針對β-淀粉樣蛋白肽的抗體的制作方法
【專利摘要】結(jié)合人類β-淀粉樣蛋白肽的抗體，使用所述抗體治療特征在于提高的β淀粉樣蛋白水平或β淀粉樣沉淀的疾病或失調(diào)的方法，包含所述抗體的藥物組合物和制造方法。
【專利說明】針對β-淀粉樣蛋白肽的抗體
[0001]本申請為申請?zhí)枮?00780012436.0的分案申請，要求2006年3月30日的優(yōu)先權(quán)。發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及結(jié)合β -淀粉樣蛋白肽、特別是人類β -淀粉樣蛋白肽的抗體。本發(fā)明還涉及用所述抗體治療特征是提高的β淀粉樣蛋白水平或β_淀粉樣沉淀，特別是阿爾茨海默氏病的疾病或失調(diào)的方法，包含所述抗體的藥物組合物以及制造的方法。根據(jù)以下的描述，本發(fā)明的其他方面將變得明顯。
[0003]發(fā)明背景
[0004]阿爾茨海默氏病(AD)是年齡相關(guān)的認(rèn)知下降的最常見原因，在世界范圍內(nèi)影響超過 I 千 2 百萬人(Citron M(2002)Nat.Neurosci5, Suppll055_1057)。疾病的最早的階段特征在于伴有相關(guān)的認(rèn)知下降和語言及行為缺陷的漸進(jìn)性的記憶喪失。在疾病的較晚階段，患者發(fā)生全局的健忘癥，并具有大大地降低的運(yùn)動機(jī)能。死亡一般在診斷后9年發(fā)生，通常與其他狀況，一般是肺炎相關(guān)(Davis K.L.and Samules S.C.(1998) in PharmacologicalManagement of Neurological and Psychiatric Disorders eds Enna S.J.and CoyleJ.T.(McGraw-Hill, New York pp267_316))。當(dāng)前的治療代表了癥狀性的方法，集中于減輕認(rèn)知損傷和改善與進(jìn)展的疾病病因相關(guān)的行為癥狀。實(shí)際上，這些治療僅提供了短暫的認(rèn)知益處，報(bào)道的認(rèn)知損傷的水平僅維持達(dá)2年。減緩并可能停止病發(fā)展的疾病修飾治療的潛力是巨大的。這種方法將提供對患者、特別是他們的護(hù)理者的生活質(zhì)量的巨大的和持續(xù)的改善，以及降低這種疾病的巨大的總體護(hù)理成本。
[0005]阿爾茨海默氏病的臨床診斷是基于生理和心理測試的組合，其將產(chǎn)生可能的或大概的阿爾茨海默氏病的診斷結(jié)論。在死后，通過良好地表征腦中的神經(jīng)病學(xué)標(biāo)志來確認(rèn)疾病，其包括實(shí)質(zhì)斑塊和腦血管中Aβ的沉積，神經(jīng)纖絲纏結(jié)的神經(jīng)內(nèi)形成，突觸損失和特定腦區(qū)域中的神經(jīng)兀亞群的損失。(Terry, RD (1991) J Neural Trans Suppl53:141-145)。
[0006]大量的遺傳學(xué)的、組織學(xué)和功能證據(jù)表明β -淀粉樣蛋白肽(Αβ )是阿爾茨海默氏病發(fā)展的關(guān)鍵(Selkoe, D.J.(2001) Physiological Reviews81:741-766)。
[0007]Αβ已知通過β淀粉樣蛋白前體蛋白(也稱為APP)被稱為BACEl的天冬氨酰蛋白酶(也稱為 β -分泌酶、Asp2 或 Memapsin-2)裂解產(chǎn)生(De Strooper, B.and Konig, G.(1999)Nature402:471-472)。除了實(shí)質(zhì)和血管的沉積之外，Αβ的可溶的寡聚形式已經(jīng)被假定促進(jìn)了 AD的發(fā)作,它們可以通過損害突觸功能初步地影響神經(jīng)元功能(Lambert et.al.(1998proceedings of the National Academy of Science, U.S.A.95:6448-6453)。雖然早期在AD中和在MCI中發(fā)現(xiàn)了不溶的淀粉樣蛋白斑塊，可溶的Αβ聚集物(稱為寡聚體或Αβ衍生的可擴(kuò)散配體(ADDL)的水平也在這些個(gè)體中增加，與淀粉樣蛋白斑塊相比，可溶Αβ水平與神經(jīng)纖絲退化、突觸標(biāo)記物的損失更好地相關(guān)。(Naslund et.al.(2000) J AmMed Assoc283:1571-1577, Younkin, S.(2001)Nat.Med.1:8-19)。高度淀粉樣變性的 Αβ 42和氨基末端截短形式A β χ-42是在彌散和老年斑中存在的A β的優(yōu)勢種類(Iwatsubo, T(1994)Neuron.13: 45 - 53, Gravina, SA(1995)J.Biol.Chem.270:7013 - 7016)。Αβ 42 的相對水平似乎是Αβ聚集成淀粉樣蛋白斑塊的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物，實(shí)際上Αβ 42顯示了離體時(shí)比其他 Αβ 更容易聚集(Jarrett, JT (1993)Biochemistry.32:4693 - 4697)，因而暗示了 Αβ 42作為 AD 的發(fā)病機(jī)理的啟動分子(Younkin SG, (1998)J.Physiol.(Paris).92:289 - 292)。雖然Αβ 42是APP新陳代謝的副產(chǎn)物，在它的產(chǎn)生中的小的偏差與對Αβ沉積的大的影響相關(guān)，因而假定的是，單獨(dú)的A β 42的降低可能是治療AD的有效途徑(Younkin SG, (1998)J.Physiol.(Paris).92:289 - 292)。為了支持這一點(diǎn)，淀粉樣蛋白前體蛋白質(zhì)(APP)和presenilin基因中的突變已經(jīng)被報(bào)道主要地提高Αβ42的相對水平，并因而縮短阿爾茨海默氏病(AD)的發(fā)作時(shí)間(Selkoe D.J., Podlisny Μ.B.(2002) Annu.Rev.Genomics Hum.Gemet.3:67-99)。然而要注意的是沉積速率也取決于分解代謝和Aβ清除。
[0008]通過在小鼠中過量表達(dá)突變的人類轉(zhuǎn)基因已經(jīng)產(chǎn)生了淀粉樣蛋白沉積的動物模型。過量表達(dá)單獨(dú)的人類APP轉(zhuǎn)基因的小鼠一般從12月齡發(fā)展出腦部斑塊樣β-淀粉樣沉淀(Games D.et al., (1995) Nature373:523-527;Hsiao K.et al., (1996)Science274:99-102))，而攜帶突變的人類APP和presenilin-1 (PS-1)轉(zhuǎn)基因的小鼠一般早在2月齡發(fā)展出腦部斑塊樣β-淀粉樣沉淀(Kurt Μ.A.et al.，(2001) Exp.Neurol.171:59-71;McGowan E.et al., (1999) NeuroIbio1.Dis.6:231-244)0
[0009]變得越來越明顯的是，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和血漿之間外源A β的轉(zhuǎn)運(yùn)在腦淀粉樣蛋白水平的調(diào)節(jié)方面起到作用(Shibata, et al (2000) J ClinInvestl06:1489-1499), CSF Αβ被快速地從CSF轉(zhuǎn)運(yùn)到原生質(zhì)。因而，使用Αβ肽的主動疫苗接種或特異性Aβ抗體的被動施用快速地結(jié)合了外周的Αβ，改變血漿、CSF之間和最終的CNS的動力平衡。實(shí)際上現(xiàn)在有很多的研究展現(xiàn)了這些方法都可以在淀粉樣變性的各種轉(zhuǎn)基因模型中降低Αβ水平，降低Αβ病理并提供認(rèn)知的益處。還在高等動物中進(jìn)行了有限的研究。Caribbean vervet猴(16-10歲)用Aβ肽免疫10個(gè)月。在血衆(zhòng)中Αβ 40水平提高2-5倍，峰值在251d，而Αβ 40和Αβ 42的水平到IOOd顯著地降低，此后向基線返回。在CSF中的這種 降低伴隨著斑塊負(fù)荷的顯著降低(Lemere, CA (2004) Am JPathologyl65:283-297)。血漿Αβ水平的類似提高也在年老的(15-20歲)恒河猴的免疫之后檢測到(Gandy, S (2004) Alzheimer Dis Assoc Disordl8:44:46.[0010]針對腦淀粉樣蛋白的第一個(gè)免疫治療是Elan/AN-1792，一種活性疫苗。這種治療在與腦膜腦炎相符的臨床征象的出現(xiàn)之后被終止。亞群分析表明，治療減慢了認(rèn)知功能的下降(Nature Clin Pract Neurol (2005)1:84_85)?；颊叩氖潞蟮姆治鲆诧@示了斑塊清除的證據(jù)(Gilman S.et al, (2005)Neurology64 (9)1553-1562)。Bapineuzumab (AAB-OOI,Elan/Wyeth),—種被動的MAb治療已經(jīng)在小的I期安全性研究中顯示了顯著地改善認(rèn)知分值。
[0011]特征在于提高的β -淀粉樣蛋白水平或β -淀粉樣沉淀的其他疾病或失調(diào)包括輕微的認(rèn)知損傷(MCI, Blasko 1(2006)Neurobiology of aging^Conversion from cognitivehealth to mild cognitive impairment and Alzheimer’s disease:Predictionby plasma amyloid β 42, medial temporal lobe atrophy and homocysteine，，inpress, e_publishedl90ct2006)、伴有荷蘭型β -淀粉樣變性的遺傳性腦出血、腦β _淀粉樣蛋白血管病和各種類型的退化性癡呆，例如與帕金森氏病相關(guān)的那些，漸進(jìn)性的核上的麻痹、皮層基底退化和阿爾茨海默氏病的彌散Lewis體型(Mollenhauer B(2007)J NeuralTransm e-published23Feb2007, van Oi jen, M Lancet Neurol.20065:655-60)和Down綜合征(Mehta, PD (2007)J Neurol Sc1.254:22-7)。
[0012]發(fā)明概沭
[0013]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供了治療性抗體，其是抗體或抗原結(jié)合片段和/或其衍生物，其以低于IOOpM的平衡常數(shù)KD結(jié)合β-淀粉樣蛋白肽1_12(SEQ ID NO:15),但是不結(jié)合β-淀粉樣蛋白肽2-13 (SEQ ID NO:44)，兩種測定都在利用在鏈霉抗生物素蛋白芯片上捕獲的肽的表面等離子共振分析中進(jìn)行。 [0014]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了治療性抗體，其是抗體或抗原結(jié)合片段和/或其衍生物，其以低于IOOpM的平衡常數(shù)KD結(jié)合β-淀粉樣蛋白肽1_12(SEQ ID NO:15),具有的與淀粉樣蛋白肽2-13 (SEQ ID NO:44)的結(jié)合的平衡常數(shù)KD，1000倍大于與肽1-12 (SEQ ID NO:15)的結(jié)合的平衡常數(shù)，兩種測定都在利用在鏈霉抗生物素蛋白芯片上捕獲的肽的表面等離子共振分析中進(jìn)行。
[0015]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了治療性抗體，其是抗體或抗原結(jié)合片段和/或其衍生物，其以低于IOOpM的平衡常數(shù)KD結(jié)合β-淀粉樣蛋白肽1_12(SEQ ID NO:15),具有的與淀粉樣蛋白肽2-13 (SEQ ID NO:44)的結(jié)合的平衡常數(shù)KD，10，000倍大于與肽1-12 (SEQ ID NO:15)的結(jié)合的平衡常數(shù)，兩種測定都在利用在鏈霉抗生物素蛋白芯片上捕獲的肽的表面等離子共振分析中進(jìn)行。
[0016]在一個(gè)方面，利用在鏈霉抗生物素蛋白芯片上捕獲的肽的表面等離子共振分析是在以下的實(shí)施例中描述的表面等離子共振分析。在另一個(gè)方面，利用在鏈霉抗生物素蛋白芯片上捕獲的肽的表面等離子共振分析是以下的SPR Biacore?分析描述的方法A (i)。
[0017]在本發(fā)明的一個(gè)可選擇的實(shí)施方式中，提供了治療性抗體，其是抗體或抗原結(jié)合片段和/或其衍生物，其以低于IOnM的平衡常數(shù)結(jié)合β -淀粉樣蛋白肽1-40，但是不結(jié)合β-淀粉樣蛋白肽2-13(SEQ ID NO:44)，兩種測定都在以下的實(shí)施例的方法B中描述的表面等離子共振分析中進(jìn)行。
[0018]在本發(fā)明的另一個(gè)可選擇的實(shí)施方式中，提供了治療性抗體，其是抗體或抗原結(jié)合片段和/或其衍生物，其以低于IOnM的平衡常數(shù)結(jié)合β -淀粉樣蛋白肽1-40，具有的與β-淀粉樣蛋白肽2-13 (SEQ ID NO:44)的結(jié)合的平衡常數(shù)KD，1000倍大于與肽1-12 (SEQID NO:15)的結(jié)合的平衡常數(shù)，兩種測定都在以下的實(shí)施例的方法B中描述的表面等離子共振分析中進(jìn)行。
[0019]在本發(fā)明的另一個(gè)可選擇的實(shí)施方式中，提供了治療性抗體，其是抗體或抗原結(jié)合片段和/或其衍生物，其以低于IOnM的平衡常數(shù)結(jié)合β -淀粉樣蛋白肽1-40，具有的與β-淀粉樣蛋白肽2-13 (SEQ ID NO:44)的結(jié)合的平衡常數(shù)KD，10，000倍大于與肽1-12(SEQ ID NO:15)的結(jié)合的平衡常數(shù)，兩種測定都在以下的實(shí)施例的方法B中描述的表面等離子共振分析中進(jìn)行。
[0020]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，提供了治療性抗體，其是抗體或抗原結(jié)合片段和/或其衍生物，其結(jié)合β_淀粉樣蛋白肽，并且其包含以下⑶R:
[0021]CDRHl:DNGMA (SEQ ID No:1)
[0022]CDRH2:FISNLAYSIDYADTVTG (SEQ ID No:2)
[0023]CDRH3:GTWFAY (SEQ ID No:3)[0024]處在來源于VH3基因家族的人類重鏈可變區(qū)之內(nèi)，和:
[0025]CDRLl:RVSQSLLHSNGYTYLH (SEQ ID No:4)
[0026]CDRL2:KVSNRFS (SEQ ID No:5)
[0027]CDRL3:SQTRHVPYT (SEQ ID No:6)
[0028]處在來源于GenP印t條目CAA51135中公開的氨基酸序列的人類輕鏈可變區(qū)(SEQID NO:24)之內(nèi)。
[0029]在整個(gè)說明書中，術(shù)語“CDR”、“ CDRLl ”、“ CDRL2 ”、“ CDRL3 ”、“ CDRHl ”、“ CDRH2 ”、“CDRH3，， 根據(jù) Kabat et al;Sequences of proteins of Immunological InterestNIH, 1987中闡述的Kabat編號系統(tǒng)。因而，以下的定義了根據(jù)本發(fā)明的⑶R:
[0030]CDR 殘基
[0031]CDRH1:31_35B
[0032]CDRH2:50-65
[0033]CDRH3:95-102
[0034]CDRLl:24-34 [0035]CDRL2:50-56
[0036]CDRL3:89-97
[0037]VH3基因家族和相關(guān)的免疫球蛋白基因命名在Matsuda et al (Journal ofExperimental Medicine, 188:2151-2162, 1998)和 Lefranc&Lefranc(The ImmunoglobulinFactsbook.2001.Academic Press: London)中描述。
[0038]在特定的實(shí)施方式中，人類重鏈可變區(qū)來源于:
[0039]?選自以下 VH3 家族成員的子集的 V基因:VH3-48、VH3-21、VH3-11、VH3-7、VH3-13、VH3-74、VH3-64、VH3-23、VH3-38、VH3-53、VH3-66、VH3-20、VH3-9&VH3-43
[0040]?選自以下VH3家族成員的子集的V基因:VH3-48，VH3-21&VH3-11
[0041].νΗ3_48 基因
[0042]或其等位基因。
[0043]Genbank條目Μ99675中的序列是VH3-48基因的等位基因。Μ99675是包括兩個(gè)外顯子的DNA的基因組片段的Genbank核苷酸序列，所述外顯子構(gòu)成人類重鏈基因VH3-48(SEQ ID Ν0:22)并編碼SEQ ID NO:21中給出的可變區(qū)氨基酸序列。在特定的方面，人類接受體重鏈框架來源于Μ99675。
[0044]為了構(gòu)建完整的V-區(qū)域，框架4必需添加到種系編碼的V基因Μ99675。適合的框架4序列包括人類JH4迷你基因(minigene)編碼的那些(Kabat):
[0045]YFDYffGQGTLVTVSS (SEQ ID No:23)
[0046]其中屬于CDR3區(qū)域的開頭的四個(gè)殘基被來自供體抗體的引入的CDR替換。
[0047]技術(shù)人員理解的是，種系V基因和J基因不包括重鏈⑶R3的整個(gè)的編碼序列。然而，在本發(fā)明的抗體中，CDR3序列由供體免疫球蛋白提供。因而，VH基因例如VH3-48、JH迷你基因例如JH4的組合，以及一組重鏈CDR，例如SEQ ID NO:USEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3 (以一定方式組裝以模擬成熟的、完整的重排重鏈可變區(qū))足以定義本發(fā)明的重鏈可變區(qū)，例如在SEQ ID NO:26,28和30中表示的。
[0048]由Genp印t ID CAA51134編碼的可變區(qū)具有SEQ ID NO:24中給出的氨基酸序列。[0049]由GenP印t ID CAA51134已知的輕鏈可變區(qū)框架序列是完整的重排輕鏈可變區(qū)的推定的氨基酸序列，與數(shù)據(jù)庫中具有相同框架的另一個(gè)氨基酸序列=Genpept登記號碼S40356 相同，并在 Klein，R.et al., Eur.J.1mmunol.23 (12), 3248-3262 (1993)中描述了。作為Genbank登記N0.X72467可獲得的CAA51134的DNA編碼序列作為SEQ ID NO:25來給出。
[0050]在本發(fā)明的特定的方面，人類接受體重鏈框架來源于M99675和JH4迷你基因，人類接受體輕鏈框架來源于CAA51135，任選地含有一個(gè)或多個(gè)，例如一到四個(gè)，更特別地一到三個(gè)，根據(jù)在具有序列SEQ ID NO:17的供體Vh結(jié)構(gòu)域和具有序列SEQ ID NO:19的\結(jié)構(gòu)域中存在的相應(yīng)殘基氨基酸殘基的替換，其維持了供體抗體對β_淀粉樣蛋白肽的所有的或基本上所有的結(jié)合親和性。
[0051]“基本上所有的結(jié)合親和性”是指，與供體抗體相比，治療性抗體具有結(jié)合親和性方面最多10倍降低。
[0052]在更特別的方面，來源于Μ99675和JH4的本發(fā)明的接受體重鏈框架具有選自位置24、48、93和/或94 (Kabat編號)的一到四個(gè)氨基酸殘基替換。
[0053]在本發(fā)明的更特別的方面，來源于Μ99675和JH4的人類接受體重鏈框架包含以下的殘基(或其保守性替換物):
[0054]( i)
[0055]位置殘基
[0056]93V
[0057]94S
[0058]或
[0059](ii)
[0060]
UW殘墓
24V
[0061]
93V
94S
[0062]或
[0063](iii)
[0064]
位置殘基
48I
93V
94S
[0065]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供了治療性抗體，其包含具有SEQ ID NO:26、28或30中列出的序列的Vh鏈和具有SEQ ID NO:32中列出的序列的\結(jié)構(gòu)域。
[0066]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了治療性抗體，所述抗體包含具有SEQ IDNO:34,36或38中列出的序列的重鏈和具有SEQ ID NO:40中列出的序列的輕鏈。
[0067]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了包含根據(jù)本發(fā)明的的治療性抗體的藥物組合物。
[0068]在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，提供了治療受到β淀粉樣蛋白肽相關(guān)疾病影響的人類患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的治療性抗體的步驟。
[0069]還提供了根據(jù)本發(fā)明的治療性抗體在制造用于治療β淀粉樣蛋白肽相關(guān)疾病的藥物方面的用途。
[0070]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的治療性抗體的過程，所述過程包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所述抗體的多核苷酸。
[0071]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了編碼治療性抗體重鏈的多核苷酸，所述治療性抗體重鏈包含具有SEQ ID NO:26、28或30中所列的Vh鏈。
[0072]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了編碼治療性抗體輕鏈的多核苷酸，所述治療性抗體輕鏈包含具有SEQ ID NO:32中所列的\結(jié)構(gòu)域。
[0073]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了編碼治療性抗體重鏈的多核苷酸，所述治療性抗體重鏈具有SEQ ID NO:34、36或38中所列的序列。
[0074]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了編碼治療性抗體輕鏈的多核苷酸，所述治療性抗體輕鏈具有SEQ ID NO:40中所列的序列。
[0075]在本發(fā)明的更特別的實(shí)施方式中，提供了編碼治療性抗體重鏈的多核苷酸，所述多核苷酸包含在SEQ ID NO:35、37、39或42中所列的序列。
[0076]在本發(fā)明的另一個(gè)更特別的實(shí)施方式中，提供了編碼治療性抗體輕鏈的多核苷酸，所述多核苷酸包含在SEQ ID NO:41或43中所列的序列。
[0077]在特定的實(shí)施方式中，作為抗體或片段和/或其衍生物的治療性抗體基本上缺乏a)經(jīng)典途徑的補(bǔ)體的活化；和b)調(diào)節(jié)抗體依賴性細(xì)胞毒性的功能。
[0078]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了抗體或其片段，其包含具有序列SEQ IDNO:17的VH結(jié)構(gòu)域和具有序列SEQ ID NO:19的\結(jié)構(gòu)域。
[0079]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了編碼包含具有序列SEQ ID N0:17的￥11結(jié)構(gòu)域的抗體重鏈或其片段的多核苷酸，特別是SEQ ID N0:18的多核苷酸。
[0080]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了編碼包含具有序列SEQ ID N0:19的'結(jié)構(gòu)域的抗體輕鏈或其片段的多核苷酸，特別是SEQ ID N0:20的多核苷酸。
[0081]發(fā)明的詳細(xì)i兌明
[0082]1.杭體結(jié)構(gòu)
[0083]1.1完整抗體
[0084]完整抗體通常是包含至少兩個(gè)重鏈和兩個(gè)輕鏈的異多聚糖蛋白。除了 IgM之外，完整抗體是大約150KDa的雜四聚糖蛋白，包括兩個(gè)相同的輕(L)鏈和兩個(gè)相同的重(H)鏈。一般地，每條輕鏈通過一個(gè)共價(jià)的二硫鍵連接到重鏈，而不同的免疫球蛋白同種型的重鏈之間二硫鍵的數(shù)目是可變的。每條重鏈和輕鏈也具有鏈內(nèi)的二硫鍵。每條重鏈在一個(gè)末端具有可變區(qū)(VH)，之后是多個(gè)恒定區(qū)。每條輕鏈具有可變區(qū)(')和在它另一個(gè)末端的恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)對準(zhǔn)，輕鏈可變區(qū)與種類的可變區(qū)對準(zhǔn)。來自大多數(shù)脊椎動物物種的抗體的輕鏈可以根據(jù)恒定區(qū)的氨基酸序列被分成稱為Kappa和Lambda的兩種類型之一。取決于它們的重鏈的恒定區(qū)的氨基酸序列，人類抗體可以被分成五種不同的種類，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM0 IgG和IgA可以進(jìn)一步分成子類,IgGl、IgG2、IgG3和IgG4 ;以及IgAl和IgA2。具有至少IgG2a、IgG2b的小鼠和大鼠中存在物種變體。抗體的可變區(qū)賦予抗體上的結(jié)合特異性，顯示了特定的變異性的某些區(qū)域稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。可變區(qū)的更保守的部分稱為框架區(qū)域(FR)。完整重鏈和輕鏈的可變區(qū)各自包含三個(gè)CDR連接的四個(gè)FR。每條鏈中的⑶R通過FR區(qū)域緊密地保持在一起，來自另一條鏈的⑶R促進(jìn)了抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成。恒定區(qū)不直接地涉及抗體與抗原的結(jié)合，但是展現(xiàn)了各種效應(yīng)物功能，例如參與抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、經(jīng)由與Fe Y受體結(jié)合的吞噬作用、經(jīng)由新生Fe受體(FcRn)的半衰期/清除率和經(jīng)由補(bǔ)體級聯(lián)的Clq組件的互補(bǔ)依賴性細(xì)胞毒性。人類IgG2恒定區(qū)缺乏通過經(jīng)典途徑活化補(bǔ)體的能力，或介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性的能力。IgG4恒定區(qū)缺乏通過經(jīng)典途徑活化補(bǔ)體的能力，僅僅微弱地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性?；旧先狈@些效應(yīng)物功能的抗體可以稱為“非裂解”抗體。
[0085]1.1.1人類杭體[0086]人類抗體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法來產(chǎn)生。人類抗體可以通過利用人類骨髓瘤或小鼠-人類雜交骨髓瘤細(xì)胞系的雜交瘤方法來產(chǎn)生，參見KozborJ.1mmunol133，3001，(1984)和 Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications, pp51_63 (Marcel Dekker Inc, 1987)?？蛇x擇的方法包括利用嗤菌體庫或轉(zhuǎn)基因小鼠，兩者都利用了人類V區(qū)庫(參見Winter G, (1994), Annu.Rev.1mmunol12, 433-455, Green LL (1999) , J.1mmunol.methods231, 11-23)。
[0087]幾個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠品系現(xiàn)在是可獲得的，其中它們的小鼠免疫球蛋白基因座已經(jīng)用人免疫球蛋白基因片段替換(參見 Tomizuka K, (2000) PNAS97, 722-727;Fishwild D.M(1996)Nature Biotechnol.14，845-851，Mendez MJ, 1997, Nature Genetics, 15, 146-156)。在抗原攻擊時(shí)，這種小鼠能夠產(chǎn)生人類抗體的所有部分，從中可以選擇感興趣的抗體。
[0088]特別注意的是Trimera? 系統(tǒng)(參見 Eren R et al, (1998)Immunology93:154-161),其中人類淋巴細(xì)胞被移植到照射的小鼠中，選擇淋巴細(xì)胞抗體系統(tǒng)(SLAM,參見Babcook et al, PNAS (1996)93:7843-7848)，其中人類(或其他物種)淋巴細(xì)胞被有效地穿過大量集中的體外抗體產(chǎn)生過程，隨后是deconvulated、限制稀釋和選擇過程，以及Xenomouse II??？蛇x擇的方法是可以從Morphotek Inc獲得的，利用Morphodoma?技術(shù)。
[0089]噬菌體展示技術(shù)可以用于產(chǎn)生人類抗體(和其片段)，參見McCafferty;Nature, 348,552-553 ( 1990)和 Griffiths AD et al ( 1994)EMB013:3245-3260。依據(jù)這種技術(shù)，抗體V區(qū)基因按照框架被克隆到絲狀噬菌體的主要和次要外殼蛋白基因中，例如M13或fd，在噬菌體粒子的表面上被呈現(xiàn)(通常借助于輔助噬菌體)為功能性抗體片段。根據(jù)抗體的功能性質(zhì)的選擇產(chǎn)生了編碼展現(xiàn)那些性質(zhì)的抗體的基因的選擇。噬菌體展示技術(shù)可以用于從庫中選擇抗原特異性抗體，所述庫從取自受如上所述的疾病或失調(diào)影響個(gè)體、或作為選擇取自未免疫的人類供體的人類B細(xì)胞制成(參見Marks; J.Mol.Bi0.222，581-597，1991)。當(dāng)期望完整的人類抗體包含F(xiàn)e結(jié)構(gòu)域時(shí)，必需的是重新將噬菌體展示的衍生片段克隆到包含期望的恒定區(qū)的哺乳動物表達(dá)載體中并建立穩(wěn)定的表達(dá)細(xì)胞系。
[0090]親合成熟(Marks;Bio/technollO, 779-783 (1992))的技術(shù)可以用于改善結(jié)合親和性，其中原始人類抗體的親和性通過用天然發(fā)生的變體連續(xù)替換H和L鏈的V區(qū)并在改善的結(jié)合親和性的基礎(chǔ)上選擇來改善。這種技術(shù)的變體例如“表位印記”現(xiàn)在也是可用的，參見 W093/06213。也參見 Waterhouse;Nucl.Acids Res21, 2265-2266 (1993)。
[0091]1.2嵌合的和人源化抗體
[0092]在人類疾病或失調(diào)的治療中使用非人類抗體帶來了潛在的免疫原性的現(xiàn)在公認(rèn)的難題，特別是在抗體的重復(fù)施用時(shí)，也就是，患者的免疫系統(tǒng)可以將非人類完整抗體識別為非自身的并產(chǎn)生中和反應(yīng)。除了開發(fā)完全人類抗體(參見上文)之外，多年來已經(jīng)開發(fā)了各種技術(shù)來克服這些難題，一般地涉及降低完整治療性抗體中非人類氨基酸序列的組成，而保持相對容易從免疫的動物，例如大鼠、小鼠或兔獲得非人類抗體。大致兩種方法已經(jīng)用于實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。第一種是嵌合抗體，其一般包括融合到人類恒定區(qū)的非人類(例如，哨齒動物如小鼠)可變區(qū)。由于抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)定位于可變區(qū)之內(nèi)，嵌合抗體保持了它對抗體的結(jié)合親和性，但是獲得了人類恒定區(qū)的效應(yīng)物功能，因而能夠進(jìn)行效應(yīng)物功能，例如上文中所述的。嵌合抗體一般使用重組DNA方法產(chǎn)生。編碼抗體的DNA (例如，cDNA)使用常規(guī)過程(例如，通過使用寡核苷酸探針，其能夠特異性地結(jié)合編碼本發(fā)明的抗體的H和L鏈可變區(qū)的基因，例如上文描述的SEQ ID NO:18和20的DNA)來分離和測序。雜交瘤細(xì)胞充當(dāng)這種DNA的典型來源。一旦被分離出來,DNA可以被放入表達(dá)載體中，然后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞，例如E.coliXOS細(xì)胞、PerC6細(xì)胞或不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞，以獲得抗體的合成。通過用人類L和H鏈的編碼序列替換相應(yīng)的非人類(例如，鼠)H和L恒定區(qū)，可以修飾DNA，參見，例如Morrison;PNAS81，6851 (1984)。因而，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，提供了嵌合抗體，其包含具有序列SEQ ID NO: 17的Vh結(jié)構(gòu)域和具有序列SEQ ID NO:19的\結(jié)構(gòu)域、融合到人類恒定區(qū)(其可以是IgG同種型，例如IgGl)。
[0093]第二種方法涉及產(chǎn)生人源化抗體，其中抗體的非人類內(nèi)容通過使可變區(qū)人源化來降低。人源化的兩種技術(shù)已經(jīng)變得流行。第一種是通過⑶R移植來人源化。⑶R構(gòu)造環(huán)靠近抗體的N-末端，在此它們形成裝配在框架區(qū)域提供的支架中的表面。抗體的抗原結(jié)合特異性主要由拓?fù)鋱D和由它的CDR表面的化學(xué)特性決定。這些特征隨后由單獨(dú)的CDR的構(gòu)象、CDR的分布以及包含CDR的殘基的側(cè)鏈的性質(zhì)和分布來決定。免疫原性的大的降低可以通過僅僅移植非人類(例如，鼠)抗體(“供體”抗體)的CDR到適合的人類框架(“接受體框架”)和恒定區(qū)中來實(shí)現(xiàn)(參見Jones et al (1986) Nature321, 522-525andVerhoeyen M et al (1988)Science239, 1534-1536)。然而，CDR 移植本身不能產(chǎn)生抗原結(jié)合性質(zhì)的完全保留，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的是，如果要恢復(fù)顯著的抗原結(jié)合親和性，供體抗體的某些框架殘基需要被保留(有時(shí)稱為“回復(fù)突變”)在人源化分子中(參見Queen C et al (1989)PNAS86, 10, 029-10, 033, Co, M et al (1991) Nature351, 501-502)。在這種情況中，顯示了與非人類供體抗體的最大序列同源性(一般60%或更高)的人類V區(qū)域可以從數(shù)據(jù)庫中選擇以提供人類框架(FR)。人類FR的選擇可以從人類共有的或單獨(dú)的人類抗體來進(jìn)行。此時(shí)來自供體抗體的必需關(guān)鍵殘基被替換到人類接受體框架中以保持CDR構(gòu)象?？贵w的計(jì)算機(jī)建模可以用于幫助鑒定這種結(jié)構(gòu)上重要的殘基，參見W099/48523。
[0094]做為選擇，人源化可以通過“飾面”(veneering)的過程來實(shí)現(xiàn)。獨(dú)特的人類和鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)的統(tǒng)計(jì)分析揭示了，暴露的殘基的確切模式在人類和鼠抗體中是不同的，各表面位置中的大多數(shù)具有對少數(shù)不同殘基的強(qiáng)的偏愛性(參見PadlanE.A.et al; (1991) Mol.1mmunol.28, 489-498and Pedersen J.T.et al (1994) J.Mol.Biol.235;959-973)。因而，有可能通過替換其框架區(qū)域中與在人類抗體中通常發(fā)現(xiàn)的不同的暴露殘基來降低非人類Fv的免疫原性。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)抗原性可能與表面可接近性相關(guān)，表面殘基的替換可能足以使小鼠可變區(qū)對于人類免疫系統(tǒng)來說成為“看不見的”。(還參見 Mark G.E.et al (1994) in Handbook of Experimental Pharmacology vol.113:Thepharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, ppl05-134)o 這種人源化的過程被稱為“飾面”，因?yàn)橐飪H改變了抗體的表面，支持性殘基保持原狀。進(jìn)一步可選擇的方法包括W004/006955中闡述的，和Humaneering? (Kalobios)的過程，其利用了細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)，并產(chǎn)生在序列上接近人類種系的抗體(Alfenito-M Advancing ProteinTherapeutics January2007, San Diego, California)。 [0095]對本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，術(shù)語“衍生的”意圖是不僅定義在材料的物理來源的意義上的來源，還定義結(jié)構(gòu)上相同于所述材料、但不來源于參考來源的材料。因而，“供體抗體中存在的殘基”不必是從供體抗體純化的。
[0096]本領(lǐng)域公認(rèn)的是，某些氨基酸替換被認(rèn)為是“保守的”。氨基酸根據(jù)常見的側(cè)鏈性質(zhì)被分成幾組，維持了本發(fā)明的治療性抗體的所有的或基本上所有的結(jié)合親和性的組內(nèi)的替換被認(rèn)為是保守性替換，參見以下表1:
[0097]表1
[0098]
【權(quán)利要求】
1.一種治療性抗體，其是抗體或抗原結(jié)合片段和/或其衍生物，其結(jié)合β-淀粉樣蛋白肽，并且其包含以下⑶尺:
CDRHl:DNGMA (SEQ ID No:1)
CDRH2:FISNLAYSIDYADTVTG (SEQ ID No:2)
CDRH3:GTWFAY (SEQ ID No:3) 處在來源于VH3基因家族的人類重鏈可變區(qū)之內(nèi)，和:
CDRLl:RVSQSLLHSNGYTYLH (SEQ ID No:4)
CDRL2:KVSNRFS (SEQ ID No:5)
CDRL3:SQTRHVPYT (SEQ ID No:6) 處在來源于GenP印t條目CAA51135中公開的氨基酸序列的人類輕鏈可變區(qū)(SEQ IDNO:24)之內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的治療性抗體，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段和/或其衍生物以低于IOOpM的平衡常數(shù)KD結(jié)合β -淀粉樣蛋白肽1-12 (SEQ ID NO:15)，具有的與β -淀粉樣蛋白肽2-13 (SEQ ID NO:44)的結(jié)合的平衡常數(shù)KD，1000倍大于與肽1-12 (SEQ ID NO:15)的結(jié)合的平衡常數(shù)，兩種測定都在利用在鏈霉抗生物素蛋白芯片上捕獲的肽的表面等離子共振分析中進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的治療性抗體，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段和/或其衍生物以低于IOnM的平衡常數(shù)KD結(jié)合 β-淀粉樣蛋白肽1-40，具有的與β -淀粉樣蛋白肽2_13(SEQID NO:44)的結(jié)合的平衡常數(shù)KD，1000倍大于與肽1-12 (SEQ ID NO:15)的結(jié)合的平衡常數(shù)，這些測定在利用BiOCOre?3000的表面等離子共振分析中進(jìn)行，其中所述抗體首先在CM5生物傳感器芯片的蛋白A表面捕獲到1000-2500共振單位的水平，已在HBS-EP緩沖液中稀釋的β -淀粉樣蛋白1-40、2-13或1-12以4-500ηΜ的濃度范圍流過捕獲的抗體表面(即實(shí)施例的方法B)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的治療性抗體，其中所述人類重鏈可變區(qū)來源于: ?選自以下VH3家族成員的子集的V基因:VH3-48、VH3-21、VH3-11、VH3-7、VH3-13、VH3-74、VH3-64、VH3-23、VH3-38、VH3-53、VH3-66、VH3-20、VH3-9& VH3-43?選自以下VH3家族成員的子集的V基因:VH3-48、VH3-21&VH3-11? VH3-48 基因或其等位基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的治療性抗體，其中所述人類接受體重鏈框架與框架4一同來源于M99675 (SEQ ID NO:21)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的治療性抗體，其中框架4序列是由人類JH4迷你基因(Kabat)編碼的:
YFDYffGQGTLVTVSS (SEQ ID No:23) 其中屬于CDR3區(qū)域的開始的四個(gè)殘基被來自供體抗體的引入的CDR替換。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的治療性抗體，其含有根據(jù)在具有序列SEQIDNO:17的供體VH結(jié)構(gòu)域和具有序列SEQ ID NO:19的VL結(jié)構(gòu)域中存在的相應(yīng)殘基的、維持供體抗體對β -淀粉樣蛋白肽的所有的或基本上所有的結(jié)合親和性的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基替換。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的治療性抗體，其中來源于Μ99675和JH4的人類接受體重鏈框架含有選自位置24、48、93和/或94 (Kabat編號)的一到四個(gè)氨基酸殘基替換。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的治療性抗體，其中人類接受體重鏈框架包含以下的殘基(或其保守性替換): ⑴
10.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的治療性抗體，其是IgGl同種型。
11.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的治療性抗體，其基本上缺乏a)通過經(jīng)典途徑的補(bǔ)體的活化；和b)調(diào)節(jié)抗體依賴性細(xì)胞毒性的功能。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的治療性抗體，其中殘基235和237已經(jīng)被突變成丙氨酸。
13.一種包含根據(jù)任一前述權(quán)利要求的治療性抗體的藥物組合物。
14.權(quán)利要求1到12的任一項(xiàng)的治療性抗體，用于治療β淀粉樣蛋白肽相關(guān)疾病。
15.用于制備權(quán)利要求1到12的任一項(xiàng)的治療性抗體的方法，其中所述方法包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所述抗體的多核苷酸。
【文檔編號】C07K16/18GK103539857SQ201310338011
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2007年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2006年3月30日
【發(fā)明者】S.A.伯比奇, J.H.艾利斯, S.K.福德, V.格爾馬謝夫斯基, U.庫馬, K.L.菲爾波特, P.E.索登 申請人:葛蘭素集團(tuán)有限公司