專利名稱：：具有串聯(lián)轉(zhuǎn)錄單位的重組流感病毒載體的制作方法具有串聯(lián)轉(zhuǎn)錄單位的重組流感病毒載體相關(guān)申請(qǐng)的交叉參者本申請(qǐng)要求2004年11月19日提交的美國(guó)申請(qǐng)序號(hào)60/629,665的權(quán)益，所述申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容在此引入作為參考。政府權(quán)利聲明本發(fā)明是在美國(guó)政府資助下完成的(美國(guó)公共衛(wèi)生服務(wù)部國(guó)立變態(tài)反應(yīng)和感染性疾病研究所(NationalInstituteofAllergyandInfectiousDiseasesPublicHealthService)資助號(hào)AI047446)。美國(guó)政府在本發(fā)明中可享有一定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
：流感季節(jié)性流行和大流行持續(xù)奪走人類生命，并影響全球經(jīng)濟(jì)。單在美國(guó)，流感每年引致估計(jì)50,000例死亡(Thompson等，2003),而全球大流行可導(dǎo)致數(shù)百萬(wàn)例流感相關(guān)死亡。一個(gè)經(jīng)典事例就是所謂的'西班牙流感，，其于1918-1919年在全世界奪走了估計(jì)4000-5000萬(wàn)人的生命(Potter，1998)。流感病毒施加的威脅由于近期禽流感病毒傳入人群中而被進(jìn)一步提升。長(zhǎng)期以來(lái)一直認(rèn)為禽流感病毒不會(huì)直接傳播到人類并引起致死結(jié)果。但是，這種觀念在1997年被改變，當(dāng)時(shí)18名香港居民被H5N1亞型的全禽流感病毒感染，導(dǎo)致6人死亡(Subbarao等，l"8;Claas等，1998)。在之后的幾年當(dāng)中，報(bào)告了其它幾例直接禽傳人病例(Peiris等，20(M;Fouchier等，2004;Koopsman等，2004)，包括在幾個(gè)亞洲國(guó)家正在發(fā)生的高致病性H5N1流感病毒的爆發(fā)，至2005年1月26日為止奪走了54名受感染個(gè)體中的41條生命(WHO，2004)。人H5N1病毒感染數(shù)量的逐漸增加連同高死亡率以及可能的人傳人傳播一起，使得必須開(kāi)發(fā)針對(duì)這些病毒的疫苗。在美國(guó)，兩種流感疫苗獲頒人用許可一種滅活疫苗和一種減毒活疫苗病毒。流感病毒疫苗的生產(chǎn)依賴于重配(Gerdil，2003),其需要用提供血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)節(jié)段的循環(huán)野生抹和A/PR/8/34(PR8)病毒(在雞胚(egg)中提供高生長(zhǎng)特性的減毒人病毒)或提供減毒表型的減毒活病毒共感染細(xì)胞。選擇期望的"6+2"重配體(即在PR8或減毒活病毒遺傳背景中含循環(huán)野生林的HA和NA基因節(jié)段的那些毒林)耗時(shí)且麻煩。而且，需要重配和選擇以及某些重配體病毒不能培養(yǎng)至高滴度導(dǎo)致疫苗生產(chǎn)延遲。對(duì)于曱型和乙型流感病毒，高效反向遺傳系統(tǒng)目前所處狀態(tài)允許由克隆的cDNA產(chǎn)生這些病毒(Neumann等，1999;Hoffmann等,2002;Fodor等，1999;Hoffmann等，2000)。在一個(gè)系統(tǒng)(Neumann等,1999)中，8種質(zhì)粒編碼處于RNA聚合酶I(PolI)啟動(dòng)子和終止子序列控制之下的8個(gè)流感病毒RNA節(jié)段，將這8種質(zhì)粒連同4種RNA聚合酶II(PolII)驅(qū)動(dòng)的、用于表達(dá)3種病毒聚合酶亞單位和核蛋白NP的質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞中；這4種蛋白是啟動(dòng)病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄所必需的。也已開(kāi)發(fā)出替代系統(tǒng)(Hoffinann等，2000),其依賴于8種質(zhì)粒，在這8種質(zhì)粒中，病毒cDNA在一個(gè)位點(diǎn)側(cè)接RNA聚合酶I啟動(dòng)子，在另一個(gè)位點(diǎn)側(cè)接RNA聚合酶II啟動(dòng)子，該系統(tǒng)允許由同一模板獲得vRNA和mRNA。這些系統(tǒng)允許對(duì)6+2重配體進(jìn)行工程化，而不需要重配和篩選步驟。數(shù)量有限的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系可用于生產(chǎn)流感病毒疫苗。它們包括Madin-Darby犬腎細(xì)胞(MDCK)(Brands等，1999;Palache等，1999;Halperin等，2002)和非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)(Kistner等，1998;Kistner等，1999a;Kistner等,1999b;Bruhl等，2000)。這些細(xì)胞系不能被高效轉(zhuǎn)染，有時(shí)限制了其在反向遺傳系統(tǒng)中用于流感病毒疫苗生產(chǎn)的用途；但是，在Vero細(xì)胞中生產(chǎn)流感病毒已得到證實(shí)(Fodor等，1999;Nicolson等，2005)。因此，需要一種制備流感病毒的改良方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供含串聯(lián)轉(zhuǎn)錄單位(轉(zhuǎn)錄盒)的分離載體(多核苦酸)，所述串聯(lián)轉(zhuǎn)錄單位包括(i)基于RNA聚合酶I(PolI)的轉(zhuǎn)錄盒，和/或(ii)基于RNA聚合酶II(PolII)的轉(zhuǎn)錄盒，和/或(iii)基于RNAPolI/II的轉(zhuǎn)錄盒，它們?cè)谝粋€(gè)或多個(gè)載體(例如質(zhì)?；蚱渌d體，例如線性核酸傳遞載體)上。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供可用于組合物的質(zhì)粒，以制備感染性負(fù)鏈分段RNA病毒，所述組合物具有少于8種含病毒基因的質(zhì)粒，用于病毒生產(chǎn)。例如，本發(fā)明的組合物可包含l、2、3、4、5、6或7種具有流感病毒基因的質(zhì)粒，所述組合物一旦導(dǎo)入到細(xì)胞中，就產(chǎn)生感染性流感病毒。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，為提供病毒生產(chǎn)用質(zhì)粒數(shù)減少的反向遺傳系統(tǒng)，將達(dá)8種用于對(duì)應(yīng)流感病毒RNA合成的RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄盒組合在一種質(zhì)粒上，并將達(dá)用于3種流感病毒聚合酶亞單位的3種轉(zhuǎn)錄盒組合在一種質(zhì)粒上。如下文所述，該方法允許在Vero細(xì)胞中有效和大量地產(chǎn)生曱型流感病毒。例如，本發(fā)明包括含串聯(lián)轉(zhuǎn)錄盒的載體，例如質(zhì)粒，所述串聯(lián)轉(zhuǎn)錄盒例如為以下的一種或更多種轉(zhuǎn)錄盒(i)RNAPoll啟動(dòng)子、流感病毒RNA的cDNA(為負(fù)義或正義方向)和RNAPoll終止子；(ii)RNAPolII啟動(dòng)子、流感病毒的PB2、PB1、PA和/或NP蛋白的DNA以及聚腺苷酸化信號(hào)(RNAPolII轉(zhuǎn)錄終止序列)，和/或(iii)RNAPolII啟動(dòng)子、RNAPoll轉(zhuǎn)錄終止序列、流感病毒RNA的cDNA(為正義方向)、RNA聚合酶PolI啟動(dòng)子和RNAPolII轉(zhuǎn)錄終止序列。在可被有效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中，這些方法在來(lái)源于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的每ml上清液中產(chǎn)生高達(dá)108病毒。轉(zhuǎn)錄盒和/或本文所述載體的組合可用于產(chǎn)生減毒活流感疫苗病毒，例如使用所謂的"內(nèi)部基因，，(即PB2、PB1、PA、NP、M和NS)與來(lái)源于現(xiàn)有循環(huán)病毒的HA和NA基因組合。例如，H5N1病毒不能在雞胚中培養(yǎng)，所以含這些基因的轉(zhuǎn)錄盒對(duì)產(chǎn)生H5N1疫苗病毒特別有用。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄盒中的HA是曱型HA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄盒中的HA是乙型HA。在再一個(gè)實(shí)施方案中，使用丙型流感病毒的基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，RNAPoll啟動(dòng)子是人RNAPolI啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，NAcDNA還包含NB序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物還包含含Poll啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄盒，所述Poll啟動(dòng)子有效連接(叩erablylinked)至與Poll轉(zhuǎn)錄終止序列相連的流感病毒BM2cDNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將全部8種用于產(chǎn)生流感病毒的RNAPoll轉(zhuǎn)錄盒組合在一種質(zhì)粒上，可由5個(gè)質(zhì)粒產(chǎn)生病毒，即l種用于合成全部8種vRNA,4種用于合成聚合酶蛋白和NP蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將4種用于合成聚合酶和NP蛋白的RNAPolII轉(zhuǎn)錄盒組合在一種質(zhì)粒上，可由兩個(gè)質(zhì)粒產(chǎn)生病毒，即1種用于合成全部8個(gè)vRNA，1種用于合成聚合酶蛋白和NP蛋白。在再一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將3種用于合成聚合酶蛋白的RNAPolII轉(zhuǎn)錄盒組合在1種質(zhì)粒上、將用于NP蛋白的1個(gè)RNAPolII轉(zhuǎn)錄盒組合在1種質(zhì)粒上以及使用1種用于合成全部8個(gè)vRNA的質(zhì)粒，可由3種質(zhì)粒產(chǎn)生病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將用于產(chǎn)生HA、NA、M和NSvRNA的4種RNAPoll轉(zhuǎn)錄盒和用于產(chǎn)生PB2、PB1、PA和NPvRNA和mRNA的4種RNAPolI/II轉(zhuǎn)錄盒組合在一種質(zhì)粒上，可由一種質(zhì)粒產(chǎn)生流感病毒。任意合適的啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止序列都可用于表達(dá)蛋白(例如病毒蛋白、非病毒病原體的蛋白或治療性蛋白)或vRNA。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離和純化的載體，例如質(zhì)粒，其表達(dá)或編碼流感病毒蛋白，或表達(dá)或編碼流感vRNA，所述流感vRNA既可以是天然vRNA，也可以是重組vRNA。優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子適于在特定宿主細(xì)胞中表達(dá)，例如禽宿主細(xì)胞或哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，例如犬、貓、馬、牛、綿羊或靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞(包括人細(xì)胞)，或優(yōu)選地適于在不止一種宿主中表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于vRNA生產(chǎn)的一種或更多種載體包含RNAPolII啟動(dòng)子、RNAPoim啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子或T3啟動(dòng)子。對(duì)于含RNAPolII啟動(dòng)子的vRNA載體，該載體可選地可包含核酶序列(參見(jiàn)PCT/US04/016649，其公開(kāi)內(nèi)容在此引入作為參考)。vRNA載體用的優(yōu)選轉(zhuǎn)錄終止序列包括^旦不限于RNAPoll轉(zhuǎn)錄終止序列、RNAPolin轉(zhuǎn)錄終止序列或核酶。質(zhì)粒或待一起使用的質(zhì)粒組合中的各個(gè)RNAPolII啟動(dòng)子可相同或不同。質(zhì)?；虼黄鹗褂玫馁|(zhì)粒組合中的各個(gè)RNAPoll啟動(dòng)子可相同或不同。同樣，質(zhì)粒或待一起使用的質(zhì)粒組合中的各個(gè)RNAPolII轉(zhuǎn)錄終止序列可相同或不同。此外，質(zhì)?；虼黄鹗褂玫馁|(zhì)粒組合中的各個(gè)RNAPoll轉(zhuǎn)錄終止序列可相同或不同。使用少于12種質(zhì)粒，例如少于10種質(zhì)粒，可產(chǎn)生102TCID50/mL、103TCID50/mL、104TCID50/mL、105TCID50/mL、106TCID50/mL、107TCID5O/mL、108TCID5()/mL或以上的滴度。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)(例如2、3、4、5、6、7或8個(gè))病毒節(jié)段的cDNA各自均側(cè)接RNAPoll終止序列和啟動(dòng)子序列，這種轉(zhuǎn)錄盒然后側(cè)接RNAPolII啟動(dòng)子和RNAPolII聚腺苷酸化信號(hào)(以圖4中的NP基因?yàn)槔?。該方法由同一模板產(chǎn)生vRNA(由RNAPoll合成)和mRNA(由RNAPolII合成)這二者。因此不再需要另外的病毒蛋白合成用質(zhì)粒，減少了流感病毒生產(chǎn)所必需的轉(zhuǎn)錄盒數(shù)。在各個(gè)vRNA/蛋白編碼盒中的RNAPoll啟動(dòng)子和/或RNAPoll轉(zhuǎn)錄終止序列和/或RNAPolII啟動(dòng)子和/或RNAPolII終止序列可與任意其它編碼盒相同或不同。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括以下組合2種質(zhì)粒(l種用于產(chǎn)生HAvRNA和NAvRNA，1種用于產(chǎn)生MvRNA和NSvRNA)和1種質(zhì)粒(含4種用于合成PB2、PB1、PA和NPvRNA和mRNA的RNAPolI/II轉(zhuǎn)錄盒)，4吏得可由3種質(zhì)粒產(chǎn)生病毒；或者l種用于PB2、PB1、PA、NP、M和NSvRNA的質(zhì)粒、1種用于HAvRNA的質(zhì)粒、1種用于NAvRNA的質(zhì)粒以及1種用于合成聚合酶和NP蛋白的質(zhì)粒，使得可由4種質(zhì)粒產(chǎn)生病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括1種用于產(chǎn)生6種vRNA(例如PB2、PB1、PA、NP、M和NSvRNA)的質(zhì)粒、1種用于產(chǎn)生兩個(gè)vRNA(HA和NAvRNA)的質(zhì)粒和4種各自用于生產(chǎn)PB2、PB1、PA和NP蛋白的質(zhì)粒，使得可由6種質(zhì)粒產(chǎn)生病毒。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括1種用于產(chǎn)生6個(gè)vRNA(例如PB2、PB1、PA、NP、M和NSvRNA)的質(zhì)粒、1種用于產(chǎn)生兩個(gè)vRNA(例如HA和NAvRNA)的質(zhì)粒和1種用于產(chǎn)生PB2、PB1和PA蛋白的質(zhì)粒以及1種用于生產(chǎn)NP蛋白的質(zhì)粒，使得可由4種質(zhì)粒產(chǎn)生病毒。可用于本發(fā)明的組合物和/或方法的其它載體包含目標(biāo)DNA，例如預(yù)防或治療性蛋白的目標(biāo)基因或可讀框(編碼區(qū))，其側(cè)接病毒序列以及可選的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列和/或PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列。目標(biāo)DNA相對(duì)于啟動(dòng)子可為正義方向或負(fù)義方向。目標(biāo)DNA無(wú)論是在vRNA生產(chǎn)用載體中還是在蛋白生產(chǎn)用載體中都可編碼免疫原性表位，例如可用于癌癥治療或疫苗或基因治療的表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)DNA是全長(zhǎng)流感病毒cDNA或流感病毒DNA編碼區(qū)，例如甲型流感(例如任意曱型流感病毒基因，包括15種HA或9種NA亞型中的任一種)、乙型流感或丙型流感DNA(參見(jiàn)FieldsVirology(Fields等(編輯)，Lippincott-RavenPubl.，Philadelphia,PA(1996))的45和46章，其通過(guò)引用具體地結(jié)合到本文中)，盡管預(yù)期任意來(lái)源(例如任意病毒)的基因都可用于本發(fā)明的載體和方法。因此，本發(fā)明的組合物還可包含一種轉(zhuǎn)錄盒，其包含連接至5'流感病毒序列的啟動(dòng)子，所述5'流感病毒序列包含連接至異源目標(biāo)DNA(即未被發(fā)現(xiàn)與流感病毒序列天然連接的DNA或與自然界中所發(fā)現(xiàn)不同的譜系中的DNA)的5'流感病毒非編碼序列，所述目標(biāo)DNA連接至3'流感病毒序列，所述3'流感病毒序列包含連接至轉(zhuǎn)錄終止序列的3'流感病毒非編碼序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)DNA有效連接至RNA聚合酶啟動(dòng)子和RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)DNA包含編碼病原體的免疫原性多肽或肽或者治療性多肽或肽的可讀框。在一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)DNA有效連接至Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列，而在另一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)DNA有效連接至PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列。在再一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)DNA有效連接至Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列。含目標(biāo)DNA的轉(zhuǎn)錄盒可與至少一種其它轉(zhuǎn)錄盒在同一質(zhì)粒上，或者可與其它轉(zhuǎn)錄盒在不同質(zhì)粒上。當(dāng)制備病毒時(shí)，目標(biāo)DNA可替代流感病毒可讀框或其部分，或者可處于所有流感病毒可讀框之外。本發(fā)明還提供一種制備病毒(例如流感病毒)的方法，或提供一種通過(guò)將異源目標(biāo)DNA導(dǎo)入流感病毒載體而傳遞基因的方法。例如，所述方法包括使細(xì)胞與多種本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄盒例如序貫地或同時(shí)接觸，例如使用其量有效產(chǎn)生感染性流感病毒的本發(fā)明組合物。本發(fā)明還包括由與所述組合物接觸的細(xì)胞分離出病毒。因此，本發(fā)明還提供分離的病毒以及與本發(fā)明的組合物或病毒接觸過(guò)的宿主細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括使細(xì)胞與一種或更多種載體(或者是vRNA生產(chǎn)載體，或者是蛋白生產(chǎn)載體)接觸，之后與其它載體(或者是vRNA生產(chǎn)載體，或者是蛋白生產(chǎn)載體)接觸。本發(fā)明的方法允許容易地操作流感病毒之類的負(fù)鏈病毒，例如通過(guò)將減毒突變導(dǎo)入到病毒基因組中。此外，因?yàn)榱鞲胁《菊T導(dǎo)強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫，所以本發(fā)明大大地增強(qiáng)了這些作為疫苗載體的病毒，尤其是考慮到病毒天然變異體的可獲得性，所述病毒可序貫使用，允許重復(fù)地用于基因治療。本文描述的病毒生產(chǎn)方法不需要輔助病毒感染，可用于病毒誘變研究，以及生產(chǎn)疫苗(例如用于AIDS、流感、乙肝、丙肝、鼻病毒、絲狀病毒、癡疾、皰滲和口蹄疫的疫苗)和基因治療載體(例如用于癌癥、AIDS、腺苷脫氨酶缺乏癥、肌營(yíng)養(yǎng)不良、鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的基因治療載體)。因此，提供用于藥物治療(例如用于疫苗或基因治療)的病毒。本發(fā)明還提供一種免疫接種個(gè)體以對(duì)抗病原體(例如細(xì)菌、病毒或寄生物)或惡性腫瘤的方法。該方法包括給予個(gè)體一定量的至少一種本發(fā)明的分離病毒，其可選地與能有效免疫個(gè)體的佐劑組合。該病毒包含含有由病原體或腫瘤特異性多肽所編碼的多肽之序列的vRNA。本發(fā)明還提供一種擴(kuò)大或增加哺乳動(dòng)物中的內(nèi)源蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，所述哺乳動(dòng)物患有以所述內(nèi)源性蛋白質(zhì)的量下降或缺乏為特征的適應(yīng)癥或疾病。該方法包4舌給予所述哺乳動(dòng)物一定量的本發(fā)明分離病毒，以有效擴(kuò)大或增加所述哺乳動(dòng)物中的該內(nèi)源蛋白質(zhì)的量。所述病毒含擴(kuò)大或增加內(nèi)源蛋白質(zhì)量的多肽的vRNA。優(yōu)選地，所迷哺乳動(dòng)物是人。附圖簡(jiǎn)述圖1:已建立的反向遺傳系統(tǒng)的示意圖。在RNP轉(zhuǎn)染方法(A)中，用體外合成的vRNA將純化的NP和聚合酶蛋白質(zhì)裝配到RNP中。用RNP轉(zhuǎn)染細(xì)胞，接著進(jìn)行輔助病毒感染。在RNA聚合酶I方法(B)中，將含有RNA聚合酶I啟動(dòng)子、編碼待拯救的vRNA的cDNA以及RNA聚合酶I終止子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。RNA聚合酶I的胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生了合成vRNA，該vRNA在用輔助病毒感染時(shí)被包裝入子代病毒顆粒中。在A)和B)中，由輔助病毒群中選擇轉(zhuǎn)染子病毒(即含來(lái)源于所克隆cDNA的RNA的那些病毒)。在示于(C)的方法中，將含RNA聚合酶I啟動(dòng)子、8個(gè)病毒RNA節(jié)段各自的cDNA和RNA聚合酶I終止子的質(zhì)粒與蛋白表達(dá)質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中。盡管可用表達(dá)PA、PB1、PB2和NP的質(zhì)粒產(chǎn)生感染性病毒，但所有其余結(jié)構(gòu)蛋白(以括號(hào)表示)的表達(dá)增加了依賴于所產(chǎn)生病毒的病毒生產(chǎn)效率。圖2:產(chǎn)生RNA聚合酶I構(gòu)建物的示意圖。通過(guò)PCR擴(kuò)增得自流感病毒的cDNA,用&wBI消化并克隆到pHH21載體的&mBI位點(diǎn)中(E.Hoffmann,Ph.D.thesis,Justus,Liebig誦University,Giessen，Germany),該載體含人RNA聚合酶I啟動(dòng)子(P)和小鼠RNA聚合酶I終止子(T)。該終止子序列上游的胸苦核苦酸(*丁)代表該流感病毒RNA的3'末端。曱型流感病毒序列用粗體字母表示。圖3:具有多個(gè)流感病毒基因的質(zhì)粒的示意圖。A)用于由一個(gè)模板轉(zhuǎn)錄全部8個(gè)流感病毒RNA的pTM-PolI-WSN-All。通過(guò)使用限制性內(nèi)切核酸酶的單一識(shí)別位點(diǎn)，將包含人RNA聚合酶I啟動(dòng)子(藍(lán)色，Poll啟動(dòng)子)、編碼負(fù)義方向的流感病毒節(jié)段的cDNA(以不同顏色顯示)和小鼠RNA聚合酶I終止子(黑色，PolI終止子)的轉(zhuǎn)錄單位組合在一種質(zhì)粒上。B)用于由1種質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄6個(gè)和2個(gè)流感病毒RNA的pTM-PolI-WSN-PB2-PBl-PA-NP-M-NS和pTM-PolI-WSN-HA-NA。這些質(zhì)粒和術(shù)語(yǔ)的產(chǎn)生同對(duì)pTM-PolI-WSN-All的概述一樣。C)用于由1種質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄PB2、PB1和PAmRNA的pC-PolII-WSN-PB2-PB1-PA。通過(guò)使用限制性內(nèi)切核酸酶的單一識(shí)別位點(diǎn)，將包含RNA聚合酶II啟動(dòng)子(深藍(lán)色，PolII啟動(dòng)子)(即雞j3-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)、相應(yīng)病毒蛋白的編碼區(qū)(以不同顏色顯示)和聚腺苷酸化序列(金色，PolyA)的轉(zhuǎn)錄單位組合在一種質(zhì)粒上。圖4:RNA聚合酶I/II轉(zhuǎn)錄單位。NP基因側(cè)接RNA聚合酶I終止子(PolI-Term)和RNA聚合酶I啟動(dòng)子(PolI-Prom)序列。然后將該單位插到RNA聚合酶II啟動(dòng)子(例如CMV啟動(dòng)子(CMVPr))和聚腺苷酸化信號(hào)(例如牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化信號(hào)(BGHpolyA))之間。圖5:含4種用于合成PB2、PBl、PA和NPvRNA和mRNA的RNA聚合酶I/II轉(zhuǎn)錄單位以及4種用于合成HA、NA、M和NSvRNA的RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄單位的質(zhì)粒。PII:RNA聚合酶II啟動(dòng)子(陰影框)，pA:聚腺苷酸化信號(hào)(空心框)；P:RNA聚合酶I啟動(dòng)子(大黑框)，T:RNA聚合酶I終止子(小黑框)。發(fā)明詳述定義本文所用的術(shù)語(yǔ)"分離的和/或純化的"指在體外制備、分離和/或純化核酸分子，例如本發(fā)明的質(zhì)?；虮景l(fā)明的病毒，使其不與體內(nèi)物質(zhì)相結(jié)合，或者基本上由體外物質(zhì)中純化出來(lái)。分離的病毒制備物一般通過(guò)體外培養(yǎng)和繁殖獲得，并基本上不含其它感染因子。本文所用的"基本上不含"指對(duì)特定感染因子來(lái)說(shuō)，低于用針對(duì)該感染因子的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的檢測(cè)水平。"重組體"病毒是例如使用重組DNA技術(shù)體外操作以向病毒基因組導(dǎo)入變化的病毒或者人工產(chǎn)生的病毒。本文所用的術(shù)語(yǔ)"重組核酸"或"重組DNA序列或節(jié)段，，指一種核酸(例如DNA),該核酸來(lái)源于或分離自其某來(lái)源，隨后可在體外發(fā)生化學(xué)變化，使得其序列不是天然序列，或者其序列相當(dāng)于天然序列，但此序列的定位與其在天然基因組中應(yīng)處位置不同。"來(lái)源"于某來(lái)源的DNA的實(shí)例應(yīng)是被鑒定為有用片段的DNA序列，該序列然后可用化學(xué)方法合成為基本純的形式。"分離"自某來(lái)源的此DNA的實(shí)例應(yīng)是通過(guò)化學(xué)方法(如使用限制性內(nèi)切核酸酶)從所述來(lái)源中切下或取出的有用DNA序列，這樣其可通過(guò)基因工程方法作進(jìn)一步處理(如擴(kuò)增)而用于本發(fā)明。本文所用的"高度可轉(zhuǎn)染細(xì)胞"是這樣的細(xì)胞在這種細(xì)胞中例如根據(jù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的蛋白表達(dá)檢測(cè)，單個(gè)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率達(dá)約95%,和/或其中用起過(guò)5種具有流感病毒基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，用于非減毒流感病毒的病毒生產(chǎn)，至轉(zhuǎn)染后2天時(shí)產(chǎn)生至少約106TCID50/mL的病毒滴度，或者用于減毒病毒生產(chǎn)，產(chǎn)生約102TCID5Q/mL的病毒滴度。代表性的高度可轉(zhuǎn)染細(xì)胞包括但不限于293T細(xì)胞。相反，本文所用的"感染效率降低的細(xì)胞，，是這樣的細(xì)胞在這種細(xì)胞中單個(gè)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率低于約50%,和/或用超過(guò)5個(gè)具有流感病毒基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，用于非減毒流感病毒的病毒生產(chǎn)，至感染后2天時(shí)產(chǎn)生低于約3xl05TCIDs(/mL的病毒滴度。代表性的感染效率降低的細(xì)胞包括但不限于Vero細(xì)胞和MDCK細(xì)胞。負(fù)義RNA病毒負(fù)義RNA病毒分為7個(gè)^K彈狀病毒科(A/w^/ovzW^e)、副粘病毒科(Para，xovzW(i—、絲狀病毒科(Fz7ov/r油g)、玻那病毒科(Jor"fl!v,n'(ifle)、正粘病毒科(6W/zow少xovzV油e)、布尼亞病毒科(Bw";vw7W(i3e)和沙粒病毒科(^rew(2Wn'(iafe))，其中包括常見(jiàn)的人類病原體(例如呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus)、流感病毒(influenzavirus)、麻滲病毒(measlesvirus)和埃博才立病毒(Ebolavirus))以及對(duì)家禽業(yè)和養(yǎng)牛業(yè)具有重要經(jīng)濟(jì)影響的動(dòng)物病毒(例如新城疫病毒(Newcastlediseasevirus)和牛瘕病毒(Rinderpestvirus))。前4科的特征在于不分^殳基因組，而后3科分別具有包含6-8個(gè)、3個(gè)或2個(gè)負(fù)義RNA段的基因組。負(fù)義RNA病毒的共同特征是其RNA基因組的負(fù)極性；即病毒RNA(vRNA)與mRNA互補(bǔ)，因此自身沒(méi)有感染性。為了啟動(dòng)病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，vRNA必須通過(guò)病毒聚合酶復(fù)合體和核蛋白分別轉(zhuǎn)錄成正義mRNA或cRNA;對(duì)于曱型流感病毒，病毒聚合酶復(fù)合體由3種聚合酶蛋白PB2、PB1和PA組成。在病毒復(fù)制期間，cRNA作為新vRNA分子的合成模板。對(duì)于所有負(fù)鏈RNA病毒來(lái)說(shuō)，vRNA和cRNA5'端和3'端的非編碼區(qū)對(duì)病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制都是至關(guān)重要的。與細(xì)胞或病毒的mRNA轉(zhuǎn)錄物不同，cRNA和vRNA在5'末端都沒(méi)有被加帽，在絕對(duì)的3'末端(very3'end)也都沒(méi)有聚腺香酸化。從生物化學(xué)方面和/或在病毒感染背景下，已經(jīng)闡明了許多病毒蛋白的基本功能。然而，反向遺傳系統(tǒng)使我們對(duì)負(fù)鏈分段和不分段RNA病毒在其病毒復(fù)制和致病性方面的了解以及對(duì)開(kāi)發(fā)減毒活病毒疫苗的了解急劇增加。反向遺傳學(xué)作為用于分子病毒學(xué)的術(shù)語(yǔ)，定義為產(chǎn)生具有來(lái)自克隆cDNA的基因組的病毒(有關(guān)綜述參見(jiàn)Neumann等，2002)。流感病毒曱型流感病毒具有8條單鏈負(fù)義病毒RNA(vRNA)的基因組，總共編碼10-11種蛋白。流感病毒生命周期起始于血凝素(HA)與宿主細(xì)胞表面含唾液酸受體的結(jié)合，其后是受體介導(dǎo)的胞吞作用。晚期內(nèi)體的低pH觸發(fā)HA構(gòu)象變化，因而暴露出HA2亞基的N端(所謂的融合肽)。融合肽促使病毒和胞內(nèi)體膜融合，基質(zhì)蛋白(M1)和RNP復(fù)合體釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。RNP由將vRNA殼體化的核蛋白(NP)以及由PA、PB1和PB2蛋白所形成的病毒聚合酶復(fù)合體組成。RNP轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，在此發(fā)生轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。RNA聚合酶復(fù)合體催化3個(gè)不同反應(yīng)合成具有5'帽和3'多聚腺苦酸結(jié)構(gòu)的mRNA、合成全長(zhǎng)互補(bǔ)RNA(cRNA)以及使用cDNA為模板合成基因組vRNA。隨后，新合成的vRNA、NP和聚合酶蛋白裝配成RNP，從核中輸出，轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜，在此發(fā)生子代病毒顆粒的出芽。神經(jīng)氨酸酶(NA)蛋白除去唾液酸寡糖中的唾液酸，由此從細(xì)胞表面釋放出新裝配的病毒體，并阻止病毒顆粒的自我聚集，因而在感染后期起至關(guān)重要的作用。盡管病毒裝配涉及蛋白一蛋白相互作用和蛋白一vRNA相互作用，但是這些相互作用的性質(zhì)很大程度上還是未知的。盡管乙型和丙型流感病毒在結(jié)構(gòu)和功能上均類似于曱型流感病毒，但還是有一些差異。例如，乙型流感病毒的M節(jié)段通過(guò)串聯(lián)順?lè)醋拥慕K止-重起始模式編碼兩種蛋白Ml和BM2，NA節(jié)段由雙順?lè)醋觤RNA編碼NA和NB蛋白。丙型流感病毒具有7個(gè)vRNA節(jié)段，依靠剪接過(guò)的轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生Ml蛋白；未剪接過(guò)的mRNA的產(chǎn)物被蛋白酶剪切，產(chǎn)生CM2蛋白。另外，丙型流感病毒編碼HA-酯酶，而不是單個(gè)的HA和NA蛋白。索戈托病毒屬(Thogotovirus)索戈托病毒屬(THOV)代表正粘病毒科的一個(gè)新屬。它們由蜱傳播，并己在馴養(yǎng)動(dòng)物中(包括駱駝、山羊和牛)發(fā)現(xiàn)。因此，THOV能在蜱和脊推動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制。THOV基因組包含6個(gè)單鏈負(fù)義RNA節(jié)段。由3個(gè)最大節(jié)段編碼的蛋白質(zhì)顯示出與流感病毒聚合酶蛋白質(zhì)PB2、PB1和PA有顯著同源性。節(jié)段5編碼一種與流感病毒NP有關(guān)的蛋白質(zhì)。節(jié)段4編碼的THOV糖蛋白與流感病毒HA或NA均不同源，但是它顯示出與桿狀病毒糖蛋白有序列相似性。一般認(rèn)為最小節(jié)段編碼基質(zhì)蛋白，與^f壬一種流感病毒蛋白質(zhì)都不象。與流感病毒相似，vRNA的3'和5'端都是啟動(dòng)子活性所需要的，此活性分別位于該vRNA的3'和5'端的末端14個(gè)和15個(gè)核苦酸上。THOV的mRNA合成由宿主細(xì)胞衍生的帽結(jié)構(gòu)啟動(dòng)。然而，與流感病毒相反，只有該帽結(jié)構(gòu)(沒(méi)有額外核苷酸)才被從細(xì)胞mRNA中切下(Albo等，1996;Leahy等，1997;Weber等，1996)。體外切割測(cè)定揭示，vRNA的5'和3'末端都是核酸內(nèi)切酶活性所需要的(Leahy等，1998),但是如流感病毒已顯示的一樣(Hagen等，1994),加入模型cRNA啟動(dòng)子并不刺激核酸內(nèi)切酶活性(Leahy等，1998)。已提出了THOV的'鉤，結(jié)構(gòu)(Leahy等，1997;Weber等，1997)，這與對(duì)流感病毒提出的螺旋狀結(jié)構(gòu)相類似。然而，這種'鉤，結(jié)構(gòu)僅存在于THOVvRNA啟動(dòng)子中。cRNA啟動(dòng)子序列不允許cRNA5'端的2和9位之間以及3和8位之間形成堿基對(duì)。允許在這些核苦酸之間i成基配對(duì)的3位或8位替換刺激核酸內(nèi)切酶活性，這是對(duì)所提出的'鉤，結(jié)構(gòu)的強(qiáng)力支持證據(jù)(Leahy等，1998)。而且，該結(jié)構(gòu)對(duì)THOV生命周期的調(diào)控可能是至關(guān)重要的；形成該'鉤，結(jié)構(gòu)的vRNA啟動(dòng)子可刺激PB2核酸內(nèi)切酶活性，因而允許轉(zhuǎn)錄。相反，cRNA啟動(dòng)子不能形成'鉤，結(jié)構(gòu)，因此不能刺激核酸內(nèi)切酶活性，因而不能引起復(fù)制。布尼亞病毒牙牛布尼亞病毒科包括若干種在人中引起出血熱或腦炎熱(如裂谷熱、；又坦病毒、LaCrosse和Crimean-Congo出血熱)的病毒。5求狀有包膜的病毒粒含有3個(gè)單鏈負(fù)義RNA節(jié)段(綜述于Elliott,1997)。最大的節(jié)段(L)編碼病毒RNA聚合酶蛋白(L蛋白)，而M節(jié)段編碼Gl和G2兩種病毒糖蛋白以及一個(gè)非結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)(NSm)。最小節(jié)段(S)編碼核殼蛋白質(zhì)(N)和第二種非結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)(NSs)。病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，新裝配的病毒粒通過(guò)高爾基體膜出芽。Bridgen和Elliott(1996)己建立了一種反向遺傳系統(tǒng)，從克隆的cDNA完整地產(chǎn)生感染性布尼安威拉病毒(Bunyamweravinus)。他們采用了首先由Schnell等(1994)描述的用于狂犬病毒的策略在表達(dá)病毒聚合酶和核蛋白的細(xì)胞中進(jìn)行編碼正義反基因組RNA(而不是負(fù)義基因組RNA)的cDNA的胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄。Bridgen和Elliott(1996)用表達(dá)T7聚合酶的牛痘病毒感染HeLaT4+細(xì)胞，然后用表達(dá)S、M和L節(jié)段所編碼蛋白質(zhì)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞。接著他們用3種編碼側(cè)接T7聚合酶啟動(dòng)子和丁型肝炎病毒核酶的全長(zhǎng)反基因組cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞。為了相對(duì)于牛痘病毒顆粒數(shù)增加布尼亞病毒顆粒數(shù)，該作者使用了蚊子細(xì)胞，在該細(xì)胞中布尼安威拉病毒復(fù)制而牛痘病毒不復(fù)制。此方案不僅能用于基因工程改造布尼亞病毒，還可以產(chǎn)生用不同的布尼亞病毒科毒抹共感染細(xì)胞不易獲得的重配體病毒。為研究轉(zhuǎn)錄與復(fù)制所需要的布尼亞病毒啟動(dòng)子元件和病毒蛋白質(zhì)，Dunn等(1995)以負(fù)義方向?qū)AT基因克隆在布尼安威拉SRNA節(jié)段5'和3'非翻譯區(qū)之間。用表達(dá)L和S節(jié)段所編碼蛋白質(zhì)的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后用在體外轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)染，產(chǎn)生CAT活性。布尼亞病毒S節(jié)段在重疊讀框中編碼兩種蛋白質(zhì)-N和NSs。為確定這兩種蛋白質(zhì)是否都是轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所需要的，測(cè)試了僅表達(dá)N或NSs的構(gòu)建物的CAT活性。N蛋白與L蛋白一起表達(dá)產(chǎn)生CAT活性，而用NSs表達(dá)構(gòu)建物沒(méi)有檢測(cè)到CAT活性。因此，L蛋白和N蛋白足以滿足布尼亞病毒樣RNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。同流感病毒一樣，布尼亞病毒RNA的末端序列是互補(bǔ)的且高度保守的。因此猜測(cè)這些序列元件限定了布尼亞病毒啟動(dòng)子，并且對(duì)啟動(dòng)子活性至關(guān)重要。在該病毒RNA3'末端缺失5個(gè)核香酸極大地降低了CAT表達(dá)(Dunn等，1995)。相反，在5'末端加入2個(gè)核苦酸，或者在3'末端加入11個(gè)或35個(gè)核苷酸，并不消除CAT表達(dá)(Dunn等，l995)。因此，與流感病毒聚合酶復(fù)合體一樣，布尼亞病毒聚合酶蛋白明顯可在內(nèi)部啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄和/或復(fù)制。本發(fā)明的重組流感病毒載體使用本文所述載體明顯降低了產(chǎn)生分段病毒(例如流感病毒)所需的質(zhì)粒數(shù)，增加了可被高效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中的流感病毒的拯救效率，允許產(chǎn)生被嚴(yán)重減毒的病毒，和/或允許在不能以高效率被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系(包括用于人疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系(例如Vero細(xì)胞))中產(chǎn)生流感病毒。因此，使用本發(fā)明載體降低了病毒產(chǎn)生的變量數(shù)，使流感病毒產(chǎn)生更一致，并減輕了提供有關(guān)質(zhì)粒歷史、純度和毒性的必要文件證明的負(fù)擔(dān)。這些優(yōu)勢(shì)允許快速產(chǎn)生疫苗病毒，尤其是對(duì)大流行而言。而且，本文公開(kāi)的本發(fā)明并不限于流感病毒，而是可適用于任意其它的反義RNA病毒，例如副粘病毒科(尸arawjaovzW^e)、彈狀病毒科(//w^dovzWcbe)、絲狀病毒科(Fz7ovzWcfee)、呼腸3瓜病毒科(及eovzWt/"g)、沙粒病毒科(^re"aWn'(i(3e)或布尼亞病毒科本發(fā)明提供至少一種以下的分離和/或純化載體或包含一種或更多種載體和或兩種或更多種轉(zhuǎn)錄盒的組合物一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB1cDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB1cDNA)的PolI啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2cDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB2cDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒HAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒HAcDNA)的PolI啟動(dòng)子，所述cDNA連接至PolI轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NPcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NPcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NAcDNA)的PolI啟動(dòng)子，所述cDNA連接至PolI轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒McDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒McDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NScDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NScDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PA的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB1的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NP的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PA的DNA節(jié)段(例如全長(zhǎng)流感病毒PAcDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PB1的DNA節(jié)段(例如全長(zhǎng)流感病毒PB1cDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PB2的DNA節(jié)段(例如全長(zhǎng)流感病毒PB2cDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；和/或一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒NP的DNA節(jié)段(例如全長(zhǎng)流感病毒NPcDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列。本發(fā)明的載體可包含選自以下的兩種或更多種轉(zhuǎn)錄盒一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB1cDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB1cDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2cDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB2cDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒HAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒HAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NPcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NPcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒McDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒McDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NScDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NScDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至PolI轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PA的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB1的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；和/或一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NP的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體包含選自以下的兩種或更多種轉(zhuǎn)錄盒一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PA的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB1的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；和一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NP的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連^r至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體包含選自以下的至少兩種轉(zhuǎn)錄盒一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒HAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒HAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒McDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒McDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；和/或一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NScDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NScDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列。本發(fā)明還包括具有至少兩種選自以下的轉(zhuǎn)錄盒的載體一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PA的DNA節(jié)段(例如全長(zhǎng)流感病毒PAcDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PB1的DNA節(jié)段(例如全長(zhǎng)流感病毒PB1cDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PB2的DNA節(jié)段(例如全長(zhǎng)流感病毒PB2cDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；和/或一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒NP的DNA節(jié)段(例如全長(zhǎng)流感病毒NPcDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列。本發(fā)明還提供含選自以下的兩種或更多種轉(zhuǎn)錄盒的載體一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB1cDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB1cDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2cDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB2cDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒HEFcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒HEFcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NPcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NPcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒McDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒McDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；和/或一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NScDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NScDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列。本發(fā)明還提供含選自以下的兩種或更多種轉(zhuǎn)錄盒的載體一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒McDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒McDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NScDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NScDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；和一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒HEFcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒HEFcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離和/或純化的載體，其包含一種或更多種轉(zhuǎn)錄盒，所述轉(zhuǎn)錄盒包括一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PBlcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB1cDNA)的PolI啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2cDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB2cDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒HEFcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒HEFcDNA)的PolI啟動(dòng)子，所述cDNA連4^至PolI轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NPcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NPcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒McDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒McDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NScDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NScDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PA的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB1的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NP的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PA的DNA節(jié)段(例如全長(zhǎng)流感病毒PAcDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PB1的DNA節(jié)段(例如全長(zhǎng)流感病毒PB1cDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PB2的DNA節(jié)段(例如全長(zhǎng)流感病毒PB2cDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；和/或一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒NP的DNA節(jié)段(例如全長(zhǎng)流感病毒NPcDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll專爭(zhēng)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列。本發(fā)明的示例性組合物本發(fā)明提供一種組合物，所述組合物包含至少一種質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含兩種或更多種vRNA生產(chǎn)用轉(zhuǎn)錄盒，所述轉(zhuǎn)錄盒選自一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB1cDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB1cDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2cDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB2cDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒HAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒HAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NPcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NPcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒McDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒McDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；和/或一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NScDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NScDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；以及所述組合物包含至少一種質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含一種或更多種mRNA生產(chǎn)用轉(zhuǎn)錄盒，所述轉(zhuǎn)錄盒選自一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PA的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB1的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；和/或一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NP的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)Poll啟動(dòng)子都是相同的。在一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)PolII啟動(dòng)子都是相同的。在一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)Poll轉(zhuǎn)錄終止子序列都是相同的。在一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)Poin轉(zhuǎn)錄終止子序列都是相同的。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種vRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒包含流感病毒PA、流感病毒PB1、流感病毒PB2、流感病毒HA、流感病毒NP、流感病毒NA、流感病毒M和流感病毒NS節(jié)段的轉(zhuǎn)錄盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種mRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒包含兩種或更多種用于流感病毒PA、流感病毒PB1、流感病毒PB2或流感病毒NP的轉(zhuǎn)錄盒，例如至少一種mRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒包含流感病毒PA、流感病毒PB1、流感病毒PB2和流感病毒NP的轉(zhuǎn)錄盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種mRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒包含3種轉(zhuǎn)錄盒，其中所述組合物還包含第三種mRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒，其具有有效連接至流感病毒基因的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列，其中在第三種質(zhì)粒中的DNA編碼區(qū)屬于不在所述含3種轉(zhuǎn)錄盒的質(zhì)粒上的流感病毒基因，例如，至少一種mRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒包含流感病毒PA、流感病毒PB1、流感病毒PB2的轉(zhuǎn)錄盒，第三種質(zhì)粒包含流感病毒NP的轉(zhuǎn)錄盒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種vRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒包含流感病毒PA、流感病毒PB1、流感病毒PB2、流感病毒NP、流感病毒M和流感病毒NS的轉(zhuǎn)錄盒。本發(fā)明還包括一種vRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒，其包含一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒HAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒HAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；和一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列，例如，至少一種mRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒包含流感病毒PA、流感病毒PB1、流感病毒PB2和流感病毒NP的轉(zhuǎn)錄盒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種mRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒包含其中3種轉(zhuǎn)錄盒，其中所述組合物還包含第三種mRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒，其具有有效連接至流感病毒基因的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列，其中在第三種質(zhì)粒中的DNA編碼區(qū)屬于不在含所述3種轉(zhuǎn)錄盒的質(zhì)粒上的流感病毒基因，例如，至少一種mRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒包含流感病毒PA、流感病毒PB1、流感病毒PB2的轉(zhuǎn)錄盒，第三種質(zhì)粒包含流感病毒NP的轉(zhuǎn)錄盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB1cDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB1cDNA)的PolI啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2cDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB2cDNA)的PolI啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒HAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒HAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NPcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NPcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒McDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒McDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；和一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NScDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NScDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄盒中的HA是甲型HA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄盒中的HA是乙型HA。在一個(gè)實(shí)施方案中，RNA聚合酶I啟動(dòng)子是人RNA聚合酶I啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄盒中的NA節(jié)段是乙型NA節(jié)段，即乙型流感病毒NA和NB蛋白這二者的節(jié)段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物還包含一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有有效連接至流感病毒McDNA(例如Ml和BM2這二者的cDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列。本發(fā)明還提供一種含質(zhì)粒的組合物，所述質(zhì)粒包含兩種或更多種選自以下的轉(zhuǎn)錄盒一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PA的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB1的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；和/或一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NP的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種含質(zhì)粒的組合物，所述質(zhì)粒包含一種或更多種選自以下的轉(zhuǎn)錄盒一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒HAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒HAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒McDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒McDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；和一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NScDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NScDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；以及所述質(zhì)粒包含一種或更多種選自以下的轉(zhuǎn)錄盒一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PAcDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PBlcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB1cDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PB2cDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB2cDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；和一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒NPcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NPcDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄盒中的HA為曱型HA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄盒中的HA為乙型HA。在一個(gè)實(shí)施方案中，RNAPoll啟動(dòng)子是人RNAPoll啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄盒中的NAcDNA是乙型NAcDNA,即具有NA和NB的cDNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物還包含一種轉(zhuǎn)錄盒，該轉(zhuǎn)錄盒含有有效連接至流感病毒McDNA(例如具有Ml和BM2的cDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列。本發(fā)明還提供一種含質(zhì)粒的組合物，該質(zhì)粒包含一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PA(例如全長(zhǎng)流感病毒PA)的cDNA的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PBlcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB1cDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PB2cDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB2cDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；和一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒NPcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NPcDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列。本發(fā)明還包括一種組合物，所述組合物含至少一種vRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含兩種或更多種選自以下的轉(zhuǎn)錄盒一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PAcDNA)的PolI啟動(dòng)子，所述cDNA連接至PolI轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PBlcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PBlcDNA)的PolI啟動(dòng)子，所述cDNA連接至PolI轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2cDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB2cDNA)的PolI啟動(dòng)子，所述cDNA連接至PolI轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒HEFcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒HEFcDNA)的PolI啟動(dòng)子，所述cDNA連接至PolI轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NPcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NPcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒McDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒McDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；和/或一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NScDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NScDNA)的啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；以及所述組合物含至少一種mRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含一種或更多種選自以下的轉(zhuǎn)錄盒一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PA的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB1的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；和/或一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NP的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種vRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒包含流感病毒PA、流感病毒PB1、流感病毒PB2、流感病毒HEF、流感病毒NP、流感病毒M和流感病毒NS節(jié)段的轉(zhuǎn)錄盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種mRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒包含兩種或更多種流感病毒PA、流感病毒PB1、流感病毒PB2或流感病毒NP的轉(zhuǎn)錄盒，例如至少一種mRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒包含流感病毒PA、流感病毒PB1、流感病毒PB2和流感病毒NP的轉(zhuǎn)錄盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種mRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒包含其中3種轉(zhuǎn)錄盒，其中所述組合物還包含第三種mRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒，該質(zhì)粒具有有效連接至流感病毒基因的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列，其中在第三種質(zhì)粒中的DNA編碼區(qū)屬于不在含所述3種轉(zhuǎn)錄盒的質(zhì)粒上的流感病毒基因，例如，至少一種mRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒包含流感病毒PA、流感病毒PB1、流感病毒PB2的轉(zhuǎn)錄盒，第三種質(zhì)粒包含流感病毒NP的轉(zhuǎn)錄盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種vRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒包含流感病毒PA、流感病毒PB1、流感病毒PB2、流感病毒NP、流感病毒M和流感病毒NS節(jié)段的轉(zhuǎn)錄盒。例如，所述組合物包含vRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含一種轉(zhuǎn)錄盒，該轉(zhuǎn)錄盒含有有效連接至流感病毒HEFcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒HEFcDNA)的Poll啟動(dòng)子，該cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列。本發(fā)明還提供一種含質(zhì)粒的組合物，所述質(zhì)粒包含兩種或更多種選自以下的轉(zhuǎn)錄盒一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至PolI轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB1cDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB1cDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至PolI轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2cDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB2cDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至PolI轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒HEFcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒HEFcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NPcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NPcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒McDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒McDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；和/或一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NScDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NScDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，各種vRNA生產(chǎn)用轉(zhuǎn)錄盒均在一種質(zhì)粒上。在一個(gè)實(shí)施方案中，各種mRNA生產(chǎn)用轉(zhuǎn)錄盒均在一種質(zhì)粒上。在一個(gè)實(shí)施方案中，各種轉(zhuǎn)錄盒均在一種質(zhì)粒上。在一個(gè)實(shí)施方案中，RNAPoll啟動(dòng)子是人RNAPoll啟動(dòng)子。本發(fā)明還包括一種含質(zhì)粒的組合物，所述質(zhì)粒包含一種或更多種選自以下的轉(zhuǎn)錄盒一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒HEFcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒HEFcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒McDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒McDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至PolI轉(zhuǎn)錄終止序列；和一種4爭(zhēng)錄盒，其含有效連接至流感病毒NScDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NScDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；以及所述質(zhì)粒包含一種或更多種選自以下的轉(zhuǎn)錄盒一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PAcDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PB1cDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB1cDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PB2cDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB2cDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；和一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒NPcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NPcDNA)的Poll啟在一個(gè)實(shí)施方案中，用于vRNA生產(chǎn)的各種轉(zhuǎn)錄盒均在一種質(zhì)粒上。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于mRNA生產(chǎn)的各種轉(zhuǎn)錄盒均在一種質(zhì)粒上。在一個(gè)實(shí)施方案中，各種轉(zhuǎn)錄盒均在一種質(zhì)粒上。在一個(gè)實(shí)施方案中，RNAPoll啟動(dòng)子是人RNAPoll啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物當(dāng)與可選地為293T細(xì)胞或Vero細(xì)胞的細(xì)胞接觸時(shí)，產(chǎn)生可檢測(cè)量的流感病毒，例如至少102至至少103TCID5Q/mL的滴度。示例't生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還提供一種制備流感病毒的方法。該方法包括使細(xì)胞與質(zhì)粒接觸，所述質(zhì)粒包含兩種或更多種選自以下的轉(zhuǎn)錄盒一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB1cDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB1cDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2cDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB2cDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒HAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒HAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NPcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NPcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；和/或一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒McDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒McDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；和/或一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NScDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NScDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至PolI轉(zhuǎn)錄終止序列；以及使細(xì)胞與質(zhì)粒接觸，所述質(zhì)粒含一種或更多種選自以下的轉(zhuǎn)錄盒一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PA的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB1的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子；和/或一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NP的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，制備流感病毒的方法包括使細(xì)胞與質(zhì)粒接觸，所述質(zhì)粒包含一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒HAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒HAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒McDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒McDNA)的啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NScDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NScDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；以及可選地包含一種或更多種選自以下的轉(zhuǎn)錄盒一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PAcDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PBlcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PBlcDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PB2cDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB2cDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；和/或一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒NPcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NPcDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種制備流感病毒的方法，該方法包括使細(xì)胞與質(zhì)粒接觸，所述質(zhì)粒包含兩種或更多種選自以下的轉(zhuǎn)錄盒一種轉(zhuǎn)錄盒，其舍有效連接至流感病毒PAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PAcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其舍有效連接至流感病毒PBlcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PBlcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2cDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB2cDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒HEFcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒HEFcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其舍有效連接至流感病毒NPcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NPcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒McDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒McDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；和/或一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NScDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NScDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；以及使細(xì)胞與這樣的質(zhì)粒接觸，所述質(zhì)粒含一種或更多種選自以下的轉(zhuǎn)錄盒一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PA的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB1的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子；和/或一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NP的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子。本發(fā)明還提供一種制備流感病毒的方法。該方法包括使細(xì)胞與質(zhì)粒接觸，所述質(zhì)粒包含一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒HEFcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒HEFcDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒McDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒McDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NScDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NScDNA)的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；并可選地包含一種或更多種選自以下的轉(zhuǎn)錄盒一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PAcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PAcDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PBlcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB1cDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PB2cDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒PB2cDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；和/或一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒NPcDNA(例如全長(zhǎng)流感病毒NPcDNA)的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括使細(xì)胞與載體接觸，所述載體包含一種轉(zhuǎn)錄盒，其包含連接至5'流感病毒序列的啟動(dòng)子，所述5'流感病毒序列包含5'流感病毒非編碼序列和可選的編碼序列的鄰接部分(參見(jiàn)PCT/US03/04233,其在此引入作為參考)，連接至目標(biāo)DNA，所述目標(biāo)DNA連接至3'流感病毒序列，所述3'流感病毒序列包含3'流感病毒非編碼序列和可選的編碼序列的鄰接部分，連接至轉(zhuǎn)錄終止序列(參見(jiàn)PCT/US03/04233)。在一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)DNA為有義方向。在另一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)DNA為負(fù)義方向。目標(biāo)DNA可包含編碼病原體的免疫原性多肽或肽或者治療性多肽或肽的可讀框。目標(biāo)DNA可有效連接至Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列，和/或目標(biāo)DNA可有效連接至PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列。可用于本發(fā)明的細(xì)胞系和流感病毒根據(jù)本發(fā)明，任何支持流感病毒有效復(fù)制的細(xì)胞都可用于本發(fā)明，所述細(xì)胞包括表達(dá)減少或降低水平的一種或多種作為流感病毒受體的唾液酸的突變細(xì)胞。由該方法得到的病毒可以制備成重配體病毒。優(yōu)選所述細(xì)胞是WHO已鑒定或可鑒定的連續(xù)細(xì)胞系。鑒定這類細(xì)胞系的要求包括對(duì)至少一個(gè)系鐠的生長(zhǎng)特征、免疫學(xué)標(biāo)記、病毒易感性、致瘤性和儲(chǔ)藏條件進(jìn)行表征，以及通過(guò)在動(dòng)物、雞胚和細(xì)胞培養(yǎng)物中檢驗(yàn)進(jìn)行表征。所述表征用于證實(shí)所述細(xì)胞沒(méi)有可檢測(cè)的外源因子。在一些國(guó)家，還需要細(xì)胞核學(xué)實(shí)驗(yàn)。另外，致瘤性優(yōu)選在與用于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞具有相同傳代水平的細(xì)胞中進(jìn)行檢驗(yàn)。優(yōu)選通過(guò)已顯示能得到穩(wěn)定結(jié)果的方法純化疫苗病毒(參見(jiàn)例如WorldHealthOrganization,1982)。優(yōu)選建立待用細(xì)胞系的完整特征，以便可納入適于終產(chǎn)物純度的試驗(yàn)。可用于表征本發(fā)明所用細(xì)胞的數(shù)據(jù)包括(a)有關(guān)其來(lái)源、建系和傳代史的信息；(b)有關(guān)其生長(zhǎng)和形態(tài)學(xué)特征的信息；(c)外源因子的檢驗(yàn)結(jié)果；(d)區(qū)別性特征，例如將這些細(xì)胞與其它細(xì)胞系清楚地區(qū)分開(kāi)來(lái)的生物化學(xué)、免疫學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)模式；和(e)致瘤性試驗(yàn)結(jié)果。優(yōu)選所用宿主細(xì)胞的傳代水平或群體倍增盡可能低。優(yōu)選所述細(xì)胞中生產(chǎn)的病毒在配制疫苗或基因治療劑之前已高度純化。一般而言，純化過(guò)程使細(xì)胞DNA、其它細(xì)胞組分和外源因子#:完全除去。也可使用使DNA徹底降解或變性的方法。參見(jiàn)例如Mizrahi，1990。疫苗本發(fā)明的疫苗可包含免疫原性蛋白，所述蛋白包括任何病原體的糖蛋白，例如來(lái)自一種或更多種細(xì)菌、病毒、酵母或真菌的免疫原性蛋白。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的流感病毒可以是流感病毒或其它病毒病原體的疫苗載體，所述其它病毒病原體包括但不限于慢病毒如fflV、乙肝病毒、丙肝病毒、皰滲病毒如CMV或HSV或口蹄疫病毒。完整病毒體疫苗通過(guò)超濾濃縮，然后通過(guò)區(qū)帶離心或色譜進(jìn)行純化。其在純化前或純化后使用例如福爾馬林或P-丙內(nèi)酯進(jìn)行滅活。亞單位疫苗包含純化的糖蛋白?？扇缦轮苽渌鲆呙缡褂媒?jīng)去污劑處理而片段化的病毒懸液，通過(guò)例如超速離心純化表面抗原。因此，亞單位疫苗主要含有HA蛋白，也含有NA。所用的去污劑可以是陽(yáng)離子去污劑，例如十六烷基三曱基溴化銨(Bachmeyer，1975);陰離子去污劑，例如脫氧膽酸按(Laver和Webster,1976;Webster等,1977);或非離子去污劑，例如商品名為TRITONX100的去污劑。也可以在用蛋白酶如菠蘿蛋白酶處理病毒體后分離血凝素，然后通過(guò)例如Grand和Skehel(1972)所描述的方法進(jìn)行純化。片段疫苗(splitvaccine)包含已經(jīng)過(guò)溶解脂質(zhì)的試劑處理的病毒體。片段疫苗可如下制備在攪拌下，用脂質(zhì)溶劑例如乙醚或氯仿以及去污劑處理如上獲得的、滅活或未滅活的純化病毒水性懸液。病毒包膜脂質(zhì)的溶解導(dǎo)致病毒顆粒片段化。回收含片段疫苗的水相，片段疫苗主要由血凝素和神經(jīng)氨酸酶(其原有的脂質(zhì)環(huán)境被去除)以及病毒核心或其降解產(chǎn)物組成。然后，如果之前尚未經(jīng)過(guò)滅活，則將殘留的感染性顆粒滅活。滅活疫苗。可以用已知方法滅活本發(fā)明的復(fù)制型病毒來(lái)提供本發(fā)明的滅活流感病毒疫苗，所迷方法例如但不限于福爾馬林或(3-丙內(nèi)酯處理?？捎糜诒景l(fā)明的滅活疫苗類型可包括全病毒(WV)疫苗或亞病毒顆粒(sv)(片段)疫苗。wv疫苗含有完整的滅活病毒，而sv疫苗含有用溶解含脂質(zhì)病毒包膜的去污劑破壞、接著化學(xué)滅活殘余病毒的純4t病毒。另外，可以使用的疫苗包括含有分離的HA和NA表面蛋白的疫苗，稱為表面抗原或亞單位疫苗。一般而言，針對(duì)SV和表面抗原(即純化的HA或NA)疫苗的應(yīng)答是類似的。一種含有與流行性病毒免疫相關(guān)的NA抗原和無(wú)關(guān)的HA的實(shí)驗(yàn)滅活WV疫苗似乎有效性比常規(guī)疫苗差(Ogra等，1977)。優(yōu)選含有兩種相關(guān)表面抗原的滅活疫苗。減毒活病毒疫苗。根據(jù)已知的方法步驟，減毒活流感病毒疫苗也可用于預(yù)防或治療流感病毒感染。優(yōu)選按照已知方法(參見(jiàn)例如Murphy，1993),通過(guò)將來(lái)自減毒供體病毒的減毒基因轉(zhuǎn)移到分離的或重配的復(fù)制型病毒中，一步實(shí)現(xiàn)減毒。因?yàn)獒槍?duì)曱型流感病毒的抗性是由出現(xiàn)抗HA和NA糖蛋白的免疫應(yīng)答介導(dǎo)的，所以編碼這些表面抗原的基因必須來(lái)自循環(huán)野生型^^。減毒基因來(lái)自減毒親本。在該方法中，賦予減毒的基因優(yōu)選不編碼HA和NA糖蛋白?；蛘?，這些基因不能轉(zhuǎn)移給帶有臨床病毒分離林表面抗原的重配體。已評(píng)價(jià)了許多供體病毒可重復(fù)地使流感病毒減毒的能力。作為非限制性實(shí)例，A/AnnArbor(AA)/6/60(H2N2)冷適應(yīng)(ca)供體病毒可用于減毒疫苗生產(chǎn)(參見(jiàn)例如Edwards,1994;Murphy，1993)。然后，在H2N2抗血清(其抑制帶有減毒A/AA/6/60(H2N2)ca供體病毒表面抗原的病毒的復(fù)制)存在下，在"。C(對(duì)強(qiáng)毒病毒復(fù)制是限制性的)選已在人類中評(píng)價(jià)了一大系列的HIN1和H3N2重配體，發(fā)現(xiàn)在以下方面是令人滿意的(a)感染性，(b)對(duì)血清反應(yīng)陰性兒童和初次免疫的成人的減毒性，(c)免疫原性，和(d)遺傳穩(wěn)定性。ca重配體的免疫原性與其復(fù)制水平相對(duì)應(yīng)。因此，由新野生型病毒獲得ca供體病毒的6個(gè)可轉(zhuǎn)移基因可重復(fù)地l吏這些病毒減毒，以用于接種易感成人和兒童。其它減毒突變可以經(jīng)定點(diǎn)^"變引入流感病毒基因中，以拯救帶有這些突變基因的感染性病毒。減毒突變可以引入基因組非編碼區(qū)以及編碼區(qū)中。這些減毒突變也可以引入例如PB2聚合酶基因(Subbarao等，1993)或NS基因中。因此，也可以產(chǎn)生帶有經(jīng)定點(diǎn)誘變引入的減毒突變的新供體病毒，此新供體病毒可用于生產(chǎn)減毒活重配體H1N1和H3N2候選疫苗，其方式類似于上述A/AA/6/60ca供體病毒。優(yōu)選所述減毒病毒保留的病毒基因所編碼的抗原決定簇與原臨床分離林的抗原決定簇基本類似。這是因?yàn)闇p毒疫苗的目的是為了提供與原臨床分離毒抹基本上相同的抗原性，而同時(shí)沒(méi)有感染性，以至于疫苗在接種哺乳動(dòng)物中4吏誘發(fā)嚴(yán)重病情的變化最小。因此，可按照已知方法將所述病毒減毒或滅活、配制并作為疫苗給予，以在動(dòng)物如哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。確定這些減毒或滅活疫苗是否保留與臨床分離林或由其衍生的高生長(zhǎng)抹相似的抗原性的方法在本領(lǐng)域眾所周知。所述已知方法包括利用抗血清或抗體消除表達(dá)供體病毒抗原決定簇的病毒；化學(xué)選擇(例如金剛烷胺或金剛乙胺)；HA和NA活性和抑制；以及DNA篩選(例如探針雜交或PCR),以證實(shí)減毒病毒中不存在編碼所述抗原決定簇的供體基因(例如HA或NA基因)。參見(jiàn)例如Robertson等，1988;Kilbourne，1969;Aymard-Henry等，1985;Robertson等，1992。藥物組合物適于接種或胃腸外或口服給藥的本發(fā)明藥物組合物包含減毒或滅活流感病毒，任選還包含無(wú)菌的水性或非水性溶液、懸浮液和乳液。所述組合物還可包含本領(lǐng)域已知的助劑或賦形劑。參見(jiàn)例如Berkow等，1987;Avery，sDrugTreatment,1987;Osol，1980。本發(fā)明的組合物通常以單劑量(單位劑量)形式存在。常規(guī)疫苗通常含有約0.1-200|ig、優(yōu)選10-15嗎血凝素，其來(lái)自加入到常規(guī)疫苗組合物中的各毒抹。構(gòu)成本發(fā)明疫苗組合物主要成分的疫苗可包括曱型、乙型或丙型病毒或其任何組合，例如，這三種型別中的至少兩種、不同亞型中的至少兩種、同型中的至少兩種、相同亞型中的至少兩種或者不同分離林或重配體。人曱型流感病毒包4舌H1N1、H2N2和H3N2亞型。胃腸外給藥的制劑包括無(wú)菌的水性或非水性溶液劑、混懸劑和/或乳劑，其可含有本領(lǐng)域已知的助劑或賦形劑。非水性溶劑的實(shí)例為丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄欖油)以及注射用有機(jī)酯類，例如油酸乙酯。載體或封閉敷料(occlusivedressing)可用于增加皮膚滲透性并增強(qiáng)抗原吸收。口服給藥的液體劑型通?？砂ê兴鲆后w劑型的脂質(zhì)體溶液劑。適于懸浮脂質(zhì)體的形式包括乳劑、混懸劑、溶液劑、糖漿劑和酏劑，其含有本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑，例如純化水。除了惰性稀釋劑外，所述組合物還可包含佐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑和懸浮劑，或者甜味劑、調(diào)味劑或芳香劑。參見(jiàn)例如Berkow等,1992;Avery's，1987;和Osol,1980。當(dāng)本發(fā)明的組合物用于給予個(gè)體時(shí)，其還可包含鹽、緩沖劑、佐劑或?qū)τ谔岣咚鼋M合物功效所需要的其它物質(zhì)。對(duì)于疫苗來(lái)說(shuō)，可以使用能增強(qiáng)特異性免疫應(yīng)答的佐劑。通常，佐劑和組合物混合在一起，然后給予免疫系統(tǒng)，或者可以分開(kāi)給予，但是給予待免疫生物體的同一部位。Osol(1980)提供了適用于疫苗組合物的材料的實(shí)例。通過(guò)混合至少24朱流感病毒株(例如2-50^^朱或其間的任意范圍或數(shù)值)的復(fù)制型流感病毒，可提供疫苗異質(zhì)性。優(yōu)選具有現(xiàn)代抗原組成的曱型或乙型流感病毒抹。按照本發(fā)明，可使用本領(lǐng)域已知技術(shù)在單林流感病毒中提供用于疫苗的變異性。本發(fā)明的藥物組合物可進(jìn)一步或另外包含至少一種化療化合物，例如用于基因治療的免疫抑制劑、抗炎藥或免疫增強(qiáng)劑，以及用于疫苗的化療劑，其包括但不限于Y球蛋白、金剛烷胺、胍、羥基苯并咪唑、干擾素-a、干擾素-P、干擾素-y、腫瘤壞死因子-a、縮氨基硫脲類、美替沙腙、利福平、利巴韋林、嘧啶類似物、嘌呤類似物、膦甲酸、膦酰乙酸、阿昔洛韋、二脫氧核苷、蛋白酶抑制劑或更昔洛韋。所述組合物還可含有可變的、但少量的無(wú)內(nèi)毒素曱醛和防腐劑，其已被發(fā)現(xiàn)是安全的，并且在接受所述組合物的生物中不會(huì)促成不希望的作用。藥物用途給予所述組合物(或其激發(fā)的抗血清)可用于"預(yù)防"或"治療"目的。當(dāng)預(yù)防性提供時(shí)，在出現(xiàn)病原體感染的任何癥狀之前，提供作為疫苗的本發(fā)明組合物。預(yù)防性給予所述組合物用于預(yù)防或緩解任何其后的感染。當(dāng)預(yù)防性提供時(shí)，在出現(xiàn)任何疾病癥狀之前，提供本發(fā)明的基因治療組合物。預(yù)防性給予所述組合物用于預(yù)防或緩解一種或更多種與所述疾病有關(guān)的癥狀。當(dāng)治療性提供時(shí)，在檢測(cè)到有實(shí)際感染癥狀時(shí)提供減毒或滅活病毒疫苗。治療性給予所述化合物用于緩解任何實(shí)際感染。參見(jiàn)例如Berkow等，1992;和Avery，1987。當(dāng)治療性提供時(shí)，當(dāng)才全測(cè)到疾病癥狀或指征時(shí)，提供基因治療組合物。治療性給予所述化合物用于緩解所述疾病癥狀或指征。因此，本發(fā)明的減毒或滅活疫苗組合物可在感染發(fā)作之前(以便預(yù)防或減弱預(yù)期感染)或?qū)嶋H感染開(kāi)始之后提供。同樣，對(duì)于基因治療，所述組合物可在出現(xiàn)障礙或疾病的任何癥狀之前或者在檢測(cè)到一種或更多種癥狀之后提供。如果一種組合物的給予可^^皮受體患者耐受，則該組合物被稱為"藥理學(xué)上可接受的"。如果這樣的藥物的給予量在生理學(xué)上是有意義的，則稱為該藥物以"治療有效量"給予。如果本發(fā)明組合物的存在導(dǎo)致在受體患者生理學(xué)上出現(xiàn)可檢測(cè)的變化，例如增強(qiáng)針對(duì)至少一種感染性流感病毒抹的初次或繼發(fā)性體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答中的至少一種，則該組合物在生理學(xué)上是有意義的。所提供的"保護(hù)性"不必是絕對(duì)的，即，如果與對(duì)照群體或一組患者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性改善，則流感感染無(wú)須完全被預(yù)防或消滅。保護(hù)性可限于減輕流感病毒感染癥狀發(fā)作的嚴(yán)重程度或減慢其速度。藥物給予一種或更多種病原體(例如一種或更多種流感病毒林)的抗性。在主動(dòng)免疫中，預(yù)防性給予宿主(例如哺乳動(dòng)物)滅活或減毒活疫苗組合物，于被動(dòng)免疫，可以回收激發(fā)的抗血清，將其給予懷疑具有至少一種流感病毒抹引起的感染的接受者。本發(fā)明的基因治療組合物可通過(guò)主動(dòng)免疫產(chǎn)生預(yù)防或治療水平的目標(biāo)基因產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，在足以引起免疫應(yīng)答產(chǎn)生的時(shí)間和量的條件下，將所述疫苗提供給雌性哺乳動(dòng)物(在受孕或分娩時(shí)或之前)，所述免疫應(yīng)答同時(shí)用于保護(hù)母體和胎兒或新生兒(經(jīng)穿過(guò)胎盤的或母乳中的抗體的被動(dòng)摻入)。因此，本發(fā)明包括預(yù)防或》爰解障礙或疾病(例如由至少一種病原體毒株引起的感染)的方法。如果本文所使用疫苗的給予引起疾病的癥狀或病況全部或部分緩解(即抑制)，或使個(gè)體產(chǎn)生針對(duì)該疾病的全部或部分免疫力，則認(rèn)為該疫苗預(yù)防或緩解疾病。如本文所使用的，(即抑制)，或使個(gè)體產(chǎn)生針對(duì)該疾病的全部或部分免疫力，則認(rèn)為該基因治療組合物預(yù)防或緩解疾病?？赏ㄟ^(guò)達(dá)到預(yù)期目的任何方式，^吏用如前所述的藥物組合物，給予本發(fā)明的至少一種滅活或減毒流感病毒或其組合物。例如，可以通過(guò)各種胃腸外途徑，例如皮下、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、口服或經(jīng)皮途徑，給予所述組合物。胃腸外給藥可通過(guò)快速濃注或者通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間逐漸輸注的方式進(jìn)行。使用本發(fā)明藥物組合物的優(yōu)選方式是通過(guò)肌內(nèi)或皮下施用。參見(jiàn)例如Berkow等，1992;和Avery,1987。用于預(yù)防、抑制或治療流感病毒相關(guān)病理的典型方案包括給予有效量的本文所述疫苗組合物，可以作為單次治療給藥，或者在1周至約24個(gè)月之間的周期(包4舌1周和24個(gè)月)內(nèi)或者其間的任何范圍或數(shù)值內(nèi)，作為加強(qiáng)或增強(qiáng)劑量重復(fù)給藥。按照本發(fā)明，組合物的"有效量"是指足以達(dá)到期望生物學(xué)作用的量。人們知道，有效劑量將取決于接受者的年齡、性別、健康狀況和體重、同時(shí)治療的種類(如果有的話)、治療頻率和所期望作用的性質(zhì)。下面提供的有效劑量范圍并不是對(duì)本發(fā)明的限制，而是代表優(yōu)選的劑量范圍。但是，最優(yōu)選劑量將因各受試者而異，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員理解且可確定的。參見(jiàn)例如Berkow等，1992;Avery's,1987;和Ebadi，1985。用于哺乳動(dòng)物(例如人)或鳥(niǎo)類成年生物的減毒病毒疫苗劑量可為約10^0"藍(lán)斑形成單位(PFU)/kg或其間的任意范圍或數(shù)值。滅活疫苗劑量范圍可為約0.1-200|Lig(例如50嗎)血凝素蛋白。但是，依據(jù)使用現(xiàn)有疫苗作為出發(fā)點(diǎn)通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行的測(cè)定，所述劑量應(yīng)當(dāng)是安全有效量。每劑復(fù)制型病毒疫苗中的免疫活性HA的劑量可標(biāo)準(zhǔn)化，使其含有合適的量，例如1-50嗎或其間的任意范圍或數(shù)值，或者為美國(guó)公共衛(wèi)生服務(wù)部(PHS)的推薦量，通常是對(duì)于3歲以上兒童每組分15嗎，對(duì)于不滿3歲兒童每組分7.5|ig。NA的用量也可以標(biāo)準(zhǔn)化，但是，該糖蛋白在處理器純化和^^者藏過(guò)程中可能不穩(wěn)定。每劑0.5ml的疫苗優(yōu)選含有約10-500億個(gè)病毒顆拉，優(yōu)選100億個(gè)病毒顆粒。下面通過(guò)以下非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例1曱型或乙型流感病毒基因組是一條分成8節(jié)段的負(fù)單鏈(C型僅有7個(gè)節(jié)段)。其中兩種基因?qū)Σ《靖腥疽约伴_(kāi)發(fā)流感疫苗的策略是至關(guān)重要的，它們是血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因。HA刺突蛋白結(jié)合至含末端N-乙酰神經(jīng)氨酸(唾液酸)基團(tuán)的粘蛋白，有助于進(jìn)入到宿主細(xì)胞中。經(jīng)典的流感疫苗通常通過(guò)融合HA和NA基因連同6個(gè)得自"無(wú)害"母抹的其它基因制備。該方法非常耗時(shí)，經(jīng)常在疫苗開(kāi)發(fā)過(guò)程中傾向于低滴度。已使用允許人們通過(guò)反向遺傳產(chǎn)生合成流感病毒的方法制備病毒，例如組裝含致病毒抹的HA和NA基因以及母林的6個(gè)基因的重組病毒。具體地說(shuō)，將這些克隆基因連同在其它質(zhì)粒中編碼的、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄所必需的蛋白(聚合酶PB2、PB1、PA和NP)—起轉(zhuǎn)染入細(xì)胞系中。然后收獲減毒活病毒用于疫苗生產(chǎn)。材料與方法細(xì)胞。將293T人胚腎細(xì)胞和非洲綠猴腎(Vero)細(xì)胞保持在補(bǔ)加10°/。FCS的DMEM中。對(duì)于所有實(shí)驗(yàn)，都使用VeroCCL-81細(xì)胞，該細(xì)胞先前已用于生產(chǎn)滅活日本腦炎疫苗，并已進(jìn)行了無(wú)致瘤性和外源感染因子篩選(Sugawara等，2002)。Madin-Darby犬腎(MDCK)細(xì)胞保持在含5%NCS的MEM中。所有細(xì)胞都保持在37°C、5%C02下。質(zhì)粒的構(gòu)建。為組合用于合成流感病毒RNA節(jié)段的RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄盒，用含在病毒基因組中不存在的限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別序列的寡核苷酸通過(guò)PCR擴(kuò)增含人RNA聚合酶I啟動(dòng)子、負(fù)義方向的流感病毒cDNA和小鼠RNA聚合酶I終止子的轉(zhuǎn)錄盒(Neumann等,2002)。使用pPolI畫WSN國(guó)PB2、pPolI-WSN-PBl、pPolI-WSN-PA、pPolI-WSN-HA、pPolI-WSN-NP、pPolI-WSN-NA、pPolI-WSN-M、pPolI-WSN-NS(全部描述于Neumann等，2002)作為模板，其包含位于RNA聚合酶I啟動(dòng)子和終止子序列之間的A/WSN/33(H1N1)病毒的對(duì)應(yīng)病毒cDNA。將PCR產(chǎn)物克隆入含對(duì)應(yīng)限制位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)載體中，測(cè)序，以證實(shí)它們沒(méi)有不希望的突變。所獲質(zhì)粒的功能性經(jīng)反向遺傳證實(shí)。使用具有側(cè)接的單一限制位點(diǎn)的改良pTMl載體(Moss等，1990)逐步組合各個(gè)RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄盒(該載體在下文更詳細(xì)地描述)。在各個(gè)克隆步驟中，通過(guò)反向遺傳證實(shí)含2-7個(gè)RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄單位的所獲質(zhì)粒的功能性。最終的質(zhì)粒pPolI-WSN-All(圖3A)包含8個(gè)RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄盒，用于合成全部8個(gè)流感A/WSN/33病毒RNA。該質(zhì)粒于室溫穩(wěn)定保持在大腸桿菌JM109細(xì)胞中；細(xì)菌培養(yǎng)物在TerrificBroth培養(yǎng)基中培養(yǎng)約30小時(shí)。使用相同策略分別產(chǎn)生兩種質(zhì)粒(分別為pTM-PolI-WSN-HA-NA和pTM-PolI-WSN-PB2-PBl-PA-NP-M-NS)(圖3B),其分別含HA和NA節(jié)段以及其余6個(gè)病毒節(jié)段(即PB2、PB1、PA、NP、M和NS)的RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄盒。質(zhì)粒pCAWSPB2、pCAWSPBl和pCAWSPA包含雞P-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、A/WSN/33PB2、PB1或PA蛋白的編碼序列以及聚腺苦酸化信號(hào)。這些RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄單位通過(guò)PCR或通過(guò)插入短DNA接頭側(cè)接單一限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列。對(duì)PCR擴(kuò)增的轉(zhuǎn)錄盒整體測(cè)序，之后使用單一限制位點(diǎn)組合這3個(gè)RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄盒。所獲質(zhì)粒(pC-PolII-WSN-PB2-PBl-PA，圖3C)的功能性通過(guò)反向遺傳驗(yàn)證。由質(zhì)粒產(chǎn)生病毒。使用TransIT-LT1(Mirus，Madison,WI)按照生產(chǎn)商的說(shuō)明轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(lxl()6)或VeroCCL-81細(xì)胞(5xl05)。簡(jiǎn)單地講，將轉(zhuǎn)染試劑(2)ulTransIT-LTl/嗎用于轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的DNA;4)ilTransIT-LTl/嗎用于轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞的DNA)稀釋在100plOpti-MEM(GIBCOBRL)中，于室溫溫育5分鐘，并加至預(yù)混合的DNA中。對(duì)于所有轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，使用0.1嗎用于合成病毒RNA的各個(gè)'單一單位，質(zhì)粒(即pPolI-WSN-PB2、pPolI-WSN-PBl、pPolI-WSN-PA、pPolI-WSN隱HA、pPolI-WSN-NP、pPolI國(guó)WSN-NA、pPolI-WSN國(guó)M、pPolI-WSN-NS;描述于Neumann等(1999))、1|ug含不止一種RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄單位的質(zhì)粒(即pTM-PolI-WSN-All、pTM-PolI-WSN-HA-NA或pTM-PolI-WSN-PB2-PBl-PA-NP-M-NS)以及1jig各種蛋白表達(dá)質(zhì)粒。在轉(zhuǎn)染后的指定時(shí)間，測(cè)定MDCK細(xì)胞中50%組織培養(yǎng)物感染的劑量(TCIDs。)。結(jié)果舍多種RNA聚合酶I或II轉(zhuǎn)錄盒的質(zhì)粒。為允許由少于8-12種質(zhì)粒產(chǎn)生流感病毒(Neumann等，1999;Hofftna皿等，2000;Fodor等，1999)，將用于病毒RNA(vRNA)合成的RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄盒或用于mRNA合成的RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄盒組合在一種質(zhì)粒上。作為示范，使用其病毒產(chǎn)生的參數(shù)和效率已充分確立的A/WSN/33(WSN)病毒。簡(jiǎn)單地講，將含人RNA聚合酶I啟動(dòng)子、負(fù)義方向的流感病毒cDNA和小鼠RNA聚合酶I終止子的RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄盒通過(guò)PCR擴(kuò)增、克隆并測(cè)序，然后使用單一限制性位點(diǎn)逐步連接。使用改良的pTMl載體(Moss等，1990)作為載體骨架，其穩(wěn)定支持20kb的埃博拉病毒cDNA(Neumann等，2000)，因此適于插入大DNA片段。含8個(gè)單獨(dú)的RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄單位的pTM-PolI-WSN-All(圖3A;約22.5kb長(zhǎng))的產(chǎn)生不存在大的障礙；但是，需要大腸桿菌JM109細(xì)菌在室溫生長(zhǎng)，以防止該質(zhì)粒重組。對(duì)于每年的流感病毒疫苗生產(chǎn)，僅有兩個(gè)病毒RNA節(jié)段不需要被替換，即編碼血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)表面糖蛋白的節(jié)段。為此，產(chǎn)生其中組合了HA和NA節(jié)段的轉(zhuǎn)錄單位的質(zhì)粒(pTM-PolI-WSN-HA-NA)(圖3B)，而第二種質(zhì)粒組合了編碼內(nèi)部蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄單位(pTM-PolI-WSN-PB2-PBl-PA-NP-M-NS)(圖3B)。這兩種質(zhì)粒在37。C于大腸桿菌JM109中擴(kuò)增的過(guò)程中均是穩(wěn)定的。為進(jìn)一步減少病毒產(chǎn)生所需的質(zhì)粒數(shù)，使用允許連接用于vRNA合成的RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄單位的相同策略，將WSNPB2、PB1和PA蛋白的3個(gè)RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄單位組合在一個(gè)載體骨架上。所M粒于37。C在大腸桿菌JM109中是穩(wěn)定的；其被稱做pC-PolII-WSN-PB2-PB1-PA(圖3C)。值得注意的是，組合了聚合酶蛋白和NP的RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄單位的質(zhì)粒不能^皮回收。在293T細(xì)胞中由含多個(gè)轉(zhuǎn)錄盒的質(zhì)粒產(chǎn)生病毒。為測(cè)試含多個(gè)轉(zhuǎn)錄盒的質(zhì)粒的功能性，用pTM-PolI-WSN-All(用于全部8個(gè)vRNA的轉(zhuǎn)錄)(表1，欄2和3)或pTM-PolI-WSN-HA-NA和pTM-PolI-WSN-PB2-PB1-PA-NP-M-NS(用于2個(gè)和6個(gè)vRNA的轉(zhuǎn)錄)(表1，欄7和8)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。用4種用于表達(dá)NP和由不同質(zhì)粒表達(dá)聚合酶亞單位的質(zhì)粒(表1，欄2和7)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，或用2種分別表達(dá)NP或表達(dá)PB2、PB1和PA的質(zhì)粒(表1,欄3和8)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。成功地由這些質(zhì)粒產(chǎn)生病毒，表明可組合RNA聚合酶I或RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄單位，由此降低人工產(chǎn)生流感病毒所需要的質(zhì)粒數(shù)。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)時(shí)，病毒產(chǎn)生的效率在2xl0至2.7x108TCID50/ml的范圍內(nèi)(表1,欄2、3、7、8:平均值-Uxlo8TCID5o/ml)。這些效率稍微高于(p-0.17)對(duì)照實(shí)驗(yàn)所獲得的效率，在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，用8種用于轉(zhuǎn)錄病毒vRNA的單獨(dú)質(zhì)粒、4種或2種用于合成NP和3種聚合酶亞單位的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(表1，欄9和10，產(chǎn)生6.3xl(^至1.3xl08TCID5。/ml;平均值=5.5x107TCID5()/ml)。還進(jìn)行了許多對(duì)照實(shí)驗(yàn)，包括模擬轉(zhuǎn)染(表l,欄14)、僅用蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(表1、欄11和12)、用8種僅用于vRNA合成的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(表1，欄13)或分別用合成2個(gè)或6個(gè)vRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(表l,分別為欄4或5)。這些對(duì)照沒(méi)有一個(gè)產(chǎn)生病毒。但是，在用pTM-PolI-WSN-All(表1,欄l)或者pTM-PolI-WSN-HA-NA和pTM-PolI-PB2-PBl-PA-NP-M-NS的組合(表1,欄6)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中始終檢測(cè)到可測(cè)量的病毒滴度。這些質(zhì)粒設(shè)計(jì)用于轉(zhuǎn)錄負(fù)義病毒RNA,預(yù)期不合成NP和3種聚合酶蛋白。因此，預(yù)期用任一個(gè)單獨(dú)的這些質(zhì)粒也不會(huì)產(chǎn)生病毒(關(guān)于可能的解釋，參見(jiàn)下文)。表l:在293T細(xì)胞中的病毒產(chǎn)生效率<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>用指定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。48小時(shí)后，通it^MDCK細(xì)胞中的噬斑檢測(cè)測(cè)定上清液中的病毒滴度。顯示了3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。'8單位'質(zhì)粒pTM-PolI-WSN-All;'6單位'質(zhì)粒pTM-PolI-WSN-PB2-PBl-PA-NP-M-NS;'2單位，質(zhì)粒pTM-PolI-WSN-HA-NA;8xl單位質(zhì)粒pPolI-WSN-PB2、pPolI-WSN-PBl、pPolI-WSN-PA、pPolI-WSN-HA、pPolI-WSN-NP、pPolI-WSN-NA、pPolI-WSN-M、pPolI-WSN-NS的組合；p.t.:轉(zhuǎn)染后。在Vero細(xì)胞中由含多個(gè)轉(zhuǎn)錄盒的質(zhì)粒產(chǎn)生病毒。接著，測(cè)試在難以高效轉(zhuǎn)染的Vero細(xì)胞中的病毒產(chǎn)生效率。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)時(shí)，來(lái)自12種質(zhì)粒的病毒產(chǎn)生在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中是可忽略的，在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中很低(表2,欄9)，而在轉(zhuǎn)染后72小時(shí)時(shí)，在全部3個(gè)實(shí)驗(yàn)中均檢測(cè)到病毒。使用僅一種或兩種用于合成病毒RNA的質(zhì)粒提高了轉(zhuǎn)染后72小時(shí)時(shí)的病毒產(chǎn)生效率，尤其是在與pC-PolII-WSN-PB2-PBl-PA組合時(shí)，產(chǎn)生達(dá)2.5xl06TCID5o/ml(表2,欄9對(duì)欄3:p-0.0017;欄9對(duì)欄8:p-0.0063)。與此相一致，和由各自的質(zhì)粒提供這些蛋白相比，由質(zhì)粒pC-PolII-WSN-PB2-PBl-PA表達(dá)3種聚合酶蛋白導(dǎo)致更有效的病毒產(chǎn)生(表2,對(duì)比欄2和欄3(p=0.0054)，欄7和欄8(p=0.028)，以及欄9和欄10(p=0.2))。由僅質(zhì)粒pTM-PolI-WSN-All(表2，欄1),或由質(zhì)粒pTM-PolI-WSN-PB2-PBl-PA-NP-M-NS和pTM-PolI-WSN-HA-NA(表2，欄6)4企測(cè)到病毒；但是，未一致地觀察到病毒產(chǎn)生，且獲得的病毒滴度低。這可能是由于Vero細(xì)胞的較低轉(zhuǎn)染效率?？傊?，這些結(jié)果表明，含多個(gè)RNA聚合酶I或II轉(zhuǎn)錄單位的質(zhì)?？稍谟赩ero細(xì)胞中產(chǎn)生病毒方面高度有效。表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>用指定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染VERO細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)或72小時(shí)時(shí)，通過(guò)在MDCK細(xì)胞中的噬斑檢測(cè)測(cè)定上清液中的病毒滴度。顯示了3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。'8單位'質(zhì)粒pTM-PolI-WSN-All;'6單位，質(zhì)粒pTM-PolI-WSN-PB2-PBl-PA-NP-M-NS;'2單位'質(zhì)粒pTM-PolI-WSN-HA-NA;8xl單位質(zhì)粒pPolI-WSN-PB2、pPolI-WSN-PBl、pPolI-WSN-PA、pPolI-WSN-HA、pPolI-WSN-NP、pPolI-WSN-NA、pPolI-WSN-M、pPolI-WSN-NS的組合；p.t.:轉(zhuǎn)染后。200580046922.5勢(shì)溢也誡47/533討論現(xiàn)在可通過(guò)反向遺傳實(shí)現(xiàn)疫苗病毒的產(chǎn)生。實(shí)際上，這是生產(chǎn)針對(duì)高致病性禽流感病毒的疫苗抹的唯一有效方法。這些病毒對(duì)人和含胚卵是致命的(Shortridge等，1998);因此，例如通過(guò)改變其HA切割位點(diǎn)序列減毒(Horimoto等，I994;Subbarao等，2003)對(duì)確保在含胚卵中生長(zhǎng)至高滴度、同時(shí)保護(hù)疫苗生產(chǎn)人員對(duì)抗與飛沫病毒的接觸是至關(guān)重要的。對(duì)人用來(lái)說(shuō)，疫苗抹的生產(chǎn)需要經(jīng)鑒定沒(méi)有致瘤性和外源感染因子的細(xì)胞系。一種這樣的細(xì)胞系是Vero細(xì)胞系，其目前用于生產(chǎn)狂犬疫苗和脊髓灰質(zhì)炎疫苗(Montagnon等，1999)。使用'12質(zhì)粒，法，F(xiàn)odor等(1999)報(bào)告了在轉(zhuǎn)染后4天時(shí)由107Vero細(xì)胞產(chǎn)生10-20個(gè)噬斑形成單位。Wood和Robertson(2004)通過(guò)反向遺傳在Vero細(xì)胞中產(chǎn)生了H5N1參比疫苗林，但沒(méi)有報(bào)告拯救效率，而基于A/PR/8/34(H1N1)或A/PR/S/34的病毒以<103pfli/ml的效率在Vero細(xì)胞中產(chǎn)生(Ozaki等，2004)。通過(guò)組合RNA聚合酶I和/或II轉(zhuǎn)錄單位并因此由更少質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)病毒拯救，我們能夠在轉(zhuǎn)染后第3天時(shí)由5xl05Vero細(xì)胞生產(chǎn)約105-106TCID50/ml。因此，與'12質(zhì)粒，法相比，用這些系統(tǒng)在Vero細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了更有效的病毒產(chǎn)生(表2，對(duì)比欄3或8與欄9)。因此，這種顯著和高效的反向遺傳系統(tǒng)對(duì)在大流行情況下快速制備疫苗株有益。流感病毒的產(chǎn)生依賴于聚合酶和NP蛋白的表達(dá)。聚合酶亞單位組合在一種質(zhì)粒上增強(qiáng)了病毒產(chǎn)生的效率。該觀察結(jié)果可由用于病毒拯救的質(zhì)粒數(shù)下降來(lái)解釋，或者3種轉(zhuǎn)錄單位的組合可能更接近地反映出在感染細(xì)胞中觀察到的等摩爾比率的聚合酶亞單位。一般認(rèn)為，相同啟動(dòng)子和終止子單位組合在一種質(zhì)粒上引致重組。但是，本文證實(shí)，8個(gè)RNA聚合酶I或3個(gè)RNA聚合酶II啟動(dòng)子和終止子序列可組合在一個(gè)載體骨架上。Hoffeiann等(2000)表明，RNA聚合酶I和II啟動(dòng)子的組合允許由一個(gè)模板合成vRNA和mRNA。因此，人們可設(shè)計(jì)一種質(zhì)粒，其含有4種用于合成PB2、PB1、PA和NPvRNA和mRNA的RNA聚合酶I/II轉(zhuǎn)錄單位，以及4種用于合成NA、HA、M和NSvRNA的RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄單位。這樣的構(gòu)建物應(yīng)允許由一種質(zhì)粒有效產(chǎn)生流感病毒。而且，對(duì)于其來(lái)說(shuō)，或?qū)τ谄渌嗽O(shè)計(jì)由一種質(zhì)粒同時(shí)表達(dá)幾種蛋白的載體來(lái)說(shuō)，本文描述的在一種質(zhì)粒上組合多個(gè)轉(zhuǎn)錄單位的成功可能提供了鼓勵(lì)。令人驚訝的是，由單種質(zhì)粒pTM-PolI-WSN-All觀察到病毒產(chǎn)生。該質(zhì)粒表達(dá)流感病毒蛋白提示，由在載體中或在RNA聚合酶I啟動(dòng)子或終止子區(qū)中存在的(隱蔽)RNA聚合酶II啟動(dòng)子合成蛋白。為確定RNA聚合酶I啟動(dòng)子序列是否在相反方向具有能潛在地驅(qū)動(dòng)上游轉(zhuǎn)錄盒表達(dá)蛋白的啟動(dòng)子，我們?cè)趫?bào)告基因前克隆了一個(gè)反向的RNA聚合酶I啟動(dòng)子；但是，由該質(zhì)粒未檢測(cè)到可測(cè)量水平的報(bào)告基因表達(dá)(未出示數(shù)據(jù))。流感病毒的產(chǎn)生依賴于4種不同蛋白(PB2、PB1、PA和NP)的表達(dá)，因此應(yīng)需要幾個(gè)通讀事件?；蛘撸鞍妆磉_(dá)可由另一種機(jī)制產(chǎn)生，例如翻譯的內(nèi)部啟動(dòng)。使用改良的pTMl(Moss等，1990)載體，其含fl單鏈DNA復(fù)制起點(diǎn)、氨千青霉素抗性基因、多克隆位點(diǎn)和T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止子。已由該改良形式中去除了存在于原pTMl克隆載體中的強(qiáng)T7RNA聚合酶啟動(dòng)子以及部分EMCV非翻譯區(qū)和胸苦激酶序列。因此預(yù)期由該載體不能對(duì)聚合酶和NP蛋白進(jìn)行蛋白合成。盡管如此，由設(shè)計(jì)用于僅生產(chǎn)負(fù)鏈RNA的質(zhì)粒產(chǎn)生流感病毒是令人感興趣的，值得進(jìn)一步研究?？傊?，在這里，本文描述了一種產(chǎn)生流感病毒的改良系統(tǒng)，其允許在Vero細(xì)胞中容易且可重復(fù)地生產(chǎn)疫苗病毒。在高致病性禽流感病毒爆發(fā)的情況下應(yīng)用該系統(tǒng)可能尤其有優(yōu)勢(shì)。實(shí)施例2為改進(jìn)重組病毒生產(chǎn)，一種方法是將編碼全部8個(gè)病毒基因的cDNA都克隆入質(zhì)粒中。因此，可將用于合成8種病毒RNA的轉(zhuǎn)錄單位組合在一種質(zhì)粒上，而不是由8種質(zhì)粒產(chǎn)生8種病毒RNA;因此，全部8個(gè)病毒RNA都僅由l種質(zhì)粒制備，使得可由較少的質(zhì)粒拯救病毒。同樣，可將用于合成病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄單位組合在較少質(zhì)粒上。如果全部8個(gè)病毒基因都類似地處于1種質(zhì)粒中，則用于合成流感病毒所需要的質(zhì)粒數(shù)是5種(l種質(zhì)粒用于全部病毒基因，4種質(zhì)粒用于編碼PB2、PB1、PA和NP的基因)。或者，人們可將PB2、PB1、PA和NP基因組合入1種質(zhì)粒中，每個(gè)基因均側(cè)接RNA聚合酶II啟動(dòng)子和聚腺苷化信號(hào)。而且，全部病毒基因和PB2、PB1、PA和NP都可組合入1種質(zhì)粒中。其它組合可包括1種具有6個(gè)病毒基因(每個(gè)基因都具有PolI啟動(dòng)子)的質(zhì)粒、1種具有3個(gè)病毒基因(每個(gè)基因都具有PolII啟動(dòng)子)的質(zhì)粒以及1種具有2個(gè)病毒基因(HA和NA)(每個(gè)基因都具有PolI啟動(dòng)子)的質(zhì)粒。病毒基因側(cè)接RNA聚合酶I啟動(dòng)子和終止子序列，以形成轉(zhuǎn)錄單位(或轉(zhuǎn)錄盒)，在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄盒隨后側(cè)接RNA聚合酶II啟動(dòng)子和終止信號(hào)(聚腺苷酸化4言號(hào))(圖4)。該方法既可獲得由RNA聚合酶I合成的基因組負(fù)鏈RNA，又可獲得由RNA聚合酶II從相同基因合成的mRNA。因此，本發(fā)明將用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒數(shù)由12種降低至5種或更少，例如4、3、2或1種，提高了從細(xì)胞系拯救病毒的效率，允許產(chǎn)生嚴(yán)重減毒的病毒，允許使用具有低轉(zhuǎn)染效率的細(xì)胞系(例如Vera細(xì)胞)，允許一致地產(chǎn)生用于疫苗生產(chǎn)的流感病毒，和/或P爭(zhēng)低了有關(guān)質(zhì)粒歷史、純度和毒性的FDA法規(guī)問(wèn)題。參考文獻(xiàn)Albo等，J.Virol"2Q:9013(1996).Avery'sDrugTreatment:PrinciplesandPracticeofClinicalPharmacologyandTherapeutics,第3版，ADISPress,Ltd"Williams和Wilkins,Baltimore,MD(1987).Aymard-Henry等，Virology:A.PracticalApproach.OxfordIRLPress,Oxford,119-150(1985).Bachmeyer,Tntervirology.5:260(1975).Berkow等編輯，TheMerckManual,第16版，Merck&Co.，Rahway，NJ(1992).Brands等，Dev.Biol.Stand..巡:93(1999).Bridgen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Ar21:15400(1996).Bruhl等，Vaccine,12:1149(2000).Claas等，Lancet.21L472(1998).D腿等，Virology,211:133(1995).Edwards,.T.Infect.Dis..169:68(1994).Elliott,Mol.Med..2:572(1997).Enami等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A..￡2:3802(1990).Fodor等，J.Virol"22:9679(1999).Fouchier等，Proc.Natl.Acad.Sci.USAr皿:1356(2004).Gerdil，Vaccine,21:1776(2003).Grand和Skehel，Nature.NewBiology,22^:145(1972).Hagen等，J.Virol..^:1509(1994).Halperin等，Vaccine.20:1240(2002).Hoffinan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，22:6108(2000).Hoffhian等，Proc-Natl.Acad.Sci.IJSA:22:11411(2002).Honda等，J.Biochem.(Tokyo),104:1021(1988).Horimoto等，J.Virol"^:3120(1994).Kilbourne,Bull.M2WorldHealthOrg"化653(1969).Kistner等，Dev.BioLStand"巡:IOI(1999).Kistner等，Vaccine,1^:960(1998).Kistner等，Wein.Klin.Wochenschr.，111:207(1999).Koopmans等，Lancet巡:587(2004).Laver和Webster,Virology.處511(1976).Lawson等，Proc.Natl.Acad.Sci.TLS.A.，22:4477(1995).Leahy等，.T.Virol"21:8347(1997).Leahy等，J.ViroL21:8352(1997).Leahy等，.T.Virol"22:2305(1998).Mizrahi，(編輯)，ViralVaccines,Wiley-Liss,NewYork,39-67(1990).Montagnon等，Dev.Biol.Stand"巡:137(1999).Moss等，Nature,348:91(1990).Murphy,Tnfect.Dis.Clin.Pract"2:174(1993).Muster等，Proc.Natl.Acad.Sci.IJSA，巡5177(1991).Neumann等，Adv.VirusRes"2:265(1999).Neumann等，J.Gen.Virol"￡1:2635(2002).Neumann等，J.Virol..26:406(2002).Neumann等，Proc.Natl.Acad.Sci.IJSA，26:9345(1999).Nicolson等，Vaccine.21:2943(2005).Ogra等，.T.Infect.Dis"134:499(1977).Osol(編輯)，Remington'sPharmaceutical.Sciences,MackPublishingCo.，Easton，PA1324-1341(1980).Ozaki等，.T.ViroL!￡:1851(2004).Palache等，Dev.Biol.Stand"巡:115(1999).Peiris等，Lancet,逛617(2004).PotterinTextbookofInfluenza,編輯，Nicholson,K.G"Webster,R.G.和Hey,A丄;Maiden:BlackwellScientificPublic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利要求1-26中任一項(xiàng)的組合物，其中所述HA是乙型HA。29.制備流感病毒的方法，所述方法包括:使細(xì)胞與權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)的組合物接觸，所述組合物的量有效產(chǎn)生感染性流感病毒。30.制備流感病毒的方法，所述方法包括使細(xì)胞與質(zhì)粒接觸，所述質(zhì)粒包含兩種或更多種vRNA生產(chǎn)用轉(zhuǎn)錄盒，所述轉(zhuǎn)錄盒選自一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PAcDNA的PolI啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB1cDNA的PolI啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2cDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其舍有效連接至流感病毒HAcDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NPcDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NAcDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒McDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；和/或一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NScDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；以及使細(xì)胞與質(zhì)粒接觸，所述質(zhì)粒包含一種或更多種mRNA生產(chǎn)用轉(zhuǎn)錄盒，所述轉(zhuǎn)錄盒選自一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PA的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB1的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；和/或一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NP的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列，其中所述細(xì)胞與8種用于vRNA的轉(zhuǎn)錄盒接觸，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生至少lxl(^TCIDs。/mL的滴度。31.制備流感病毒的方法，所述方法包括使細(xì)胞與質(zhì)粒接觸，所述質(zhì)粒包含vRNA生產(chǎn)用轉(zhuǎn)錄盒，所述轉(zhuǎn)錄盒包括一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PAcDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB1cDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2cDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒HAcDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NPcDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NAcDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒McDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至PolI轉(zhuǎn)錄終止序列；和一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NScDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列，其中所述細(xì)胞與8種用于vRNA的轉(zhuǎn)錄盒接觸，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生至少lxl(^TCID5(/mL的滴度。32.制備流感病毒的方法，所述方法包括使細(xì)胞與兩種質(zhì)粒接觸，其中所述兩種質(zhì)粒一起包含一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PAcDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB1cDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2cDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒HAcDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NPcDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NAcDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒McDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；和一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NScDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列，其中所述細(xì)胞與8種用于vRNA的轉(zhuǎn)錄盒接觸，其中所迷細(xì)胞產(chǎn)生至少lxl02TCIDs(/mL的滴度。33.權(quán)利要求30-32中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是高度可轉(zhuǎn)染細(xì)胞。34.權(quán)利要求30-32中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是Vero細(xì)胞。35.權(quán)利要求30-34中任一項(xiàng)的方法，其中所述HA是曱型HA。36.權(quán)利要求30_34中任一項(xiàng)的方法，其中所述HA是乙型HA。37.權(quán)利要求30-36中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括分離所述病毒。38.權(quán)利要求30-37中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包含一種轉(zhuǎn)錄盒，所述轉(zhuǎn)錄盒包含連接至5'流感病毒序列的啟動(dòng)子，所述5'流感病毒序列包含連接至目標(biāo)DNA的5'流感病毒非編碼序列，所述目標(biāo)DNA連接至3'流感病毒序列，所述3'流感病毒序列包含連接至轉(zhuǎn)錄終止序列的3'流感病毒非編碼序列。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述目標(biāo)DNA為正義方向。40.權(quán)利要求38的方法，其中所述目標(biāo)DNA為負(fù)義方向。41.權(quán)利要求38的方法，其中所述目標(biāo)DNA包含編碼病原體的免疫原性多肽或肽或者治療性多肽或肽的可讀框。42.權(quán)利要求30-36和38-41中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括分離所述病毒。43.細(xì)胞，所述細(xì)胞已與權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)的組合物接觸。44.流感病毒生產(chǎn)用質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PAcDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB1cDNA的PolI啟動(dòng)子，所述cDNA連才妄至PolI轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2cDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至PolI轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒HAcDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NPcDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NAcDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒McDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；和一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NScDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列，其中用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生至少lx102TCID5Q/mL的滴度。45.vRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PAcDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PBlcDNA的PolI啟動(dòng)子，所述cDNA連接至PolI轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒PB2cDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至PolI轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NPcDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒McDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；和/或一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NScDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列，其中用所述質(zhì)粒以及用于HA和NA的vRNA生產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄盒轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生至少1x102TCID50/mL的滴度。46.vRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒HAcDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；和一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NAcDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列，其中用所述質(zhì)粒以及用于PA、PB1、PB2、NP、M和NS的vRNA生產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄盒轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生至少lxl(^TCIDVmL的滴度。47.mRNA生產(chǎn)用質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含一種轉(zhuǎn)錄盒，其包含有效連接至流感病毒PA的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其包含有效連接至流感病毒PBl的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其包含有效連接至流感病毒PB2的DNA編碼區(qū)的PolII啟動(dòng)子，所述DNA編碼區(qū)連接至PolII轉(zhuǎn)錄終止序列，其中所述質(zhì)粒不編石馬NP。48.流感病毒生產(chǎn)用質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒HAcDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NAcDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒McDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有效連接至流感病毒NScDNA的Poll啟動(dòng)子，所述cDNA連接至Poll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PA的DNA節(jié)段的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒PB1的DNA節(jié)段的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和？olll轉(zhuǎn)錄終止序列；一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至編碼流感病毒PB2的DNA節(jié)段的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列；和一種轉(zhuǎn)錄盒，其含有各自均有效連接至流感病毒NP的DNA節(jié)段的Poll啟動(dòng)子和Poll轉(zhuǎn)錄終止序列以及PolII啟動(dòng)子和PolII轉(zhuǎn)錄終止序列。'49.制備流感病毒的方法，所述方法包括使細(xì)胞與權(quán)利要求44或48的質(zhì)粒接觸，所述質(zhì)粒的量有效產(chǎn)生感染性流感病毒。全文摘要本發(fā)明提供一種用于例如在沒(méi)有輔助病毒的情況下使用含串聯(lián)轉(zhuǎn)錄盒的載體制備流感病毒的組合物，其中所述串聯(lián)轉(zhuǎn)錄盒包含PolI和/或PolII啟動(dòng)子。文檔編號(hào)A61K39/145GK101103103SQ200580046922公開(kāi)日2008年1月9日申請(qǐng)日期2005年11月18日優(yōu)先權(quán)日2004年11月19日發(fā)明者加布里埃萊·諾伊曼,川岡義弘申請(qǐng)人:威斯康星舊生研究基金會(huì)