專利名稱：雞痘病毒表達(dá)載體p12－18及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種有利于提高重組雞痘病毒抵抗母源抗體干擾能力的雞痘病毒表達(dá)載體，尤其是載體中的復(fù)制非必需區(qū)，從而提供一種能夠提高重組FPV疫苗抵抗母源抗體干擾能力的方法。
背景技術(shù)：
雞痘病毒(Fowlpox Virus，F(xiàn)PV)是繼痘苗病毒VV之后的一種具有獨(dú)特優(yōu)越性和廣闊應(yīng)用前景的表達(dá)載體，是當(dāng)今分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。禽痘病毒屬痘病毒科，禽痘病毒屬，雞痘病毒是其代表種。FPV做為表達(dá)載體有其獨(dú)特的優(yōu)越性。其基因組龐大，長度約為VV的1.5倍，含較多的復(fù)制非必需區(qū)，可構(gòu)建FPV多價(jià)和多聯(lián)疫苗；FPV具有自身的酶系統(tǒng)和調(diào)控信號(hào)，其轉(zhuǎn)錄、翻譯和裝配均發(fā)生在胞漿中，可對(duì)外源基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行翻譯后加工、修飾，保留其相應(yīng)的生物學(xué)活性，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫；與VV相比，F(xiàn)PV的宿主范圍較窄，僅感染禽類，不易散毒，對(duì)哺乳動(dòng)物和人類無潛在的威脅；重組病毒的構(gòu)建方法相對(duì)簡單；表達(dá)水平較高；便于對(duì)重組雞痘病毒免疫雞群和自然感染雞群進(jìn)行鑒別。
近十幾年來，F(xiàn)PV載體疫苗的研究已取得了巨大進(jìn)展，有多種病原體的保護(hù)性抗原基因在FPV中得以成功表達(dá)，如MDV的gB/pp38基因、NDV的F和HN基因、IBDV的VP2/VP2-3-4基因、AIV的HA/NA/NP基因、IBV的S1基因、ALV的env基因、REV的env基因等，并在SPF雞上有很高甚至100％的保護(hù)率。但迄今為止，重組FPV活載體疫苗在國內(nèi)外尚未獲得廣泛應(yīng)用。究其原因，主要是重組FPV疫苗的免疫效力在很大程度上受到商品雞所攜帶的母源抗體的干擾，這無疑給疫苗，尤其弱毒苗和活載體疫苗的早期應(yīng)用和疫情監(jiān)測帶來很大的困難。許多研究已經(jīng)證明，針對(duì)外源蛋白的母源抗體會(huì)干擾重組FPV的免疫效力，而且母源抗體越高干擾越大。
雞痘病毒(Fowlpox Virus，F(xiàn)PV)基因組龐大，長約300kb，包括約260個(gè)ORF，存在大量的復(fù)制非必需區(qū)可以做為外源基因的插入位點(diǎn)。構(gòu)建重組FPV表達(dá)載體的第一步是要選擇病毒的復(fù)制非必需區(qū)(Nonessential Region，NER)。然而，現(xiàn)已證實(shí)，某些復(fù)制非必需區(qū)并不是嚴(yán)格的復(fù)制非必需區(qū)，因?yàn)槟承┗螂m然是病毒在體外復(fù)制非必需的，但它們可能與病毒毒力、病毒免疫逃避或宿主范圍相關(guān)，若被缺失或因插入外源基因而失活，可能導(dǎo)致病毒在體內(nèi)的復(fù)制能力或免疫逃避能力下降，使重組FPV無法在宿主體內(nèi)發(fā)揮持久而有效的免疫效力。經(jīng)試驗(yàn)，復(fù)制非必需區(qū)FPV7S為外源基因插入位點(diǎn)構(gòu)建了表達(dá)多種不同病原保護(hù)性抗原基因的重組FPV，在SPF雞上均能提供100％的保護(hù)，但在有母源抗體的商品雞上免疫效果欠佳，保護(hù)率低于50％。將FPV7S兩個(gè)側(cè)翼區(qū)的序列與Afsono等發(fā)表的美國致病株基因組的相應(yīng)序列(AF198100)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該DNA片段共跨越FPV基因組的6個(gè)連續(xù)的編碼框(ORF072-ORF077)，目的基因的插入位點(diǎn)位于ORF073內(nèi)部。ORF073主要編碼IL-18結(jié)合蛋白的類似物，IL-18bp能夠抑制IL-18依賴性的IFN-γ的產(chǎn)生，是一種免疫調(diào)節(jié)因子。它既不是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，也不是病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的酶類，揭示了FPV7S適合作為轉(zhuǎn)移載體復(fù)制非必需區(qū)的分子基礎(chǔ)。但ORF073的破壞可能是影響以FPV7S為外源基因插入位點(diǎn)的重組FPV在有母源抗體商品雞上免疫效力的主要原因。因此，有必要篩選適當(dāng)?shù)膹?fù)制非必需區(qū)作為外源基因的插入位點(diǎn)，這可能是克服重組FPV母源抗體干擾的一個(gè)有效策略?？朔冈纯贵w干擾是重組FPV疫苗研究領(lǐng)域亟待解決的一個(gè)難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于設(shè)計(jì)一種有利于克服母源抗體干擾的雞痘病毒表達(dá)載體p12-18。
本發(fā)明雞痘病毒表達(dá)載體p12-18于2005年6月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC NO1385，其長度為10450bp，該載體以雞痘病毒復(fù)制非必需區(qū)FPV12-18為外源基因插入位點(diǎn)，是一個(gè)含有雞痘病毒復(fù)制非必需區(qū)側(cè)翼區(qū)FPV1和FPV2的表達(dá)載體，F(xiàn)PV1的核苷酸長度為1863bp，F(xiàn)PV2的核苷酸長度為1554bp，F(xiàn)PV1和FPV2的DNA序列分別為FPV1gtttctaaga tcatcatgtc ctacaatttt atttctttga cgtcgtgttt atatcatttt 60ctgttttggg ataataattt tctctaatat aaaattatat attaattctt tttctatatt 120gaagtgattt aattaaagaa aatatgtaat ctttatctaa ttaggttttt ccttatctaa 180
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本發(fā)明另一目的在于設(shè)計(jì)一種能夠提高重組雞痘疫苗抵抗母源抗體干擾能力的雞痘病毒表達(dá)載體p12-18的方法。
本發(fā)明包括以下步驟(1)定向克隆法篩選雞痘病毒的新復(fù)制非必需區(qū)根據(jù)已發(fā)表的雞痘病毒的基因組全序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物P1 5’-CGTAAGACTTATCCATACCGAG-3’P2 5’-GTTTCTAAGATCATCATGTCCTAC-3’P3 5’-CTGTAGTAGTTACTACATACGCAG-3’P4 5’-AACAGAAATAGCTCCTCTCATAC-3’P1位于ORF077的內(nèi)部，P2和P3均位于ORF073與ORF074兩個(gè)ORF之間的間隔區(qū)，P4位于ORF071的內(nèi)部。P1和P2跨幅約為1880bp，即FPV1，P3和P4跨幅約為1570bp，即FPV2。
用PCR方法分別擴(kuò)增雞痘病毒復(fù)制非必需區(qū)FPV12-18的兩個(gè)側(cè)翼區(qū)FPV1和FPV2。
(2)利用分子克隆技術(shù)將復(fù)制非必需區(qū)FPV12-18的兩個(gè)側(cè)翼區(qū)FPV1和FPV2、標(biāo)記基因表達(dá)框P11-LacZ先后克隆入載體pBluescript SK(-)(以下簡稱pSK)，所得載體pP12與282E4株FPV共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染試劑為FuGENETM6 Transfection Reagent(轉(zhuǎn)染及重組病毒的篩選純化按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行)，重組病毒的篩選標(biāo)記基因?yàn)榇竽c桿菌的β-半乳糖苷酶LacZ基因，經(jīng)藍(lán)斑篩選得到純化的重組病毒載體pP12。
(3)構(gòu)建雞痘病毒表達(dá)載體p12-18將外源基因的啟動(dòng)子Ps插入步驟(2)中構(gòu)建的載體pP12，獲得一個(gè)雞痘病毒FPV表達(dá)載體p12-18。
本發(fā)明從篩選適當(dāng)FPV復(fù)制非必需區(qū)作為外源基因插入位點(diǎn)的角度來克服母源抗體干擾，成功地提高了重組FPV抵抗母源抗體干擾的能力。
上述步驟(3)中，將pN11S用Hind III+Sma I進(jìn)行雙酶切，37℃消化2h后，電泳并回收約200bp的含MCS的Ps啟動(dòng)子，與同時(shí)用Hind III+SmaI雙酶切的載體pP12連接構(gòu)建雞痘病毒表達(dá)載體p12-18。


圖1為載體pP12的構(gòu)建過程。
圖2為通用表達(dá)載體p12-18的構(gòu)建過程圖。
圖3為表達(dá)新城疫病毒F基因的轉(zhuǎn)移載體p1218NDF的構(gòu)建圖。
圖4顯示感染重組FPV的CEF中F基因表達(dá)產(chǎn)物的間接免疫熒光鑒定。
圖5顯示4株重組FPV在不同齡商品雞上的4次免疫效力試驗(yàn)的保護(hù)率。
具體實(shí)施例方式
1、定向克隆法篩選雞痘病毒的新復(fù)制非必需區(qū)FPV12-18病毒的增殖及基因組的提取按常規(guī)方法取9-10日齡的SPF雞胚，制成CEF單層。接種282E4株FPV，在5％CO2，37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待病變達(dá)80％以上棄去原培養(yǎng)基，細(xì)胞用PBS洗兩遍后，加入適量PBS，用吸管將細(xì)胞吹下。低速離心棄上清，用少量PBS(50ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶用200μl)懸浮。提取方法參照High Pure PCRTemplate Preparation Kit說明書進(jìn)行1.5ml的Eppendorf管中依次加入上述200μl樣品、200μl Binding Buffer和40μl Proteinase K，混勻；72℃作用10min后，加入100μl異丙醇；將上述混合物混勻后加入特定的離心管，8000rpm離心1min，棄濾液；然后加入500μl Washing Buffer，離心，洗滌兩遍；13000rpm離心10s，去除殘余的液體；加入200μl Elution Buffer(70℃預(yù)熱)，8000rpm1min離心至干凈的Eppendorf管中，所得即為282E4株FPV基因組DNA。
PCR擴(kuò)增FPV復(fù)制非必需區(qū)FPV12-18的側(cè)翼區(qū)FPV1和FPV2根據(jù)已發(fā)表的美國致病株雞痘病毒FPV的基因組全序列(AF198100)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，引物表達(dá)式P1 5’-CGTAAGACTTATCCATACCGAG-3’P2 5’-GTTTCTAAGATCATCATGTCCTAC-3’P3 5’-CTGTAGTAGTTACTACATACGCAG-3’P4 5’-AACAGAAATAGCTCCTCTCATAC-3’P1位于ORF077的內(nèi)部，P2和P3均位于ORF073與ORF074兩個(gè)ORF之間的間隔區(qū)，P4位于ORF071的內(nèi)部。P1和P2跨幅約為1880bp，即FPV1，P3和P4跨幅約為1570bp，即FPV2。
兩對(duì)引物分別用于擴(kuò)增雞痘病毒FPV復(fù)制非必需區(qū)各自的兩個(gè)側(cè)翼區(qū)(FPV1和FPV2)。引物中加入了便于克隆操作的限制性酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基。以282E4株FPV的基因組DNA為模板，用高保真PCR系統(tǒng)(ExpandHigh Fidelity PCR System)擴(kuò)增FPV復(fù)制非必需區(qū)側(cè)翼區(qū)FPV1和FPV2并進(jìn)行序列測定。
經(jīng)測定，F(xiàn)PV1的核苷酸長度為1863bp，DNA序列(不含引物中附加的酶切位點(diǎn))為gtttctaaga tcatcatgtc ctacaatttt atttctttga cgtcgtgttt atatcatttt 60ctgttttggg ataataattt tctctaatat aaaattatat attaattctt tttctatatt 120gaagtgattt aattaaagaa aatatgtaat ctttatctaa ttaggttttt ccttatctaa 180taatagaact gtatacctgg tgatcttcct acttgattta cgtgacctaa tataattatt 240tagatattta cctgtttttc gcataaatat aattcctaaa aatattatta ttaagatatt 300aatatctatt atccatgata atatatagag aaacattata ttaatcgcca atcgaatatg 360aataacatac atagtaataa taaagatagc agttaatggc aaactaatat tattcatgat 420aactgctata aaagaagata atatagcaag atatattgaa gtgtctatca tatcttattt 480tatggataaa cctttaacgg caacttctaa gttacttatt ttttggttta ttaaactatt 540ggttttttcg tacttttctt ccaatttttt tgtatttttc tttaatttta atatctcatt 600atcatgaatg tcgtatagta ttttacttat accctcagag aagaagccgc ttcgtatctg 660atcttcatta tcagaacctt ttttaagcct cgtgcaatag gagttagaaa gataggagtt 720aagtatcttg gaaaaattaa gtgcaatact aggaaaaacc caacagataa tatgaggcac 780gagatcgata tgcacatatg ttcctacaag ttcgtattta taggcactat ttgatgctaa 840tccgatttct aaaacggctt tattatagat accgttttta tagttcaatg tttttatgag 900ttttttagat gactctagtc tacaccactg cctaaagttc ttatttccaa gatcacatat 960tttagtagca tttatatatc cgttgtattt taacatgatt acttctatgt tcgcatagtt 1020gataaagcaa aagttctcat ctatatgttt aacggtgtta ggtacaaact ccatattgta 1080atactttcat tcagaatagt attgttttta cattttttat tataaggaaa aaactggttt 1140attcattttc ttttaaccat gcatacacaa tttacaggaa ctgatacatg tttagtcatt 1200acagcattat tttcaccaag atacattatt tttttaattt ctgtgaccgt agaacagtaa 1260gattcccatc ttgactcatc aatgccctta caaggagatg tagaattagg gaatcccatg 1320cagctaatca tttgaatgta ttgtgtgtat ccatctcctt tctcagaata tctgcccaaa 1380gattctattt tactgacacc agttccatta acagggctta cttctctaat atctacccat 1440gtagttacta attcacaagc gggttcgtat aaataaacag tagtattatc attactagat 1500gtctgggtat cgtataatac agctgcatga tagtactgaa aacatgttag taacacaagt 1560atatgtgtaa cgtacataat agaaaaaagt ataatttatg ccttattttt acattatagt 1620taaaaccata aaactatctt aattacaaat aaaatactat gtagttacat tatttttgat 1680cgcattaaat gaaaggaact attatattgt ttggtaaacc aaattgcccg ttatgtaaat 1740tttcaaacga aatactttcg aataaaaaga tagctagtaa atatgaaatc gttagaataa 1800atatagctac attcttcgat aaatcaaagg tcgtagaaat actcggtatg gataagtctt 1860acg
FPV2核苷酸長度為1554bp，DNA序列(不含引物中附加的酶切位點(diǎn))序列為agaacagaaa tagctcctct catacccgta ctaaaattct ctaaaaatct gactggtttt 60ttttctaaag atactctagt ccctccagat gtgactaaag ctacacgcct gtttttctct 120ttttgtaatt ttacccaatt attaatgtta gtagtcgtgt ccattttttt aatataagaa 180tttatattag tttaatttat aagaaaccaa tactttaaat ctataattcg ttgttctaaa 240caacagttat ggtttcttaa attgttgatt catgataata ttatcgtaat aattctatta 300ttgaaatatc tagtctcgtt tttgagataa atattacgaa taaagcatat tcatatcaaa 360gcaacattag ctttacattt aagttgtact acgcatacgc acgaagtacc tattcttata 420tattcccagg aaggcattcc atttttaata actatagagt taacaaaaga atgagacgta 480gaacaataag aggaccaaaa tcgtgtatct attcctaaac agccactaat agccggatgc 540tccttacact tggtttcgaa taggtactga tagtaaactt gtttattatg tactatttga 600tccaatagtt ctagtttatt acctctgtga tcaaagactg tagttttgtt agcgacccat 660gtagaactac tttcacaaga taagtatatt ccttcactgg tattacctac agacaataat 720tcatctatgc ttcgtttacc acgatgttct atattcggag tacgagtact aaaaacaact 780ttagatgtat ctaatttatc gtttataaga taaggattag taaattggag taacgatccc 840ttgcatacta tacctaatac acatataaag attagccttc taaaattaca ggggtgcgta 900tggtatgcca ttcttattta tatatgaact tactaattaa gtaatagaat atgtctcagt 960aataattgac ggtacactgt agtatttgat tccactagta aacacataaa ttccttacca 1020ttatgtttat tatccactaa tagttctcta ataaaaaatg tagagttttg taacggaatt 1080gttacaggac ttttatgaat taccgattcc atttcgctaa tgggtttacc accgggaccg 1140gcccaaaaca ttctcgctga cgaacctttc ctaccacacc ctacacatat taagctagta 1200gtatttatat cttcaggcag tctagtaata ttaacgtagg tacaatcttc gcgtgttaca 1260ggacagcatt ctcgcacacc gtcggaattt tttcttgcgt tttccggaag atatccttct 1320aggtctagaa aaatagtttc gtcactatca tcttcctcat aactaactgt actgtaatct 1380ccttcatcgc catagtctat cggattcaag agtacgggta ttatcaaaca tagaataaaa 1440atagttctat acatcatgtt aatttagata tttcttctgg acacgatatc tatcctacta 1500agtatgtatg gtatttattt atcaattaat ctgcgtatgt agtaactact acag2、構(gòu)建載體pP12如圖1所示(1)用Hind III+Xho I雙酶切克隆載體pSK和上述回收的FPV2片段，37℃消化2h以后，電泳并回收約3.0kb的載體片段和約1.57kb的FPV2。然后按一定比例進(jìn)行連接成pSKP2，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑取白色菌落提質(zhì)粒并以Hind III+Xho I雙酶切(20μl體系)，37℃消化1.5h以后，加4μl6×Loading buffer，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。陽性質(zhì)粒命名為pSKP2。
(2)將pSKP2和FPV1分別用BamH I+Sac I、Bgl II+Sac I進(jìn)行雙酶切，37℃消化2h后，電泳并回收約4.57kb的載體片段和約1.88kb的FPV1片段，按一定比例連接形成pSKP1P2，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α，然后挑取白色菌落提質(zhì)粒并用Hind III+Sac I雙酶切(20μl體系)，加4μl 6×Loading buffer，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，陽性質(zhì)粒命名為pSKP1P2。pSKP1P2分別以Hind III+XhoI和Hind III+Sac I雙酶切后電泳，可見預(yù)期目的條帶FPV2和FPV1，條帶大小分別約為1.57kb和1.93kb(其中包括約50bp的酶切位點(diǎn))，表明FPV1和FPV2已成功插入載體。
(3)將pSKP1P2和pFG1175-1分別用Nhe I、Xba I進(jìn)行單酶切，37℃消化2h后，電泳并回收約6.45kb的載體片段和約3.80kb的P11-LacZ標(biāo)記基因表達(dá)框，按一定比例連接構(gòu)成pP12L，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α，然后挑取藍(lán)色菌落提質(zhì)粒并用Sac I進(jìn)行酶切(20μl體系)，37℃消化1.5h后，加4μl6×Loading buffer，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。篩選P11-LacZ標(biāo)記基因表達(dá)框正向插入的陽性質(zhì)粒，陽性質(zhì)粒命名為pP12。
3、FPV復(fù)制非必需區(qū)的篩選將純化的載體質(zhì)粒pP12與282E4株FPV共轉(zhuǎn)染CEF，轉(zhuǎn)染試劑為FuGENETM6 Transfection Reagent，轉(zhuǎn)染及重組病毒的篩選純化按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。在35mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)CEF，使形成60％的單層后以0.1MOI的282E4株FPV感染，37℃吸附2小時(shí)后傾去上清培養(yǎng)基，加1ml含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基；將1μg載體質(zhì)粒pP12溶解于50μl的無血清DMEM培養(yǎng)基；取5μl轉(zhuǎn)染試劑FuGENETM6緩慢加入到100μl無血清DMEM培養(yǎng)基中，兩者混勻置室溫作用15min，然后緩緩滴加至上述CEF中，邊滴邊混勻，置37℃培養(yǎng)3小時(shí)后補(bǔ)加1ml含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基；12h后更換為含1％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置37℃繼續(xù)培養(yǎng)；CEF產(chǎn)生80％病變后收獲病毒，反復(fù)凍融3次，低速離心去除細(xì)胞碎片，上清用于重組病毒的篩選和純化。將上清稀釋液接種60mm平皿上長成致密單層的CEF，37℃培養(yǎng)約72h，待出現(xiàn)較多病毒蝕斑后，用含有200μg/ml X-gal的營養(yǎng)瓊脂覆蓋，待出現(xiàn)藍(lán)色蝕斑后挑取藍(lán)色蝕斑，見圖3，用吸管將其吸出，轉(zhuǎn)入0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)維持液中，凍融3次，低速離心去除細(xì)胞與瓊脂碎片，取上清感染次代細(xì)胞。在60mm平皿中重復(fù)進(jìn)行以上步驟后，于96孔板上篩選數(shù)次，直至在X-gal存在的條件下，重組病毒在CEF上所形成的蝕斑全部呈藍(lán)色。即可得到純化的重組病毒。重組病毒rFPV-1218NDF的獲得表明，預(yù)先假定的復(fù)制非必需區(qū)均為真正的FPV復(fù)制非必需區(qū)，命名為FPV12-18。
4、復(fù)制非必需區(qū)的遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)重組雞痘病毒接種CEF，在5％CO2，37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2-3天后待病變達(dá)80％以上后收獲，反復(fù)凍融3次，用于下次擴(kuò)增，連續(xù)傳10代。空斑計(jì)數(shù)后保存于-70℃冰箱備用。分別取重組病毒的0、5、10代以10-3、10-4、10-5、10-6稀釋，接種生長在24孔板上單層次代CEF，100μl/孔。待出現(xiàn)單個(gè)蝕斑后，覆蓋含200μg/ml X-gal的瓊脂，37℃，CO2箱中培養(yǎng)1-2天觀察蝕斑純度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有病毒蝕斑均呈藍(lán)色。
用PBS吹下擴(kuò)增的三個(gè)代次重組雞痘病毒的單層細(xì)胞，以High Pure PCRTemplate Preparation Kit(寶靈曼公司)提取核酸模板DNA。按常規(guī)方法針對(duì)LacZ基因部分片段進(jìn)行PCR并測序，檢測外源基因在重組FPV傳代過程中是否發(fā)生變異，結(jié)果序列沒有發(fā)生任何變異。
以上試驗(yàn)表明，重組病毒基因組中的LacZ基因能夠穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，同時(shí)也證明了篩選的FPV復(fù)制非必需區(qū)FPV12-18具有良好的遺傳穩(wěn)定性。
5、雞痘病毒表達(dá)載體p12-18的構(gòu)建如圖2所示，將pN11S用Hind III+Sma I進(jìn)行雙酶切，37℃消化2h后，電泳并回收約200bp的含MCS的Ps啟動(dòng)子，與同時(shí)用Hind III+Sma I雙酶切的載體pP12按一定比例連接構(gòu)建雞痘病毒表達(dá)載體p12-18，將該載體轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α，然后挑取藍(lán)色菌落提質(zhì)粒，并用Hind III+Sma I雙酶切(20μl體系)，加4μl 6×Loading buffer，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，陽性質(zhì)粒分別命名為p12-18。
經(jīng)檢測，其長度為10450bp，該載體以雞痘病毒復(fù)制非必需區(qū)FPV12-18為外源基因插入位點(diǎn)，是一個(gè)含有雞痘病毒復(fù)制非必需區(qū)側(cè)翼區(qū)FPV1和FPV2的表達(dá)載體。
6、以FPV12-18為外源基因插入位點(diǎn)，表達(dá)新城疫病毒F基因的轉(zhuǎn)移載體p1218NDF的構(gòu)建如圖3所示，質(zhì)粒pTF用Bgl II+Sal I雙酶切，回收約1.7kb的ZJ1株NDV的F基因片段，與經(jīng)BamH I+Sal I雙酶切的表達(dá)載體p12-18進(jìn)行連接構(gòu)建載體P1218NDF。
轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α，然后挑取藍(lán)色菌落提質(zhì)粒，并用Hind III酶切(20μl體系)，加4μl 6×Loading buffer，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，陽性質(zhì)粒可見約1.9kb的條帶。用堿裂解法制備轉(zhuǎn)移載體的質(zhì)粒DNA并以PEG純化質(zhì)粒DNA。
7、構(gòu)建新城疫病毒F基因的重組雞痘病毒rFPV-1218NDF將轉(zhuǎn)移載體P1218NDF與282E4株FPV共轉(zhuǎn)染CEF，轉(zhuǎn)染和篩選具體方法在35mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)CEF，使形成60％的單層后以0.1MOI的282E4株FPV感染，37℃吸附2小時(shí)后傾去上清培養(yǎng)基，加1ml含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基；將1μg轉(zhuǎn)移載體P1218NDF溶解于50μl的無血清DMEM培養(yǎng)基；取5μl轉(zhuǎn)染試劑FuGENETM6緩慢加入到100μl無血清DMEM培養(yǎng)基中，兩者混勻置室溫作用15min，然后緩緩滴加至上述CEF中，邊滴邊混勻，置37℃培養(yǎng)3小時(shí)后補(bǔ)加1ml含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基；12h后更換為含1％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置37℃繼續(xù)培養(yǎng)；CEF產(chǎn)生80％病變后收獲病毒，反復(fù)凍融3次，低速離心去除細(xì)胞碎片，上清用于重組病毒的篩選和純化。將上清稀釋液接種60mm平皿上長成致密單層的CEF，37℃培養(yǎng)約72h，待出現(xiàn)較多病毒蝕斑后，用含有200μg/ml X-gal的營養(yǎng)瓊脂覆蓋，待出現(xiàn)藍(lán)色蝕斑后挑取藍(lán)色蝕斑，用吸管將其吸出，轉(zhuǎn)入0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)維持液中，凍融3次，低速離心去除細(xì)胞與瓊脂碎片，取上清感染次代細(xì)胞。在60mm平皿中重復(fù)進(jìn)行以上步驟后，于96孔板上篩選數(shù)次，直至在X-gal存在的條件下，重組病毒在CEF上所形成的蝕斑全部呈藍(lán)色。即可得到282E4株重組病毒rFPV-1218NDF。感染rFPV-1218NDF和陽性對(duì)照rFPV-F或rFPV-HN的CEF胞漿和胞膜區(qū)呈特異性黃綠色熒光，而感染陰性對(duì)照親本282E4株FPV的CEF則未呈現(xiàn)特異性熒光著色，表明重組雞痘病毒中的F基因已獲得表達(dá)。重組雞痘病毒rFPV-1218NDF及其陽性對(duì)照rFPV-F、陰性對(duì)照FPV282的熒光照片見圖4。圖4中，A圖為感染rFPV-1218NDF的CEF；B圖為感染rFPV-F的CEF；C圖為感染野生型282E4株FPV的CEF。
重組病毒的0、5、10代接種24孔板上的單層次代CEF，待出現(xiàn)單個(gè)蝕斑后，覆蓋含200μg/ml X-gal的瓊脂，發(fā)現(xiàn)所有病毒蝕斑均呈藍(lán)色。而間接免疫熒光試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所有病毒蝕斑均呈現(xiàn)特異性熒光，陰性對(duì)照組無特異性熒光。對(duì)5、10代重組病毒中的F基因進(jìn)行PCR，結(jié)果均可以擴(kuò)增出1.7Kb的目的條帶，與預(yù)期值相符。測序結(jié)果顯示，所測序列沒有發(fā)生任何變異。以上試驗(yàn)表明，重組病毒基因組中的F基因均能夠穩(wěn)定地遺傳和表達(dá)。
8、新構(gòu)建的重組雞痘病毒rFPV-1218NDF與原有的以FPV7S為外源基因插入位點(diǎn)的重組雞痘病毒rFPV-N11SF在有母源抗體商品雞上的免疫效力比較試驗(yàn)重組病毒rFPV-N11SF與重組病毒rFPV-1218NDF之間僅存在FPV復(fù)制非必需區(qū)的差異，復(fù)制非必需區(qū)分別為FPV7S和FPV12-18。為了探討以不同復(fù)制非必需區(qū)為外源基因插入位點(diǎn)對(duì)重組FPV抵抗母源抗體能力的影響，將它們分別在5、10、15和25日齡的存在不同水平母源抗體的商品雞上進(jìn)行免疫效力試驗(yàn)。
將1日齡商品蛋雞隨機(jī)分組，25-26只/組，進(jìn)行隔離飼養(yǎng)。1日齡ND的HI抗體效價(jià)平均約為28。分別于5、10、15、25日齡頸部皮下接種rFPV-N11SF、rFPV-1218NDF和野生型雞痘病毒FPV282，105PFU/只，同時(shí)設(shè)ND油苗對(duì)照組，0.2ml/只。免疫后28d進(jìn)行滴鼻攻毒，每只試驗(yàn)雞接種105ELD50的F48E8株NDV強(qiáng)毒。觀察14d，記錄發(fā)病死亡情況。
5日齡商品雞商品雞5日齡時(shí)的ND母源抗體相當(dāng)高，平均HI效價(jià)為2(6.0±0.4)。由表1可見，F(xiàn)PV復(fù)制非必需區(qū)不同的重組病毒的免疫保護(hù)率之間存在很大的差異，分別為50.0％和75.0％；ND油苗的保護(hù)率為100％。rFPV-N11SF組組與ND油苗組的保護(hù)率之間存在顯著差異，而rFPV-1218NDF組與ND油苗組的保護(hù)率之間無顯著差異。
表1 重組FPV在5日齡商品雞上的免痘效力試驗(yàn)結(jié)果

ND HI效價(jià)＝平均HI效價(jià)(log2X)±標(biāo)準(zhǔn)差；a、b有顯著差異(P＜0.05)；免疫保護(hù)率＝(攻毒對(duì)照組死亡率-疫苗免疫組死亡率)/攻毒對(duì)照組死亡率×100％
10日齡商品雞商品雞10日齡時(shí)ND母源抗體的平均HI效價(jià)為2(5.0±0.6)。由表2可見，F(xiàn)PV復(fù)制非必需區(qū)不同的重組病毒的免疫保護(hù)率之間也存在很大的差異，分別為50.0％和70.8％，ND油苗的保護(hù)率為83.3％。rFPV-N11SF組與ND油苗組的保護(hù)率之間存在顯著差異，而rFPV-1218NDF組與ND油苗組的保護(hù)率之間無顯著差異。
表2 重組FPV在10日齡商品雞上的免疫效力試驗(yàn)結(jié)果

ND HI效價(jià)＝平均HI效價(jià)(log2X)±標(biāo)準(zhǔn)差；a、b有顯著差異(P＜0.05)；免疫保護(hù)率＝(攻毒對(duì)照組死亡率-疫苗免疫組死亡率)/攻毒對(duì)照組死亡率×100％15日齡商品雞商品雞15日齡時(shí)ND母源抗體的平均HI效價(jià)為2(4.0±0.4)。由表3可見，rFPV-N11SF和rFPV-1218NDF組的保護(hù)率均較各自5、10日齡免疫的保護(hù)率均有一定的提高，其中rFPV-1218NDF組的保護(hù)率達(dá)到了90％以上，比rFPV-N11SF組略高；重組FPV組和ND油苗組的保護(hù)率之間沒有顯著差異。
表3 重組FPV在15日齡商品雞上的免疫效力試驗(yàn)結(jié)果

ND HI效價(jià)＝平均HI效價(jià)(log2X)±標(biāo)準(zhǔn)差免疫保護(hù)率＝(攻毒對(duì)照組死亡率-疫苗免疫組死亡率)/攻毒對(duì)照組死亡率×100％25日齡商品雞商品雞25日齡時(shí)ND的母源抗體已經(jīng)很低，平均HI效價(jià)下降到2(2.0±0.4)。由表4可見，重組FPV組較其5和15日齡免疫的保護(hù)率明顯上升，rFPV-N11SF組為88％，rFPV-1218NDF組則與油苗組一樣達(dá)到100％，各免疫組之間差異不大。
表4 重組FPV在25日齡商品雞上的免疫效力試驗(yàn)結(jié)果

ND HI效價(jià)＝平均H1效價(jià)(log2X)±標(biāo)準(zhǔn)差免疫保護(hù)率＝(攻毒對(duì)照組死亡率-疫苗免疫組死亡率)/攻毒對(duì)照組死亡率×100％綜上所述，商品雞上普遍存在的母源抗體對(duì)重組FPV的免疫效力存在很大的影響；在5、10、15、25日齡的帶有不同水平母源抗體的商品雞上，以復(fù)制非必需區(qū)FPV12-18為外源基因插入位點(diǎn)的rFPV-1218NDF和以復(fù)制非必需區(qū)FPV7S為插入位點(diǎn)的rFPV-N11SF在免疫效力方面存在很大的差異。rFPV-1218NDF組較rFPV-N11SF組的保護(hù)率高，表明復(fù)制非必需區(qū)FPV12-18比FPV7S更適合于做外源基因的插入位點(diǎn)，從而能夠使重組FPV更好地抵抗母源抗體的干擾，提高重組FPV的免疫效力。但這種差異不顯著，可能與樣本數(shù)太小有關(guān)。因此，將以FPV12-18為外源基因插入位點(diǎn)的重組病毒rFPV-1218NDF與以FPV7S為插入位點(diǎn)的重組病毒rFPV-N11SF分別在5、10、15和25日齡商品雞上進(jìn)行的4次免疫效力試驗(yàn)結(jié)果一并統(tǒng)計(jì)(見表5和圖9)，從而將樣本擴(kuò)大到每組101只雞，然后用SPSS軟件對(duì)它們之間免疫保護(hù)率的差異性進(jìn)行分析，結(jié)果表明它們的保護(hù)率之間差異極顯著，這進(jìn)一步確證了以FPV12-18為插入位點(diǎn)的重組病毒比相應(yīng)的插入位點(diǎn)為FPV7S的重組病毒能夠更好地抵抗母源抗體的干擾。
表5 重組FPV在不同齡商品雞上的4次免疫效力試驗(yàn)結(jié)果

a、b差異極顯著(P＜0.01)；免疫保護(hù)率＝(攻毒對(duì)照組死亡率-疫苗免疫組死亡率)/攻毒對(duì)照組死亡率×100％
cgtaagactt atccataccg aggtttctaaga tcatcatgtc ctacctgtagtagt tactacatac gcagaacagaaata gctcctctca tacgtttctaaga tcatcatgtc ctacaatttt atttctttga cgtcgtgttt atatcatttt 60ctgttttggg ataataattt tctctaatat aaaattatat attaattctt tttctatatt 120gaagtgattt aattaaagaa aatatgtaat ctttatctaa ttaggttttt ccttatctaa 180taatagaact gtatacctgg tgatcttcct acttgattta cgtgacctaa tataattatt 240tagatattta cctgtttttc gcataaatat aattcctaaa aatattatta ttaagatatt 300aatatctatt atccatgata atatatagag aaacattata ttaatcgcca atcgaatatg 360aataacatac atagtaataa taaagatagc agttaatggc aaactaatat tattcatgat 420aactgctata aaagaagata atatagcaag atatattgaa gtgtctatca tatcttattt 480tatggataaa cctttaacgg caacttctaa gttacttatt ttttggttta ttaaactatt 540ggttttttcg tacttttctt ccaatttttt tgtatttttc tttaatttta atatctcatt 600atcatgaatg tcgtatagta ttttacttat accctcagag aagaagccgc ttcgtatctg 660atcttcatta tcagaacctt ttttaagcct cgtgcaatag gagttagaaa gataggagtt 720aagtatcttg gaaaaattaa gtgcaatact aggaaaaacc caacagataa tatgaggcac 780gagatcgata tgcacatatg ttcctacaag ttcgtattta taggcactat ttgatgctaa 840tccgatttct aaaacggctt tattatagat accgttttta tagttcaatg tttttatgag 900ttttttagat gactctagtc tacaccactg cctaaagttc ttatttccaa gatcacatat 960tttagtagca tttatatatc cgttgtattt taacatgatt acttctatgt tcgcatagtt 1020gataaagcaa aagttctcat ctatatgttt aacggtgtta ggtacaaact ccatattgta 1080atactttcat tcagaatagt attgttttta cattttttat tataaggaaa aaactggttt 1140attcattttc ttttaaccat gcatacacaa tttacaggaa ctgatacatg tttagtcatt 1200acagcattat tttcaccaag atacattatt tttttaattt ctgtgaccgt agaacagtaa 1260gattcccatc ttgactcatc aatgccctta caaggagatg tagaattagg gaatcccatg 1320cagctaatca tttgaatgta ttgtgtgtat ccatctcctt tctcagaata tctgcccaaa 1380gattctattt tactgacacc agttccatta acagggctta cttctctaat atctacccat 1440gtagttacta attcacaagc gggttcgtat aaataaacag tagtattatc attactagat 1500gtctgggtat cgtataatac agctgcatga tagtactgaa aacatgttag taacacaagt 1560atatgtgtaa cgtacataat agaaaaaagt ataatttatg ccttattttt acattatagt 1620taaaaccata aaactatctt aattacaaat aaaatactat gtagttacat tatttttgat 1680
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權(quán)利要求
1.雞痘病毒表達(dá)載體p12-18，其特征在于該載體保藏號(hào)為CGMCC1385，其長度為10450bp，該載體以雞痘病毒復(fù)制非必需區(qū)FPV12-18為外源基因插入位點(diǎn)，是一個(gè)含有雞痘病毒復(fù)制非必需區(qū)側(cè)翼區(qū)FPV1和FPV2的表達(dá)載體，F(xiàn)PV1的核苷酸長度為1863bp，F(xiàn)PV2的核苷酸長度為1554bp，F(xiàn)PV1和FPV2的DNA序列分別為FPV1gtttctaaga tcatcatgtc ctacaatttt atttctttga cgtcgtgttt atatcatttt 60ctgttttggg ataataattt tctctaatat aaaattatat attaattctt tttctatatt 120gaagtgattt aattaaagaa aatatgtaat ctttatctaa ttaggttttt ccttatctaa 180taatagaact gtatacctgg tgatcttcct acttgattta cgtgacctaa tataattatt 240tagatattta cctgtttttc gcataaatat aattcctaaa aatattatta ttaagatatt 300aatatctatt atccatgata atatatagag aaacattata ttaatcgcca atcgaatatg 360aataacatac atagtaataa taaagatagc agttaatggc aaactaatat tattcatgat 420aactgctata aaagaagata atatagcaag atatattgaa gtgtctatca tatcttattt 480tatggataaa cctttaacgg caacttctaa gttacttatt ttttggttta ttaaactatt 540ggttttttcg tacttttctt ccaatttttt tgtatttttc tttaatttta atatctcatt 600atcatgaatg tcgtatagta ttttacttat accctcagag aagaagccgc ttcgtatctg 660atcttcatta tcagaacctt ttttaagcct cgtgcaatag gagttagaaa gataggagtt 720aagtatcttg gaaaaattaa gtgcaatact aggaaaaacc caacagataa tatgaggcac 780gagatcgata tgcacatatg ttcctacaag ttcgtattta taggcactat ttgatgctaa 840tccgatttct aaaacggctt tattatagat accgttttta tagttcaatg tttttatgag 900ttttttagat gactctagtc tacaccactg cctaaagttc ttatttccaa gatcacatat 960tttagtagca tttatatatc cgttgtattt taacatgatt acttctatgt tcgcatagtt 1020gataaagcaa aagttctcat ctatatgttt aacggtgtta ggtacaaact ccatattgta 1080atactttcat tcagaatagt attgttttta cattttttat tataaggaaa aaactggttt 1140attcattttc ttttaaccat gcatacacaa tttacaggaa ctgatacatg tttagtcatt 1200acagcattat tttcaccaag atacattatt tttttaattt ctgtgaccgt agaacagtaa 1260gattcccatc ttgactcatc aatgccctta caaggagatg tagaattagg gaatcccatg 1320cagctaatca tttgaatgta ttgtgtgtat ccatctcctt tctcagaata tctgcccaaa 1380gattctattt tactgacacc agttccatta acagggctta cttctctaat atctacccat 1440gtagttacta attcacaagc gggttcgtat aaataaacag tagtattatc attactagat 1500gtctgggtat cgtataatac agctgcatga tagtactgaa aacatgttag taacacaagt 1560atatgtgtaa cgtacataat agaaaaaagt ataatttatg ccttattttt acattatagt 1620taaaaccata aaactatctt aattacaaat aaaatactat gtagttacat tatttttgat 1680cgcattaaat gaaaggaact attatattgt ttggtaaacc aaattgcccg ttatgtaaat 1740tttcaaacga aatactttcg aataaaaaga tagctagtaa atatgaaatc gttagaataa 1800atatagctac attcttcgat aaatcaaagg tcgtagaaat actcggtatg gataagtctt 1860acgFPV2agaacagaaa tagctcctct catacccgta ctaaaattct ctaaaaatct gactggtttt 60ttttctaaag atactctagt ccctccagat gtgactaaag ctacacgcct gtttttctct 120ttttgtaatt ttacccaatt attaatgtta gtagtcgtgt ccattttttt aatataagaa 180tttatattag tttaatttat aagaaaccaa tactttaaat ctataattcg ttgttctaaa 240caacagttat ggtttcttaa attgttgatt catgataata ttatcgtaat aattctatta 300ttgaaatatc tagtctcgtt tttgagataa atattacgaa taaagcatat tcatatcaaa 360gcaacattag ctttacattt aagttgtact acgcatacgc acgaagtacc tattcttata 420tattcccagg aaggcattcc atttttaata actatagagt taacaaaaga atgagacgta 480gaacaataag aggaccaaaa tcgtgtatct attcctaaac agccactaat agccggatgc 540tccttacact tggtttcgaa taggtactga tagtaaactt gtttattatg tactatttga 600tccaatagtt ctagtttatt acctctgtga tcaaagactg tagttttgtt agcgacccat 660gtagaactac tttcacaaga taagtatatt ccttcactgg tattacctac agacaataat 720tcatctatgc ttcgtttacc acgatgttct atattcggag tacgagtact aaaaacaact 780ttagatgtat ctaatttatc gtttataaga taaggattag taaattggag taacgatccc 840ttgcatacta tacctaatac acatataaag attagccttc taaaattaca ggggtgcgta 900tggtatgcca ttcttattta tatatgaact tactaattaa gtaatagaat atgtctcagt 960aataattgac ggtacactgt agtatttgat tccactagta aacacataaa ttccttacca 1020ttatgtttat tatccactaa tagttctcta ataaaaaatg tagagttttg taacggaatt 1080gttacaggac ttttatgaat taccgattcc atttcgctaa tgggtttacc accgggaccg 1140gcccaaaaca ttctcgctga cgaacctttc ctaccacacc ctacacatat taagctagta 1200gtatttatat cttcaggcag tctagtaata ttaacgtagg tacaatcttc gcgtgttaca 1260ggacagcatt ctcgcacacc gtcggaattt tttcttgcgt tttccggaag atatccttct 1320aggtctagaa aaatagtttc gtcactatca tcttcctcat aactaactgt actgtaatct 1380ccttcatcgc catagtctat cggattcaag agtacgggta ttatcaaaca tagaataaaa 1440atagttctat acatcatgtt aatttagata tttcttctgg acacgatatc tatcctacta 1500agtatgtatg gtatttattt atcaattaat ctgcgtatgt agtaactact acag。
2.如權(quán)利要求1所述雞痘病毒表達(dá)載體p12-18的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟(1)定向克隆法篩選雞痘病毒的新復(fù)制非必需區(qū)根據(jù)已發(fā)表的雞痘病毒的基因組全序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物P15’-CGTAAGACTTATCCATACCGAG-3’P25’-GTTTCTAAGATCATCATGTCCTAC-3’P35’-CTGTAGTAGTTACTACATACGCAG-3’P45’-AACAGAAATAGCTCCTCTCATAC-3’用PCR方法分別擴(kuò)增雞痘病毒復(fù)制非必需區(qū)FPV12-18的兩個(gè)側(cè)翼區(qū)FPV1和FPV2；(2)利用分子克隆技術(shù)將復(fù)制非必需區(qū)FPV12-18的側(cè)翼區(qū)FPV1和FPV2、標(biāo)記基因表達(dá)框P11-LacZ先后克隆入載體pBluescript SK(-)，所得載體pP12與282E4株FPV共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染試劑為FuGENETM6Transfection Reagent，重組病毒的篩選標(biāo)記基因?yàn)榇竽c桿菌的β-半乳糖苷酶LacZ基因，經(jīng)藍(lán)斑篩選得到純化的重組病毒載體pP12；(3)構(gòu)建雞痘病毒FPV表達(dá)載體p12-18將外源基因的啟動(dòng)子Ps插入步驟(2)中構(gòu)建的載體pP12，獲得雞痘病毒表達(dá)載體p12-18。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述雞痘病毒表達(dá)載體p12-18的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(3)中，將pN11S用Hind III+Sma I進(jìn)行雙酶切，37℃消化2h后，電泳并回收約200bp的含MCS的Ps啟動(dòng)子，與同時(shí)用Hind III+Sma I雙酶切的載體pP12連接構(gòu)建雞痘病毒表達(dá)載體p12-18。
全文摘要
雞痘病毒表達(dá)載體p12－18及其構(gòu)建方法，涉及雞痘病毒表達(dá)載體構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域，先采用篩選雞痘病毒的新復(fù)制非必需區(qū)，擴(kuò)增雞痘病毒復(fù)制非必需區(qū)FPV12－18的兩個(gè)側(cè)翼區(qū)；再將復(fù)制兩個(gè)側(cè)翼區(qū)、標(biāo)記基因表達(dá)框P11－LacZ先后克隆入載體pBluescript SK(－)，所得載體pPl2與282E4株FPV共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞，重組病毒的篩選標(biāo)記基因?yàn)榇竽c桿菌的β－半乳糖苷酶LacZ基因，經(jīng)篩選得到重組病毒載體；最后將外源基因的啟動(dòng)子Ps插入載體，獲得雞痘病毒表達(dá)載體。本發(fā)明可表達(dá)多種病原體的保護(hù)性抗原基因，可使重組雞痘病毒疫苗具有較強(qiáng)的抵抗商品雞所攜帶的母源抗體干擾的能力。
文檔編號(hào)C12N15/66GK101067140SQ20071002268
公開日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2007年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月25日
發(fā)明者劉秀梵, 孫蕾, 陳素娟, 劉武杰 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)