專利名稱：糖皮質激素修飾聚乙烯亞胺的基因載體材料的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基因藥物的載體的制備技術，尤其涉及一種糖皮質激素修飾聚乙 烯亞胺的基因載體材料的制備方法。
背景技術：
隨著分子生物學的發(fā)展，特別是人類基因庫的建立和人類疾病相關基因的闡明， 疾病的基因治療應運而生，并已發(fā)展為當代醫(yī)學和生物學的一個新的研究領域，被認為是 治療遺傳性先天疾病、惡性腫瘤、傳染病等最有希望的治療方案之一。目前的轉染載體基本上可分為兩類病毒載體與非病毒載體。非病毒基因載體能 夠克服病毒基因載體的許多內在問題，諸如無免疫原性、無遺傳毒性、細胞毒性低、成本低 等等，是治療基因體內給藥不可替代的傳遞系統(tǒng)，具有重要的臨床實用潛力。但是，相比于 病毒載體，非病毒載體的轉染效率低，限制了其實際應用。糖皮質激素是一種強疏水性的類固醇激素，能與細胞中的糖皮質激素受體(GR) 結合，形成激素_受體復合物，瞬間轉移入細胞核，通過正性或負性調節(jié)基因轉錄，改變細 胞的生理功能。GR為多蛋白復合體，存在于幾乎所有脊椎動物組織細胞中，在無配體存在時 主要存在于細胞質，其核定位信號(NLS)被隱藏。GR與強疏水性的糖皮質激素結合以后， NLS被暴露出來，其可以短暫改變核屏障的結構與穿透性，將核膜上的核孔擴張至60nm，有 利于大分子物質轉位至細胞核。因此可以選擇糖皮質激素作為NLS，提高基因載體的轉染效 率。聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，PEI)是一種陽離子聚合物，PEI的單體 為-CH2-CH2-NH-，結構骨架中每三個原子中含一個氨基，具有很高的正電荷密度，具有較強 的DNA結合能力和細胞吸附能力。PEI具有強大的緩沖能力，被細胞內吞后能抑制溶酶體內 酸化，防止所傳遞的DNA被降解，并改變溶酶體中的離子滲透壓，引起溶酶體膜的破裂并釋 放其中的DNA，Sr質子海綿”效應。PEI的分子量范圍很寬，其分子量對其轉染效果和細胞 毒性影響很大。分子量越高，PEI表面的電荷密度越大，轉染效率越高，毒性越大。低分子 量PEI的毒性較低，其轉染效率也較低。PEI進入細胞后不會進入細胞核，因此如果將糖皮 質激素與小分子量PEI連接，預計能得到低毒、高效的基因載體。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種糖皮質激素修飾聚乙烯亞胺的基 因載體材料的制備方法，本發(fā)明通過糖皮質激素的NLS作用，可以提高基因轉染效率。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的一種糖皮質激素修飾聚乙烯亞胺的 基因載體材料的制備方法，包括以下步驟(1)將糖皮質激素上的C-21羥基用甲磺酰氯酯化，合成糖皮質激素21位甲磺酸 (2)將合成的糖皮質激素21位甲磺酸酯與低分子量PEI用Traut’ s試劑連接合
3成目標產物糖皮質激素修飾聚乙烯亞胺。進一步地，所述步驟(1)具體為取C-21羥基的糖皮質激素用無水吡啶溶解，溶液 于0°C，N2保護，攪拌下，慢慢滴加過量的甲磺酰氯，反應于0°C進行5h，反應溶液加入0°C的 過量的純水終止反應，抽濾，冰水洗滌，真空干燥，得到白色固體，即糖皮質激素21位甲磺酸酯。進一步地，所述無水吡啶的制備如下吡啶中加入NaOH，加熱回流2小時，再蒸餾 得到無水吡啶。進一步地，所述步驟(2)具體為將合成的糖皮質激素21位甲磺酸酯和Traut’ s 試劑溶于無水DMS0中，將低分子量PEI 1800溶于無水DMS0中，在N2保護下滴加入前者溶 液中，邊加邊攪拌。反應室溫下進行4h，然后加入過量的冰的乙酸乙酯，過濾得到淡黃色沉 淀，加入適量純水溶解，0. 45um微孔濾膜過濾，純水透析48小時。冷凍干燥得淡黃色固體， 即為目標產物糖皮質激素修飾聚乙烯亞胺。進一步地，所述無水DMS0的制備如下DMS0中加入氫化鈣，放置48小時，減壓蒸 餾得無水DMS0。本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明用糖皮質激素修飾低分子量PEI，合成一種新型的基 因載體材料，這種材料具有“質子海綿作用”，能夠有效結合DNA，又能夠在糖皮質激素的介 導下加入細胞核，提高轉染效率，是一種低毒，高效，合成簡單的非病毒基因載體，具有廣闊 的應用前景。


圖1是糖皮質激素修飾聚乙烯亞胺的合成路線；圖2是糖皮質激素21位甲磺酸酯的i-NMR圖譜；圖3是糖皮質激素修飾聚乙烯亞胺的i-NMR圖譜；圖4是糖皮質激素修飾聚乙烯亞胺的細胞毒性圖；圖5是糖皮質激素修飾聚乙烯亞胺的細胞轉染效率圖。
具體實施例方式本發(fā)明糖皮質激素修飾聚乙烯亞胺的基因載體材料的制備方法，包括以下步驟1.將糖皮質激素上的C-21羥基用甲磺酰氯酯化，合成糖皮質激素21位甲磺酸酯。所用糖皮質激素的21位為羥基，取C-21羥基的糖皮質激素用無水吡啶溶解，溶液 于0°C，N2保護，攪拌下，慢慢滴加過量的甲磺酰氯，反應于0°C進行5h，反應溶液加入0°C的 過量的純水終止反應，抽濾，冰水洗滌，真空干燥，得到白色固體，即糖皮質激素21位甲磺 酸酯。2.糖皮質激素21位甲磺酸酯與低分子量PEI用Traut's試劑連接合成目標產物 糖皮質激素修飾聚乙烯亞胺。將糖皮質激素21位甲磺酸酯和Traut，s試劑溶于無水DMS0中，將低分子量PEI 1800溶于無水DMS0中，在N2保護下滴加入前者溶液中，邊加邊攪拌。反應室溫下進行4h， 然后加入過量的冰的乙酸乙酯，過濾得到淡黃色沉淀，加入適量純水溶解，0. 45um微孔濾 膜過濾，純水透析(截留分子量1000)48小時。冷凍干燥得淡黃色固體，即為目標產物糖皮
4質激素修飾聚乙烯亞胺。無水吡啶的制備如下吡啶中加入適量NaOH，加熱回流2小時，再蒸餾得到無水吡啶。無水DMS0的制備如下DMS0中加入氫化鈣，放置48小時，減壓蒸餾得無水DMS0。下面根據實施例詳細描述本發(fā)明，本發(fā)明的目的和效果將變得更加明顯。實施例1 取倍他米松196. 25mg用無水吡啶溶解，溶液于0°C，N2保護，攪拌下，慢慢滴加過 量的甲磺酰氯78 u L，反應于0°C進行5h，反應溶液加入0°C的過量的冰水(約80mL)終止 反應，抽濾，冰水洗滌，真空干燥，得到白色固體，為倍他米松21位甲磺酸酯。核磁圖參見附 圖2。將4倍過量的倍他米松21位甲磺酸酯117. 65mg和Traut，s試劑34. 4mg溶于無 水DMSO 2mL中，將低分子量PEI 1800 112. 5mg溶于無水DMSO 2mL中，在N2保護下滴加入 前者溶液中，邊加邊攪拌。反應室溫下進行4h，然后加入過量的冰的乙酸乙酯80mL，過濾得 到淡黃色沉淀，加入適量純水溶解，0. 45um微孔濾膜過濾，純水透析(截留分子量1000) 48 小時。冷凍干燥得淡黃色固體，即為倍他米松-聚乙烯亞胺。合成反應方程式參見附圖1。 核磁圖參見附圖3。實施例2:取地塞米松196. 25mg用無水吡啶溶解，溶液于0°C，N2保護，攪拌下，慢慢滴加過 量的甲磺酰氯78 u L，反應于0°C進行5h，反應溶液加入0°C的過量的冰水80mL終止反應， 抽濾，冰水洗滌，真空干燥，得到白色固體，為地塞米松21位甲磺酸酯。核磁圖參見附圖2。將地塞米松21位甲磺酸酯117. 65mg和Traut，s試劑34. 4mg溶于無水DMSO 2mL 中，將低分子量PEI 1800 112. 5mg溶于無水DMSO 2mL中，在N2保護下滴加入前者溶液中， 邊加邊攪拌。反應室溫下進行4h，然后加入過量的冰的乙酸乙酯80mL，過濾得到淡黃色沉 淀，加入適量純水溶解，0. 45 ym微孔濾膜過濾，純水透析(截留分子量1000)48小時。冷凍 干燥得淡黃色固體，即為地塞米松_聚乙烯亞胺。合成反應方程式參見附圖1。核磁圖參見 附圖3。實施例3 取甲基氫化潑尼松187. 24mg用無水吡啶溶解，溶液于0°C，N2保護，攪拌下，慢慢 滴加過量的甲磺酰氯78 u L，反應于0°C進行5h，反應溶液加入0°C的過量的冰水80mL終止 反應，抽濾，冰水洗滌，真空干燥，得到白色固體，為甲基氫化潑尼松21位甲磺酸酯。核磁圖 參見附圖2。將甲基氫化潑尼松21位甲磺酸酯113. 2mg和Traut，s試劑34. 4mg溶于無水DMS0 2mL中，將低分子量PEI 1800 112. 5mg溶于無水DMSO 2mL中，在N2保護下滴加入前者溶液 中，邊加邊攪拌。反應室溫下進行4h，然后加入過量的冰的乙酸乙酯80mL，過濾得到淡黃色 沉淀，加入適量純水溶解，0. 45 ym微孔濾膜過濾，純水透析(截留分子量1000)48小時。冷 凍干燥得淡黃色固體，即為甲基氫化潑尼松-聚乙烯亞胺。合成反應方程式參見附圖1。核 磁圖參見附圖3。實施例4 取氫化潑尼松180. 2mg用無水吡啶溶解，溶液于0°C，N2保護，攪拌下，慢慢滴加過量的甲磺酰氯78 u L，反應于0°C進行5h，反應溶液加入0°C的過量的冰水80mL終止反應， 抽濾，冰水洗滌，真空干燥，得到白色固體，為氫化潑尼松21位甲磺酸酯。核磁圖參見附圖 2。將氫化潑尼松21位甲磺酸酯109. 6mg和Traut，s試劑34. 4mg溶于無水DMSO 2mL 中，將低分子量PEI 1800 112. 5mg溶于無水DMSO 2mL中，在N2保護下滴加入前者溶液中， 邊加邊攪拌。反應室溫下進行4h，然后加入過量的冰的乙酸乙酯80mL，過濾得到淡黃色沉 淀，加入適量純水溶解，0. 45 ym微孔濾膜過濾，純水透析(截留分子量1000)48小時。冷凍 干燥得淡黃色固體，即為氫化潑尼松-聚乙烯亞胺。合成反應方程式參見附圖1。核磁圖參 見附圖3。實施例5 取氫化可的松181. 2mg用無水吡啶溶解，溶液于0°C，N2保護，攪拌下，慢慢滴加過 量的甲磺酰氯78 u L，反應于0°C進行5h，反應溶液加入0°C的過量的冰水80mL終止反應， 抽濾，冰水洗滌，真空干燥，得到白色固體，為氫化可的松21位甲磺酸酯。核磁圖參見附圖 2。將氫化可的松21位甲磺酸酯110. 14mg和Traut，s試劑34. 4mg溶于無水DMS0 2mL中，將低分子量PEI 1800 112. 5mg溶于無水DMSO 2mL中，在N2保護下滴加入前者溶液 中，邊加邊攪拌。反應室溫下進行4h，然后加入過量的冰的乙酸乙酯80mL，過濾得到淡黃色 沉淀，加入適量純水溶解，0. 45 ym微孔濾膜過濾，純水透析(截留分子量1000)48小時。冷 凍干燥得淡黃色固體，即為氫化可的松-聚乙烯亞胺。合成反應方程式參見附圖1。核磁圖 參見附圖3。實施例6 糖皮質激素21位甲磺酸酯和糖皮質激素-聚乙烯亞胺(GC-PEI)的核 磁共振表征將適量糖皮質激素21位甲磺酸酯溶于氘代DMS0中，進行500MHzlH-NMR掃描(參 見附圖2)。將適量GC-PEI溶于氘水中，進行500MHz 1H-NMR掃描(參見附圖3)。實施例7 各種GC-PEI材料的細胞毒性HepG 2細胞(1X104/孔)接種于96孔培養(yǎng)板，過夜培養(yǎng)至細胞貼壁，匯合度為 60 80%。PBS洗滌后加入無血清培養(yǎng)基lOOiiL/孔，并加入不同量的PEI1800、PEI 25K、 GC-PEI材料，空白對照組加100 yL無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h之后移去培養(yǎng)基，加 入180 ii L無血清培養(yǎng)基和20 ii L MTT (5mg/mL)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，加入100 u L DMSO每 孔，振搖lOmin，酶標儀上，于570nm測定A值。按以下公式計算細胞生存率。細胞生存率(％ ) = (A樣品/八空白)X100%結果表明GC-PEI材料的細胞毒性小于PEI 25K，大于PEI 1800，結果參見附圖4。實施例8 各種GC-PEI材料的細胞轉染效率測定pGL-3轉染細胞HepG 2細胞(1X105/孔)接種于24孔培養(yǎng)板，過夜培養(yǎng)至細胞貼壁，匯合度為 60 80%。將GC-PEI材料溶液、PEI 25K、PEI 1800、pGL-3質粒DNA溶液過濾除菌，按照 不同質量比用滅菌純水稀釋、混合、孵育30min，得復合物。將24孔板中培養(yǎng)基吸去，滅菌 PBS洗一遍，將配好的復合物加入細胞中，控制每孔的DNA含量為2 y g。再加入不含血清的 培養(yǎng)基，使每孔的總體積為500 iiL。以PEI 25K為陽性對照，PEI 1800為陰性對照。放入37°C C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)6小時，吸去轉染液，每孔加入500 iiL含10%小牛血清的培養(yǎng)基，繼 續(xù)培養(yǎng)48h。吸去培養(yǎng)基，PBS洗一次，每孔加入500 u L細胞裂解液，裂解30min，轉移至EP 管中，12000rpm，4°C 離心 5min。取 100 ii L 上清液，加入 100 ii L Luc if erase (Promega)測定 相對光單位。其蛋白含量用BCA蛋白檢測試劑盒檢測。以相對光單位/蛋白含量作為轉染 效率的評價指標，結果見附圖5。結果表明GC-PEI材料在最佳質量比時轉染效率大于PEI 1800。本發(fā)明所涉及的糖皮質激素不限于實施例中的糖皮質激素，包括所有具有21位 羥基的糖皮質激素。上述實施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進行限制，在本發(fā)明的精神和 權利要求的保護范圍內，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
一種糖皮質激素修飾聚乙烯亞胺的基因載體材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將糖皮質激素上的C-21羥基用甲磺酰氯酯化，合成糖皮質激素21位甲磺酸酯。(2)將合成的糖皮質激素21位甲磺酸酯與低分子量PEI用Traut’s試劑連接合成目標產物糖皮質激素修飾聚乙烯亞胺。
2.根據權利要求1所述糖皮質激素修飾聚乙烯亞胺的基因載體材料的制備方法，其特 征在于，所述步驟(1)具體為取C-21羥基的糖皮質激素用無水吡啶溶解，溶液于0°C，N2 保護，攪拌下，慢慢滴加過量的甲磺酰氯，反應于0°C進行5h，反應溶液加入0°C的過量的純 水終止反應，抽濾，冰水洗滌，真空干燥，得到白色固體，即糖皮質激素21位甲磺酸酯。
3.根據權利要求2所述糖皮質激素修飾聚乙烯亞胺的基因載體材料的制備方法，其特 征在于，所述無水吡啶的制備如下吡啶中加入NaOH，加熱回流2小時，再蒸餾得到無水吡 啶。
4.根據權利要求1所述糖皮質激素修飾聚乙烯亞胺的基因載體材料的制備方法，其特 征在于，所述步驟(2)具體為將合成的糖皮質激素21位甲磺酸酯和Traut’ s試劑溶于無 水DMSO中，將低分子量PEI 1800溶于無水DMSO中，在N2保護下滴加入前者溶液中，邊加 邊攪拌。反應室溫下進行4h，然后加入過量的冰的乙酸乙酯，過濾得到淡黃色沉淀，加入適 量純水溶解，0. 45 μ m微孔濾膜過濾，純水透析48小時。冷凍干燥得淡黃色固體，即為目標 產物糖皮質激素修飾聚乙烯亞胺。
5.根據權利要求4所述糖皮質激素修飾聚乙烯亞胺的基因載體材料的制備方法，其 特征在于，所述無水DMSO的制備如下DMS0中加入氫化鈣，放置48小時，減壓蒸餾得無水 DMSO0
全文摘要
本發(fā)明提供一種糖皮質激素修飾聚乙烯亞胺的基因載體材料的制備方法，該方法先將糖皮質激素的21位羥基與甲磺酰氯生成21位甲磺酸酯，再將糖皮質激素21位甲磺酸酯和低分子量PEI用Traut’s試劑連接，經過純化，凍干得到目標產物。本發(fā)明具有“質子海綿作用”，能夠有效結合DNA，又能夠在糖皮質激素的介導下加入細胞核，提高轉染效率，是一種低毒，高效，合成簡單的基因載體，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C08G73/04GK101864075SQ200910154929
公開日2010年10月20日 申請日期2009年11月30日 優(yōu)先權日2009年11月30日
發(fā)明者王成潤, 胡敏新, 金 一, 馬昆, 齊巖 申請人:浙江大學