一種重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體，是在含有抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制子序列，并能用HindⅢ和AvrⅡ酶切的載體，如pVAX1載體，通過(guò)引入HindⅢ和AvrⅡ酶切位點(diǎn)插入DNA片段；所述DNA片段包含帶有雙向痘病毒啟動(dòng)子和羊痘病毒TK基因的同源臂的基因序列。本發(fā)明還提供含有上述重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體的重組羊痘病毒以及其在外源抗原轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體可方便插入外源基因；并根據(jù)重組結(jié)果進(jìn)行了改良，最后達(dá)到了較好的重組效率，為此類(lèi)重組疫苗的研制奠定了良好的基礎(chǔ)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]利用病毒作為外源抗原的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是一種成熟、有效的疫苗設(shè)計(jì)研發(fā)策略，如腺病毒活載體、痘病毒活載體、皰疹病毒活載體、小RNA病毒活載體等作為新型疫苗均取得了良好的免疫效果。其中，痘病毒由于其大而復(fù)雜的基因組，作為活載體具有容量大、有大量的復(fù)制非必需片段可用作插入外源基因的位點(diǎn)等優(yōu)勢(shì)，因此成為此類(lèi)疫苗研究的理想載體。目前已構(gòu)建的痘病毒載體，有痘苗病毒、雞痘病毒、豬痘病毒、羊痘病毒以及兔痘病毒活載體。
[0003]痘病毒基因組龐大，不便在體外進(jìn)行直接操作，而且基因組DNA沒(méi)有感染性，外源基因不能直接插入到病毒基因組中，因此，重組痘病毒的構(gòu)建必須分兩步進(jìn)行。第一步是構(gòu)建一個(gè)重組質(zhì)粒，又叫轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒。此質(zhì)粒應(yīng)帶痘病毒的啟動(dòng)子，其下游接外源基因，在它們的兩側(cè)為痘病毒特異的DNA序列。第二步是將此質(zhì)粒導(dǎo)入痘病毒感染的細(xì)胞中，痘病毒DNA與質(zhì)粒中的同源序列 在細(xì)胞內(nèi)可發(fā)生同源重組，由此將外源基因組裝到痘病毒基因組的特定部位，構(gòu)建出重組的痘病毒。
[0004]由于重組效率相對(duì)較低(10-4-10-3)，篩選、純化重組成功的痘病毒成為痘病毒活載體研究中的另一個(gè)重要環(huán)節(jié)。在較早的研究中，利用病毒本身的胸苷激酶(TK)基因作為選擇標(biāo)記，是較常用的方法。但此篩選系統(tǒng)具有很大的局限，即只能用TK基因作為非必需片段構(gòu)建重組病毒；另外，需要一株適合病毒生長(zhǎng)并能產(chǎn)生蝕斑的TK-細(xì)胞系。另一類(lèi)篩選系統(tǒng)利用細(xì)菌β-半乳糖苷酶(LacZ)基因，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Neo)基因等作為標(biāo)記基因，在構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體時(shí)插入到復(fù)制非必需區(qū)。最近的篩選系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，利用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)作為標(biāo)記基因，同時(shí)加入了大腸桿菌鳥(niǎo)嘌呤-次黃嘌呤憐酸核糖轉(zhuǎn)移酶(guanine-hypoxanthine phosphoribosyl transferase, gpt)的基因作為壓力篩選基因，篩選效果顯著提高。
[0005]經(jīng)過(guò)眾多學(xué)者的不斷探索，重組痘病毒作為活載體的研究日趨完善，羊痘病毒作為其中一員也成為此類(lèi)活載體的重要工具。如前所述，在重組羊痘病毒時(shí)，同樣需要構(gòu)建一個(gè)攜帶同源臂的轉(zhuǎn)移載體。在以往的研究中，載體構(gòu)建主要是利用羊痘病毒基因組DNA復(fù)制非必需區(qū)中自然存在的酶切位點(diǎn)，插入外源DNA，如TK基因中的Kpn I。這類(lèi)操作有一定的局限性，在需要替換外源DNA時(shí)，必須重新構(gòu)建并鑒定用于重組的載體，增加了很大的工作量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體，該重組載體可方便插入外源基因。并根據(jù)重組結(jié)果進(jìn)行了改良，最后達(dá)到了較好的重組效率，為此類(lèi)重組疫苗的研制奠定了良好的基礎(chǔ)。
[0007]本發(fā)明提供一種重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體，所述重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體是在含有抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制子序列，并能用Hind III和Avr II酶切的載體，如pVAXI載體，通過(guò)引入Hind III和Avr II酶切位點(diǎn)插入DNA片段；所述DNA片段包含帶有雙向痘病毒啟動(dòng)子和羊痘病毒TK基因的同源臂基因序列。
[0008]本發(fā)明的重組載體是利用含有抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制子序列，并能用Hind III和Avr II酶切的載體構(gòu)建的，只要含有上述基因和酶切位點(diǎn)，均能構(gòu)建方便插入外源基因的重組載體。如，我們可以選擇商業(yè)載體PVAXl載體，其含有pUC ori序列和卡那霉素抗性基因(Kanamycin resistance gene),并具有 Hind III和 Avr II 的酶切位點(diǎn)。
[0009]作為優(yōu)選，所述痘病毒啟動(dòng)子為pll和p7.5。
[0010]更優(yōu)選地，所述重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體的核苷酸序列參見(jiàn)序列表中SEQ ID N0.1。
[0011]作為優(yōu)選，所述羊痘病毒TK基因的同源臂長(zhǎng)度為1400_1600bp，優(yōu)選1500bp。
[0012]在該范圍內(nèi)重組效率均較高。
[0013]作為優(yōu)選，所述DNA片段中還包括報(bào)告基因和壓力篩選基因；作為優(yōu)選，所述報(bào)告基因?yàn)榫G色熒光蛋白GFP，所述壓力篩選基因選用表達(dá)鳥(niǎo)嘌呤-次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的基因gpt。
[0014]作為優(yōu)選，所述重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體的核苷酸序列參見(jiàn)序列表中SEQ ID N0.2。
[0015]本發(fā)明還提供一種重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建方法，步驟如下:
[0016]1)以pVAXI載體為模板，利用PCR方法擴(kuò)增含有pUC ori序列和卡那霉素抗性基因的DNA目的片段，得到目的片段KarZ-ori ；
[0017]2)將雙向痘病毒啟動(dòng)子、羊痘病毒TK基因的同源臂和多克隆位點(diǎn)進(jìn)行DNA合成，得到如圖2所示的載體片段，兩端分別加入內(nèi)切酶Avr II和Hind III序列，并連接于載體上；
[0018]3)將步驟(1)得到的目的片段和步驟(2)得到的重組質(zhì)粒分別雙酶切，酶切產(chǎn)物連接環(huán)化，得到重組載體ptkpp ；
[0019]4)提取羊痘病毒弱毒株AV41基因組DNA，利用PCR方法擴(kuò)增含有TK基因的同源臂序列(約1500bp),替換質(zhì)粒ptkpp中的TK基因同源臂,得到重組載體pftkpp ；
[0020]5)將報(bào)告基因和壓力篩選基因插入到質(zhì)粒pftkpp的多克隆位點(diǎn)，置于pll啟動(dòng)子后，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pftkpgigp。
[0021]本發(fā)明的第三個(gè)目的是要求保護(hù)含有上述任一所述的重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體的
重組羊痘病毒。
[0022]作為優(yōu)選，所述重組羊痘病毒是將權(quán)利要求1-6任一所述的重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體導(dǎo)入羊痘病毒感染的細(xì)胞中，兩者的同源序列在細(xì)胞內(nèi)同源重組后得到的。
[0023]本發(fā)明還提供上述的重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體、重組羊痘病毒在外源抗原轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用。
[0024]本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路如下:
[0025]1.同源重組及同源臂的設(shè)計(jì)
[0026]運(yùn)用病毒作為活載體研制疫苗已成為一種重要的疫苗生產(chǎn)手段。在痘病毒活載體疫苗的研究中，將外源基因插入到痘病毒基因組的復(fù)制非必需區(qū)是一種可靠、高效的方法，其生物學(xué)基礎(chǔ)是DNA的重組。生物體內(nèi)DNA的重組主要有兩種:同源重組和位點(diǎn)特異性重組。在體外DNA同源重組中，設(shè)計(jì)一個(gè)包含與靶基因上下游側(cè)翼序列一致的DNA序列的基因工程載體是關(guān)鍵環(huán)節(jié)?；蚬こ梯d體能夠找到靶基因并在與之相同的DNA序列處發(fā)生同
源重組。
[0027]細(xì)胞發(fā)生同源重組后，新的DNA片段即目標(biāo)序列被插入了基因組中。其中只是靶基因及其上下游的一些側(cè)翼序列被載體中同源的部分所取代，基因組的其他部分并不受到影響。在載體與靶基因發(fā)生重組后，最初的靶基因序列被交換到了載體上。由于載體不能夠在細(xì)胞核中獨(dú)立地進(jìn)行復(fù)制，因此隨著細(xì)胞的分裂很快就丟失了。而被替代后的基因組則忠實(shí)地進(jìn)行自我復(fù)制，此時(shí)新插入的目標(biāo)序列也就得以復(fù)制了。
[0028]痘病毒活載體疫苗 的方法學(xué)基礎(chǔ)是DNA同源重組。如上所述，對(duì)于此類(lèi)體外DNA重組操作而言，合理的同源臂設(shè)計(jì)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。相關(guān)研究表明，羊痘病毒的重組都是利用胸苷激酶(thymidine kinase，TK)基因，這個(gè)復(fù)制非必需基因作為載體的同源臂進(jìn)行重組的。本研究最初也是利用TK基因作為重組的同源臂，但試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組效率很低，得不到重組病毒?？紤]到病毒重組的效率與插入片段的大小、同源臂的長(zhǎng)度有密切關(guān)系，同源臂長(zhǎng)度和插入片段大小之間可能具有一定的比例關(guān)系，所以后續(xù)研究加長(zhǎng)了同源臂序列。從重組效率看，這樣的設(shè)計(jì)優(yōu)于TK基因同源臂。另外，左、右同源臂的長(zhǎng)度比例該怎樣設(shè)計(jì)，鮮見(jiàn)此類(lèi)研究，在今后的研究中應(yīng)該關(guān)注這個(gè)問(wèn)題。
[0029]2.載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建策略
[0030]有關(guān)重組痘病毒的諸多研究顯示，利用TK基因中自然存在的內(nèi)切酶位點(diǎn)(如Kpn I )，將外源DNA插入，并利用TK基因作為同源臂進(jìn)行重組，是一種廣泛采用的設(shè)計(jì)策略。本申請(qǐng)參考以往的設(shè)計(jì)方法，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了可方便應(yīng)用于羊痘病毒重組的基因工程載體。該載體包含與羊痘病毒基因組DNA序列一致的同源臂，同源臂包含TK基因，所有目標(biāo)序列位于TK基因內(nèi)部，主要元件有:雙向啟動(dòng)子、報(bào)告基因、篩選基因、多克隆位點(diǎn)、內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site, IRES)序列等，可方便外源抗原基因的插入。另外，在制備得到本發(fā)明的重組載體后，可以根據(jù)需要更換其中的報(bào)告基因和抗性基因:如不具備熒光顯微鏡，可以將報(bào)告基因換為L(zhǎng)acZ，方便檢測(cè)；抗性基因換為Neo，利用G418篩選等。
[0031]本申請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)并構(gòu)建的載體，以綠色突光蛋白(green fluorescent protein, GFP)作為報(bào)告基因，GFP廣泛應(yīng)用于此類(lèi)基因工程載體中，具有直觀、方便檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。壓力篩選基因選用表達(dá)鳥(niǎo)嘌呤-次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(guanine-hypoxanthine phosphoribosyltransferase, gpt)的基因，gpt基因可由大腸桿菌方便獲得，其篩選效率優(yōu)于常規(guī)抗生素類(lèi)基因。
[0032]載體設(shè)計(jì)中，加長(zhǎng)同源臂序列能顯著提高重組效率，同源臂長(zhǎng)度和目標(biāo)DNA大小之間應(yīng)該存在相應(yīng)的比例關(guān)系。從理論上推測(cè)，同源臂越長(zhǎng)越好，但太長(zhǎng)的同源臂對(duì)于載體構(gòu)建是一個(gè)不小的障礙，因此，需要在兩者之間探索一個(gè)相對(duì)平衡的狀態(tài)，既有利于重組，又方便載體的構(gòu)建。本發(fā)明中將同源臂序列加長(zhǎng)到約1500bp，與以往研究中TK基因本身作為同源臂相比較，長(zhǎng)度是后者的約3-4倍，這樣的設(shè)計(jì)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。根據(jù)相關(guān)資料，同源臂大于75bp，即可以產(chǎn)生重組。但我們的實(shí)驗(yàn)中，378bp、451bp的同源臂重組效率極低，沒(méi)有篩選到重組子；后來(lái)同源臂延長(zhǎng)至1400-1600bp時(shí)，重組效率明顯提高，很容易篩選代重組病毒。[0033]3.啟動(dòng)子功能的驗(yàn)證
[0034]在載體設(shè)計(jì)時(shí),本研究選擇了痘苗病毒啟動(dòng)子p7.5和pll,這兩個(gè)啟動(dòng)子在重組痘病毒的研究中被廣泛采用。由于本實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有含P7.5和pll的載體，因此我們根據(jù)NCBI提供的核酸序列，合成了這兩個(gè)啟動(dòng)子，根據(jù)報(bào)告基因的表達(dá)情況看，這樣的設(shè)計(jì)是正確的。其中，P?.5屬于早/晚期啟動(dòng)子,其啟動(dòng)的報(bào)告基因表達(dá)相對(duì)較早,并持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，Pll則屬于晚期啟動(dòng)子，報(bào)告基因的表達(dá)也相應(yīng)較晚，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與預(yù)期一致。
[0035]結(jié)論:
[0036]本申請(qǐng)成功構(gòu)建了用于山羊痘病毒重組的基因工程轉(zhuǎn)移載體ptkpp、pftkpgigp,通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，最終形成了攜帶外源基因的重組山羊痘病毒。在實(shí)際應(yīng)用中，還可根據(jù)需要替換同源臂序列以及啟動(dòng)子、報(bào)告基因、抗性基因等載體元件:如果有更成熟的非必需區(qū)作為同源臂，可以通過(guò)酶切位點(diǎn)進(jìn)行替換；鑒定了功能更強(qiáng)的啟動(dòng)子，也可以替換；報(bào)告基因、抗性基因同上；拓寬了此類(lèi)載體的應(yīng)用范圍。本發(fā)明提供的重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體可方便插入外源基因 。并根據(jù)重組結(jié)果進(jìn)行了改良，最后達(dá)到了較好的重組效率，很容易篩選到重組病毒，為此類(lèi)重組疫苗的研制奠定了良好的基礎(chǔ)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0037]以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施方法對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述。
[0038]圖1為本發(fā)明的重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體設(shè)計(jì)圖；
[0039]圖2為DNA合成片段示意圖；
[0040]圖3為重組載體構(gòu)建示意圖；其中，A為ptkpp, B為pftkpp, C為pftkpgigp ；
[0041]圖4為用于重組的最終載體示意圖；其中,A為pftkpgigp-VPl,B為pftkpgigp-H ;
[0042]圖5為驗(yàn)證啟動(dòng)子載體示意圖；
[0043]圖6為目的片段PCR產(chǎn)物電泳圖；
[0044]圖7為質(zhì)粒ptkpp及pftkpp酶切鑒定圖；其中,A為質(zhì)粒ptkpp Avr I1、Hind III雙酶切鑒定圖；B為質(zhì)粒ptkpgigp Sal 1、Sac 1、Xho I三酶切鑒定圖；C為質(zhì)粒ptkpp-ftkRAsc 1、Hind III雙酶切鑒定圖；D為質(zhì)粒pftkpp-ftkL Avr I1、Sac I雙酶切鑒定圖。M為T(mén)rans2K plus II DNA Marker ;泳道 I 為 Kana-ori PCR產(chǎn)物，2 為 pUC19_tkpp 酶切產(chǎn)物，3 為Ptkpp酶切產(chǎn)物；4為gpt，5為cGFP-1RES，6為ptkpp酶切產(chǎn)物，7為ptkpgigp酶切產(chǎn)物；8 為 ftkR，9 為 ptkpp 酶切產(chǎn)物，10 為 ptkpp-ftkR 酶切產(chǎn)物；11 為 ftkL, 12 為 ptkpp-ftkR酶切產(chǎn)物，13為ptkpp-ftkL即pftkpp酶切產(chǎn)物；
[0045]圖8為質(zhì)粒pftkpgigp Sal 1、Sac I雙酶切鑒定圖；其中，M為T(mén)rans2Kplus II DNA Marker ;泳道 I 為 ptkpgigp 酶切產(chǎn)物，2 為 pftkpp 對(duì)照，3 為 pftkpgigp 酶切產(chǎn)物；
[0046]圖9為質(zhì)粒pftkpgigp-VPl、pftkpgigp-H酶切鑒定圖；其中，A為質(zhì)粒pftkpgigp-VPlNhe 1、Not I 雙酶切鑒定圖；B 為質(zhì)粒 pftkpgigp-H Nhe 1、Not I 雙酶切鑒定圖。M 為 Trans2K plus II DNA Marker ;泳道 1、4 為 VP1、H 的 PCR 產(chǎn)物，泳道 2、5 為pftkpgigp 對(duì)照，泳道 3、6 為 pftkpgigp-VPl、pftkpgigp-H 酶切產(chǎn)物；
[0047]圖10為質(zhì)粒ptkpp-GFP、ptkpp-H-1-GFP的酶切鑒定圖；其中,A為質(zhì)粒ptkpp-GFPNhe 1、BamH I 雙酶切鑒定圖；B 為質(zhì)粒 ptkpp-H-1_GFP Nhe 1、BamH 1、Not I 三酶切鑒定圖。M 為 Trans2K plus II DNA Marker ;泳道 1、4 為 ptkpp 對(duì)照，2 為 ptkpp-GFP 酶切產(chǎn)物；3為H的PCR產(chǎn)物，5為ptkpp-H-1-GFP酶切產(chǎn)物。
[0048]圖11 為質(zhì)粒 pftkpgigp、ptkpp-GFP、ptkpp-H-1-GFP 轉(zhuǎn)染 LT 細(xì)胞后的綠色突光；
[0049]圖12為rCPV/PPRV-H形成的綠色熒光蝕斑；
[0050]圖13為rCPV/PPRV-H形成的大量熒光蝕斑；
[0051]圖14為重組病毒基因組PCR鑒定電泳圖；其中，A為rCPV/FMDV-VPl基因組PCR鑒定電泳圖,B為rCPV/PPRV-H基因組PCR鑒定電泳圖；M為T(mén)rans2K plus II DNA Marker ;泳道1、4為質(zhì)粒pftkpgigp-VPl、pftkpgigp-H陽(yáng)性對(duì)照，泳道2、5為CPV陰性對(duì)照，泳道3、6分別為 rCPV/FMDV-VP1、rCPV/PPRV-H 的 PCR 產(chǎn)物； [0052]圖15為重組病毒RT-PCR電泳圖；其中，A為rCPV/FMDV-VPlRT-PCR鑒定圖，B為rCPV/PPRV-H RT-PCR 鑒定圖；M 為 Trans2K plus II DNA Marker ;泳道 1、4 為 LT 細(xì)胞對(duì)照，泳道 2、5 為 CPV+LT 對(duì)照，泳道 3、6 分別為 rCPV/FMDV-VP 1、rCPV/PPRV-H 感染 LT 細(xì)胞 RT-PCR產(chǎn)物；
[0053]圖16為間接免疫熒光鑒定圖；
圖17為重組載體pftkpgigp示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0054]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。
[0055]I材料與試劑
[0056]大腸桿菌DH5 α菌株，Trans2K plus II DNA Marker,購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司有限公司；DS15000DNA Marker購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶HindII1、Avr I1、Sal 1、Sac 1、Xho 1、Nhe 1、Not 1、Sac I1、Sbf 1、Spe 1、Asc 1、BamH I，
T4DNA Iigase,為 NEB 產(chǎn)品；PrimcSTARs HS DNA Polymerase 為 TaKaRa 產(chǎn)品；AxyPrep?Plasmid Miniprep Kit>AxyPrep? DNA Gel Extraction Kit 為 AxyGEN產(chǎn)品；載體pVAXI 為Invitrogen 產(chǎn)品;pIRES2_AcGFPl 為 Clontech 產(chǎn)品；蓋羊睪丸細(xì)胞(Lamb testis cells)根據(jù)參考文獻(xiàn)方法制備；LipofectamineTM2000Transfection Reagent 購(gòu)自 Invitrogen 公司;Dulbecco，s modified Eagle’s medium (DMEM)購(gòu)自 HyClone 公司;胎牛血清為 Gibco公司產(chǎn)品；AxyPr印基因組DNA小量制備試劑盒為Axygen產(chǎn)品；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。羊痘病毒弱毒株AV41購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
[0057]2重組質(zhì)粒的設(shè)計(jì)
[0058]根據(jù)載體設(shè)計(jì)原則，結(jié)合本發(fā)明的需要，設(shè)計(jì)用于病毒重組的質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含羊痘病毒TK基因的同源臂、痘苗病毒啟動(dòng)子序列P7.5和pll、多克隆位點(diǎn)，如圖1所示。
[0059]由于啟動(dòng)子p7.5、pll序列沒(méi)有模板，難以通過(guò)PCR方法獲得；載體中的多克隆位點(diǎn)也需要通過(guò)基因合成獲得；因此，把這部分關(guān)鍵元件利用DNA合成的方法串連起來(lái)，得到如圖2所示的載體片段，兩端分別加入內(nèi)切酶Avr II和Hind III序列，并連接于pUC19載體上形成pUC19_tkpp。DNA合成由Invitrogen公司完成。
[0060]3重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0061](I)抗性基因和復(fù)制子的擴(kuò)增及與合成片段的環(huán)化[0062]以pVAXI載體為模板，利用PCR方法擴(kuò)增含有pUC ori序列和卡那霉素抗性基因(Kanamycin resistance gene)的DNA目的片段。引物序列如下，下劃線(xiàn)部分為酶切位點(diǎn):
[0063]Kanr-or1-Hind II1: 5’ -GCTAAGCTTCTTCTACTGGGCGG-3’
[0064]Kanr-or1-Avr I1:5’-ATGCCTAGGGTCAATAATCAATGTC-3’
[0065]PCR 反應(yīng)條件:95°C 3min,94°C 15s,52°C 15s,72°C 2minl0s
[0066]將PCR擴(kuò)增獲得的目的片段回收，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果參見(jiàn)圖6中泳道1，PCR擴(kuò)增的目的片段Karf-ori的大小約2015bp，與預(yù)期大小一致。
[0067]將上述驗(yàn)證正確的目的片段Karf-ori與含有DNA合成片段的質(zhì)粒pUC19_tkpp,分別用內(nèi)切酶Avr II和Hind III雙酶切，酶切產(chǎn)物回收，并用T4DNA Iigase連接環(huán)化，連接反應(yīng)條件:10X ligase bufferl μ L, DNA 片段各 3 μ L，T41igase0.5 μ L, ddH202.5 μ L, 16°C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，鑒定陽(yáng)性克隆并測(cè)序，最后形成如圖3A所示的重組載體骨架ptkpp。
[0068](2) TK基因同源臂的延長(zhǎng)
[0069]按照AxyPr印基因組DNA小量制備試劑盒說(shuō)明提取羊痘病毒弱毒株AV41 (CPVAV41)基因組DNA利用PC R方法擴(kuò)增含有TK基因的同源臂序列(約1500bp)，用于替換質(zhì)粒Ptkpp中的TK基因同源臂，引物如下，下劃線(xiàn)部分為酶切位點(diǎn):
[0070]ftkL-Avr I1:5’-GCGCCTAGGTATGATTAATAATACTTC-3’
[0071]ftkL-Sac 1:5’-ACCGAGCTCATCTTTAAAAAATTGC-3’
[0072]ftkR-Asc 1:5’-ATTAGGCGCGCCATTGTACCTTTTTCTG-3’
[0073]ftkR-Hind II1:5’-CCGAAGCTTAATCTTTTACCCATTGATC-3’
[0074]PCR 反應(yīng)條件:95°C 3min，94°C 15s，50。。15s，72。。lmin30s
[0075]將擴(kuò)增獲得的同源臂序列利用酶切位點(diǎn)插入替換質(zhì)粒ptkpp中的tk I^Ptk R，得到含有TK基因及其側(cè)翼序列同源臂的重組質(zhì)粒pftkpp，如圖3B所示。
[0076](3)報(bào)告基因和壓力篩選基因的連接
[0077]以載體PIRES2-AcGFPl為模板，利用PCR方法擴(kuò)增含有GFP和IRES的片段；以大腸桿菌BL21基因組為模板，擴(kuò)增gpt基因。引物序列如下，下劃線(xiàn)部分為酶切位點(diǎn):
[0078]G-1-Sac 1:5’ GCAGAGCTCTCACTTGTACAGCTCATC3’
[0079]G-1-Xho 1:5，ATTCTCGAGGCCCCTCTCCCTCCC3，
[0080]PCR 反應(yīng)條件:95°C 3min,94°C 15s,55°C 15s,72°C lmin30s ；
[0081]gpt-Xho 1:5’ TCTCTCGAGTTAGCGACCGGAGATTG3'
[0082]gpt-Sal 1:5’ CCTGTCGACATGAGCGAAAAATACATC3’
[0083]PCR 反應(yīng)條件:95°C 3min, 94°C 15s, 52°C 15s, 72°C 40s
[0084]將擴(kuò)增得到的GFP-1RES片段和gpt基因，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果分別參見(jiàn)圖6中泳道2和3，PCR擴(kuò)增的目的片段cGFP-1RES的大小為1326bp，gpt的大小為459bp,與預(yù)期大小一致。
[0085]將電泳驗(yàn)證正確的GFP-1RES片段和gpt基因插入到質(zhì)粒pftkpp的多克隆位點(diǎn)(MCS A),置于pll啟動(dòng)子后，形成pll-gpt-1RES-GFP表達(dá)盒,構(gòu)建成重組質(zhì)粒pftkpgigp,如圖3C和圖17所示。
[0086](4)外源抗原基因的插入[0087]以FMDV P12A3C為模板擴(kuò)增FMDV-VP1基因、以PPRV cDNA為模板PPRV-H基因。弓丨物序列如下:
[0088]VPl-Nhe 1:5’ ATAGCTAGCATGTGACCACTTCGACG3’
[0089]VPl-Not 1:5’ ATAGCGGCCGCTCACAAGGACTGCTTTAC3’
[0090]PCR 反應(yīng)條件:95V 3min, 94。。15s, 52V 15s, 72V 45s ；
[0091]PPRV-H-Nhe 1:5，TAAG CTAGCGCCACCATGGCCGCACAAAG3，
[0092]PPRV-H-Not 1:5’ TGGAGCGGCCGCTCAGACTGGATTACATG3’
[0093]PCR 反應(yīng)條件:95°C 3min, 94°C 15s, 52V 15s, 72V 2min
[0094]將擴(kuò)增得到的FMDV-VPl基因和PPRV-H基因，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果分別參見(jiàn)圖6中泳道4和5，PCR擴(kuò)增的目的片段FMDV-VPl的大小約645bp，PPRV-H的大小約1830bp，與預(yù)期大小一致。
[0095]將驗(yàn)證正確的目的片段FMDV-VPl、PPRV-H分別插入質(zhì)粒pftkpgigp中，構(gòu)建成用于病毒重組的質(zhì)粒pftkpgigp-VPl、pftkpgigp-H。如圖4所示。
[0096]4啟動(dòng)子pll和p7.5功能的驗(yàn)證
[0097](I)載體構(gòu)建
[0098]分別在啟動(dòng)子pll和p7.5后面插入報(bào)告基因，用以驗(yàn)證載體設(shè)計(jì)的正確性。pll表達(dá)盒已在2.3中構(gòu)建完成，即質(zhì)粒pftkpgigp。在p7.5后插入小反芻獸疫病毒基因H和IRES-GFP片段，形成p7.5-H-1RES-GFP表達(dá)盒；另外，單獨(dú)插入GFP構(gòu)建p7.5-GFP表達(dá)盒，均用以驗(yàn)證P7.5的功能。相關(guān)引物如下:
[0099]GFP-Nhe 1:5，-TAAGCTAGCCATGGTGAGCAAGGGC-3，
[0100]GFP-BamH 1:5’-TCCGGGATCCTCACTTGTACAGCTC-3’
[0101]PCR 反應(yīng)條件:95V 3min，94°C 15s，55。。15s，72。。50s。
[0102]PPRV-H-Nhe 1:5，-TAAGCTAGCCGCCACCATGGCCGCACAAAG-3，
[0103]PPRV-H-BamH 1:5’-CCGGGATCCTCAGACTGGATTACATG-3’
[0104]PCR 反應(yīng)條件:95°C 3min,94°C 15s,52°C 15s,72°C 2min。
[0105]GFP 連接至 ptkpp，構(gòu)成 ptkpp-GFP ； IRES-GFP 片段直接從載體 pIRES2_AcGFPl 上用BamH I ,Not I切下，連接至ptkpp的多克隆位點(diǎn)(MCS B)，然后連接PPRV-H，最后形成質(zhì)粒 ptkpp-H-1-GFP，如圖 5 所示。
[0106](2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LT細(xì)胞
[0107]LT細(xì)胞鋪至6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至單層，接CPV弱毒AV41孵育2h。按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作程序，將構(gòu)建好的質(zhì)粒pftkpgigp、ptkpp-GFP、ptkpp-H-1-GFP轉(zhuǎn)染至LT細(xì)胞，并于48h后觀察結(jié)果，結(jié)果參見(jiàn)圖11。
[0108]5重組CPV的形成、篩選與鑒定
[0109](I)重組質(zhì)粒的制備
[0110]試驗(yàn)3中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pftkpgigp-VPl和pftkpgigp-H按照QIAGEN公司EndoFree Plasmid Kit說(shuō)明書(shū)的操作程序,制備用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒,并測(cè)定質(zhì)粒濃度。
[0111](2)重組質(zhì)粒與CPV共轉(zhuǎn)染LT細(xì)胞
[0112]6孔板上鋪LT細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，CPV弱毒AV41感染6孔板上LT細(xì)胞，37°C吸附2h,重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，按Lipofectamine?2000Transfection Reagent試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染48h后在熒光顯微鏡下觀察是否有熒光，同時(shí)觀察細(xì)胞病變，參見(jiàn)圖12。當(dāng)90%細(xì)胞發(fā)生病變且有熒光出現(xiàn)時(shí)(參見(jiàn)圖13)，收毒CPV于-70°C保存:將發(fā)生病變的細(xì)胞培養(yǎng)板置于_70°C保存。
[0113](3)重組CPV的篩選
[0114]96孔板上鋪LT細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，換選擇培養(yǎng)液(2.5%FBS, MPA25 μ g/mL,Xanthine250 μ g/mL, Hypoxanthinel5 μ g/mL)鮮育 16_24h。將上述病毒原液稀釋 100 倍后接種于96孔板的LT細(xì)胞，37°C吸附2h，換選擇培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。觀察細(xì)胞病變及熒光，當(dāng)出現(xiàn)帶有綠色熒光的病毒蝕斑時(shí)，選擇此孔中的病毒懸液作為下一步篩選的病毒庫(kù)。重復(fù)上述過(guò)程，直至獲得含有多量熒光病毒蝕斑的病毒懸液，此時(shí)將該病毒懸液稀釋后接種于6孔板上擴(kuò)大培養(yǎng)，收取病毒懸液。
[0115](4)重組CPV的鑒定
[0116]①rCPV基因組DNA檢測(cè):上述試驗(yàn)獲得的重組病毒懸液，提取所得重組病毒rCPV/FMDV-VP 1、rCPV/PPRV-H基因組，利用下列引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，以確定CPV發(fā)生重組的情況。
[0117]ρ7.5: 5，-TCTCTATAATCTCGCGCAACC-3’
[0118]tkR:5’-AAACGTGCTATCTAGTGCAGC-3’
[0119]PCR 反應(yīng)條件:95V 3min，94°C 15s，52。。15s，72。。2minl0s
[0120]②RT-PCR檢測(cè)外源基因:PCR鑒定陽(yáng)性的病毒懸液接種于LT細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)中等程度病變時(shí)收集細(xì)胞，用TRIzoI提取RNA，進(jìn)行RT-PCR進(jìn)一步鑒定重組病毒中外源基因的轉(zhuǎn)錄。鑒定時(shí)加入羊的β-actin基因擴(kuò)增作為內(nèi)參。
[0121]③rCPV外源蛋白的表達(dá):將鑒定為陽(yáng)性的rCPV接種于LT細(xì)胞(96孔板或24孔板)，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)輕度病變時(shí)，進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，以鑒定rCPV中插入外源基因的表達(dá)情況。
[0122]二、結(jié)果
[0123]I目的片段PCR結(jié)果
[0124]PCR 擴(kuò)增的目的片段有 Kanr-ori (2015bp)、cGFP-1RES (1326bp)、gpt (459bp)、FMDV-VPl (645bp)、PPRV-H (1830bp)，本 申請(qǐng)人:對(duì)其均進(jìn)行了電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果參見(jiàn)圖6，以上目的片段的PCR產(chǎn)物均與預(yù)期大小一致。
[0125]2重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果
[0126]依據(jù)重組載體的構(gòu)建過(guò)程，本 申請(qǐng)人:對(duì)制備方法步驟3和4中獲得的所有質(zhì)粒均進(jìn)行了酶切驗(yàn)證，結(jié)果參見(jiàn)圖7-10 ;酶切鑒定結(jié)果均與預(yù)期相符。
[0127]3重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果
[0128]所有重組質(zhì)粒均進(jìn)行了 DNA測(cè)序，測(cè)序由華大基因科技服務(wù)有限公司及上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。所有結(jié)果與預(yù)期一致，可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
[0129]4重組質(zhì)粒 啟動(dòng)子功能驗(yàn)證結(jié)果
[0130]為了驗(yàn)證載體中啟動(dòng)子pll和ρ7.5的功能，質(zhì)粒pftkpgigp、ptkpp-GFP、ptkpp-H-1-GFP分別轉(zhuǎn)染LT細(xì)胞。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后24h開(kāi)始即可觀察到綠色熒光，不同啟動(dòng)子下報(bào)告基因的表達(dá)時(shí)間也存在差異，p7.5的啟動(dòng)稍早,且突光相對(duì)較強(qiáng)；反之，pll下的GFP則表達(dá)稍晚，熒光強(qiáng)度較低。圖11所示即為驗(yàn)證啟動(dòng)子功能的熒光照片。[0131]5重組CPV的篩選結(jié)果
[0132]在MPA選擇培養(yǎng)基下，重組rCPV會(huì)在LT細(xì)胞上形成綠色熒光病毒蝕斑，未發(fā)生重組的病毒由于其核酸合成受到抑制而逐漸減少，經(jīng)過(guò)幾輪篩選，獲得了滴度較高的rCPV。如圖12和13所示。
[0133]6重組CPV的鑒定結(jié)果
[0134]①rCPV基因組DNA中外源基因檢測(cè)結(jié)果:提取所得重組病毒rCPV/FMDV-VPl、rCPV/PPRV-H基因組，用引物對(duì)p7.5、tkR能夠擴(kuò)增得到插入到重組轉(zhuǎn)移載體MCS中的外源基因，得到的PCR產(chǎn)物比外源基因長(zhǎng)約150-200bp。如圖14所示。
[0135]②重組病毒RT-PCR鑒定外源基因結(jié)果如圖15所示。
[0136]③rCPV外源基因表達(dá)產(chǎn)物的鑒定結(jié)果如圖16所示。
[0137]最后應(yīng)說(shuō)明的是:以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例 所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體，其特征在于:所述重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體是在含有抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制子序列，并能用III和Jkt II酶切的載體，如pVAXI載體，通過(guò)引入Hiη? III和Jkt II酶切位點(diǎn)插入DNA片段；所述DNA片段包含帶有雙向痘病毒啟動(dòng)子和羊痘病毒TK基因的同源臂的基因序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體，其特征在于:所述痘病毒啟動(dòng)子為pll 和 ρ7.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體，其特征在于:所述重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體的核苷酸序列參見(jiàn)序列表中SEQ ID N0.1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體，其特征在于:所述羊痘病毒TK基因的同源臂長(zhǎng)度為1400bp_1600bp,優(yōu)選1500bp。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體，其特征在于:所述DNA片段中還包括報(bào)告基因和壓力篩選基因；作為優(yōu)選，所述報(bào)告基因?yàn)榫G色熒光蛋白GFP，所述壓力篩選基因選用表達(dá)鳥(niǎo)嘌呤-次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的基因gpt。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體，其特征在于:所述重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體的核苷酸序列參見(jiàn)序列表中SEQ ID N0.2。
7.—種重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟如下: (1)以pVAXI載體為模板，利用PCR方法擴(kuò)增含有pUCori序列和卡那霉素抗性基因的DNA目的片段，得到目的片段Karf-ori ； (2)將雙向痘病毒啟動(dòng)子、羊痘病毒TK基因的同源臂和多克隆位點(diǎn)進(jìn)行DNA合成，得到如圖2所示的載體片段，兩端分別加入內(nèi)切酶Jkt II和//i/7dIII序列，并連接于載體上； (3)將步驟(1)得到的目的片段和步驟(2)得到的重組質(zhì)粒分別雙酶切，酶切產(chǎn)物連接環(huán)化，得到重組載體ptkpp ； (4)提取羊痘病毒弱毒株AV41基因組DNA，利用PCR方法擴(kuò)增含有TK基因的同源臂序列(約1500bp),替換質(zhì)粒ptkpp中的TK基因同源臂,得到重組載體pftkpp ； (5)將報(bào)告基因和壓力篩選基因插入到質(zhì)粒pftkpp的多克隆位點(diǎn)，置于pll啟動(dòng)子后，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pftkpgigp。
8.含有權(quán)利要求1-6任一所述的重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體的重組羊痘病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組羊痘病毒，其特征在于:所述重組羊痘病毒是將權(quán)利要求1-6任一所述的重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體導(dǎo)入羊痘病毒感染的細(xì)胞中，兩者的同源序列在細(xì)胞內(nèi)同源重組后得到的。
10.權(quán)利要求1-6任一所述的重組羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體、權(quán)利要求8或9所述的重組羊痘病毒在外源抗原轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N7/01GK103966262SQ201410140376
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年4月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月9日
【發(fā)明者】李繼東, 才學(xué)鵬, 竇永喜, 朱學(xué)亮, 蒙學(xué)蓮, 駱學(xué)農(nóng) 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所, 寧夏大學(xué)