2.6.0(分子模擬有限公司(MolecularSimulations Inc.))進行的。結(jié)果彈性蛋白短肽的設(shè)計Urry及其同事有許多報道，描述化學(xué)或物理誘導(dǎo)的彈性蛋白聚合物的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變(Urry，1993，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，32，p819-841)。然而，描述的所有這些轉(zhuǎn)變模型中，沒有一個對彈性蛋白較短肽進行過檢驗。還發(fā)現(xiàn)彈性蛋白肽中N和C末端帽子結(jié)構(gòu)的長度和存在影響聚集的轉(zhuǎn)變溫度(McPherson等人，1992，生物技術(shù)進展(Biotechnol.Prog.)，8，p347-352)。CD光譜和熱彈性數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性也有報道(UDrry等人，1985，生物化學(xué)及生物物理學(xué)研究通訊，130(1)，p50-57；Urry等人，1986，國際肽和蛋白質(zhì)研究雜志(Int.J.Pept.Prot.Res.)，28，p649-660)。
在本研究中，設(shè)計了彈性蛋白短肽以測試序列變化對觀察到的構(gòu)象轉(zhuǎn)變的影響。特別感興趣的是N和C末端乙酰化和酰胺化的影響，以及加在8肽(表1，A-H肽)N末端的額外甘氨酸的影響。此外，推論N末端的甘氨酸與N和C末端的電荷一起將提高肽的靈活性和溶解性(Haxpaz等人，1994，美國國家科學(xué)院進展，91，p311-315)。為了測試在彈性單位(-VPGVG-)數(shù)和結(jié)構(gòu)折疊的轉(zhuǎn)變溫度之間是否存在相關(guān)性，我們還合成了18肽(3個VPGVV單位)和28肽(5個VPGVG單位)(表1，E肽、L肽和O肽)。為了測量疏水序列對類彈性蛋白18肽折疊的轉(zhuǎn)變溫度的影響，在C末端逐步引入了額外的亮氨酸和異亮氨酸殘基(表1，L-N肽)。
人們還認(rèn)為這些位于C末端亮氨酸和異亮氨酸殘基附近的額外甘氨酸可能影響這個疏水片段的靈活性(表1，I肽)。我們也研究了鄰近彈性序列或位于其中的帶電荷殘基的影響。在一個設(shè)計中，將一個額外巰水殘基放置在N末端帶電荷的賴氨酸附近(表1，J肽)，將一個谷氨酸殘基放置在彈性蛋白序列的中部(表1，K肽)。在不同溫度下用CD研究所有上述肽設(shè)計，而且，如果可行，還獲得熱力學(xué)數(shù)據(jù)。
肽的純化和分析合成表1顯示的15種彈性蛋白短肽序列，并在HPLC上用窄梯度條件純化。這些肽在反相分析HPLC上以單個峰洗脫，說明它們是純的，每種肽的類型、純度和濃度用ESP/MS和氨基酸分析測定并證實(表2)。
肽的CD分析短肽和較長肽在緩沖液中不同溫度下的CD光譜顯示相似的曲線(圖1顯示了由D肽得到的結(jié)果)。全局最小值(global minimum)在一定程度上取決于緩沖液(表3)，但是通常在198-200nm范圍內(nèi)——發(fā)現(xiàn)更雜亂的肽也如此(Woody，1995，酶學(xué)方法，246，p34-71)。然而，與理想無規(guī)線團的-40,000deg cm2dmol-1相比較，這些短肽在1℃的最小平均殘基橢圓率為-7,000--10,000deg cm2dmol-1。這在Urry等人就較長彈性蛋白聚合物觀察到的范圍內(nèi)(Urry等人，1986，見上文；Urry等人，1985，見上文)，據(jù)報道(VPGG)n和(VPGVG)n聚合物為-5,000--16,000deg cm2dmol-1。較長的I-O肽的相應(yīng)值在-17,000--19,000范圍內(nèi)。這有些令人驚訝地說明，在低溫下較短肽比較長肽具有更有序的結(jié)構(gòu)。這些數(shù)值是那些無規(guī)線團和II類β轉(zhuǎn)角的等摩爾混合物預(yù)期具有的(Perczel等人，1993，國際肽和蛋白質(zhì)研究雜志，41，p223-236)。而且，彈性蛋白五肽聚合體能量最小化的結(jié)構(gòu)模型也含有部分折疊結(jié)構(gòu)作為伸展的低溫形式(Chang和Urry，1988，見上文；Wasserman和Salemme，1990，見上文)。對于所有的肽，195-205nm左右的CD振幅隨溫度升高而降低，而206-212nm的振幅降低較小。這個區(qū)域中的正峰是II類β轉(zhuǎn)角的特征(Urry等人，1986，見上文；Urry等人，1985，見上文；Woody，1995，見上文)。
對于具有最不均勻組成的K肽(表1)，在210-230nm的CD振幅有升高，而在222nm有局部最小值(在208nm有近似的同二色性點(isodichroicpoint))。N末端具有GGYG序列的一些短肽在更高溫度下也發(fā)現(xiàn)了這些現(xiàn)象。詳見表1C肽和G肽于pH7以及D肽于pH4。這些光譜類似與螺旋或I/III型β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)相關(guān)的C類光譜。C類光譜具有激發(fā)子(II-II*)，分為位于195nm(通常由于溶解而藍(lán)移至180nm)的正波段和位于208nm的負(fù)波段。在220-224nm左右也有強的負(fù)n-II*轉(zhuǎn)變。只有波段的強度和比例與α螺旋的CD光譜不同，因而通常難以將α螺旋和I型β轉(zhuǎn)角區(qū)分開(Baldwin等人，1994，國際肽和蛋白質(zhì)研究雜志，43，p180-183；Perczel等人，1993，見上文；Woody，1995，見上文)。
不同肽的熔解曲線(圖2-4)也令人驚訝地具有與較長彈性蛋白聚合物的曲線相似的曲線(Urry等人，1985，見上文)。對于四肽聚合物(VPGG)n，在本研究中A-H肽的轉(zhuǎn)變范圍是3-5,000MRE單位，較長的I-O肽增加到5-10,000(此處數(shù)據(jù)沒有顯示)。這比五肽聚合物(VPGVG)n中較變有16000MRE單位的變化要小。
將CD數(shù)據(jù)擬合范特霍夫方程后，有可能得到較小肽折疊的ΔS和ΔH的數(shù)據(jù)(表3)。對于一些較大肽，轉(zhuǎn)變前和轉(zhuǎn)變后的斜率是足夠大的，以至于全套熱力學(xué)分析在統(tǒng)計上比較困難。對于這些，只報道了轉(zhuǎn)變中點(表4)。不可能測定K肽和O肽的Tm。然而所有其它肽具有正的ΔH和ΔS，暗示是熵驅(qū)動過程。8肽、9肽和21肽(表3和表4)相似的ΔH和ΔS值也說明重復(fù)區(qū)的每個殘基是作為獨立單位發(fā)生作用。另一方面，如表5所示，較短肽相比于21肽和彈性蛋白聚合物，每個殘基的ΔH和ΔS要大許多。
8肽和9肽的Tm沒有明顯差異(表3)。然而，對于8肽和9肽，α-氨基的乙?；挺?羧基的酰胺化相比于游離N和C末端(E肽和G肽與B肽和D肽比較)使轉(zhuǎn)變溫度降低了8-10℃。未受保護的B肽和D肽在不同pH值的Tm沒有差異，說明這樣或那樣的電荷的存在對于短肽的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變具有相似的影響。支持這種意見的現(xiàn)象有，當(dāng)一個末端被酰胺化或乙酰化而受保護時，離子形式的Tm上升(表3中，F(xiàn)肽與H肽比較，A肽與C肽比較)。將肽的長度由8肽增加到18肽而不改變組成，沒有使Tm改變超過3℃(表4；E肽32℃與L肽35℃比較)。
將相似氨基酸殘基相互緊密地置于肽的某一端，對轉(zhuǎn)變溫度沒有影響。在N末端有兩個甘氨酸的較短的8/9肽與具有一個甘氨酸的肽具有相同Tm，18/20肽C末端有亮氨酸/異亮氨酸對也如此。然而，C末端附近疏水殘基的加入使肽的轉(zhuǎn)變溫度降低了17-21℃。對于一些肽，由于沒有轉(zhuǎn)變的終點，即使在200nm左右的CD振幅有相似降低，也不可能檢測到明確的轉(zhuǎn)變溫度。這包括具有更復(fù)雜組成的長K肽以及28肽的VPG型O肽。對于K肽，實驗揭示由于在1.4℃的MRE值(-20,000deg cm2dmol-1左右)較低，這種肽在較低溫度可能比其它肽更無序。然而，在N和C末端有三個插入殘基的J肽的轉(zhuǎn)變溫度為18℃。J肽中插入賴氨酸的影響被更多疏水殘基所對抗，得到相對低Tm。
選擇一些短肽和較長肽(C肽、E肽、L肽和N肽)，于70℃溫育30分鐘，然后迅速冷卻至20℃測試可逆性。發(fā)現(xiàn)所有肽都是完全可逆的(圖5)。同樣地，在兩個不同溫度，15.5℃和62.5℃，分析L肽的濃度依賴性(圖6和圖7)。由肽濃度范圍5-304.5μM內(nèi)的波長掃描，將199nm和210nm處的橢圓率繪圖。在低溫下，發(fā)現(xiàn)它們不依賴肽濃度(圖6)。在高溫(圖7)下，濃度低于100μM時，210nm左右的橢圓率有更顯著的變化。
膠粒和非膠粒SDS的影響檢驗去污劑SDS對短肽(表1，B肽、E肽和G肽)和較長肽(表1，K肽、L肽、N肽和O肽)的影響。對于8肽和9肽，膠粒SDS(25mM)誘導(dǎo)兩類肽在210nm處MRE的增加，而且對于8肽，在非膠粒SDS(2mM)中也觀察到此現(xiàn)象(圖8)。這是轉(zhuǎn)變成II型β-轉(zhuǎn)角的特征，在206-210nm顯示正的峰，在較長聚合物中也觀察到此現(xiàn)象(Urry等人，1986，見上文；Urry等人，1985，見上文；Woody，1995，見上文)。然而令人驚訝地，除K肽外，非膠粒SDS對較長的18-28肽(L肽、N肽和O肽)沒有影響，正如在圖9中就L肽圖示的。對于SDS的兩種濃度，K肽在206-240nm的橢圓率顯示降低。這種相似的轉(zhuǎn)變成222nm左右的局部最小值，也在膠粒SDS中對L肽、N肽和O肽觀察到。200nm左右MRE的增加和206-212nm左右的緩慢增加，說明所有肽在SDS存在時都變得更有序。
三氟乙醇的影響對于8、9、18和28肽，II型β-轉(zhuǎn)角的誘導(dǎo)在87-9296(v/v)TFE中比在SDS中更明顯(圖8和圖9)。對于L肽，TFE的濃度在0-97％范圍內(nèi)變化，在40％ TFE中，198nm、206nm和213nm處MRE的變化速度顯著變化，說明存在結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變(圖10)。還研究了溫度和TFE濃度升高對L肽的影響(圖11)。在6.8℃和58.6℃之間，II型β-轉(zhuǎn)角的比例在高TFE濃度時降低，或在低TFE濃度時不變。在低TFE濃度時，200nm處的橢圓率在高溫下升高，說明轉(zhuǎn)變成更有序結(jié)構(gòu)。
肽的電腦模型構(gòu)建了基于φ和
扭轉(zhuǎn)角(取自較長彈性蛋白肽的MD模擬)的較短肽的模型。它們顯示在較高溫度下由無規(guī)線團/Z-結(jié)構(gòu)向β-螺旋的轉(zhuǎn)變，不僅由沿著螺旋軸的收縮顯示，而且還有單體內(nèi)橫跨軸的膨脹，得到具有比28殘基肽更大直徑和更小長度的螺旋。實施例2用實施例1中描述的肽和方法學(xué)進行進一步的實驗。結(jié)果CD分析圖12a顯示了D肽9肽在不同溫度的CD光譜。為了比較，圖12b顯示了L肽18肽的光譜。所有的其它短肽和較長肽顯示相似的CD曲線(此處沒有顯示數(shù)據(jù))。
對于所有的肽，在195-205nm處的CD振幅隨溫度升高而降低，在206-212nm處的振幅降低較小。在這后一區(qū)域中的正峰是II型β-轉(zhuǎn)角的特征(Perczel等人，1993，見上文；Urry等人，1985，見上文；Woody，1995，見上文)。在報道的轉(zhuǎn)變中，發(fā)現(xiàn)短肽在218nm左右有近似的同二色性點。這在誘導(dǎo)II型β-轉(zhuǎn)角的TFE濃度增加的影響(此處沒有顯示數(shù)據(jù))和圖12a和b描述的溫度的影響中也觀察到。Urry及其同事在220nm左右檢測到較大的彈性蛋白聚合物熔解的近同二色性點(1988a，蛋白質(zhì)化學(xué)雜志(J.Protein Chem.)，7(1)，1-34)。然而，當(dāng)溫度變化時，一些肽的最小值/最大值位置變化很小，而且其中光譜的變化不如強度的變化大。
圖13a-c顯示了短的D肽、E肽和H肽在磷酸鹽緩沖液中，C肽、D肽和G肽在不同緩沖液中以及較長的J肽、L肽和N肽在pH7的轉(zhuǎn)變曲線。最初為每條熔解曲線擬合了轉(zhuǎn)變的起點，雖然對大多數(shù)肽都得到明確確定的轉(zhuǎn)變。
熱力學(xué)分析如實施例1所述測試可逆性。
發(fā)現(xiàn)所有肽都是完全可逆的(圖14a)。還對L肽(18肽)和最疏水的短E肽(8肽)于兩個不同溫度下測試濃度依賴性(圖14b、c)。在所有情況中，發(fā)現(xiàn)在此溫度范圍內(nèi)橢圓率不依賴于肽的濃度(在實驗誤差限度內(nèi))。這個發(fā)現(xiàn)表明，溫度誘導(dǎo)β-轉(zhuǎn)角的形成是由于分子內(nèi)相互作用而非分子間聯(lián)系。此處報道的熔解曲線是在肽濃度比顯示于圖14c的最大濃度低10-20倍(較長肽為18μM左右，較短肽為50μM以下)時得到的。
將數(shù)據(jù)擬合范特霍夫圖，它們是線性的。當(dāng)CD測量中的低信噪比導(dǎo)致數(shù)據(jù)更分散時，通過固定轉(zhuǎn)變的一個終點或兩個都固定得到更好的擬合(圖15)。使用自由[θ]F和[θ]U的結(jié)果是ΔH＝13.7±6.6、ΔS＝0.045±0.021；然而當(dāng)用固定的[θ]F模擬時，得到下面的結(jié)果ΔH＝10.4±1.4、ΔS＝0.034±0.004。
將CD數(shù)據(jù)擬合范特霍夫方程，能夠計算大部分肽轉(zhuǎn)變的ΔH、ΔS和Tm值。然而，由于一些短肽(圖13b)轉(zhuǎn)變起點的不確定性，因此只報道了那些具有明確轉(zhuǎn)變曲線的肽(表16)。
N和C末端狀態(tài)相同的短肽的熔解溫度相關(guān)性很好(表7和圖16)。8和9肽α-氨基的乙酰化或α-羧基的酰胺化(或者二者兼有)與游離N和/或C末端相比，使轉(zhuǎn)變溫度降低了平均13℃。然而，對于末端電荷信號不同的肽，熔解溫度沒有顯著差異(表7，對于8肽，pH4時A肽和B肽與pH9.5時B肽和F肽比較；對于9肽，pH4時C肽和D肽與pH9.5時D肽和H肽比較)，說明任何一種電荷的存在對于短肽的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變具有相似的影響。pH7.0時肽的熔解溫度相對于那些有“高Tm”值的肽降低(圖16)，而且對9肽的影響比對8肽更大。這說明可能存在通過N-C末端相互作用的加成性穩(wěn)定作用——這或許能夠解釋為什么一些較小的8肽相對于較大的18肽其熔解溫度較低。較小肽N末端額外甘氨酸的存在將“低Tm”和“高Tm”肽的熔解溫度都提高了大約6℃(圖16)。在C末端附近加入一個或多個疏水殘基，發(fā)現(xiàn)有相反的影響，導(dǎo)致熔解溫度降低20-23℃(將L肽與M肽和N肽比較，表6)。
SDS和TFE的影響圖17顯示了SDS和TFE影響的結(jié)果(如實施例1所述進行)。關(guān)于實施例1和2的結(jié)果的討論對于所有研究的肽，觀察到在195-205nm和206-212nm處的MRE隨溫度升高而升高(II型β-轉(zhuǎn)角形成的信號)，這支持這些序列的折疊是由疏水折攏驅(qū)動的觀點。此處研究的類彈性蛋白肽形成的精確結(jié)構(gòu)依賴于側(cè)翼序列和溶劑條件。在低溫下(0℃)，短肽顯示有部分結(jié)構(gòu)的跡象，正如在較大聚合物中所看到的(Urry等人，1986，見上文；Urry等人，1985，見上文)。此外，大部分肽顯示在210nm處的MRE略微升高，這是VPGVG聚合物內(nèi)II型β-轉(zhuǎn)角形成的特征(Urry等人，1985)。
對于K肽，在210-230nm處的CD-振幅有明顯增加，說明I型或III型β-轉(zhuǎn)角的形成。這種現(xiàn)象也在這種肽在膠粒和非膠粒SDS中觀察到。在其它肽于高溫下的CD-光譜中發(fā)現(xiàn)第I/III型β-轉(zhuǎn)角的一些跡象。這說明，對于許多這些序列可能存在不同β-轉(zhuǎn)角群的平衡，雖然具有GGVG的N末端區(qū)域的肽被認(rèn)為優(yōu)先采取II型β-轉(zhuǎn)角(Broch等人，1996，國際肽和蛋白質(zhì)研究雜志，47，p394-404)。I型和II型β-轉(zhuǎn)角之間的互變被認(rèn)為需要+0.2--1.7kcal/mol能量(Yang等人，1996，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)，259，p873-882，及其參考文獻)，這一障礙比較小，能夠通過側(cè)翼序列或緩沖液組成(TFE、SDS等等)影響?；蛘?，較短肽中Val-Pro鍵異構(gòu)化成順式構(gòu)象將有助于形成I型或III型β-轉(zhuǎn)角，正如在水中研究VPGVG的環(huán)狀類似物時發(fā)現(xiàn)的(Khaled等人，1981，國際肽和蛋白質(zhì)研究雜志，17，p23-33；Renugopalakrishnan等人，1978，J.Chem.Soc.Perkin Trans.，2，p111-119)。然而，無論是否形成I、II或III型β-轉(zhuǎn)角，彈性轉(zhuǎn)變?nèi)匀皇强赡艿?Bhandary等人，1990，國際肽和蛋白質(zhì)研究雜志，36，p122-127)。
以前對線性五肽Boc-VPGVG-Ome的晶體學(xué)研究(Ayato等人，1980，在“肽化學(xué)”(Peptide Chemistry)中，主編K.Okawa，p107-112)顯示不存在任何β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，而VPGVG環(huán)狀十肽類似物的結(jié)構(gòu)顯示有一個VPGVG單位的III型轉(zhuǎn)角及另一個單位的I型轉(zhuǎn)角(Bhandary等人，1990，見上文)。
為了確定移植到其它蛋白質(zhì)中的彈性蛋白序列的轉(zhuǎn)變溫度，考慮側(cè)翼區(qū)域是重要的。Urry及其助手劃分的疏水等級(1993，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，32，p819-841)只估計聚合物序列中的殘基的Tm。我們在此處已經(jīng)清楚地證明，當(dāng)合適的側(cè)翼序列存在時，VPGVG單體能夠形成與類彈性蛋白聚合物(VPGVG)n相同的II型β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)(在CD的識別能力內(nèi))。我們還已經(jīng)證實，當(dāng)特定類型的側(cè)翼殘基存在時，轉(zhuǎn)變溫度可以按與聚合物中看到的相同方式改變(Urry，1993，見上文)。例如，在鄰近VPGVG轉(zhuǎn)角序列處加入額外的疏水殘基能使熔解溫度降低多達20℃，而加入甘氨酸使TM升高6℃。這似乎值得注意，這些巨大的溫度影響可以通過加入單個殘基產(chǎn)生(比較8肽和9肽(圖16)以及L肽和M肽，表6)，雖然當(dāng)進行多個添加時，影響不是必然的累加(比較M肽和N肽，表6)。此外，當(dāng)這些額外疏水殘基存在時，插入帶電荷殘基并沒有觀察到預(yù)期的熔解溫度升高(比較I肽和J肽，表6)。這說明側(cè)翼連接不同的非彈性殘基的彈性序列，其Tm可能通過將側(cè)翼區(qū)域的疏水和親水殘基的平衡平均化得到。由較短肽圖解了電荷的影響。對于所有肽，N和C末端的電荷將疏水折疊的轉(zhuǎn)變溫度提高了差不多20℃(比較pH4和pH9.5時的C肽和H肽，表7)。末端帶電荷基團的熱力學(xué)影響很可能是因肽周圍水殼層的穩(wěn)定性增加引起的。
相反地，與pH4和pH9.5相比較，在pH7.0的磷酸鹽緩沖液中具有帶電荷末端的肽的Tm降低了。在pH7，兩個末端都將帶上電荷，在N和C末端之間可能形成的鹽橋可能穩(wěn)定了β-轉(zhuǎn)角并降低了轉(zhuǎn)變的Tm。對于酰胺化和乙?；牟煌L度VPGVG肽(E肽和L肽)，其轉(zhuǎn)變溫度對那些長許多的VPGVG聚合物觀察到的不同(Luan等人，1990，生物聚合物，29，p1699-1706；Urry等人，1985，見上文)。令人奇怪地，正如在表5中也可看到，在兩個溫度，0℃(未折疊狀態(tài))和60℃(折疊狀態(tài))之間，五聚體序列自由能的差異為大約-2.0kcal/mol(ΔG＝5×2.0+(5×0.0066)T)。這與35個殘基的分子動力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)的每一五聚體的轉(zhuǎn)變能量大致相同(Chang和Urry，1988，見上文)。此處重要的結(jié)論是，結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變似乎不依賴肽長度，而且在某種程度上對側(cè)翼區(qū)域不敏感，使這些肽可用于蛋白質(zhì)工程目的。
SDS對彈性蛋白短序列的影響支持了疏水相互作用是較高溫度下彈性蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化的驅(qū)動力的假設(shè)。在本研究中，低濃度SDS(不超過25mM)誘導(dǎo)β-轉(zhuǎn)角的形成(圖17a)。一種可能的機制是SDS可能將跨越PG-轉(zhuǎn)角每一側(cè)(順式面)的兩個纈氨酸連接起來。然后它可能破壞這些纈氨酸周圍的水化殼層，從而促進更密切的Val-Val相互作用并誘導(dǎo)II型β-轉(zhuǎn)角。事實上，建立在彈性蛋白肽MD模擬基礎(chǔ)上的模型(Wasserman和Salemme，1990，見上文)暗示，在高溫形式中兩個纈氨酸之間的距離比在低溫形式中大約短2。SDS對較長肽(多于一個VPGVG單體)的影響與纈氨酸在其中更受屏蔽的假說是一致的。較短肽與較長彈性蛋白聚合物相比相對較高的ΔH和ΔS(表5)支持這種機制。由于ΔH和ΔS依賴于疏水部分周圍網(wǎng)格狀水分子的量，因此較大的ΔH和ΔS暗示在這些肽中有較大百分比的疏水表面是溶劑可接觸到的。
TFE濃度升高對L肽的影響，說明橢圓率的改變反映了或平衡了肽的內(nèi)部疏水性。TFE最強的影響在其中疏水相互作用占優(yōu)勢的低于40％ TFE時觀察到(Bodkin和Goodfellow，1996，生物聚合物，39，p43-50)。在VPGVG單體的收縮形式/II型β-轉(zhuǎn)角形式中纈氨酸基團之間的較短距離暗示這些疏水殘基通過表面積最小化而受到部分水屏蔽，可能是彈性蛋白中由TFE誘導(dǎo)II型β-轉(zhuǎn)角的驅(qū)動力。Bodkin和Goodfellow(1996，見上文)已經(jīng)將其作為TFE誘導(dǎo)二級結(jié)構(gòu)折疊的普遍模型進行了論述。既然總自由能對于TFE/水混合物比單獨水要低，則優(yōu)選的形式將是TFE混合物中Val基團比較靠近的形式。TFE超過40％時，II型β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)形成較慢，反映出靜電相互作用占優(yōu)勢。然而，Cammers-Goodwin等人最近的工作(1996，美國化學(xué)協(xié)會雜志(J.Am.Chem.Soc.)，118，p3082-3090)提出，通過取代周圍的水分子和提高順式/反式互變速率，TFE還可以使其中酰胺基團暴露于溶劑的線團狀態(tài)去穩(wěn)定，這被認(rèn)為是使酰胺-酰胺氫鍵最大化，導(dǎo)致二級結(jié)構(gòu)的形成增加以降低自由能。在我們的研究中，在高濃度TFE時溫度對II型β-轉(zhuǎn)角穩(wěn)定性的影響，以及在低濃度時溫度對更無序結(jié)構(gòu)的影響是不同的。在較高溫度下，本研究中聚合物(VPGVG)n和L肽在206nm處的MRE都降低?？赡苡袔讉€因子影響這種高濃度TFE下溫度誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)變。II型β-轉(zhuǎn)角可能發(fā)生熔解或者可能轉(zhuǎn)變成其它轉(zhuǎn)角。這可以是不同類型轉(zhuǎn)角的溫度依賴性平衡常數(shù)、順式-反式轉(zhuǎn)變速率增加、由于主鏈靜電力更占優(yōu)勢而疏水Val-Val相互作用去穩(wěn)定、或由于II型β-轉(zhuǎn)角206nm左右CD振幅的TFE依賴性減小的結(jié)果。然而，在低濃度TFE中，200nm左右CD振幅的減小可能反映了TFE和溫度對破壞肽中Val基團周圍的水化殼層并增強Val-Val相互作用的加成影響。
本研究由此例證，類彈性蛋白短肽可以發(fā)生與天然和經(jīng)修飾的聚合物中觀察到的相同的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。在彈性蛋白聚合物(VPGVG)n中，相同的五聚體序列都參與形成有II型β-轉(zhuǎn)角的β螺旋(Pro2-Gly3，具有Val1C＝O…H-N Val4氫鍵)。分子內(nèi)疏水性接觸被認(rèn)為可驅(qū)動該螺旋內(nèi)的轉(zhuǎn)變(Urry，1988a，見上文)。然而，唯一的穩(wěn)定化氫鍵位于每個單體(VPGVG)內(nèi)。雖然如此，但螺旋的形成未必是疏水折攏驅(qū)動及五聚體內(nèi)氫鍵穩(wěn)定而產(chǎn)生的合作轉(zhuǎn)變。我們沒有發(fā)現(xiàn)這種合作影響的證據(jù)。8肽(1個VPGVG單位)和18肽(3個VPGVG單位)的ΔH和ΔS值是相同的，說明“合作單位”沒有超越一個重復(fù)單位。
從8肽到18肽的構(gòu)型熵對總熵的貢獻顯示為最小——單個VPGVG肽的構(gòu)象熵(在松弛(764)和伸展(58)構(gòu)象的幾種狀態(tài)之間的差異，ΔSconf)已經(jīng)計算為每個殘基1.024cal·mol-1·K-1(每個殘基一個熵單位)。假定熵得自沒有隨機鏈網(wǎng)的內(nèi)在鏈動力學(xué)，那么在8肽和18肽之間升高的構(gòu)象熵改變將正好是0.010kcal·mol-1·K-1(Urry，1988a，見上文)。這顯示了當(dāng)鏈長增加時，轉(zhuǎn)變中的ΔS(表6)不能被這些ΔSconf的略微增加平衡。
這使得有可能將這些序列加工成球蛋白。8肽(E肽)從0℃到60℃的轉(zhuǎn)變涉及的自由能為-3.2kcal/mol(表5；ΔG＝8×2.0-T(8×0.0066))。這一能量應(yīng)該足以改變球蛋白結(jié)構(gòu)和功能的構(gòu)象。另一方面，為了具有更強和更劇烈的力量，增加單體(VPGVG)的數(shù)目可能比較理想。例如，連續(xù)串聯(lián)作為接頭肽的3-5個單體，可以使用單個大的可塑變形的能量以移動蛋白質(zhì)的不同結(jié)構(gòu)域或亞基。同樣，這些序列可以用來取代表面轉(zhuǎn)角而誘導(dǎo)局部結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，或者通過插入到酶或結(jié)合蛋白中從而提供調(diào)節(jié)蛋白的熱穩(wěn)定性或熱不穩(wěn)定性的新方法。表1具有受保護或未受保護末端的彈性蛋白短肽和具有不同組成的較長肽的序列肽之間的差異用粗體表示，其中Ac-乙酰基，NH2-酰胺。
AH-GVG(VPGVG)-NH2E Ac-GVG(VPGVG)-NH2BH-GVG(VPGVG)-OH F Ac-GVG(VPGVG)-OHCH-GGVG(VPGVG)-NH2G Ac-GGVG(VPGVG)-NH2DH-GGVG(VPGVG)-OH H Ac-GGVG(VPGVG)-OHIAc-GVG(VPGVG)(VPGVG)(VPGVG)ILG-NH2JAc-GKL(VPGVG)(VPGVG)(VPGVG)ILG-NH2KAc-GKL(VPGVG)(VPGEG)(VPGVG)ILG-NH2LAc-GVG(VPGVG)(VPGVG)(VPGVG)-NH2MAc-GVG(VPGVG)(VPGVG)(VPGVG)L-NH2NAc-GVG(VPGVG)(VPGVG)(VPGVG)IL-NH2OAc-GVG(VPGVG)(VPGVG)(VPGVG)(VPGVG)(VPGVG)-NH2表2彈性蛋白短肽的特征肽 MH+ 氨基酸分析[aa，測定值(預(yù)期值)][測定值(預(yù)期值)]A639.4(640.1)P，0.94(1)；G，4.04(4)；V，2.44(3)B641.4(640.4)P，1.05(1)；G，4.22(4)；V，2.52(3)C696.4(697.2)P，0.92(1)；G，5.31(5)；V，2.67(3)D698.4(697.4)P，0.90(1)；G，5.15(5)；V，2.54(3)E682.4(682.1)P，0.95(1)；G，4.29(4)；V，2.63(3)F683.4(683.4)P，0.88(1)；G，4.36(4)；V，2.65(3)G738.4(739.2)P，1.01(1)；G，5.20(5)；V，2.66(3)H739.4(740.2)P，0.95(1)；G，5.06(5)；V，2.53(3)I1784.2(1785.2) P，3.74(3)；G，8.24(9)；V，5.68(7)；I，1.13(1)；L，1.27(1)J1869.3(1870.3) P，3.52(3)；G，7.39(8)；V，4.84(6)；I，1.02(1)；L，2.24(2)；K，1.21(1)K1900.5(1900.3) P，3.25(3)；G，7.98(8)；V，4.32(5)；I，0.88(1)；L，1.97(2)；K，1.09(1)；E，1.17(1)L1500.7(1501.8) P，3.80(3)；G，7.65(8)；V，5.66(7)M1614.0(1614.9) P，3.43(3)；G，6.96(8)；V，5.06(7)；L，1.24(1)N1728.6(1728.1) P，3.53(3)；G，7.80(8)；V，5.87(7)；I，1.03(1)；L，1.19(1)O2320.8(2320.8) P，5.82(5)；G，12.22(12)；V，9.13(11)表3彈性蛋白肽8和9肽熱轉(zhuǎn)變的熱力學(xué)數(shù)值aTm(℃)ΔHU→F(kcal mol-1)ΔSU→F(kcal mol-1K-1)肽pH4.0 pH7.0 pH9.5pH4.0pH7.0pH9.5 pH4.0 pH7.0 pH9.5A 44403111.2±4.214.0±3.622.8±6.30.035±0.0130.045±0.0110.075±0.021B 43394113.7±3.616.3±3.813.2±4.50.043±0.0120.052±0.0120.042±0.014C 44413117.1±6.314.7±3.212.6±3.40.054±0.0070.047±0.0100.042±0.011D 38363816.3±3.913.9±1.515.9±2.10.052±0.0120.045±0.0050.051±0.007E 31323315.7±2.815.6±3.116.8±5.10.052±0.0090.051±0.0100.055±0.017F 33374016.8±3.313.4±4.310.2±2.40.055±0.0110.043±0.0140.033±0.008G 32313317.3±4.715.7±3.120.8±5.80.057±0.0150.052±0.0100.068±0.019H 30394415.8±6.916.3±2.417.0±3.10.052±0.0230.052±0.0080.054±0.010a對在每個pH在一個波長測定每種肽的MRE，并對溫度作圖。取決于緩沖液、pH和肽的種類，這個范圍為197-202nm。數(shù)值通過將數(shù)據(jù)擬合范特霍夫方程(ΔCp＝0，允許ΔH和ΔS浮動)得到。Tm由ΔH/ΔS得到。表4彈性蛋白18-21肽在pH7.0熱轉(zhuǎn)變的熱力學(xué)數(shù)值a肽Tm(℃)ΔHU→FΔSU→F(kcal mol-1)(kcal mol-1K-1)I 16 19.5±25.9 0.068±0.088J 18 25.2±5.20.083±0.018L 35 --M 14 16.0±13 0.055±0.043N 18 --a數(shù)據(jù)分析如表3所述進行，不同之處在于數(shù)值是通過將數(shù)據(jù)擬合范特霍夫方程(其中ΔCp＝0)，指定基線的斜率和離軸偏移，并且允許ΔH和ΔS浮動而得到。表5彈性蛋白肽的ΔH和ΔS與其它工作的比較肽每個殘基的ΔH 每個殘基的ΔS(kcal mol-1) (cal mol-1K-1)8肽緩沖液平均值(E)2.0 6.69肽緩沖液平均值(G)2.0 6.621肽平均值(I+J) 1.1 3.650聚丙氨酸肽a1.3 -(-VPGVG-)n，n＞120b0.240.8a(Schohtz等人，1991，美國國家科學(xué)院進展，88，p2854-2858)，由差示掃描量熱測定(differential scanning calorimetry，DSC)的數(shù)據(jù)，測定α-螺旋伸展成線團的變化(范特霍夫估計)；b(Luan等人，1990，見上文)由DSC測量。表6彈性蛋白肽熱轉(zhuǎn)變的熱力學(xué)數(shù)值a肽 pH TM(℃)ΔHU-FΔSU-F(kcal mol-1)(kcal mol-1K-1)A7.041 11.0±2.70.035±0.009B9.535 14.9±4.90.048±0.016C4.045 20.0±2.90.063±0.009D9.540 13.0±4.80.042±0.016G9.535 13.7±2.80.047±0.009H9.547 14.4±2.30.045±0.007I7.020 26.0±10.6 0.089±0.036J7.018 25.3±2.50.087±0.009L7.037 18.9±4.70.061±0.015M7.014 15.9±10.7 0.055±0.036N7.017 12.1±2.40.042±0.008a選擇處于各自特異pH值的A-H肽(8和9肽)，因為這些熔解曲線具有比較明確的轉(zhuǎn)變(圖13a)。對較長的18-21肽(I-N)進行擬合(終點、ΔHU→F和ΔSU→F可變動，只指定轉(zhuǎn)變前和轉(zhuǎn)變后曲線的斜率)。表7彈性蛋白短肽轉(zhuǎn)變的熔解溫度a肽pH4.0 pH7.0 pH9.5A 35 41 30B 40 34 35C 45 37 24D 39 27 40E 22 21 20F 23 34 39G 33 26 35H 26 36 47a對每個pH在一個波長測定每種肽的MRE，并對溫度作圖。根據(jù)緩沖液、pH和肽的種類，這個范圍為197-202nm。通過將數(shù)據(jù)擬合范特霍夫方程(ΔCp＝0，最初允許轉(zhuǎn)變的ΔH、ΔS和終點浮動)得到數(shù)值。Tm由ΔH/ΔS關(guān)系式得到。實施例3將彈性序列加工到蛋白A微結(jié)構(gòu)域的一級結(jié)構(gòu)中來自金黃色葡萄球菌的蛋白A能結(jié)合哺乳動物IgG的Fc部分。這種3螺旋束蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)存在于細(xì)菌的細(xì)胞表面，含有串聯(lián)的同源結(jié)合結(jié)構(gòu)域，每個大約有60個殘基，命名為E、D、A、B和C(Lofdahl等人，1983，美國國家科學(xué)院進展，80，p697-701；Uhlen等人，1984，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，259，p1695-1702)。其X射線和NMR(Gouda等人，1992，生物化學(xué)(Biochemistry)，31(40)，p9665-9672)結(jié)構(gòu)都能得到，而且已經(jīng)構(gòu)建了一個合成的蛋白A結(jié)構(gòu)域——Z結(jié)構(gòu)域，以進行高水平的蛋白質(zhì)表達。最近，Z結(jié)構(gòu)域被進一步最小化至33個殘基，并保留了它與IgG的Fc部分的大部分親和力(Braisted和Wells，1996，見上文)。該結(jié)構(gòu)只由通過一個I型β-轉(zhuǎn)角連接在一起的兩個α-螺旋組成。
用固相肽化學(xué)法合成含有不同轉(zhuǎn)角區(qū)域(即其中的野生型序列被彈性肽取代)的突變蛋白A序列的肽(表8，其中粗體表示的氨基酸是被取代以引入彈性肽的氨基酸)，并如實施例1所述用圓二色性法進行分析。儀器用溶于二噁烷的異雄甾酮在304nm校準(zhǔn)，使用1.0cm石英比色杯應(yīng)該得到強度142.5ΔA。通過同時在260nm校正離軸偏移，跟蹤222nm處肽的熔解轉(zhuǎn)變。記錄222nm和260nm的3個實驗值(每個有5-10秒鐘的整合時間)的平均值。迅速冷卻至24℃，在190-260nm掃描，測試轉(zhuǎn)變的可逆性。測試了不同的溶劑，在不同溫度下測試不同濃度三氟乙醇對結(jié)構(gòu)的影響。由顯示可逆兩相模擬模型得到肽熔解的自由能，使用Grafit軟件擬合數(shù)據(jù)(詳見實施例1)。
表面等離子體振子共振光譜通過表面等離子體振子共振光譜，使用BIAcoreXTM(Biosensor，瑞典)監(jiān)控肽(分析物)與固定化Fc(配基)相互作用的動力學(xué)。在低于或高于室溫10℃進行測量前，將BIAcoreX冷卻或加熱至平衡(根據(jù)生產(chǎn)商的介紹)。在10mM pH4.5乙酸鈉緩沖液中，使用胺偶聯(lián)試劑盒，用購自生產(chǎn)商的N-乙基-N’-[(二甲基氨基)丙基]碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，將IgG2a小鼠單克隆抗體561(αCD34)(Dynal A/S(挪威)惠贈)的純化FC固定在研究級CM-5羧甲基化傳感器芯片上。Fc-561的固定化在10℃使用35μL含100μg Fc-561/mL的溶液(流速5μL/min)進行，表面未反應(yīng)基團用pH8.5的1M乙醇胺封閉。表面用pH2.4的10mM甘氨酸-HCl緩沖液再生后，固定了大約1000RU的Fc-561。在相似條件下將人血清白蛋白(HAS，30μL 50μg HSA/mL，NovoNordisk，丹麥)固定化作為對照蛋白質(zhì)。
用Hepes緩沖鹽溶液(pH7.4的10mM Hepes，150mM NaCl，3.4mM EDTA和0.005％P20)流速30μL/min進行分析。每種肽(分析物)注入4-10×100μL。同時減去芯片HSA部分的RU(由于體積影響)，以校正分析物與Fc-561的結(jié)合。在每次注射前，使用5μL pH2.4的10mM甘氨酸-HCl緩沖液將表面再生。通過將分析物在含0.005％P20的HBS中稀釋得到幾個低濃度，分析得到結(jié)合常數(shù)的數(shù)據(jù)，解離常數(shù)由分析物重新結(jié)合最少化的最高濃度測定。在最初200秒測定結(jié)合的結(jié)合速率，并且同樣地在另外200-300秒記錄流動緩沖液中的解離相(解離速率)。
BIAcoreX數(shù)據(jù)的評價芯片上金膜表面附近折射指數(shù)的變化與RU的變化有關(guān)，由此使監(jiān)控分析物結(jié)合和解離的變化成為可能。每種傳感器記錄圖代表實時記錄的折射指數(shù)隨時間的變化。結(jié)合速率和解離速率常數(shù)，分別用kon和koff表示，它們通過使用BIAevaluation2.1軟件(Pharmacia Biosensor)評價傳感器記錄圖的數(shù)據(jù)來擬合。通過二次冪的非線性擬合，由方程(5)得到只是兩個獨立的單組分事件加和的雙組分結(jié)合相。
R＝RA(1-exp(-ksAt))+RB(1-exp(-ksBt)) (5)其中R代表在時刻t的應(yīng)答，而RA和RB是兩個事件的穩(wěn)態(tài)應(yīng)答水平。為了測定結(jié)合速率，將擬合的ksA和ksB值對分析物濃度C作圖。
通過使用關(guān)系式ksA＝konAC+koffA和ksB＝konBC+koffB由ksA或ksB對C的線性擬合的斜率得到平行結(jié)合的kon速率。如下測定雙組分相互作用的解離常數(shù)，或解離速率，R＝RDexp(-koffAt)+REexp(-koffBt) (6)這里有RD和RE，即每個事件在解離起始時對總應(yīng)答的貢獻。然而，只有擬合的koffA和koffB通過指定解離的起始(t＝t0)被進一步使用。不同結(jié)合和解離速率的測定使計算解離常數(shù)KD成為可能KD＝koff/kon。同樣地，得到一定溫度范圍內(nèi)不同肽和野生型1號肽之間結(jié)合自由能的相對差異ΔΔG，表示如下ΔΔG＝+RTXln(X肽在TX的KD/野生型1號肽在TX的KD) (7)R代表摩爾氣體常數(shù)，Tx代表計算KD(基于快速結(jié)合和解離速率)和ΔΔG的溫度(用絕對溫度表示)。結(jié)果對經(jīng)結(jié)構(gòu)最小化的基于蛋白A的IgG-結(jié)合肽(Braisted和Wells，1996，見上文)進行修飾(表8，1號肽，對照)。它具有使用肽合成法可以容易制成的序列，而且它與IgG結(jié)合的結(jié)合速率較好。用彈性蛋白序列GVPGVG取代此肽中的I型β-轉(zhuǎn)角HDPNLN。我們省略了轉(zhuǎn)角N末端起始的GV部分，因為它側(cè)接有相似的小且疏水的殘基AL(ALHDPNLN)。為了避免影響彈性蛋白序列在較高溫度下的折疊，轉(zhuǎn)角C末端的EE殘基(HDPNLNEE)用QQ取代(表8，2號肽(1號突變體)和4號肽(2號突變體)。由此用Syntem(Nmes，法國)合成肽，由反相HPLC純化至95-98％純。由質(zhì)譜驗證分子量，并由氨基酸分析驗證組成(數(shù)據(jù)沒有顯示)。
由圓二色性法對肽進行結(jié)構(gòu)鑒定在磷酸鹽緩沖液中于低溫下對肽進行遠(yuǎn)紫外圓二色性掃描，以研究轉(zhuǎn)角區(qū)域內(nèi)突變的影響(圖18)。只有野生型肽(1號肽，表8)具有可檢測的特征性α-螺旋的CD-光譜，最小值在208和222nm左右，而最大值在190nm左右。然而，其相對低的CD-振幅(MRE在-10,000deg·cm2·dmol-1左右)說明光譜只顯示部分折疊α-螺旋結(jié)構(gòu)(Luo和Baldwin，1997，生物化學(xué)，36，p8413-8421及其參考文獻)。更令人驚訝的是，觀察到具有彈性蛋白β-轉(zhuǎn)角的突變體在低溫下不成形。然而，具有受保護C末端的3號肽(3號突變體)比其它突變體有更大比例的螺旋性(在222nm處測量)。
TFE對α-螺旋有穩(wěn)定化作用，因此測試1-4號肽。圖19a-c還證實了TFE可穩(wěn)定或誘導(dǎo)這些肽中的α-螺旋結(jié)構(gòu)，正如2號肽所示(圖19b)。通過升高TFE在磷酸鹽緩沖液中的濃度，發(fā)生2號肽由無規(guī)線團變成α-螺旋光譜的CD-轉(zhuǎn)變，同二色性點在204nm左右。3號和4號肽可以得到相似的光譜。這說明所有突變肽均具有折疊α-螺旋的傾向，盡管它們在磷酸鹽緩沖液中很大程度上是無序的。
野生型肽在磷酸鹽緩沖液中的CD-光譜只具有部分折疊的α-螺旋結(jié)構(gòu)，正如通過升高TFE的濃度后掃描肽發(fā)現(xiàn)的(圖19a和c)。在大約20％(v/v)TFE中，轉(zhuǎn)變似乎是完全的，而且同樣地對2-4號肽，TFE的主要誘導(dǎo)影響一直到30％都可觀察到。然而，對于1號肽，升高TFE的濃度超過20％后其在222nm的CD-信號減弱。這些拐點在20％TFE左右的CD-曲線的S形特征曲線，暗示這種轉(zhuǎn)變涉及協(xié)同相互作用。
當(dāng)TFE的濃度高達50％時，螺旋度最高的是1號肽(野生型)＞3號肽＝4號肽＞2號肽。對于1號和2號肽，膠粒SDS(25mM)也誘導(dǎo)類似α-螺旋的CD-光譜(數(shù)據(jù)沒有顯示)。然而，這些光譜的208/222比率比在TFE-誘導(dǎo)的α-螺旋光譜中觀察到的大很多(圖19a、b)，這是不完全α-螺旋誘導(dǎo)或向310-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變的典型特征(Hungerford等人，1996，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，35，p326-329)。圖20a-c顯示了在較高溫度下1-4號肽在TFE中誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。
圖20a顯示了1號肽在30％TFE中的熔解和可逆性測試。對于1號和2號肽，熔解曲線大約95-100％可逆，而對于3號和4號肽，曲線在冷卻后大約95％可逆。在204nm處的同二色性點還說明，1號肽在TFE中α-螺旋的熔解遵循兩相可逆轉(zhuǎn)變方式。圖20b顯示了1號肽中α-螺旋在不同溶劑中的熔解。TFE對二級結(jié)構(gòu)存在顯著的熱穩(wěn)定效果，而且通過增加磷酸鹽緩沖液中TFE的濃度，在熔解曲線TM處的斜率作為溫度的函數(shù)降低(協(xié)同作用降低)。1號肽在膠粒SDS中的熔解具有最平的斜率，截斷1號肽在磷酸鹽緩沖液中的熔解曲線。注意SDS對1號肽α-螺旋結(jié)構(gòu)在較低溫度下有去穩(wěn)定效果，在較高溫度下有穩(wěn)定作用。
為了定量研究IgG結(jié)合肽轉(zhuǎn)角區(qū)域內(nèi)突變的影響，在所有肽中通過使用30和60％TFE誘導(dǎo)α-螺旋結(jié)構(gòu)。肽在60％TFE中的熔解(圖20c)揭示了不同肽在α-螺旋穩(wěn)定性方面的差異。
通過將數(shù)據(jù)擬合可逆范特霍夫兩相轉(zhuǎn)變，進行熔解曲線的進一步研究。擬合是建立在30％或60％TFE中1號肽的擬合終點并將TFE中的其它熔解曲線的終點固定為這些值這一基礎(chǔ)之上的。表9顯示了不同肽的熱力學(xué)數(shù)據(jù)。不同肽的TM之間最大的差異在于30％TFE中。與野生型1號肽比較，3號和4號肽的TM降低了33-35℃，而2號肽足足降低了48℃。這些結(jié)果證實2號肽是最不穩(wěn)定的肽，而野生型1號肽是最耐熱的肽。
由表面等離子體振子共振評價肽使用BIAcoreXTM(BIAcore，瑞典)研究合成肽與小鼠單克隆IgG2a抗體561的固定化Fc的結(jié)合動力學(xué)。圖21a、b顯示了1號肽在20℃結(jié)合相的數(shù)據(jù)的擬合。1號肽對雙組分模型擬合更好。對其它肽在所有溫度下也發(fā)現(xiàn)有這種現(xiàn)象。然而，在10℃下1號肽也可以很好地擬合單組分模型。作為覆蓋測試結(jié)合和解離相的溫度范圍的最適當(dāng)模型，選擇兩組分模型。
圖22a和b顯示了對1號和2號肽記錄的典型傳感器記錄圖。傳感器記錄圖揭示了與相對快速的結(jié)合速率和解離速率有關(guān)的結(jié)合。由ksA或ksB對所用最低濃度的線性擬合的斜率測量結(jié)合速率(圖22a、b插圖)。快速結(jié)合速率的二次擬合的線性相關(guān)系數(shù)(r)為0.98左右。雖然異類動力學(xué)的擬合更適合肽在所有溫度下的情況，但是只有快速結(jié)合速率可以由統(tǒng)計方法測定。慢速結(jié)合速率大小低大約50倍而且可變性大很多(高達100％，數(shù)據(jù)沒有顯示)。然而，在較低溫度下統(tǒng)計測定快速和慢速解離速率，表10列出了1-4號肽在10℃的慢速解離速率。
使用慢速解離速率，由單或雙組分模型擬合得到的1號肽的動力學(xué)常數(shù)，與以前報道的非常相似(Starovasnik等人，1997，美國國家科學(xué)院進展，94，p10080-10085)。圖23a-c顯示了1號和2號肽的快速結(jié)合速率和解離速率以及解離常數(shù)的溫度相關(guān)性。1號和2號肽的快速解離速率在同一數(shù)量級。然而，雖然1號肽的結(jié)合速率比2號肽高100倍，但它們對溫度的應(yīng)答效果相反。當(dāng)溫度從10℃升高到30℃時，1號肽的結(jié)合速率減半，而2號肽卻加倍。2號肽在較高溫度下結(jié)合速率升高穩(wěn)定了它的解離常數(shù)。令人驚訝地，雖然3號和4號肽具有更大的α-螺旋傾向，但它們與配基的結(jié)合比2號肽差很多。它們在10℃的快速結(jié)合速率分別為211±113和289±90s-1·M-1，而它們的快速解離速率為0.674s-1(3號肽)和0.563s-1(4號肽)。這大約是2號肽結(jié)合速率的一半，而解離速率與2號肽相比要高。沒有測定它們在其它溫度下的速率。
2號肽相對于野生型1號肽之間的結(jié)合自由能的差異(ΔΔG)是線性的，正如圖24所示。在溫度范圍10-30℃內(nèi)，ΔΔG是正數(shù)，說明1號肽與Fc-561的結(jié)合比2號肽要強。然而，在相同溫度范圍內(nèi)，ΔΔG降低了0.057kcal·mol-1·K-1，或Δ(ΔΔG)降低了1.2kcal·mol-1。如果此關(guān)系在更廣溫度范圍仍是線性的，這暗示在354K(81℃)以上2號肽將是比野生型1號肽更好的Fc-561結(jié)合劑，而且結(jié)合自由能將超過4kcal·mol-1。對于3號和4號肽，它們在10℃相對于1號肽的ΔΔG值分別為+4.8和+4.5kcal·mol-1(比2號肽的正ΔΔG值高15-20％)。結(jié)構(gòu)最不穩(wěn)定的2號肽是與3號和4號肽相比更好的配基結(jié)合劑，而且它的結(jié)合速率隨溫度而升高，使用CD進一步研究這些令人驚訝的結(jié)果。
用CD研究肽在緩沖液中的溫度依賴性在222nm用CD研究在含0.005％P20的HBS緩沖液(BIAcore running緩沖液)中溫度對1號、2號和4號肽的影響，對于1號肽，隨著溫度升高，其CD-振幅降低，正如前面對于1號肽在TFE或磷酸鹽緩沖液中的熔解發(fā)現(xiàn)的那樣(圖20b)。對2號和4號肽在含P20的HBS中和在10mM磷酸鹽緩沖液中的波長掃描(210-260nm)揭示，通過升高溫度，在此區(qū)域有幾乎相同的光譜。通過升高溫度，它們的CD-振幅在210nm以下降低，在210-260nm升高，與1號肽相比影響相反(圖25a-c)。
溫度CD-光譜幾乎是100％可逆的，正如圖25a-c所示。也對2號肽在磷酸鹽緩沖液中于15.5℃和48℃下光譜的濃度依賴性測試到620μM，它們在222nm沒有任何顯著的偏差(數(shù)據(jù)沒有顯示)。野生型肽(1號肽)也顯示很容易溶解而且是以單體存在的(Starovasnik等人，1997，見上文)。通過升高溫度，進一步測定了2-4號肽在10mM磷酸鹽緩沖液和HBS中在222nm的MRE，圖26a、b顯示了它們各自的熔解曲線。S形特征曲線說明涉及協(xié)同效應(yīng)，將數(shù)據(jù)擬合從未折疊到折疊構(gòu)象的兩相可逆轉(zhuǎn)變。3號肽的熔解遵循異常的熔解曲線，MRE在222nm有升高和降低。因此，表11只列出了2號和4號肽的熱力學(xué)數(shù)據(jù)。2號和4號肽在它們相應(yīng)緩沖液中的范特霍夫圖是線性的，相關(guān)系數(shù)平均為-0.98。注意4號肽具有比2號肽更長的折疊前區(qū)域和更大的TM。轉(zhuǎn)變涉及的能量比肽在TFE中熔解涉及的能量更高(表9)。討論通過增加轉(zhuǎn)角區(qū)域內(nèi)的疏水性，在彈性蛋白GVPGVG區(qū)域內(nèi)誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)的概率應(yīng)當(dāng)隨溫度增加而增加。因此將野生型肽位點25-26的谷氨酸殘基突變成谷氨酰胺?？偣哺淖兞讼铝袣埢鶎⒁吧虸型β-轉(zhuǎn)角用可能形成II型β-轉(zhuǎn)角的殘基取代，引入螺旋去穩(wěn)定化的殘基(Val、Gly)，而且將噬菌體展示選擇的轉(zhuǎn)角附近的Glu-Glu基團變成Gln-Gln。在N末端位點的谷氨酰胺對螺旋的穩(wěn)定性具有消極的影響(Chakrabartty等人，1993，美國國家科學(xué)院進展，90，p11332-11336)。換句話說，由于將彈性蛋白序列引入到如此小的肽(選自噬菌體展示)中而破壞二級結(jié)構(gòu)的風(fēng)險是巨大的。
然而，以前已經(jīng)顯示了彈性蛋白轉(zhuǎn)角區(qū)域的不確定性。有一些報道顯示，除詳細(xì)鑒定的II型β-轉(zhuǎn)角之外，彈性蛋白序列還可能形成I型和III型轉(zhuǎn)角(Arad和Goodman，1990，生物聚合物，29，p1651-1668；Bhandary等人，1990，見上文)。二級結(jié)構(gòu)在較低溫度下顯然完全的熔解也是彈性蛋白肽或聚合物的特征之一(Urry，1988a，見上文；1988b，蛋白質(zhì)化學(xué)雜志(J.Protein Chem.)，7，p81-114；1993，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，32，p819-841)。這種熵驅(qū)動的折疊暗示彈性蛋白的疏水基團被水化，因此在較低溫度下對結(jié)構(gòu)或穩(wěn)定性沒有貢獻。
Urry把彈性蛋白的彈性描述成振動熵機制(1988a，見上文)。在彈性蛋白序列中的某些扭轉(zhuǎn)角的偶聯(lián)誘導(dǎo)序列中的大振幅搖擺運動。這暗示IgG-肽中插入的彈性蛋白序列由于內(nèi)在鏈熱力學(xué)應(yīng)當(dāng)具有巨大的熵，而且由于溫度而引起的彈性蛋白轉(zhuǎn)角中扭轉(zhuǎn)角的偶聯(lián)變化應(yīng)當(dāng)誘導(dǎo)整個序列中的結(jié)構(gòu)變化。確實，IgG結(jié)合短肽中I型β-轉(zhuǎn)角被更疏水的彈性蛋白轉(zhuǎn)角取代，使野生型肽在磷酸鹽緩沖液中的二級結(jié)構(gòu)被完全熔解。然而，甚至野生型肽本身也是不穩(wěn)定的，后來被末端的二硫橋穩(wěn)定(Starovasnik等人，1997，見上文)。
為了將它們分類，我們需要用TFE誘導(dǎo)肽中的結(jié)構(gòu)。通過使用較高濃度的TFE(＞30％(v/v))，憑借不同肽的更多的熔解數(shù)據(jù)，也有可能得到改進的熔解曲線。然而，會存在破壞野生型肽中一些已有螺旋性的風(fēng)險，正如此肽濃度超過20-25％時看到的。在熔解曲線的協(xié)同效應(yīng)和它們在不同濃度TFE中相應(yīng)的ΔS和ΔH值之間存在聯(lián)系。TFE濃度升高時的熔解曲線的協(xié)同效應(yīng)和ΔH值降低了，Luo和Baldwin最近也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象(1997，見上文)。這也符合更早的觀察結(jié)果——熔解曲線在TM處的斜率與ΔH有關(guān)(Applequist，1963，化學(xué)及物理學(xué)雜志(J.Chem.Phys.)，38，p934-941)。這暗示1號肽在25mM SDS中(具有最平的斜率，圖20b)應(yīng)當(dāng)也具有很小的ΔH值。因此，ΔH的降低不只是與肽結(jié)合的氫鍵合水分子的減少有關(guān)，可能也與溶劑的疏水性及其與肽的相互作用有關(guān)。
然而，除了Luo和Baldwin關(guān)于對ΔH的影響的研究(1997，見上文)，我們還顯示ΔS以相似的方式隨TFE濃度的增加而降低。這進一步支持他們的看法TFE通過加強它的分子內(nèi)H鍵從而穩(wěn)定α-螺旋。然而，沒有看到由于肽氫鍵合水分子減少而增加熵，大概因為它們被更多的TFE和水分子取代，并且TFE-水混合物的能量進一步降低(Rico等人，1986，生物聚合物，25，p1031-1053)。
穩(wěn)定TFE中的α-螺旋為顯示突變體和野生型α-螺旋肽(其中突變體的螺旋性被完全破壞)之間分子內(nèi)穩(wěn)定性的差異提供了一條途徑。含有最疏水轉(zhuǎn)角的突變體(2號肽)顯示了這一點，其在30％TFE中熔解α-螺旋的轉(zhuǎn)變溫度相對于野生型肽降低了48℃。含有彈性蛋白轉(zhuǎn)角但是在轉(zhuǎn)角附近含有Glu-Glu序列的其它肽(3號和4號肽)在TFE中更具螺旋性，而且它們的TM“只”降低了33-35℃。由具有酰胺化C末端的α-螺旋-3號肽的TM發(fā)現(xiàn)存在穩(wěn)定螺旋的作用(表9)。在前面有關(guān)于α-螺旋也顯示如此(Fairman等人，1989，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和遺傳(ProteinsStruct.Funct.Genet.)，5，p1-7)。
2-4號肽在磷酸鹽緩沖液中或在含P20的HBS中的CD-振幅，在222nm區(qū)域內(nèi)隨溫度而升高，這是α-螺旋或I型β-轉(zhuǎn)角形成的特征(Perczel等人，1993，見上文；Woody，1995，見上文)。然而，緩沖液中熔解曲線在222nm處CD-信號的大小比轉(zhuǎn)變成α-螺旋的預(yù)計低很多，而與I型β-轉(zhuǎn)角的強度減小更相似(Woody，1995，見上文)。
這種轉(zhuǎn)變的CD-信號受在較高溫度采取無規(guī)線團構(gòu)象的較大數(shù)目殘基影響，因此通過升高溫度并不轉(zhuǎn)變成典型的α-螺旋光譜(Perczel等人，1993，見上文)。所有肽在TFE中的穩(wěn)定性顯示α-螺旋的含量應(yīng)隨著溫度升高而降低，對1號肽在磷酸鹽緩沖液中也觀察到如此。然而，2-4號肽在磷酸鹽緩沖液中并不如此，它們在磷酸鹽緩沖液中在222nm處的CD振幅隨溫度而增加。熔解曲線中的協(xié)同效應(yīng)比對α-螺旋熔解的觀察結(jié)果更大。在TFE中具有比2號肽更大的α-螺旋傾向的4號肽，在222nm處的轉(zhuǎn)變應(yīng)當(dāng)具有比2號肽更低的TM。然而，發(fā)現(xiàn)相反的結(jié)果。在兩個不同溫度下的濃度非依賴性和這種轉(zhuǎn)變涉及的完全可逆性暗示這是分子內(nèi)轉(zhuǎn)變。因此，在222nm處對2-4號肽的影響可能是由于溫度誘導(dǎo)的I型β-轉(zhuǎn)角。
此轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)也發(fā)現(xiàn)存在于彈性蛋白序列中(Arad和Goodman，1990，見上文；Bhandary等人，1990，見上文)，雖然-Pro-Gly-II型β-轉(zhuǎn)角比I型β-轉(zhuǎn)角更穩(wěn)定0.2-1.7kcal mol-1，而且也是彈性蛋白中更常見的β-轉(zhuǎn)角(Urry，1993，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，32，p819-841；Yang等人，1996，見上文及此處參考文獻)。I型β-轉(zhuǎn)角是結(jié)構(gòu)最小化肽中螺旋I和螺旋II之間改良的、噬菌體展示選擇的轉(zhuǎn)角(Starovasnik等人，1997，見上文)。這種類型的轉(zhuǎn)角可能確保螺旋雖然發(fā)生了熔解，也是正確地排列而能結(jié)合的。也有來自自然界的結(jié)合誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的報道(Daughdrill等人，1997，自然結(jié)構(gòu)生物學(xué)(Nature Struc.Biol.)，4，p285-291；Uesugi等人，1997，科學(xué)(Science)，277，p1310-1313)。誘導(dǎo)螺旋排列的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變可能有助于稍后與配基結(jié)合時增加α-螺旋性。
通常將CD-光譜明顯沒有二級結(jié)構(gòu)的肽假定為“無規(guī)線團”肽。然而，通過輕微搖動溶劑或通過結(jié)合誘導(dǎo)，被抑制的結(jié)構(gòu)可能會展現(xiàn)出來(Waterhous和Johnson，1994，生物化學(xué)，33，2121-2128頁)。因此無規(guī)線團并非“無規(guī)”，而是含有大量隱藏的二級結(jié)構(gòu)，它們可能被或不被溶劑/結(jié)合誘導(dǎo)(Siligardi，1996，生物聚合物)。彈性蛋白肽或聚合物的電荷的影響和它們各自的轉(zhuǎn)變溫度之間也有清楚的相關(guān)性(參閱實施例1和2；Urry，1993，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，32，p819-841)，在此工作中的結(jié)果符合這種看法。
具有最疏水轉(zhuǎn)角區(qū)域的2號肽在磷酸鹽緩沖液中222nm處溫度誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)變的TM，與3號和4號肽相比最低。后一種肽在相當(dāng)于2號肽轉(zhuǎn)角區(qū)域附近(Gln-Gln)多兩個負(fù)電荷Glu-Glu。根據(jù)在彈性蛋白序列中觀察到的結(jié)果，帶電荷多的肽將提高水合的概率，因此也提高疏水相互作用的TM。此轉(zhuǎn)變涉及的能量(表11)也與在彈性蛋白短肽中的發(fā)現(xiàn)驚人的相似。對于那些彈性蛋白肽8-21肽，有關(guān)II型β-轉(zhuǎn)角形成的相似轉(zhuǎn)變的平均ΔH和ΔS，分別為16.8kcal mol-1和0.056kcal mol-1K-1(基于實施例1和2的結(jié)果)。同樣，與以前對α-螺旋的熔解發(fā)現(xiàn)的結(jié)果(表10)相比，此處ΔH和ΔS的差異更大，說明涉及疏水相互作用的溫度誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變成I型β-轉(zhuǎn)角是加熱時最可能形成的結(jié)構(gòu)。
2號肽在含P20的HBS中由0-60℃的轉(zhuǎn)變涉及自由能變化3.0kcalmol-1。這與形成β-轉(zhuǎn)角所需的能量(2-4kcal mol-1)相同，但是低于α-螺旋起始所需的能量(4kcal mol-1)(Yang等人，1996，見上文及此處參考文獻)。
通過先確定哪種動力學(xué)模型適合使用，由表面等離子體振子共振研究所有肽的活性。如果分析物或配基以多種構(gòu)象存在，那么可能解釋為什么對所有肽使用BIAevaluation2.1能較好擬合異類雙組分結(jié)合動力學(xué)模型。在此研究中使用的配基是單克隆小鼠IgG2a(561)的純化Fc，但是此研究中的2-4號肽都是在HBS中沒有任何螺旋結(jié)構(gòu)的，而且同樣1號肽的螺旋性隨溫度降低。然而，可以在二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性處于其局部最高水平的最低溫度將1號肽擬合單組分模型。最近觀察到46個殘基的蛋白A片段(B-結(jié)構(gòu)域)可能經(jīng)過具有不同H鍵模式的兩種不同螺旋構(gòu)象發(fā)生折疊(Guo等人，1997，美國國家科學(xué)院進展，94，p10161-10166)，說明此研究中未折疊的蛋白A衍生33肽可能存在不同的中間構(gòu)象。
通過升高溫度，未折疊肽(1號肽，對照)的比例增加了，而且形成更大比例的不均勻群體。2號肽的結(jié)合速率升高符合pH7的10mM磷酸鹽緩沖液或含P20的HBS中的CD-熔解曲線，顯示二級結(jié)構(gòu)隨溫度而增加(圖23a、b)。1號肽隨著溫度升高而結(jié)合速率降低與二級結(jié)構(gòu)降低之間具有聯(lián)系。這說明結(jié)合速率遵循肽的二級結(jié)構(gòu)。以前的報道已經(jīng)顯示了α-螺旋含量和結(jié)合強度之間存在很好相關(guān)性(Jansson等人，1997，生物化學(xué)，36，p4108-4117，及此處參考文獻)。然而，兩種肽的解離速率都相當(dāng)相似(而且大)，隨著溫度升高都輕微增加。這說明兩種肽存在相似的分子間解離力。這進一步說明1號和2號肽在結(jié)合后獲得相似的結(jié)構(gòu)，或者這種效果是因固定化配基的結(jié)構(gòu)變化引起的。
溫度誘導(dǎo)的結(jié)合和結(jié)構(gòu)對轉(zhuǎn)角附近Glu殘基的電荷變化的反應(yīng)相似(2號肽(-GVPGVGQQ-)與3號和4號肽(-GVPGVGEE-)相比)。雖然由于2號肽中QQ殘基的螺旋去穩(wěn)定作用而使得3號和4號肽形成α-螺旋的傾向比2號肽更大(比較2號、3號和4號肽在60％TFE中的熔解曲線，Chakrabartty等人，1993，見上文)，但它們與配基的結(jié)合并非更好。對于2號肽，轉(zhuǎn)角區(qū)域中更疏水的基團相互作用，誘導(dǎo)TM比4號肽更低的結(jié)構(gòu)(I型β-轉(zhuǎn)角)，它可能影響分子內(nèi)兩個熔解的α-螺旋之間的接近度或涉及結(jié)合的殘基的位置。溫度誘導(dǎo)2號肽折疊與1號肽相比較都是由熵驅(qū)動的，這一觀察結(jié)果說明了升高溫度涉及的結(jié)合能量(2號肽相對于1號肽)和ΔΔG的負(fù)斜率。通過基因工程改造，可以產(chǎn)生具有足夠大的負(fù)斜率ΔΔG/T的肽或蛋白質(zhì)。
如本文描述的將可誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)換機制引入蛋白A，說明可以將野生型結(jié)構(gòu)以這種方式進行改變從而導(dǎo)致最初的穩(wěn)定性喪失。通過將彈性蛋白轉(zhuǎn)換機制引入到在較高溫度下可以折疊成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)中，其活性和穩(wěn)定性可以再恢復(fù)。因此在螺旋之間使用彈性蛋白序列也是適當(dāng)?shù)?。因此，通過用VPGVG螺旋中斷序列將蛋白A的轉(zhuǎn)角從I型β-轉(zhuǎn)角變成彈性蛋白β-轉(zhuǎn)角，我們首先熔解了α-螺旋，并將新的熱誘導(dǎo)轉(zhuǎn)換導(dǎo)回到I型β-轉(zhuǎn)角。因此這可能為蛋白A以及其它螺旋蛋白提供了一種新的溫度調(diào)控，其中在較低溫度下降低結(jié)合速率而在較高溫度下提高結(jié)合速率從而調(diào)節(jié)結(jié)合。表8具有插入的彈性蛋白序列的最小化蛋白A序列Noa1號肽 2號肽 3號肽*4號肽(蛋白A對照)(1號突變體)(2號突變體*) (3號突變體)A5 PHEPHE PHEPHEA6 ASNASN ASNASNA7 METMET METMETA8 GLNGLN GLNGLNA9 GLNGLN GLNGLNA10 GLNGLN GLNGLNA11 ARGARG ARGARGA12 ARGARG ARGARGA13 PHEPHE PHEPHEA14 TYRTYR TYRTYRA15 GLUGLU GLUGLUA16 ALAALA ALAALAA17 LEULEU LEULEUA18 HISGLY GLYGLYA19 ASPVAL VALVALA20 PROPRO PROPROA21 ASNGLY GLYGLYA22 LEUVAL VALVALA23 ASNGLY GLYGLYA24 GLUGLN GLUGLUA25 GLUGLN GLUGLUA26 GLNGLN GLNGLNA27 ARGARG ARGARGA28 ASNASN ASNASNA29 ALAALA ALAALAA30 LYSLYS LYSLYSA31 ILEILE ILEILEA32 LYSLYS LYSLYSA33 SERSER SERSERA34 ILEILE ILEILEA35 ARGARG ARGARGA36 ASPASP ASPASPA37 ASPASP ASPASP殘基號 33 33 33 33*這種肽具有酰胺化的C末端，其它肽具有游離N和C末端。a在蛋白A序列中的氨基酸編號表9肽在三氟乙醇中熔解的熱力學(xué)數(shù)值*TmΔH ΔS(℃) (kcal·mol-1) (kcal·mol-1·K-1)1號肽磷酸鹽緩沖液13 13.1±0.4 0.046±0.00120％TFE 48 10.7±0.7 0.033±0.00230％TFE 48 11.9±0.4 0.037±0.00160％TFE 44 9.1±0.1 0.0286±0.00052號肽30％TFE 0 8.7±0.6 0.032±0.00260％TFE 9 6.8±0.2 0.0241±0.00063號肽30％TFE 18 6.4±0.2 0.0219±0.000760％TFE 23 6.2±0.1 0.0211±0.00054號肽30％TFE 8 9.7±1.0 0.035±0.00460％TFE 23 7.8±0.1 0.0263±0.0005a測定每種肽在222nm的平均殘基橢圓率，并擬合可逆范特霍夫方程(ΔCp＝0，允許ΔH、ΔS和轉(zhuǎn)變后終點浮動)。將轉(zhuǎn)變前終點固定為就1號肽在相似溶液中的熔解最初擬合的值。表10由表面等離子體振子共振測量的在10℃下肽和小鼠單克隆IgG2a561(αCD34)的Fc相互作用的動力學(xué)參數(shù)akoff快速(s-1) Kd快速(μM-1) koff慢速(s-1Kd慢速(μM-1)1號肽 0.109±0.004 0.69±0.030.0322±0.0004 0.203±0.0041號肽b0.044 0.241號肽 0.041 0.1852號肽 0.39±0.08953±207 0.0349±0.004 86±113號肽 0.7±0.1 3194±17750.10±0.04 493±3254號肽 0.56±0.061948±638 0.0212±0.001 73±23a用含0.005％(v/v)表面活性劑P20的HBS流速30μl/min，并使用固定化HSA校正體積的影響，由分析物與配基(1000RU)的異類結(jié)合動力學(xué)的擬合測定快速和慢速解離速率(koff)。解離常數(shù)(KD)是建立在快速結(jié)合速率基礎(chǔ)上的(圖23b)。以±S.E表示誤差，而且KD的誤差由KD＝koff/kon的關(guān)系式依據(jù)kon和koff的S.E計算得到。
b將1號肽擬合10℃的單個均質(zhì)1∶1結(jié)合，得到結(jié)合速率為1.87×10-5M-1·s-1，此數(shù)值還用于計算上面顯示的KD值。
cStarovasnik等人(1997，見上文)給出的結(jié)合單克隆IgG1的參數(shù)，kon為2.2×10-5M-1·s-1。c中的實驗溫度沒有給出。c中的擬合是建立在肽和配基之間1∶1相互作用基礎(chǔ)上的。表112號肽和4號肽在緩沖液中222nm處的熱轉(zhuǎn)變熱力學(xué)數(shù)據(jù)aTm ΔHΔS(℃) (kcal·mol-1) (kcal·mol-1·K-1)2號肽在磷酸鹽26 19.0±1.6 0.063±0.005緩沖液中2號肽在含P20 31 15.4±1.9 0.051±0.006的HBS中4號肽在磷酸鹽45 18.5±1.5 0.058±0.005緩沖液中4號肽在含P20 39 13.8±1.9 0.044±0.006的HBS中GVG(VPGVG)肽b18.2 0.062a將222nm處的熔解數(shù)據(jù)擬合可逆的范特霍夫方程(允許ΔH、ΔS和轉(zhuǎn)變終點浮動)。熱容量固定為0。
b數(shù)值是短肽GVG(VPGVG)n(n＝1和3)在pH7.0磷酸鹽緩沖液中的平均值。實施例4用彈性接頭基因工程改造抗-gp41 ScFv 3D6將ScFv 3D6(抗HIV-gp41，Engelhardt等人，1994，生物技術(shù)(BioTechniques)，17，p44-46，基因庫編號U35316)的序列由質(zhì)粒pDAP2(Kerschbaumer等人，1996，免疫技術(shù)(Immunotechnology)，2，p145-150)亞克隆到質(zhì)粒pUC119His6mycXba(Griffiths等人，1994，EMBOJ.13，p3245-3260)中。在前一種質(zhì)粒中(圖27a)，scFv以堿性磷酸酶融合蛋白的形式表達，含有用于周質(zhì)表達的pelB前導(dǎo)序列和用于金屬親和層析純化的His6標(biāo)簽。后一種質(zhì)粒(圖27b)還含有c-myc標(biāo)簽，便于使用抗體9E10進行陽性鑒定/純化(Hoogenboom等人，1991，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，19，p4133-4137)。兩種質(zhì)粒都由LacZ啟動子調(diào)控并且攜帶氨芐青霉素抗性基因，3D6 mRNA和蛋白質(zhì)通過使用1mM誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)合成。
使用含有SGGGGSGGRASGGGGS接頭的3D6 scFv質(zhì)粒(圖28)作為起點，用如下基于彈性蛋白的接頭加工scFv舊的scFv接頭序列-SGGGGSGGRASGGGGS-新的scFv接頭序列-X[VPGVG]nY-，其中n＝1-10，X、Y可以是相同的或不同的任何氨基酸殘基，優(yōu)選小的脂族氨基酸殘基以保持接頭的彈性。在這個實施例中，我們具體地設(shè)計了下列將要克隆到3D6 scFv中的接頭。
(I) -S[GVG(VPGVG)VPG]S- 11聚體接頭(II) -S[GVG(VPGVG)4VPG]S- 26聚體接頭(III)-S[GVG(VPGVG)7VPG]S- 41聚體接頭將第一個接頭區(qū)(I)如圖29a-c中所示進行克隆。圖29a顯示了pDAP2質(zhì)粒中3D6基因的結(jié)構(gòu)，而在圖29b中使用限制性位點Hind III和Not I，已經(jīng)將該基因亞克隆到pUC119His6mycXba中。如圖29c和30所示，使用引物組合LMB3(B)與VHLINK(F)以及PHENCO(F)與VLLINK(B)進行進一步的PCR誘變。這一步引入了新的限制性位點(在圖30中用*標(biāo)記)。在圖29c中圖解了用于3D6基因克隆、篩選和測序的引物位置。圖30b顯示了3D6基因與新的接頭構(gòu)建物的裝配。最初的11聚體接頭(I)通過連續(xù)限制性酶切和與退火VPGVG-編碼寡核苷酸退火得以擴展(圖31和圖32)。圖31顯示了26聚體接頭區(qū)(II)的裝配，通過將含有兩個開口限制性位點(在圖31中用**標(biāo)記)的退火寡核苷酸連接到基因的接頭區(qū)(I)(在圖31中用粗體和下劃線表示)而裝配。在這個步驟中，引入了一個新的XmaI限制性位點并在圖31中用(*)標(biāo)記。圖32顯示了41聚體接頭區(qū)(III)的裝配，是通過將含有兩個開口限制性位點(在圖32中用**表示)的退火寡核苷酸連接到經(jīng)限制酶消化的質(zhì)粒中3D6基因的接頭區(qū)(II)(在圖32中用粗體和下劃線表示)內(nèi)而裝配的。圖33b顯示了最終的41聚體接頭區(qū)(III)的結(jié)構(gòu)。將3D6基因亞克隆至pUC119His6mycXba中將凍干的pDAP2-3D6質(zhì)粒溶于無菌的純水中并熱轉(zhuǎn)化(于42℃1-2分鐘)到CaCl2感受態(tài)TOPP2細(xì)胞中，并在含100μg/ml氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)板上篩選。使菌落在4ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB中于37℃和250rpm進一步生長過夜。取細(xì)菌培養(yǎng)物樣品進行甘油保存(在含15％甘油的LB中于-70℃保存)，使用Hybaid RecoveryTM快速制備微量試劑盒(QuickPrep Mini Kit)(Hybaid，Middlesex，英國)或WizarTMPlus微量制備DNA純化系統(tǒng)(Minipreps DNA Purification Systems)(Promega，Madison，WI)純化pDAP2-3D6質(zhì)粒。在1.0％瓊脂糖凝膠上鑒定質(zhì)粒pDAP2-3D6和pUC119His6mycXba。pDAP2-3D6和pUC119His6mycXba質(zhì)粒都分別使用10U Not I和20U Hind III(New England Biolabs，NEB)在含100μg/ml BSA的緩沖系統(tǒng)2(NEB)中于37℃進行16小時限制性酶切，然后于65℃20分鐘熱滅活。在1％(w/v)低熔點(LMP)瓊脂糖(Gibco)上，于4℃使用pH8.0的Tris-乙酸-EDTA緩沖系統(tǒng)(TAE)分離3D6基因和開口的pUC119His6mycXba質(zhì)粒，用長波(＞300nm)UV燈檢測并從凝膠上切下來。使用MAGICTM-PCR制備物DNA純化系統(tǒng)(PCR Preps DNA PurificationSystem)(Promega，Madison，WI)純化3D6基因，使用Qiaquick GelExtraction Kit(Qiagen，Crawley，英國)純化開口的質(zhì)粒。在1％瓊脂糖凝膠上分析產(chǎn)物，使用400U T4 DNA連接酶(NEB)在提供的T4連接酶緩沖液中于16℃，將3D6基因連接到開口的pUC119His6mycXba中過夜。進行只有開口載體的對照連接反應(yīng)。將連接反應(yīng)混合物(10μl)熱轉(zhuǎn)化到CaCl2感受態(tài)的TG1細(xì)胞中，并在2xTY瓊脂培養(yǎng)板上于37℃溫育過夜。用牙簽挑取陽性轉(zhuǎn)化體，并用PCR-篩選鑒定在20μl反應(yīng)混合物中使用引物L(fēng)MB3(B)和Phenenco(F)(圖34)各10pmol、200μM各種核苷酸(Pharmacia或Bioline)、和含MgCl2和Taq-聚合酶的緩沖液(Bioline)。在熱循環(huán)儀(MJ Research)上進行PCR-篩選，程序如下最初94℃ 5分鐘，然后30個重復(fù)循環(huán)，順序為94℃(30秒鐘)、42℃(30秒鐘)和72℃(1分鐘)。程序最后為72℃5分鐘并冷卻至4℃。在1或1.5％瓊脂糖凝膠上在Tris-硼酸-EDTA緩沖系統(tǒng)(TBE)中分析PCR產(chǎn)物，并讓陽性菌落在4ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB過夜培養(yǎng)物中生長。制成甘油保存物，并分離質(zhì)粒，用Hybaid RecoveryTM快速制備微量試劑盒(Hybaid，Middlesex，英國)純化。將來自三個含有質(zhì)粒pUC119His6mycXba的陽性菌落的3D6基因在兩個方向上使用引物L(fēng)MB3(B)和Phenenco(F)進行測序。使用自動熒光染色終止子測序方法(377 Perkin-Elmer測序儀)。在所有三個克隆中都檢測到N末端的一個突變(氨基酸E變成D)和一些沉默突變。接頭構(gòu)建物(I)的克隆在二次反應(yīng)混合物中使用高保真延伸聚合酶(Boehringer Mannheim)進行PCR擴增，插入第一個接頭構(gòu)建物(11聚體；編號I)(圖29c和30)。每次含有正向和反向引物組合VHLINK(F)和LMB3(B)(覆蓋scFv的VH-區(qū)并帶有新的接頭)，或VLLINK(B)和PHENECO(F)(覆蓋scFv的VL-區(qū)并帶有新的接頭)(圖29c)。將引物(每種15pmol)、200μM dNTP(Pharmacia)、1μl 1∶10稀釋的模板(帶有舊接頭的3D6-pUC119His6mycXba)和提供的延伸緩沖液在熱循環(huán)儀上溫育，延伸程序為94℃(2分鐘)；10個循環(huán)，順序為94℃(15秒鐘)、43℃(30秒鐘)和72℃(45秒鐘)；然后15個循環(huán)，順序為94℃(15秒鐘)、43℃(30秒鐘)和72℃(最初45秒鐘，然后每個循環(huán)延長20秒鐘)。以72℃5分鐘并冷卻至4℃完成程序。將VH和VL的PCR產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠(TBE緩沖液)上分析，顯示每種產(chǎn)物分別為一條清晰的條帶，VH(正好超過500bp)和VL(正好低于500bp)。用MAGICTMPCR制備物DNA純化系統(tǒng)(Promega，Madison，WI)純化產(chǎn)物。VH的PCR產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)具有新的接頭(帶有Kpn I、EcoN I和Xho I位點)。VL應(yīng)當(dāng)同樣在新的接頭上帶有Kpn I、EcoN I和BamH I位點。在VH和VL的PCR產(chǎn)物中，覆蓋Kpn I和EcoN I位點的序列是重疊的。使用相應(yīng)的NEB酶及其說明書，用限制性酶切和T4連接酶檢測位點Kpn I和EcoN I。在1.5％瓊脂糖凝膠(TBE緩沖液)上分析連接產(chǎn)物，顯示Kpn I在1000bp左右(3D6scFv)給出比EcoN I強許多的條帶。因此兩種PCR產(chǎn)物都用20U Kpn I根據(jù)NEB的說明書進行限制性酶切。用MAGICTMPCR制備物DNA純化系統(tǒng)(Promega，Madison，WI)純化產(chǎn)物，以除去小的消化產(chǎn)物(10-16bp)，并如上所述將VH和VL用T4連接酶于16℃進一步連接過夜。將連接混合物熱滅活(65℃10分鐘)，用MAGICTMPCR制備物DNA純化系統(tǒng)純化，并用40U Hind III和20U Not I如前述進行進一步限制性酶切。消化混合物于65℃(20分鐘)熱滅活后，于4℃進行LMP 1.5％瓊脂糖凝膠電泳(TAE緩沖系統(tǒng))。根據(jù)基因的MW切下相應(yīng)的凝膠區(qū)域，并用β-瓊脂糖酶I根據(jù)NEB的方法于40℃消化過夜。將DNA用異丙醇于-20℃沉淀2小時，干燥，重懸于20μl無菌純水中，并在1.5％瓊脂糖凝膠(TBE)上分析。在1000bp左右檢測到三條帶，可能來自VH-VH、VL-VL和VH-VL裝配。然而，只有VH-VL可以成功地插入到開口的載體中。將分離的三條帶用T4(NEB)連接到Hind III/Not I限制性酶切的載體pUC119His6mycXba中，并熱轉(zhuǎn)化(于42℃90秒鐘)到感受態(tài)TG1細(xì)胞中。如上所述將菌落進行PCR篩選和分離。將由菌落分離得到的質(zhì)粒進行新位點Xho I和Kph I的檢測(使用NEB所述相應(yīng)的限制性酶切方法)。將質(zhì)粒進行Xho I和Kph I限制性酶切。如上所述將質(zhì)粒進一步進行正向和反向測序，鑒定到新的接頭。接頭構(gòu)建物(II)的克隆如圖31所示裝配接頭。首先將編碼接頭構(gòu)建物(I)的質(zhì)粒用80U XhoI在NEB2緩沖液中進行限制性酶切，然后用40U Kpn I在NEB1緩沖液中進行進一步的限制性酶切。兩次限制性酶切都是在100μg/ml BSA中于37℃進行過夜，限制性酶切混合物在每次溫育后都用WizardDNA清洗系統(tǒng)(DNA Clean-up System)純化。將單鏈寡核苷酸LINK1(F)和LINK1(B)各150pmol，分別在T4連接酶緩沖液中用T4多核苷酸激酶于37℃磷酸化反應(yīng)60分鐘。將激酶混合物于65℃熱滅活20分鐘，然后退火。首先將每種寡核苷酸25pmol的混合物于94℃溫育5分鐘以完全解開寡核苷酸。然后將這些寡核苷酸在熱循環(huán)儀上每分鐘下降1℃而由94℃冷卻到20℃緩慢退火。將雙鏈寡核苷酸凍干，并再溶于冰冷的無菌純水中，并且向經(jīng)限制性酶切的載體中加入摩爾數(shù)100倍過量的雙鏈寡核苷酸并使用T4 DNA連接酶(NEB)于16℃連接過夜。將連接反應(yīng)混合物熱滅活(65℃，10分鐘)并加到感受態(tài)TG1細(xì)胞中，在含100μg/ml氨芐青霉素的2xTY培養(yǎng)板上于37℃生長過夜。使用覆蓋大約220bp包含接頭區(qū)的引物組合LMB3(B)與Phenenco(F)或INT1(F)與INT1(B)，經(jīng)PCR篩選鑒定陽性菌落(圖29c)。后一組引物對新接頭大小增加的分辨率較好。還通過Xma I消化和雙向測序驗證了質(zhì)粒的序列。接頭構(gòu)建物(III)的克隆將含有帶有接頭構(gòu)建物(II)的基因的質(zhì)粒在含100μg/ml BSA的NEB1緩沖液中用40U Xma I和40U Kpn I于37℃限制性酶切過夜，并將限制性酶切混合物用WizardDNA清洗系統(tǒng)純化。以與接頭構(gòu)建物(II)相似的步驟進行磷酸化、退火和將單鏈寡核苷酸LINK2(F)和LINK2(B)克隆到經(jīng)Xma I/Kpn I限制性酶切的載體中(圖32)。如對接頭構(gòu)建物(II)所述進行克隆的鑒定。圖33顯示了接頭區(qū)(III)的結(jié)構(gòu)。3D6 scFv的表達與純化構(gòu)建物可以以含有c-myc和His6標(biāo)簽的純scFv的形式在載體pUC119His6mycXba中表達，或者它們可以作為只含有His6標(biāo)簽的堿性磷酸酶的融合蛋白形式在質(zhì)粒pDAP2中(通過亞克隆)表達。將含有目的基因的質(zhì)粒熱轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TG1菌株中，在盛有500ml M9ZB培養(yǎng)基(含有1％(w/v)葡萄糖，加入了100μg/ml氨芐青霉素)的2升錐形瓶中進行克隆的表達。將新鮮接種的轉(zhuǎn)化菌落于37℃(250rpm)在溫育搖床(NewBrunswick Scientific Co.，Inc.，Edison，NJ)中培養(yǎng)12-18小時至A600達到1.0-2.0。在誘導(dǎo)前，將細(xì)胞離心(4500xg，室溫10分鐘)并重懸于預(yù)熱到30℃含有1％甘油的M9ZB培養(yǎng)基中。將溫度降低到20℃左右，加入1mM IPTG(終濃度)并進一步溫育3-24小時從而誘導(dǎo)3D6的表達。
將細(xì)胞進行滲透休克后，離心收獲細(xì)胞(Sorvall，5400rpm，4℃，12分鐘)并將沉淀塊溶于滲透休克裂解緩沖液(100ml 20％蔗糖，30mM Tris，1mM EDTA)，于室溫用力搖動10分鐘后再離心(8500rpm，4℃，30分鐘)。沉淀在100ml 5mM MgSO4中經(jīng)過相似的處理(4℃，搖動10分鐘)后，提取周質(zhì)裂解物并在Spectropore管中透析。
將表達的3D6 scFv從周質(zhì)裂解物中用金屬親和層析(Qiagen，Ni2+或Zn2+柱)純化。將收集液濃縮，并在12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分析，Western電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用9E10小鼠抗體(c-myc)和連接了辣根過氧化物酶的山羊抗小鼠抗體(Sigma)(在2％(w/v)奶粉PBS中稀釋到0.1％(v/v))進行檢測和純度分析。通過堿性磷酸酶部分的活性(酶實驗)直接檢測3D6-堿性磷酸酶融合蛋白。使用Gill和von Hippel的方法由一級序列計算消光系數(shù)ε0.1％(分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)，1989，182，p319-326)，用分光光度法在280nm測定3D6的濃度。
使用具有g(shù)p41表位(短肽)、固定到GST(谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶)表面的融合蛋白GST-epi41分析3D6 scFv的活性。GST-epi41通過它的伯胺固定在金片上，并用表面等離子體振子共振(BIAcore2000，Biasensor公司，瑞典)在不同溫度下分析與3D6 scFv的結(jié)合。由至少5種不同濃度測定kon速率，而使用3D6的最高濃度測定koff速率。實施例5將彈性序列加工到含有二硫橋的蛋白A微型結(jié)構(gòu)域的一級結(jié)構(gòu)中又合成了兩種肽——5號肽和6號肽(圖35)，并如實施例3所述進行研究。
5號肽和6號肽與實施例3中研究的肽表現(xiàn)相似。具有彈性序列的6號肽在222nm處的CD-振幅隨溫度升高而增加，而且同樣的，在對照肽中α-螺旋隨溫度升高而熔解。此外，通過加入硫酸鈉，正如CD-光譜所示，6號肽形成被認(rèn)為是I型β-轉(zhuǎn)角的結(jié)構(gòu)(圖36)。
使用由制造商(BIAcore)提供的胺偶聯(lián)試劑盒，將3370RU的Fc-561(如上文所述)用HSA(3717 RU)固定在對照CM-5芯片表面，通過表面等離子體振子共振(BIAcore 2000)進一步研究肽。圖37圖解了溫度對5號肽和6號肽的影響。這在圖38中進一步圖解，該圖中還給出了不同動力學(xué)參數(shù)(與上文實施例3所述相似，但顯示略微大些的影響)。結(jié)果6號肽(具有VPGVG轉(zhuǎn)角)對Fc-561的親和力隨溫度在5-37℃增加大約20倍。這與不具有VPGVG-轉(zhuǎn)角的5號肽是相反的(圖38c)。
6號肽結(jié)構(gòu)表現(xiàn)與實施例3中研究的肽相似，它隨溫度升高而形成I型β-轉(zhuǎn)角。
權(quán)利要求
1.含有功能部分和至少一個插入的氨基酸序列的生物分子，該氨基酸序列包含當(dāng)一個或多個環(huán)境參數(shù)適當(dāng)改變時可收縮的彈性肽，其中當(dāng)插入的序列被誘導(dǎo)收縮或伸展時，該功能部分的性質(zhì)或特征改變。
2.權(quán)利要求1的生物分子，其中所述生物分子包含一個或多個多肽。
3.權(quán)利要求1或2的生物分子，其中所述功能部分是抗體或者它的功能變體、衍生物或類似物。
4.權(quán)利要求1-3中任何一項的生物分子，其中所述氨基酸序列插入到組成成分之間，構(gòu)成形成生物分子其余部分至少一部分的鏈，以形成連續(xù)鏈。
5.權(quán)利要求1-4中任何一項的生物分子，其中所述的插入氨基酸序列取代了它所插入的分子的一部分。
6.權(quán)利要求1-5中任何一項的生物分子，其中所述氨基酸序列由彈性肽及位于其一側(cè)或兩側(cè)長度為1-100個氨基酸的側(cè)翼序列組成。
7.權(quán)利要求6的生物分子，其中所述N末端的側(cè)翼序列為GVG或GGVG。
8.權(quán)利要求1-7中任何一項的生物分子，其中所述環(huán)境參數(shù)為溫度、壓力或pH。
9.權(quán)利要求1-8中任何一項的生物分子，其中所述性質(zhì)或特征的改變是不可逆的。
10.權(quán)利要求1-9中任何一項的生物分子，其中當(dāng)所述彈性肽被誘導(dǎo)收縮時，所述功能部分活性提高。
11.權(quán)利要求1-10中任何一項的生物分子，其中所述彈性肽含有序列(XP/G(X)m)n，其中XP/G(X)m代表一個可收縮單位，P/G是脯氨酸或甘氨酸，每一個X代表任何氨基酸且可以是相同的或不同的，m是1-10的整數(shù)，n是1-100的整數(shù)，序列中的每一個單位可以是相同的或不同的。
12.權(quán)利要求11的生物分子，其中每一個X選自甘氨酸、纈氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或其它疏水性氨基酸殘基或者它們的衍生物。
13.權(quán)利要求10或11的生物分子，其中XP/G(X)m具有序列VPGVG、VPGV或IPGVG。
14.權(quán)利要求10-13中任何一項的生物分子，其中m＝1-6。
15.權(quán)利要求10-14中任何一項的生物分子，其中m＝1-3。
16.權(quán)利要求1-10中任何一項的生物分子，其中所述彈性肽含有序列(PEXK)n或(XKEXPEKX)n，其中P、E和K分別指脯氨酸、谷氨酸和賴氨酸，每一個X可以是相同的或不同的任何氨基酸，n是1-100的整數(shù)，序列中的每一個單位可以是相同的或不同的。
17.權(quán)利要求16的生物分子，其中X選自亮氨酸或纈氨酸或者它們的衍生物。
18.權(quán)利要求16或17的生物分子，其中序列PEXK為PEVK。
19.權(quán)利要求16或17的生物分子，其中序列XKEXPEKX為LKELPEKL。
20.權(quán)利要求10-19中任何一項的生物分子，其中n＝1-10。
21.權(quán)利要求10-20中任何一項的生物分子，其中n＝1-5。
22.權(quán)利要求1-21中任何一項的生物分子，其中所述彈性肽長度為5-25個氨基酸。
23.權(quán)利要求1-22中任何一項的生物分子，其中所述插入的氨基酸序列長度為5-100個氨基酸。
24.權(quán)利要求23的生物分子，其中所述插入的氨基酸序列長度為8-20個氨基酸。
25.權(quán)利要求1-24中任何一項的生物分子，它是由化學(xué)合成法產(chǎn)生的。
26.權(quán)利要求2-25中任何一項的生物分子，它是由表達編碼該生物分子的DNA序列產(chǎn)生的。
27.權(quán)利要求3-26中任何一項的生物分子，其中該生物分子是單鏈抗體，所述氨基酸序列插入到所述抗體的連接區(qū)內(nèi)。
28.權(quán)利要求1、2或4-26中任何一項的生物分子，其中所述生物分子具有可誘導(dǎo)的酶活性。
29.含有編碼權(quán)利要求2-28中任何一項所定義的生物分子的序列的核酸分子。
30.含有權(quán)利要求29定義的核酸分子的載體。
31.權(quán)利要求1-28中任何一項定義的生物分子在純化方面的用途。
32.權(quán)利要求1-28中任何一項定義的生物分子作為生物傳感器，用來檢測或監(jiān)控該生物分子環(huán)境參數(shù)改變的用途。
33.權(quán)利要求1-26中任何一項的生物分子作為藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有插入的氨基酸序列的生物分子,該氨基酸序列包含可誘導(dǎo)收縮的彈性肽,該彈性肽在收縮或伸展時會改變它所插入的分子(特別是生物分子如抗體)的性質(zhì)或特征。本發(fā)明還涉及編碼這種生物分子的核酸分子以及它們的用途。
文檔編號G01N33/53GK1276796SQ98810230
公開日2000年12月13日 申請日期1998年8月28日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月29日
發(fā)明者H·雷爾森, A·里斯, L·科斯那斯 申請人:戴奈爾有限公司