專利名稱：中國(guó)雞痘病毒疫苗株表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供14個(gè)中國(guó)雞痘病毒282E4疫苗株重組表達(dá)載體，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
在細(xì)菌質(zhì)粒中克隆、重組DNA的技術(shù)大大擴(kuò)展了人們制作疫苗的方法。由于痘病毒在復(fù)制過程中存在著同源序列間的重組現(xiàn)象，而且在痘病毒的基因組中存在著許多病毒復(fù)制的非必需區(qū)域，所以，人們可以首先將病毒復(fù)制的非必需區(qū)克隆到細(xì)菌質(zhì)粒中，再把啟動(dòng)外源基因的啟動(dòng)子(由于痘病毒利用自己的RNA聚合酶在感染宿主細(xì)胞的細(xì)胞漿中復(fù)制，因此必需用痘病毒的啟動(dòng)子)插入非必需區(qū)，構(gòu)建成重組表達(dá)載體。然后把要表達(dá)的外源基因插入到已在病毒復(fù)制非必需區(qū)中的啟動(dòng)子下游，得到重組表達(dá)質(zhì)粒，利用此質(zhì)粒與病毒親本株在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制時(shí)發(fā)生同源重組，即可獲得表達(dá)外源基因的重組病毒。將此重組病毒免疫動(dòng)物時(shí)，病毒在動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制過程中則可表達(dá)攜帶的外源基因，刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生對(duì)外源蛋白的特異性免疫反應(yīng)。因此可作為重組活載體疫苗用于動(dòng)物和人的疾病防治。
總體來說，痘病毒是動(dòng)物病毒中最大的病毒，在光學(xué)顯微鏡下即可看到。在電子顯微鏡下，痘病毒呈鳥卵形外觀。病毒最主要的成份是蛋白質(zhì)、脫氧核糖核酸和類脂。聚丙烯酰胺凝膠電泳分析病毒粒子蛋白顯示有100多種包括結(jié)構(gòu)蛋白、翻譯mRNA的酶及RNA合成、DNA復(fù)制等相關(guān)酶類在內(nèi)的病毒相關(guān)蛋白。痘病毒基因組由單分子雙鏈DNA組成，G+C含量約32％～64％，基因組長(zhǎng)度約140kb～280kb。目前為止，痘苗病毒(Vaccinia Virus，VV)的基因組序列已經(jīng)明確，因此作為承載外源基因的載體，它是最早應(yīng)用也是應(yīng)用最多的病毒載體。
目前為止，已有多種類型的具有生物活性的蛋白質(zhì)在重組VV中得到了表達(dá)。而由此獲得的表達(dá)各種病原的重組VV成為預(yù)防與治療人與動(dòng)物多種傳染性疾病乃至腫瘤的重組活載體疫苗。但由于VV感染廣泛的宿主范圍和個(gè)別個(gè)體接種VV后產(chǎn)生的副反應(yīng)，尤其是免疫缺陷個(gè)體接種VV后產(chǎn)生病毒血癥而有擴(kuò)散病毒的危險(xiǎn)。所以，以VV為載體的重組疫苗的安全性引起了人們?cè)絹碓蕉嗟膿?dān)憂。
雞痘病毒(Fowlpox Virus，F(xiàn)PV)屬痘病毒科禽痘病毒屬。其自然條件下只感染禽類，但能對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生流產(chǎn)性感染，不產(chǎn)生有感染性的病毒粒子，但能表達(dá)、提呈FPV表達(dá)的蛋白，刺激機(jī)體產(chǎn)生對(duì)FPV表達(dá)蛋白的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫，因此FPV不僅可以作為禽類基因工程活疫苗載體，而且可以作為比VV更安全的哺乳動(dòng)物非復(fù)制型活疫苗載體。
構(gòu)建以FPV為載體的重組雞痘病毒，首先要構(gòu)建雞痘病毒表達(dá)載體，然后才能將外源基因插入載體構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，再通過重組表達(dá)質(zhì)粒與親本FPV的同源重組構(gòu)建表達(dá)外源基因的重組病毒。
自80年代末，F(xiàn)PV作為禽類和哺乳動(dòng)物活疫苗載體以來，國(guó)外已有多種外源基因在重組FPV中得到了表達(dá)。目前，國(guó)內(nèi)雖有外源基因在重組FPV中表達(dá)的報(bào)道，但所用載體或載體元件是從國(guó)外引進(jìn)的。
中國(guó)雞痘病毒鵪鶉化弱毒282E4疫苗株，已成功地在中國(guó)應(yīng)用多年，并已有效控制了雞痘在中國(guó)的發(fā)生和流行。其作為載體開發(fā)有著良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明申請(qǐng)人首次克隆鑒定了282E4株的TK基因(雞痘病毒非必需基因)，并建立了282E4株基因組部分BamH I片段的部分文庫，而且從中篩選鑒定了1.5kb B片段為282E4株復(fù)制非必需區(qū)，可用于構(gòu)建FPV表達(dá)載體。此外，本發(fā)明申請(qǐng)人人工合成的兩種痘病毒啟動(dòng)子即單一啟動(dòng)子和復(fù)合啟動(dòng)子已被證明在VV中有很強(qiáng)的活性?；赩V和FPV在基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)控機(jī)制上的相似性，兩種啟動(dòng)子可用于在FPV中表達(dá)外源基因。
本發(fā)明的目的在于，提供中國(guó)雞痘病毒282E4株表達(dá)載體，以開發(fā)以中國(guó)雞痘病毒為活載體的各種病毒、細(xì)菌和寄生蟲病的重組疫苗。
本發(fā)明的方案是這樣實(shí)現(xiàn)的14個(gè)可用于在重組雞痘病毒中表達(dá)外源蛋白的表達(dá)載體。在表達(dá)載體中的單一啟動(dòng)子或復(fù)合啟動(dòng)子下游，插入外源基因，通過與雞痘病毒親本株同源重組可獲得表達(dá)外源蛋白的重組雞痘病毒。
這些載體中能與雞痘病毒親本株發(fā)生同源重組的側(cè)翼序列是中國(guó)雞痘病毒282E4株含TK基因的2.2kb HindIII-ClaI片段的序列和位于基因組近末端1.5kb B片段序列。
這些載體中用于調(diào)控外源基因的啟動(dòng)子是人工合成的單一啟動(dòng)子或復(fù)合啟動(dòng)子。
可用于在這些載體中表達(dá)的外源基因可以是病毒、細(xì)菌和寄生蟲的抗原基因、致病基因等；腫瘤抗原基因，人、畜、禽等免疫調(diào)節(jié)基因以及其它動(dòng)物的免疫相關(guān)基因。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果為1、以282E4株TK基因?yàn)閭?cè)翼序列的表達(dá)載體不但可與282E4株親本FPV發(fā)生同源重組，而且可以與其它FPV毒株發(fā)生同源重組，可根據(jù)需要構(gòu)建具有不同生物學(xué)特性的重組FPV毒株。
2、以1.5kb B片段為側(cè)翼的表達(dá)載體或重組質(zhì)粒，僅能與在基因組中核苷酸序列與282E4株1.5kb B片段序列同源的FPV毒株發(fā)生同源重組，構(gòu)建以這些毒株為親本株的重組病毒。
3、通過含有LacZ報(bào)告基因的表達(dá)載體構(gòu)建重組病毒時(shí)，可通過在X-Gal存在下，篩選表達(dá)LacZ的藍(lán)色重組病毒蝕斑篩選獲得重組病毒。
4、通過不含LacZ報(bào)告基因的表達(dá)載體構(gòu)建重組病毒時(shí)，可通過蝕斑原位雜交技術(shù)或免疫蝕斑等技術(shù)篩選獲得重組病毒。利用以TK為側(cè)翼的表達(dá)載體構(gòu)建重組病毒時(shí)，還可通過利用Budr等藥物篩選重組病毒。
利用這些表達(dá)載體可根據(jù)不同的目的，構(gòu)建表達(dá)不同外源蛋白的重組雞痘病毒，這些重組雞痘病毒即可作為重組活載體疫苗，用于不同疾病的防治，也可作為研究不同生物活性蛋白質(zhì)的表達(dá)、加工、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系等研究工具。


如下圖1所示的為單一啟動(dòng)子的克隆過程。具體方法是用限制性內(nèi)切酶BamHI消化痘苗病毒表達(dá)載體pSFJ2-16制備單一啟動(dòng)子，然后將其插入質(zhì)粒pSK(-)的BamHI位點(diǎn)，通過核苷酸測(cè)序鑒定單一啟動(dòng)子方向。
圖2所示的是單一啟動(dòng)子的每個(gè)重復(fù)單位的核苷酸序列。
圖3所示的是復(fù)合啟動(dòng)子的克隆過程。具體方法是用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII同時(shí)消化痘苗病毒表達(dá)載體pSFJ1-20制備復(fù)合啟動(dòng)子，然后將其定向插入到質(zhì)粒pSK(-)的EcoRI和HindIII位點(diǎn)之間。
圖4所示的是TK基因和B片段兩個(gè)非必需區(qū)的克隆過程。具體方法是將2.2kb含TK基因的基因組片段和1.5kb B片段分別插入質(zhì)粒pUC19的兩個(gè)pVUII位點(diǎn)之間。
圖5所示的是將單一啟動(dòng)子插入TK基因和B片段的過程。具體方法是將單一啟動(dòng)子分別插入TK基因的NcoI位點(diǎn)和B片段的EcoRI位點(diǎn)，得到4個(gè)不含報(bào)告基因的表達(dá)載體，pUT16-3，pUT16-4，pUB16-3，pUB16-4。
圖6所示的是將復(fù)合啟動(dòng)子插入TK基因和B片段的過程。具體方法是將復(fù)合啟動(dòng)子分別插入TK基因的NcoI位點(diǎn)和B片段的EcoRI位點(diǎn)，得到4個(gè)不含報(bào)告基因的表達(dá)載體，pUTA-2，pUTA-5，pUBA-7，pUBA-9。
圖7所示的是GFP和LacZ的啟動(dòng)子的替換過程。
圖8是單一啟動(dòng)子FPV載體、復(fù)合啟動(dòng)子FPV載體、含GFP復(fù)合啟動(dòng)子FPV載體和含LacZ復(fù)合啟動(dòng)子FPV載體。
圖9所示的是構(gòu)建含單一啟動(dòng)子和報(bào)告基因的表達(dá)載體過程。具體方法是將單一啟動(dòng)子調(diào)控下的LacZ基因或GFP基因插入pUTA-2或pUBA-7中的復(fù)合啟動(dòng)子上游，使其轉(zhuǎn)錄方向與復(fù)合啟動(dòng)子相反。得到兩個(gè)以GFP為報(bào)告基因的載體pUTA-2-F716和pUBA-7-F716。兩個(gè)以LacZ為報(bào)告基因的表達(dá)載體pUBA-7-16LacZ和pUTA-2-16LacZ。
圖10所示的是構(gòu)建含復(fù)合啟動(dòng)子和報(bào)告基因的表達(dá)載體的過程。具體方法是將LacZ報(bào)告基因和單一啟動(dòng)子一起插入TK基因NcoI位點(diǎn)或B片段的EcoRI位點(diǎn)，得到兩個(gè)表達(dá)載體pUB1616LacZ和pUT1616LacZ。
圖11所示的是含282E4株TK基因組的2.2kb HindIII-ClaI片段的核苷酸序列。
圖12所示的是282E4株基因組1.5kb B片段的核苷酸序列。
圖13所示的是復(fù)合啟動(dòng)子的構(gòu)成及牛痘病毒A型包涵體啟動(dòng)子的核苷酸序列。
本發(fā)明中的TK基因是指胸腺嘧啶核苷激酶基因，282E4株TK基因位于其基因組2.2kb HindIII-ClaI片段中，其核苷酸序列如圖7所示。
本發(fā)明中的B片段是指位于282E4株基因組近末端的一個(gè)長(zhǎng)1.5kb的片段，其核苷酸序列如圖12所示。
本發(fā)明中的單一啟動(dòng)子是指由16個(gè)首尾串聯(lián)的痘苗病毒突變型P7.5早期啟動(dòng)子組成的啟動(dòng)子，其每個(gè)重復(fù)單位的序列如圖2所示。
本發(fā)明中的復(fù)合啟動(dòng)子是指由牛痘病毒A型包涵體啟動(dòng)子(ATI)與20個(gè)首尾串聯(lián)的突變型痘苗病毒p7.5早期啟動(dòng)子首尾串聯(lián)組成的啟動(dòng)子，其中ATI啟動(dòng)子的核苷酸序列如圖13所示，20個(gè)首尾串聯(lián)的p7.5早期啟動(dòng)子中每個(gè)重復(fù)單位的序列如圖2所示。
本發(fā)明中的LacZ基因指大腸桿菌β-D半乳糖苷酶基因。
本發(fā)明中的GFP基因是指綠色熒光蛋白基因。
下面通過表達(dá)載體的構(gòu)建與應(yīng)用方法敘述
具體實(shí)施例方式(一)DNA重組基本操作方法1.大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備，采用氯化鈣制備法，具體方法參照金冬雁、黎孟楓等譯《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社(1992)，第55～56頁。只是采用由0.75mmol/L Tris-HCl代替水為溶劑配制0.1mol/L CaCl2。感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法，參照上述參考文獻(xiàn)進(jìn)行。
2.質(zhì)粒的大量制備(除有特殊說明外，試劑配制均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社(1992)參照金冬雁、黎孟楓等譯《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社(1992)，第26～28頁，采用堿裂解法制備，用PEG沉淀法純化。具體操作方法如下，離心收獲經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)后的菌體，用STE懸浮、洗滌菌體一次，然后用特殊TE(10mmol/L Tris，50mmol/LEDTA pH8.0)，懸浮沉淀。加入2倍于TE體積的溶液II裂解，加入1.5倍體積的溶液III中和，離心后取上清，加入0.7倍體積的異丙醇沉淀。離心棄上清。用TE(pH8.0)溶解沉淀，加入等倍于TE體積的5mol/L LiCl，離心去除大分子RNA。移出上清至一新離心管中，加入2倍于上清體積的無水乙醇，沉淀DNA。加適量70％乙醇洗滌沉淀一次，涼干。用TE溶解沉淀，其中含無DNA酶的RNA酶終濃度為20Mg/ml，以去除RNA。加入等倍于TE體積的PEG溶液(20％PEG6000，2.5mol/L NaCl)混勻，置4℃過夜后離心，棄上清。用TE溶解沉淀，用等倍于TE體積的飽合酚、酚∶氯仿，按順序各抽提一次，然后用2倍體積的無水乙醇沉淀DNA，用70％乙醇洗滌沉淀一次，涼干，最后溶于TE(pH8.0)中備用。
3.質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶消化與DNA片段的回收質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶消化均參照下列反應(yīng)條件進(jìn)行，每微克質(zhì)粒DNA用5單位限制性內(nèi)切酶消化，加1/10體積的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，加滅菌二餾水調(diào)整反應(yīng)總體積為所用限制性內(nèi)切酶體積的10倍，按各種限制性內(nèi)切酶的供應(yīng)商推薦的反應(yīng)溫度反應(yīng)2～3小時(shí)。質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶消化后，DNA片段的回收采用DEAE-纖維素膜電泳回收法，具體方法參照金冬雁、黎孟楓等譯《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社(1992)，第319～321頁。本研究采用DE-81離子交換紙(Whatman公司產(chǎn)品)代替DEAE-纖維素膜。
4.線性質(zhì)粒的末端去磷酸化和DNA片段的連接酶切后線性質(zhì)粒的末端去磷酸化，采用小牛小腸堿性磷酸酶(CIP)，具體操作參照金冬雁、黎孟楓等譯《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社(1992)，第40～41頁。去磷酸化反應(yīng)后，CIP的滅活采用5mmol/L EDTA(PH8.0)存在下，75℃加熱10min。然后用酚∶氯仿抽提去除CIP，乙醇沉淀去磷酸化后的線性質(zhì)粒，溶于滅菌雙餾水中，用于連接反應(yīng)。
線性質(zhì)粒與DNA片段的連接反應(yīng)按GIBCO-BRL公司提供的T4DNA連接酶推薦的條件進(jìn)行。粘性末端的連接按質(zhì)粒載體∶目的DNA片段的摩爾比＝1∶2，25℃連接1h。平末端的連接采用質(zhì)粒載體∶目的DNA片段摩爾比＝1∶5的比例，14～16℃，連接17～24h，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。
5.重組質(zhì)粒的篩選與鑒定將連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，涂于含抗生素的平板上，挑選過夜培養(yǎng)長(zhǎng)出的單菌落，接種于2ml LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16～20h。然后參照金冬雁、黎孟楓等譯《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社(1992)，第19～22頁介紹的堿裂解法小量制備質(zhì)粒，以空載體質(zhì)粒作對(duì)照進(jìn)行質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳，挑選重組質(zhì)粒，作限制性內(nèi)切酶酶切，瓊脂糖凝膠電泳，鑒定插入的目的基因及其插入方向。
(二)FPV表達(dá)載體構(gòu)建方法1.單一啟動(dòng)子和復(fù)合啟動(dòng)子的克隆用BamHI消化pSFJ2-16，用HindIII和EcoRI消化pSFJ1-20，瓊脂糖凝膠電泳分別回收其中的單一啟動(dòng)子或復(fù)合型啟動(dòng)子，然后將其分別插入質(zhì)粒pSK(-)的BamHI位點(diǎn)或HindHI位點(diǎn)與EcoRI位點(diǎn)之間，構(gòu)建成質(zhì)粒pSK16和pKAT。其構(gòu)建策略如附圖1，3所示。
2.單一啟動(dòng)子的序列測(cè)定參照金冬雁、黎孟楓等譯《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社(1992)，第632～637頁制備變性聚丙烯酰胺凝膠。按照pharmacia公司提供的T7 Sequence Kit使用說明，以含有單一啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒為模板，采用pSK(-)上的T7引物作反應(yīng)引物，采用雙脫氧末端終止法進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。每次反應(yīng)用模板質(zhì)粒約2ug，取3μl反應(yīng)混合物上樣電泳。電泳完畢，揭膠后將凝膠在10％醋酸甲醇溶液中固定10min，壓X光片，放射自顯影24h，沖片，讀取啟動(dòng)子序列，鑒定啟動(dòng)子方向。經(jīng)序列測(cè)定與分析，pSK16中單一啟動(dòng)子的序列和方向如附圖2所示。
3.TK基因和B片段兩個(gè)非必需區(qū)的克隆。
將質(zhì)粒pSL用HindIII和ClaI消化，回收含TK基因的2.2kb片段。將質(zhì)粒pKFB0用Xbal消化，回收1.5kb B片段，然后分別將兩個(gè)片段用Klenow補(bǔ)平末端。將質(zhì)粒pUC19用Pvu II消化去除其中的多克隆位點(diǎn)，用CIP進(jìn)行末端去磷酸化處理。將補(bǔ)平末端的含TK基因的2.2kb片段和1.5kb B片段分別插入去掉多克隆位點(diǎn)的pUC19中，得到質(zhì)粒pUT和pUB，構(gòu)建策略如圖4所示。
4.將不同啟動(dòng)子分別插入兩個(gè)非必需區(qū)用NotI和Xhol I分別消化將兩種啟動(dòng)子亞克隆以后得到的質(zhì)粒pSK16和pKAT，回收其中的單一啟動(dòng)子和復(fù)合啟動(dòng)子，Klenow進(jìn)行末端補(bǔ)平。然后分別用NcoI消化pUT，用EcoRI消化pUB，隨后進(jìn)行末端補(bǔ)平和去磷酸化。將回收的單一啟動(dòng)子和復(fù)合啟動(dòng)子分別插入TK基因的NcoI位點(diǎn)，篩選得到不含LacZ報(bào)告基因，以TK為側(cè)翼的含復(fù)合啟動(dòng)子的表達(dá)載體pUTA-2，含單一啟動(dòng)子的表達(dá)載體pUT16-4。將回收的單一啟動(dòng)子和復(fù)合啟動(dòng)子插入B片段的EcoRI位點(diǎn)，篩選出不含LacZ報(bào)告基因，以B片段為側(cè)翼的含復(fù)合啟動(dòng)子的表達(dá)載體pUBA-7，含單一啟動(dòng)子的表達(dá)載體pUB16-1。構(gòu)建策略如圖5，6所示。
5、報(bào)告基因啟動(dòng)子的替換將質(zhì)粒pSK16用EcoRV和SmaI消化，去除兩個(gè)位點(diǎn)之間的EcoRV、EcoRI、SmaI、PstI等位點(diǎn)，然后自身連接。再用Xba I消化，Klenow進(jìn)行末端補(bǔ)平，然后再用HindIII消化，回收其中的單一啟動(dòng)子。
將質(zhì)粒pCMVGFP用SpeI和BamHI消化，回收CMV啟動(dòng)子調(diào)控的GFP基因。將其插入到已被HindIII消化并進(jìn)行末端補(bǔ)平的KS(-)，然后將從pSK16中回收的單一啟動(dòng)子定向替換CMV啟動(dòng)子。得到含在單一啟動(dòng)子調(diào)控下的GFP基因的質(zhì)粒pKSF716。構(gòu)建策略如圖7所示。
將Psv-β-Galacosidase用SalI和HindIII消化，回收其中的LacZ基因，將其定向替換到pKSf716中GFP基因位置，得到含在單一啟動(dòng)子調(diào)控下的LacZ基因的質(zhì)粒pKS16LacZ，構(gòu)建策略如圖8所示。
6.含復(fù)合啟動(dòng)子和LacZ報(bào)告基因的表達(dá)載體的構(gòu)建將GFP基因定向插入到pUTA-2中復(fù)合啟動(dòng)子上游的HindIII位點(diǎn)處，方向與復(fù)合啟動(dòng)子方向相反。構(gòu)建成含復(fù)合啟動(dòng)子的以TK為側(cè)翼以GFP為報(bào)告基因的質(zhì)粒pUTA-2-f716。同樣方法構(gòu)建成以B片段為側(cè)翼的含復(fù)合啟動(dòng)子的、以GFP為報(bào)告基因的質(zhì)粒pUBA-7-f716。構(gòu)建策略見圖9。
將pUTA-2-f716和pUBA-7-f716分別用Sal I和Hind III消化，去除其中的GFP基因。用Sal I和Hind III消化pSV-β-Galactosidase，回收其中的LacZ基因，把LacZ基因定向替換到GFP基因的位置上，得到分別以TK和B片段為側(cè)翼以復(fù)合啟動(dòng)子調(diào)控目的基因，以LacZ為報(bào)告基因的表達(dá)載體pUTA-2-16LacZ，pUBA-716 LacZ。構(gòu)建策略見圖9。
7.含單一啟動(dòng)子和LacZ報(bào)告基因的表達(dá)載體的構(gòu)建將單一啟動(dòng)子調(diào)控下的LacZ基因，插入到pSK16中單一啟動(dòng)子上游，方向與單一啟動(dòng)子方向相反，構(gòu)建成含有LacZ報(bào)告基因和調(diào)控外源基因啟動(dòng)子的表達(dá)載體元件，然后用NotI和XhoI消化制備這一表達(dá)載體元件，將其插入到pUT質(zhì)粒的Nco I位點(diǎn)，得到以TK為側(cè)翼的以LacZ為報(bào)告基因，以單一啟動(dòng)子啟動(dòng)目的基因的表達(dá)載體pUT1616LacZ。將構(gòu)建的表達(dá)載體元件插入pUB質(zhì)粒的EcoR I位點(diǎn)，得到以B片段為側(cè)翼，以LacZ為報(bào)告基因，以單一啟動(dòng)子啟動(dòng)目的基因的表達(dá)載體pUB1616LacZ。構(gòu)建策略見圖10。
(三)這些表達(dá)載體的特點(diǎn)1、以282E4株TK基因?yàn)閭?cè)翼序列的表達(dá)載體不但可與282E4株親本FPV發(fā)生同源重組，而且可以與其它FPV毒株發(fā)生同源重組，可根據(jù)需要構(gòu)建具有不同生物學(xué)特性的重組FPV毒株。
2、以1.5kb B片段為側(cè)翼的表達(dá)載體或重組質(zhì)粒，僅能與在基因組中核苷酸序列與282E4株1.5kb B片段序列同源的FPV毒株發(fā)生同源重組，構(gòu)建以這些毒株為親本株的重組病毒。
3、通過含有LacZ報(bào)告基因的表達(dá)載體構(gòu)建重組病毒時(shí)，可通過在X-Gal存在下，篩選表達(dá)LacZ的藍(lán)色重組病毒蝕斑篩選獲得重組病毒。
4、通過不含LacZ報(bào)告基因的表達(dá)載體構(gòu)建重組病毒時(shí)，可通過蝕斑原位雜交技術(shù)或免疫蝕斑等技術(shù)篩選獲得重組病毒。利用以TK為側(cè)翼的表達(dá)載體構(gòu)建重組病毒時(shí)，還可通過利用Budr等藥物篩選重組病毒。
利用這些表達(dá)載體可根據(jù)不同的目的，構(gòu)建表達(dá)不同外源蛋白的重組雞痘病毒，這些重組雞痘病毒即可作為重組活載體疫苗，用于不同疾病的防治，也可作為研究不同生物活性蛋白質(zhì)的表達(dá)、加工、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系等研究工具。
(四)重組病毒的構(gòu)建和篩選方法利用這些表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)外源基因的重組病毒的方法如下。
首先在這些表達(dá)載體的下游，按正確的方法插入欲表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，然后將這些重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染已被FPV親本毒株感染的能使FPV在其中復(fù)制的合適細(xì)胞(如雞胚成纖維細(xì)胞CEF)，通過重組表達(dá)質(zhì)粒與FPV親本株在同源序列處發(fā)生同源重組，產(chǎn)生攜帶、表達(dá)外源基因的重組病毒，然后通過各種合適的方法將重組病毒篩選出來。但這些載體中表達(dá)的外源基因序列必須是編碼序列，不能含有內(nèi)含子等非編碼序列，而且要帶有完整的啟始密碼子ATG，且啟動(dòng)子下游第一個(gè)ATG必須是要表達(dá)的外源基因的啟始密碼子。而且早期啟動(dòng)子下游的外源基因內(nèi)部不能含有TTTTTNT序列，其中N為四種脫氧核糖核苷酸中的任何一種。
(五)重組病毒的構(gòu)建實(shí)施例1、細(xì)胞與病毒的培養(yǎng)(除本發(fā)明介紹的雞胚成纖維細(xì)胞外，還可用其它雞痘病毒能在其中復(fù)制的細(xì)胞)利用SPF雞蛋孵至9～11日齡的雞胚，參照殷震、劉景華主編《動(dòng)物病毒學(xué)》第二版，科學(xué)出版社(1997)，第223～224頁介紹的方法制備CEF原代細(xì)胞。采用含2％犢牛血清的MEM培養(yǎng)液37℃ 5％CO2條件下培養(yǎng)。
FPV HIPRA株采用CEF單層細(xì)胞或雞胚絨毛尿囊膜培養(yǎng)傳代。病毒PFU測(cè)定2、制備CEF單層細(xì)胞，以106cell/ml繼代于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(孔徑3.5cm)每孔3ml，培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)成單層，吸去培養(yǎng)液，以PBS液洗細(xì)胞2次，將FPV病毒液以PBS液作10-1～10-5遞進(jìn)10倍稀釋，然后每孔接病毒稀釋液300μl，設(shè)一孔作細(xì)胞對(duì)照，37℃吸附1-1.5h。加入含2％犢牛血清的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)72～96h，吸去培養(yǎng)液，用PBS洗兩次，然后每孔覆蓋1ml福爾馬林結(jié)晶紫染液(配制方法每50ml中加入10ml 5％結(jié)晶紫，37.5ml 0.85％NaCl，1ml甲醛，1.5ml H2O)室溫染色30min，吸去染液，以餾水漂洗兩次，計(jì)算蝕斑數(shù)和病毒原液的PFU。
3、重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Sma I消化表達(dá)載體，然后將消化成線性的載體進(jìn)行末端去磷酸化處理后與目的基因連接，篩選鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒，然后提取、純化質(zhì)粒DNA。
4、細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法(除本發(fā)明所介紹的轉(zhuǎn)染方法外，還可用其它將DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞的方法)制備CEF細(xì)胞單層，以1×105cell/ml繼代于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔3ml，待細(xì)胞長(zhǎng)至70～80％融合單層時(shí)，吸去培養(yǎng)液，PBS洗細(xì)胞兩次，然后按0.2PFU/cell接種FPV HIPRA株，37℃吸附1～1.5h，其間將30～50μg質(zhì)粒稀釋到50μl無血清MEM中，將20μl DOTAP轉(zhuǎn)染試劑稀釋到100μl無血清的MEM中，按DOTAP Liposomal使用說明，將用于同源重組的質(zhì)粒與DoTAP轉(zhuǎn)染試劑輕輕混勻，室溫放置30min以上。待病毒吸附后，吸去細(xì)胞培養(yǎng)孔中的病毒液，將質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑的混合液用無血清MEM補(bǔ)至體積1ml，加到培養(yǎng)板孔中已被FPV感染的細(xì)胞單層上，37℃ 5％ CO2培養(yǎng)14～18h，然后每孔補(bǔ)加2ml含2％犢牛血清的MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)32～56h收獲病毒，測(cè)定病毒PFU。
5、重組病毒的篩選方法(除本發(fā)明介紹的方法外，也可用其它重組病毒的篩選方法)(1)以LacZ為報(bào)告基因的重組病毒的篩選在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中制備CEF單層，將以LacZ為報(bào)告基因的載體與FPV HIPRA共轉(zhuǎn)染后收獲的病毒以每孔300～500PFU接種CEF細(xì)胞，37℃吸附1.5h，用含2％犢牛血清的MEM培養(yǎng)48h，吸去MEM培養(yǎng)液，然后覆蓋含終濃度為200μg/ml X-gal的由2×MEM(含2％犢牛血清)和1％瓊脂糖(二者比例1∶1)組成的營(yíng)養(yǎng)瓊脂糖，繼續(xù)避光培養(yǎng)24～48h，然后挑取藍(lán)色病毒蝕斑，并用同樣方法進(jìn)行三次藍(lán)斑純化。
(2)以TK為側(cè)翼序列的重組病毒的篩選方法在6孔培養(yǎng)板中制備CEF單層，在接毒前24h用含40μg/ml Budr的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，然后以1PFU/cell量接種重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后收獲的病毒，37℃吸附1.5h后，再用含40μg/ml Budr的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，觀察CPE。接毒后120h，收獲細(xì)胞，凍融3次后，再接種用Budr處理的CEF單層細(xì)胞，繼續(xù)在含40μg/ml的培養(yǎng)基中培養(yǎng)120h，然后收獲細(xì)胞，凍融3次。再將收獲的病毒接種CEF細(xì)胞，在無Budr營(yíng)養(yǎng)瓊脂糖(見實(shí)驗(yàn)二)中培養(yǎng)，挑選單個(gè)病毒蝕斑，并進(jìn)行兩次蝕斑純化，擴(kuò)增。
6、重組病毒表達(dá)蛋白的鑒定(也可用其它合適的方法)將篩選、純化的重組病毒，以5PFU/cell按種CEF細(xì)胞，感染后36h收獲細(xì)胞，將收獲的細(xì)胞用細(xì)胞裂解液(10mmol/LTris-HCl，pH7.4～8.0，1mmol/L MgCl2，0.5％NP-40，20μg/ml Dnase I)裂解后，加等量2×SDS loading Buffer混合，100℃水浴煮沸3min，作SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用封閉液(用TBS配制3％BSA，0.05％Tween-20)室溫封閉1～2h，然后用TBS(10mmol/LTris.Cl(pH7.5)，150mmol/L NaCl)液漂洗兩次，再與抗目的蛋白的抗體室溫感作2h，用TBS液漂洗三次，每次10分鐘。然后與堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體(1∶500)室溫感作2h，再用TBS液漂洗三次，最后用堿性磷酸酶緩沖液配制的NBT和BCIP顯色液顯色，適時(shí)終止顯色反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.14個(gè)可用于在重組雞痘病毒中表達(dá)外源蛋白的表達(dá)載體。其特征在于，在表達(dá)載體中的單一啟動(dòng)子或復(fù)合啟動(dòng)子下游，插入外源基因，通過與雞痘病毒親本株同源重組可獲得表達(dá)外源蛋白的重組雞痘病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于這些載體中能與雞痘病毒親本株發(fā)生同源重組的側(cè)翼序列是中國(guó)雞痘病毒282E4株含TK基因的2.2kb HindIII-ClaI片段的序列和位于基因組近末端1.5kb B片段序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于這些載體中用于調(diào)控外源基因的啟動(dòng)子是人工合成的單一啟動(dòng)子或復(fù)合啟動(dòng)子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于可用于在這些載體中表達(dá)的外源基因可以是病毒、細(xì)菌和寄生蟲的抗原基因、致病基因，腫瘤相關(guān)抗原基因，人、畜、禽免疫調(diào)節(jié)基因以及其它動(dòng)物的免疫基因。
全文摘要
本發(fā)明提供14個(gè)雞痘病毒282E4株重組表達(dá)載體,其中8個(gè)是將人工合成、構(gòu)建的兩種痘病毒啟動(dòng)子分別插入282E4株TK基因或1.5kbB片段非必需區(qū)中構(gòu)建成的。把大腸桿菌LacZ基因或綠色熒光蛋白基因作為報(bào)告基因,插入上述的表達(dá)載體中的6個(gè)載體中,構(gòu)建成另外6個(gè)含有報(bào)告基因的中國(guó)雞痘病毒282E4株重組表達(dá)載體。利用這些表達(dá)載體,通過不同的方法可獲得表達(dá)不同外源基因的重組病毒,這些重組病毒可作為疫苗用于禽及人、畜疾病的防治。
文檔編號(hào)A61K39/275GK1268573SQ00103298
公開日2000年10月4日 申請(qǐng)日期2000年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月23日
發(fā)明者金寧一, 郭志儒, 方厚華, 王宏偉, 羅坤, 金擴(kuò)世, 顧萬鈞, 李萍, 殷震 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍需大學(xué)