專利名稱：：表達(dá)新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-1218NDHN及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種表達(dá)新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗的構(gòu)建領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：雞痘病毒(FowlpoxVirus,簡稱FPV)是繼痘苗病毒VV之后的一種具有獨(dú)特優(yōu)越性和廣闊應(yīng)用前景的表達(dá)載體，是當(dāng)今分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。禽痘病毒屬痘病毒科，禽痘病毒屬，雞痘病毒是其代表種。FPV做為表達(dá)載體有其獨(dú)特的優(yōu)越性。其基因組龐大，長度約為VV的1.5倍，含較多的復(fù)制非必需區(qū)，可構(gòu)建FPV多價(jià)和多聯(lián)疫苗；FPV具有自身的酶系統(tǒng)和調(diào)控信號(hào)，其轉(zhuǎn)錄、翻譯和裝配均發(fā)生在胞漿中，可對外源基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行翻譯后加工、修飾，保留其相應(yīng)的生物學(xué)活性，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫；與VV相比，F(xiàn)PV的宿主范圍較窄，僅感染禽類，不易散毒，對哺乳動(dòng)物和人類無潛在的威脅；重組病毒的構(gòu)建方法相對簡單；表達(dá)水平較高；便于對重組雞痘病毒免疫雞群和自然感染雞群進(jìn)行鑒別。近十幾年來，F(xiàn)PV載體疫苗的研究己取得了很大進(jìn)展，有多種病原體的保護(hù)性抗原基因在FPV中得以成功表達(dá)，如NDV的F和HN基因、IBDV的VP2/VP2-3-4基因、AIV的HA/NA/NP基因、MDV的gB/pp38基因、IBV的SI基因、ALV的env基因、REV的env基因等，并在SPF雞上有很高甚至100%的保護(hù)率(BoyleDB,HeineHG.Recombinantfowlpoxvirusvaccinesforpoultry.Immunol.CellBiol,1993,71:391-397.)。但迄今為止，重組FPV活載體疫苗在國內(nèi)外尚未獲得廣泛應(yīng)用。究其原因，主要是重組FPV疫苗的免疫效力在很大程度上受到商品雞所攜帶的母源抗體的干擾。我國商業(yè)雞群攜帶母源抗體的情況更為嚴(yán)重，因?yàn)樵谖覈酿B(yǎng)禽業(yè)中，種雞一般要多次接種針對NDV、AIV等病原體的疫苗，包括能產(chǎn)生高抗體滴度的油乳劑滅活疫苗。因此，我國市場上的商品雞普遍帶有相當(dāng)高的母源抗體，其中ND的母源抗體HI效價(jià)平均可達(dá)28-29，這無疑給疫苗，尤其弱毒苗和活載體疫苗的早期應(yīng)用和疫情監(jiān)測帶來很大的困難。重組FPV受到針對FPV的母源抗體和針對外源基因表達(dá)產(chǎn)物的母源抗體的雙重干擾，而且針對外源蛋白的母源抗體也會(huì)干擾其免疫效力。許多研究已經(jīng)證明，針對外源蛋白的母源抗體會(huì)干擾重組FPV的免疫效力，而且母源抗體越高干擾越大。Taylor等發(fā)現(xiàn)，在有較高ND母源抗體的試驗(yàn)雞上，共表達(dá)NDVF和HN基因的重組FPV抵抗NDV強(qiáng)毒攻擊的免疫保護(hù)率較在SPF雞上有所卜降(TaylorJ,ChristensenL,GettigR,etaLEfficacyofarecombinantfowlpox-basedNewcastlediseasevirusvaccinecandidateagainstvelogenicandrespiratorychallenge.AvianDis,1996,40:173-80.)。本室了煒東、韋棟平等的試驗(yàn)結(jié)果也表明，重組FPV的免疫效力因存在針對NDV或AIV的母源抗體而受到很大的影響(丁煒東，曹麗萍，張?bào)w銀等.表達(dá)新城疫病毒F和HN基岡重組雞痘病毒疫苗的遺傳穩(wěn)定性和免疫效力試驗(yàn).巾國獸醫(yī)雜志，2005,41:10-14.韋棟平，劉玉良，邵衛(wèi)星等.共表達(dá)新城疫F基因和H9亞型禽流感病毒HA基因的重組雞痘病毒.微生物學(xué)報(bào)，2004,44:14-18.)。關(guān)T針對FPV的抗體是否影響重組FPV的免疫效力，H前尚無一致的看法。Taylor等對1日齡帶有FPV母源抗體的試驗(yàn)雞免疫共表達(dá)NDVF和HN基因的重組FPV，免疫后28攻擊NDV強(qiáng)毒，保護(hù)率達(dá)94%-100%,表明針對FPV的母源抗體幾乎不影響重組病毒抵抗NDV攻擊的免疫效力(TaylorJ,ChristensenL，GettigR,etal.Efficacyofarecombinantfowlpox-basedNewcastlediseasevirusvaccinecandidateagainstvelogenicandrespiratorychallenge.AvianDis,1996，40:173-80.)。而喬傳玲等通過在SPF雞上預(yù)先感染FPV，然后接種重組FPV，來探討FPV抗體對重組病毒的免疫效力是否存在影響。結(jié)果表明，F(xiàn)PV與表達(dá)AIVHA和NA基因的重組FPV同時(shí)接種和間隔4周接種時(shí)，F(xiàn)PV抗體對重組疫苗的免疫效力不構(gòu)成影響，對高致病性AIV的保護(hù)率為100%。而間隔時(shí)間為l、2、3周時(shí)，重組疫苗的免疫效力則受到不同程度的影響(喬傳玲，李呈軍，于康震等.禽痘病毒感染對禽流感病毒疫苗免疫效力的影響.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005,27:154-156.)。在此之前，Swayne等也對此進(jìn)行了研究，首先用FPV免疫12周齡雞，然后在間隔4、9、15周后分別用表達(dá)AIVHA基因的重組FPV進(jìn)行免疫，免疫3周后用高致病性AIV攻擊，結(jié)果重組病毒未能提供堅(jiān)強(qiáng)的免疫保護(hù)(SwayneDE，BeckJRandKinneyN.Failureofarecombinantfowlpoxvirusvaccinecontaininganavianinfluenzahemagglutiningenetoprovideconsistentprotectionagainstinfluenzainchickenspermmunizedwithafowlpoxvaccine.AvianDis，2000,44:132-137.)。目前，克服母源抗體的干擾作用主要有DNA疫苗免疫、共表達(dá)細(xì)胞因子、粘膜免疫以及利用新的佐劑和載體釋放系統(tǒng)等幾種途徑，但尚有許多理論和技術(shù)問題需要解決，沒有從根本上解決重組FPV受母源抗體干擾這一難題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個(gè)目的在于發(fā)明一種具有較強(qiáng)的抵抗母源抗體干擾的能力、從而解決重組雞痘疫苗在應(yīng)用過程中受母源抗體干擾的疫苗。本發(fā)明表達(dá)新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-1218NDHN，于2007年1月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其其保藏號(hào)為CGMCCNO:1912。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于發(fā)明一種表達(dá)新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-1218NDHN的構(gòu)建方法利用FPV表達(dá)載休pl2-18，將新城疫病毒HN基因通過同源重組插入到282E4株雞痘病毒的復(fù)制非必需區(qū)FPV12-18，從而獲得了表達(dá)新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗nFPV-12腦D麗。本發(fā)明克服了母源抗體干擾是重組FPV疫苗研究領(lǐng)域亟待解決的一個(gè)難題。利用FPV表達(dá)載體pl2-18，將新城疫病毒HN基因通過同源重組插入到282E4株雞痘病毒的復(fù)制非必需區(qū)FPV12-18，從而獲得了表達(dá)新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-1218NDHN。與構(gòu)建的表達(dá)HN基因的重組病毒rFPV-HN相比，該疫苗在高母源抗體商品雞上具有較強(qiáng)的抵抗母源抗體干擾的能力。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下(1)表達(dá)新城疫病毒HN基因的轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建將ZJ1株新城疫病毒(NDV)的HN基因插入表達(dá)載體p12-18，獲得表達(dá)NDVHN基因的重組FPV轉(zhuǎn)移載體pl218NDHN。用堿裂解法制備轉(zhuǎn)移載體的質(zhì)粒DNA并以PEG純化質(zhì)粒DNA。(2)表達(dá)新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒的構(gòu)建將(1)中構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體pl218NDHN與282E4株FPV共轉(zhuǎn)染CEF。具體方法是在35mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)CEF，使形成60%的單層后以0.1MOl的282E4株FPV感染，37。C吸附2小時(shí)后傾去上清培養(yǎng)基，力Qlml含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基；將1(ig轉(zhuǎn)移載體溶解-T50|il的無血清DMEM培養(yǎng)基；取5nl轉(zhuǎn)染試劑FuGENETM6緩慢加入到lOOpl無血清DMEM培養(yǎng)基中，兩者混勻置室溫作用15min，然后緩緩滴加至上述CEF中，邊滴邊混勻，置37。C培養(yǎng)3小時(shí)后補(bǔ)加1ml含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基；12h后更換為含1%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置37。C繼續(xù)培養(yǎng)；CEF產(chǎn)生80%病變后收獲病毒，反復(fù)凍融3次，低速離心去除細(xì)胞碎片，上清用于重組病毒的篩選和純化。將上清稀釋液接種60mm平皿上長成致密單層的CEF，37°C培養(yǎng)約72h，待出現(xiàn)較多病毒蝕斑后，用含有200pg/mlX-gal的營養(yǎng)瓊脂覆蓋，待出現(xiàn)藍(lán)色蝕斑后挑取藍(lán)色蝕斑，用吸管將其吸出，轉(zhuǎn)入0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)維持液中，凍融3次，低速離心去除細(xì)胞與瓊脂碎片，取上清感染次代細(xì)胞。在60mm平皿中重復(fù)進(jìn)行以十.步驟后，于96孔板上篩選數(shù)次，直至在X-gal存在的條件下，重組病毒在CEF上所形成的蝕斑全部呈藍(lán)色。即可得到純化的重組病毒，即282E4株重組病毒rFPV-1218NDHN。重組病毒中外源基因的插入和表達(dá)可通過PCR擴(kuò)增外源基因和間接免疫熒光試驗(yàn)予以鑒定。(3)新構(gòu)建的重組雞痘病毒rFPV-1218NDHN與原有重組雞痘病毒rFPV-HN在有母源抗體商品雞上的免疫效力比較試驗(yàn)。將1日齡商品蛋雞隨機(jī)分組，52只/組，進(jìn)行隔離飼養(yǎng)。1曰齡ND的HI抗體效價(jià)平均約為28。于10日齡頸部皮下分別接種rFPV-1218NDHN、rFPV-HN和野生型雞痘病毒FPV282，10》FU/只，同時(shí)設(shè)ND油苗對照組，0.2ml/只。免疫后28d進(jìn)行滴鼻攻毒，每只試驗(yàn)雞接種105ELD5Q的F48E8株NDV強(qiáng)毒。觀察14d，記錄發(fā)病死亡情況。對免疫效力試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在高母源抗體的商品雞上，重組病毒rFPV-1218NDHN、rFPV-HN和ND油苗保護(hù)率分別為85.4%、50.0%和83.3%，重組病毒rFPV-1218NDHN與rFPV-HN的保護(hù)率之間差異顯著，與常規(guī)油苗的免疫效力相當(dāng)，表明該重組病毒具有較強(qiáng)的地抵抗母源抗體干擾的能力。圖1為轉(zhuǎn)移載體pl218NDHN的構(gòu)建過程圖。圖2為三個(gè)不同組免疫保護(hù)率圖表。具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及的FPV(雞痘病毒)表達(dá)載體pl2-18，于2005年6月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNO:1385，其長度為10450bp，該載體以雞痘病毒新鑒定的復(fù)制非必需區(qū)FPV12-18為外源基因插入位點(diǎn)，是一個(gè)含有雞痘病毒復(fù)制非必需區(qū)側(cè)翼區(qū)FPVl和FPV2的表達(dá)載體，F(xiàn)PVl的核苷酸長度為1863bp，F(xiàn)PV2的核苷酸長度為1554bp。構(gòu)建FPV(雞痘病毒)表達(dá)載體pl2-18的具體步驟是1、定向克隆法篩選雞痘病毒的新復(fù)制非必需區(qū)FPV12-18病毒的增殖及基因組的提取按常規(guī)方法取9-10日齡的SPF雞胚，制成CEF單層。接種282E4株(中國疫苗株)FPV，在5%C02，37。C的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待病變達(dá)80%以上棄去原培養(yǎng)基，細(xì)胞用PBS洗兩遍后，加入適量PBS，用吸管將細(xì)胞吹下。低速離心棄上清，用少量PBS(50ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶用懸浮。提取方法參照HighPurePCRTemplatePreparationKit說明書進(jìn)行1.5ml的Eppendorf管中依次加入上述200^1樣品、200|ilBindingBuffer和40filProteinaseK，混勻；72。C作用10min后，加入100^1異丙醇；將上述混合物混勻后加入特定的離心管，8000rpm離心lmin，棄濾液；然后加入500|ilWashingBuffer,離心，洗滌兩遍；13000rpm離心10s，去除殘余的液體；加入200|ilElutionBuffer(7(TC預(yù)熱)，8000rpmlmin離心至干凈的Eppendorf管中，所得即為282E4株FPV基因組DNA。PCR擴(kuò)增FPV復(fù)制非必需區(qū)FPV12-18的側(cè)翼區(qū)FPVl和FPV2根據(jù)已發(fā)表的美國致病株雞痘病毒FPV的基因組全序列(AF198100)設(shè)計(jì)兩對引物，引物表達(dá)式P,5，一CGTAAGACTTATCCATACCGAG—3'P25，一GTTTCTAAGATCATCATGTCCTAC—3'P35,—CTGTAGTAGTTACTACATACGCAG—3'P45，一AACAGAAATAGCTCCTCTCATAC—3，P,位于ORF077的內(nèi)部，P2和P3均位于ORF073與ORF074兩個(gè)ORF之間的間隔區(qū)，P4位于ORF071的內(nèi)部。P，和P2跨幅約為1880bp，即FPV1，P3和P4跨幅約為1570bp，即FPV2。兩對引物分別用于擴(kuò)增雞痘病毒FPV復(fù)制非必需區(qū)各S的兩個(gè)側(cè)翼區(qū)(FPVl和FPV2)。引物中加入了便于克隆操作的限制性酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基。以282E4株FPV的基因組DNA為模板，用高保真PCR系統(tǒng)(ExpandHighFidelityPCRSystem)擴(kuò)增FPV復(fù)制非必需區(qū)側(cè)翼區(qū)FPVl和FPV2并進(jìn)行序列測定。2、構(gòu)建載體pP12:(1)用歷"d11I+屈oI雙酶切克隆載體pSK和上述回收的FPV2片段，37'C消化2h以后，電泳并回收約3.0kb的載體片段和約1.57kb的FPV2。然后按一定比例進(jìn)行連接成pSKP2，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，挑取白色菌落提質(zhì)粒并以/^"din+羞oI雙酶切(20W體系)，37。C消化1.5h以后，加4(il6xLoadingbuffer，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。陽性質(zhì)粒命名為pSKP2。(2)將pSKP2和FPV1分別用BamHI十&zcI、5g/1I十&cI進(jìn)行雙酶切，37。C消化2h后，電泳并回收約4.57kb的載體片段和約1.88kb的FPV1片段，按一定比例連接形成pSKPlP2，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5a，然后挑取白色齒落提質(zhì)粒并用州^1111+5^1雙酶切(20^1體系)，加4(^16xLoadingbuffer,用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，陽性質(zhì)粒命名為pSKPlP2。pSKPlP2分別以///din+屈oI和歷mlI雙酶切后電泳，可見預(yù)期目的條帶FPV2和FPV1，條帶大小分別約為1.57kb和1.93kb(其中包括約50bp的酶切位點(diǎn))，表明FPV1和FPV2已成功插入載體。(3)將pSKPlP2和pFGl175-1分別用I、I進(jìn)行單酶切，37°C消化2h后，電泳并回收約6.45kb的載體片段和約3.80kb的Pll-丄acZ標(biāo)記基因表達(dá)框，按一定比例連接構(gòu)成pP12，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5ot，然后挑取藍(lán)色菌落提質(zhì)粒并用&cI進(jìn)行酶切(20jxl體系)，37t:消化1.5h后，加4(il6xLoadingbuffer，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。篩選Pll-丄wZ標(biāo)記基因表達(dá)框止向插入的陽性質(zhì)粒，陽性質(zhì)粒命名為pP12。3、FPV復(fù)制非必需區(qū)的篩選將純化的載體質(zhì)粒pP12與282E4株FPV共轉(zhuǎn)染CEF，轉(zhuǎn)染試劑為FuGENE6TransfectionReagent,轉(zhuǎn)染及重組病毒的篩選純化按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。在35mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)CEF，使形成60%的單層后以0.1MOI的282E4株FPV感染，37。C吸附2小時(shí)后傾去上清培養(yǎng)基，力Blml含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基；將l(ig載體質(zhì)粒pP12溶解于5(^1的無血清DMEM培養(yǎng)基；取5^1轉(zhuǎn)染試劑FuGENETM6緩慢加入到1OO)il無血清DMEM培養(yǎng)基中，兩者混勻置室溫作用15min，然后緩緩滴加至上述CEF中，邊滴邊混勻，置37。C培養(yǎng)3小時(shí)后補(bǔ)加lml含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基；12h后更換為含1。/。小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置37'C繼續(xù)培養(yǎng)；CEF產(chǎn)生80%病變后收獲病毒，反復(fù)凍融3次，低速離心去除細(xì)胞碎片，上清用于重組病毒的篩選和純化。將上清稀釋液接種60mm平皿上長成致密單層的CEF，37。C培養(yǎng)約72h，待出現(xiàn)較多病毒蝕斑后，用含有200ng/mlX-gal的營養(yǎng)瓊脂覆蓋，待出現(xiàn)藍(lán)色蝕斑后挑取藍(lán)色蝕斑，見圖3，用吸管將其吸出，轉(zhuǎn)入0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)維持液中，凍融3次，低速離心去除細(xì)胞與瓊脂碎片，取上清感染次代細(xì)胞。在60mm平皿中重復(fù)進(jìn)行以上步驟后，于96孔板上篩選數(shù)次，直至在X-gal存在的條件下，重組病毒在CEF上所形成的蝕斑全部呈藍(lán)色。即可得到純化的重組病毒。重組病毒rFPV-12LSF的獲得表明，預(yù)先假定的復(fù)制非必需區(qū)均為真正的FPV復(fù)制非必需區(qū)，命名為FPV12-18。4、復(fù)制非必需區(qū)的遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)重組雞痘病毒接種CEF，在5%C02,37'C的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2-3天后待病變達(dá)80%以上后收獲,反復(fù)凍融3次，用于下次擴(kuò)增，連續(xù)傳10代。空斑計(jì)數(shù)后保存于-7(TC冰箱備用。分別取重組病毒的0、5、10代以10—3、10—4、10—5、〗0—6稀釋，接種生長在24孔板上單層次代CEF，100)il/孔。待出現(xiàn)單個(gè)蝕斑后，覆蓋含200(ig/mlX-gal的瓊脂，37°C，C02箱中培養(yǎng)1-2天觀察蝕斑純度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有病毒蝕斑均呈藍(lán)色。用PBS吹下擴(kuò)增的三個(gè)代次重組雞痘病毒的單層細(xì)胞，以HighPurePCRTemplatePreparationKit(寶靈曼公司)提取核酸模板DNA。按常規(guī)方法針對丄Z基因部分片段進(jìn)行PCR并測序，檢測外源基因在重組FPV傳代過程中是否發(fā)生變異，結(jié)果序列沒有發(fā)生任何變異。以上試驗(yàn)表明，重組病毒基因組中的丄MZ基因能夠穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，同時(shí)也證明了篩選的FPV復(fù)制非必需區(qū)FPV12-18具有良好的遺傳穩(wěn)定性。5、FPV(雞痘病毒)表達(dá)載體pl2-18的構(gòu)建將pNllS用歷"dlII+^SVwal進(jìn)行雙酶切，37。C消化2h后，電泳并回收約200bp的含MCS的Ps啟動(dòng)子，與同時(shí)用歷"dIll+SmaI雙酶切的載體pP12按一定比例連接構(gòu)建雞痘病毒表達(dá)載體pl2-18，將該載體轉(zhuǎn)化宿主菌DH5a，然后挑取藍(lán)色菌落提質(zhì)粒，并用///dIll+SmaI雙酶切(20(il體系)，加4(al6xLoadingbuffer,用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，陽性質(zhì)粒分別命名為pl2-18。經(jīng)測序，F(xiàn)PV表達(dá)載體pl2-18的長度為10450bp，該載體以雞痘病毒新鑒定的復(fù)制非必需區(qū)FPV12-18為外源基因插入位點(diǎn)，是一個(gè)含有雞痘病毒復(fù)制非必需區(qū)側(cè)翼區(qū)FPV1和FPV2的表達(dá)載體。一、表達(dá)新城疫病毒HN基因的轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建質(zhì)粒pTHN用8g/II+loI雙酶切，回收約1.7kb的HN片段，與經(jīng)"amH1+&/1雙酶切的表達(dá)載體卩12-18進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5a，然后挑取藍(lán)色菌落提質(zhì)粒，并用尸wl酶切(20pl體系)，加4^16xLoadingbuffer,用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。陽性質(zhì)粒命名為pl218NDHN。pNllSHN具體構(gòu)建過程見圖1。用堿裂解法制備轉(zhuǎn)移載體的質(zhì)粒DNA并以PEG純化質(zhì)粒DNA。二、表達(dá)新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒的構(gòu)建將純化的載體質(zhì)粒pl218NDHN與282E4株FPV共轉(zhuǎn)染CEF，轉(zhuǎn)染試劑為FuGENE6TransfectionReagent,轉(zhuǎn)染及重組病毒的篩選純化按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。在35mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)CEF，使形成60%的單層后以0.1MOI的282E4株FPV感染，37。C吸附2小時(shí)后傾去上清培養(yǎng)基，力Ulml含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基；將lpg轉(zhuǎn)移載體溶解于50jil的無血清DMEM培養(yǎng)基；取5M1轉(zhuǎn)染試劑FuGENE6緩慢加入到lOOpl無血清DMEM培養(yǎng)基中，兩者混勻置室溫作用15min，然后緩緩滴加至上述CEF中，邊滴邊混勻，置37。C培養(yǎng)3小時(shí)后補(bǔ)加lml含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基；12h后更換為含1%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置37。C繼續(xù)培養(yǎng)；CEF產(chǎn)生80%病變后收獲病毒，反復(fù)凍融3次，低速離心去除細(xì)胞碎片，上清用于重組病毒的篩選和純化。將上清稀釋液接種60mm平皿上長成致密單層的CEF，37。C培養(yǎng)約72h，待出現(xiàn)較多病毒蝕斑后，用含有200^g/mlX-gal的營養(yǎng)瓊脂覆蓋，待出現(xiàn)藍(lán)色蝕斑后挑取藍(lán)色蝕斑，用吸管將其吸出，轉(zhuǎn)入0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)維持液中，凍融3次，低速離心去除細(xì)胞與瓊脂碎片，取上清感染次代細(xì)胞。在60mm平皿中重復(fù)進(jìn)行以上歩驟后，于96孔板上篩選數(shù)次，直至在X-gal存在的條件下，重組病毒在CEF上所形成的蝕斑全部呈藍(lán)色。即可得到純化的重組病毒，即282E4株重組病毒rFPV-1218NDHN。重組病毒的0、5、10代接種24孔板上的單層次代CEF，待出現(xiàn)單個(gè)蝕斑后，覆蓋含200pg/mlX-gal的瓊脂，發(fā)現(xiàn)所有病毒蝕斑均呈藍(lán)色。而間接免疫熒光試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所有病毒蝕斑均呈現(xiàn)特異性熒光，陰性對照組無特異性熒光。對5、IO代重組病毒中的HN基因進(jìn)行PCR，結(jié)果均可以擴(kuò)增出1.7Kb的目的條帶，與預(yù)期值相符。測序結(jié)果顯示，所測序列沒有發(fā)生任何變異。以上試驗(yàn)表明，重組病毒基因組中的HN基因均能夠穩(wěn)定地遺傳和表達(dá)。三、重組雞痘病毒rFPV-1218NDHN在高母源抗體商品雞上的免疫效力試驗(yàn)將1日齡商品蛋雞隨機(jī)分組，52只/組，進(jìn)行隔離飼養(yǎng)。1日齡ND的HI抗體效價(jià)平均約為28。于10日齡頸部皮下分別接種rFPV-1218NDHN、rFPV-HN和野生型雞痘病毒FPV282，105PFUGn、，同時(shí)設(shè)ND油苗對照組，0.2ml/只。免疫后28d進(jìn)行滴鼻攻毒，每只試驗(yàn)雞接種105ELD5。的F48E8株NDV強(qiáng)毒。觀察14d，記錄發(fā)病死亡情況。商品雞10日齡時(shí)ND母源抗體的平均HI效價(jià)為2(5Q±a6)。由表1和圖2可見，組病毒rFPV-1218NDHN、rFPV-HN和ND油苗保護(hù)率分別為85.4%、50.0%和83.3%，可見重組病毒rFPV-1218NDHN與rFPV-HN的保護(hù)率之間差異顯著，與常規(guī)油苗的免疫效力相當(dāng)，表明該重組病毒具有較強(qiáng)的地抵抗母源抗體干擾的能力。表1重組FPV在10日齡商品雞上的免疫效力試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>NDH1效價(jià)-平均H效價(jià)(log2x)±標(biāo)準(zhǔn)差；FPV282:282E4株野生型雞痘病毐免疫保護(hù)率=(攻毒對照組死亡率一疫苗免疫組死亡率)/攻毒對照組死亡率><100%a、b差異顯著(PO.05)cgtaagacttatccateccgaggtttctaagatcatcatgtcctacctgtagtagttactacatacgcagjiac嗎aaatagctcctctcatec權(quán)利要求1、表達(dá)新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-1218NDHN，其特征在于其保藏號(hào)為CGMCCNO1912。2、如權(quán)利要求1所述表達(dá)新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-1218NDHN的構(gòu)建方法，其特征在于利用FPV表達(dá)載體pl2-18，將新城疫病毒HN基因通過同源重組插入到282E4株雞痘病毒的復(fù)制非必需區(qū)FPV12-18，從而獲得了表達(dá)新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-1218NDHN。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述表達(dá)新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-1218NDHN的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟(1)表達(dá)新城疫病毒HN基因的轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建將ZJ1株新城疫病毒NDV的HN基因插入表達(dá)載體pl2-18，獲得表達(dá)NDVHN基因的重組FPV轉(zhuǎn)移載體pl218NDHN，用堿裂解法制備轉(zhuǎn)移載體的質(zhì)粒DNA并以PEG純化質(zhì)粒DNA;(2)表達(dá)新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒的構(gòu)建將(1)中構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體pl218NDHN與282E4株FPV共轉(zhuǎn)染CEF。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述表達(dá)新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-1218NDHN的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(2)中，在35mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)CEF，使形成60%的單層后以0.1MOI的282E4株FPV感染，37°C吸附2小時(shí)后傾去上清培養(yǎng)基，加lml含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基；將l)ig轉(zhuǎn)移載體溶解于50|il的無血清DMEM培養(yǎng)基；取5^1轉(zhuǎn)染試劑FuGENETM6緩慢加入到lOOpl無血清DMEM培養(yǎng)基中，兩者混勻置室溫作用15min，然后緩緩滴加至上述CEF中，邊滴邊混勻，置37'C培養(yǎng)3小時(shí)后補(bǔ)加lml含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基；12h后更換為含1%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置37"C繼續(xù)培養(yǎng)；CEF產(chǎn)生80%病變后收獲病毒，反復(fù)凍融3次，低速離心去除細(xì)胞碎片，上清用于重組病毒的篩選和純化，將上清稀釋液接種60mm平皿上長成致密單層的CEF，37。C培養(yǎng)約72h，待出現(xiàn)較多病毒蝕斑后，用含有200pg/mlX-gal的營養(yǎng)瓊脂覆蓋，待出現(xiàn)藍(lán)色蝕斑后挑取藍(lán)色蝕斑，用吸管將其吸出，轉(zhuǎn)入0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)維持液中，凍融3次，低速離心去除細(xì)胞與瓊脂碎片，取上清感染次代細(xì)胞，在60mm平皿中重復(fù)進(jìn)行以上步驟后，于96孔板上篩選數(shù)次，直至在X-gal存在的條件下，重組病毒在CEF上所形成的蝕斑全部呈藍(lán)色，即可得到純化的重組病毒，即表達(dá)新城疫HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-1218NDHN。全文摘要表達(dá)新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-1218NDHN及其構(gòu)建方法，涉及疫苗的構(gòu)建領(lǐng)域。利用FPV表達(dá)載體p12-18，將新城疫病毒HN基因通過同源重組插入到282E4株雞痘病毒的復(fù)制非必需區(qū)FPV12-18，獲得表達(dá)新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗。本發(fā)明與構(gòu)建的表達(dá)HN基因的重組病毒rFPV-HN相比，該疫苗在高母源抗體商品雞上具有較強(qiáng)的抵抗母源抗體干擾的能力。文檔編號(hào)A61P31/12GK101096686SQ20071002268公開日2008年1月2日申請日期2007年5月25日優(yōu)先權(quán)日2007年5月25日發(fā)明者劉武杰,劉秀梵,蕾孫,陳素娟申請人:揚(yáng)州大學(xué)