專利名稱：富含阿魏酸松柏酯的中藥提取物的制備方法及其在制備藥物、保健品或化妝品中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于中藥活性成分的制備及其應用，具體涉及一種富含阿魏酸松柏酯的中藥提取物的制備方法，以及這種富含阿魏酸松柏酯的中藥提取物在制備抗衰老和防治心腦血管疾病的藥物、保健品或化妝品中的應用。
背景技術：
細胞在新陳代謝過程中能產(chǎn)生許多自由基，過多的自由基可導致組織損害，進而引起多種疾病，如衰老和心腦血腦疾病等[黃進，楊國宇，李宏基，等.自然雜志2004，26，74-78；凌關庭.糧食與油脂2003，9，50-53；Valko M，Leibfritz D，Moncol J，et al.Int.J.Biochem.Cell Biol.2007，39，44-84.]。合成抗氧化劑如BHT，BHA等對生物體有潛在的毒副作用，因此，從中草藥資源中尋求高效、低毒的天然抗氧化劑對醫(yī)藥、營養(yǎng)、化妝和食品工程的發(fā)展具有重要意義[成喜雨，崔馨，劉春朝，等.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)2006，18，514-518]。血小板則是一種多功能且沒有細胞核的血細胞，具有黏附、聚集、釋放、吸附等特性，參與生理性止血、凝血。在正常血循環(huán)中血小板處于靜息狀態(tài)，當血小板受到生物或物理刺激后，血小板胞漿內顆粒膜糖蛋白釋放與質膜融合，使血小板膜表面糖蛋白發(fā)生數(shù)量重排和構象變化成為活化的血小板而聚集。血小板聚集可導致血栓形成、動脈粥樣硬化、心肌梗死、中風等多種心腦血管疾病。因此，具有抗氧化作用的抗血板聚集化合物可從兩方面協(xié)同發(fā)揮防治衰老和心腦血管疾病作用。
中藥是我國傳統(tǒng)文化的寶貴遺產(chǎn)，迄今為止已經(jīng)有數(shù)千年的臨床實踐經(jīng)驗，并且業(yè)已形成了自己獨有的一套理論體系，在華人社會有著極其廣泛的認受性。研究中藥活性成分，是發(fā)展現(xiàn)代中藥新藥的重要途徑之一。當歸、川芎、遼藁本和藁本分別為傘形科植物當歸Angelica sinensis(Oliv.)Diels、川芎Ligusticum chuanxiong Hort.、遼藁本Ligusticum jeholense Nakai et Kitag和藁本Ligusticum sinense Oliv.的干燥根和/或根莖。阿魏酸松柏酯(3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸-3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯)結構式如

圖1所示，在當歸和川芎中的存在已有報道，藥理研究顯示其有一定的抗癌[中國科學院大連化學物理研究所，中國專利，公開號CN1608616，2005-04-27；L.Kong，Z.Y.Yu，Y.M.Bao，et al.Anal Bioanal Chem 2006，386，264-274]、擴血管[TSUMURA & CO，日本專利，公開號JP07233060，1995-09-05]和殺菌[S.C.Chou，M.C.Everngam，G.Sturtz et al.Phytother.Res.2006，20，153-156.]等活性。已有的阿魏酸松柏酯分離純化方法較復雜，不便于工業(yè)化生產(chǎn)。此外，當歸具有抗氧化和抗血小板聚集作用[黃桂香.時珍國醫(yī)國藥2001，12262-263.；王芳，李東.中國藥房2003，14630-631.]，但阿魏酸松柏酯是否具有此類作用尚未見報道。
阿魏酸松柏酯結構式如下
發(fā)明內容本發(fā)明目的是提供一種富含阿魏酸松柏酯的中藥提取物(阿魏酸松柏酯富集物)在防治衰老和心腦血管疾病方面的應用；本發(fā)明還涉及該富含阿魏酸松柏酯的中藥提取物(阿魏酸松柏酯富集物)的制備方法。該方法在于建立能夠適應工業(yè)化大生產(chǎn)要求，簡便、快速制備富含阿魏酸松柏酯的中藥提取物(阿魏酸松柏酯富集物)的方法，并研究其抗氧化和抗血小板聚集作用，以開發(fā)可用于防治衰老(自由基損傷)及心腦血管疾病的藥物或化妝品。
本發(fā)明上述各發(fā)明目的是通過如下技術方案實現(xiàn)的一種富含阿魏酸松柏酯的中藥提取物在制備抗衰老和防治心腦血管疾病的藥物或保健品或化妝品中的應用。
所述的富含阿魏酸松柏酯的中藥提取物，是通過其具有的抗氧化和抗血小板聚集的作用，在所制備的藥物或保健品或化妝品中產(chǎn)生抗衰老和防治心腦血管疾病的效果。
以上應用方法的效果見以下實驗利用比色法試驗(DPPH自由基清除、ABTS自由基清除及對β-胡蘿卜素漂白)測定阿魏酸松柏酯富集物對自由基的清除作用，發(fā)現(xiàn)阿魏酸松柏酯具有明顯的抗氧化作用，結果見表1。
體外測定阿魏酸松柏酯對DPPH自由基的清除作用配制一系列濃度阿魏酸松柏酯富集物(阿魏酸松柏酯含量92％)的乙醇溶液和0.15mM的DPPH自由基甲醇溶液，0.5ml樣品溶液加入0.5mlDPPH溶液，室溫避光反應15min后測定該反應液在515nm下的吸光度，結果表明阿魏酸松柏酯有濃度依賴性清除DPPH自由基作用，其IC50為15.2μg/ml。
體外測定阿魏酸松柏酯對ABTS自由基的清除作用配制一系列濃度阿魏酸松柏酯富集物(阿魏酸松柏酯含量92％)的乙醇溶液和3.5mM的ABTS自由基乙醇溶液，10μL樣品溶液加入990μL ABTS溶液，室溫避光反應10min后測定該反應液在750nm下的吸光度。結果表明阿魏酸松柏酯有濃度依賴性清除DPPH自由基作用，其IC50為7.7μg/ml。
體外測定阿魏酸松柏酯對β胡蘿卜素漂白作用20μL亞油酸加入0.2ml吐溫-20置于燒瓶中，加入0.5ml β-胡蘿卜素的氯仿溶液(1.0mg·mL-1)。40℃下將氯仿旋轉蒸發(fā)。于殘留物中加入50ml蒸餾水，劇烈振搖使之形成穩(wěn)定的乳濁液。取5ml該乳濁液，加入0.2ml不同濃度的阿魏酸松柏酯的乙醇溶液，迅速在460nm下測定其吸收度，空白對照為不含β-胡蘿卜素的乳濁液。試管置于50℃水浴中，每隔15min測定其吸收度直至空白對照的吸光度至0.1。結果表明阿魏酸松柏酯有濃度依賴性對抗β胡蘿卜素漂白作用，其IC50為2.0μg/ml。
表1.不同含量阿魏酸松柏酯(CF)提取物的抗氧化作用

aDPPH和ABTS試驗的陽性對照物為L-抗壞血酸，β-胡蘿卜素漂白試驗陽性對照物為BHA體外利用光電比濁法體外測定二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸(AA)和凝血酶(THR)誘導的兔血小板聚集率發(fā)現(xiàn)阿魏酸松柏酯具有濃度依賴性抗ADP、AA和THR誘導的血小板聚集作用。
富血小板血漿(PRP)、貧血小板血漿(PPP)的制備動物戊巴比妥鈉(1mg/ml)麻醉，動脈插管放血。用3.2％枸櫞酸鈉抗凝，抗凝劑與血的比例為1∶9。離心(100g，10min)，上層即為PRP。將吸出PRP后的余血離心(1925g，10min)，取上清即為PPP。以PPP調PRP至7.0×109個/ml。
使用血小板聚集測試儀測定血小板聚集率。分別取300μl的PRP和PPP于比濁管中，將含PPP比濁管放入聚集儀的測試孔中調零，將藥物或對照液于37度與PRP(加入攪拌子)孵育5min。開始測定，加誘導劑與PRP管中，觀察PRP在3min內的最大聚集程度。血小板聚集抑制率按下式計算血小板聚集抑制率％＝(空白對照聚集率％-供試品聚集率％)/空白對照聚集率％×100％ADP誘導的血小板聚集2μl藥液(DMSO溶解)與PRP混合，溫育5min，加入ADP10μl(終濃度為15μmol/ml)，以加入DMSO的PRP為空白，測定3min內血小板最大聚集率。結果表明阿魏酸松柏酯對ADP誘導的血小板聚集有抑制作用，其IC50為0.3mg/ml。
AA誘導的血小板聚集2μl藥液(DMSO溶解)與PRP混合，溫育5min，加入AA10μl(終濃度為330μmol/ml)，以加入DMSO的PRP為空白，測定3min內血小板最大聚集率。結果表明阿魏酸松柏酯對AA誘導的血小板聚集有明顯的抑制作用，其IC50為7.1μg/ml。
THR誘導的血小板聚集2μl藥液(DMSO溶解)與PRP混合，溫育5min，加入THR10μl(終濃度為0.3U/ml)，以加入DMSO的PRP為空白，測定3min內血小板最大聚集率。結果表明阿魏酸松柏酯對THR誘導的血小板聚集有較強的抑制作用，其IC50為76μg/ml。
表2.阿魏酸松柏酯(CF)，阿魏酸和當歸水提物的抗血小板聚集作用

上述富含阿魏酸松柏酯的中藥提取物的制備方法，步驟是富含阿魏酸松柏酯的中藥粉末，經(jīng)二氧化碳超臨界萃取或有機溶劑提取后揮去有機溶劑制備成精油；再把上述精油以0.5～5倍精油體積的混合溶劑萃取或有機溶劑提取，下層水醇相萃取物或有機溶劑提取殘余物，蒸干溶劑即得阿魏酸松柏酯富集物；或將上述精油(或低純度阿魏酸松柏酯富集物)應用高效逆流色譜，以有機溶劑為固定相，水相(含醇10％～90％)為流動相進行逆流萃取，318nm檢測，收集阿魏酸松柏酯的峰，揮去溶劑即得含高純度阿魏酸松柏酯富集物。
二氧化碳超臨界萃取時的參數(shù)如下萃取壓力20～30MPa，萃取溫度35～50℃，萃取時間2～4h；用有機溶劑提取時，所述的有機溶劑于為中藥粉末質量的5～20倍；
所述混合溶劑的組成和比例是有機相與水相(含低級醇)的體積比為1∶0～2，其中水相低級醇含量為10％～90％。
上述液體有機相選自正己烷、環(huán)己烷、甲基環(huán)己烷、正庚烷、正辛烷或乙酸乙酯中的一種或幾種組合。
上述低級醇選自甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇或正丁醇中的一種或幾種組合。
制得的阿魏酸松柏酯富集物，經(jīng)HPLC分析，318nm檢測，按色譜歸一化法計算，阿魏酸松柏酯含量為40％～99％；精油中阿魏酸松柏酯的提取率20～95％。
上述制備方法中所述富含阿魏酸松柏酯的中藥可以是當歸、川芎、藁本或遼藁本。
其中，特別是利用藁本或遼藁作為制備阿魏酸松柏酯的原料，是本發(fā)明的首次發(fā)現(xiàn)。使之成為開發(fā)阿魏酸松柏酯的新的重要資源。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)阿魏酸松柏酯具有抗氧化和抗血小板聚集作用，可以開發(fā)用于防治衰老及心腦血管疾病的藥物或化妝品。本發(fā)明的富含阿魏酸松柏酯的中藥提取物的制備方法能夠適應工業(yè)化大生產(chǎn)要求，簡便、快速。
具體實施例方式
實施例1中藥當歸粉末經(jīng)二氧化碳超臨界萃取(萃取壓力25MPa，萃取溫度40℃，萃取時間4h)或有機溶劑(10倍中藥用量)提取后揮去有機溶劑制備成精油。
取上述的當歸油50g，加入500ml正辛烷(或正己烷、或環(huán)己烷、或甲基環(huán)己烷、或正庚烷)，超聲提取10min，傾出上清液，殘渣再加入500ml正辛烷，重復上述提取過程共5次，將殘余物烘干，即得阿魏酸松柏酯富集物。
阿魏酸松柏酯富集物經(jīng)HPLC檢測，按照歸一化法計算，在318nm(阿魏酸松柏酯最大吸收波長)下，阿魏酸松柏酯峰面積百分比為79.9％(40.5％～79.9％)，提取率為79.3％(49.5％～87.6％)。此阿魏酸松柏酯富集物具有明顯抗氧化和抗血小板聚集作用?？捎靡灾苽淇顾ダ虾头乐涡哪X血管疾病的藥物、保健品或化妝品。
實施例2取二氧化碳超臨界提取的當歸油30g，加入100ml正己烷(或環(huán)己烷、或甲基環(huán)己烷、或正庚烷、或正辛烷)，100ml 95％乙醇(或甲醇、或丙醇、或異丙醇、或正丁醇)，50ml水，靜止分層。分離，下層水醇相中再加入100ml正己烷，重復上述萃取操作共3次。將最后所得水醇相回收溶劑至干，即得阿魏酸松柏酯富集物。
阿魏酸松柏酯富集物經(jīng)HPLC檢測，按照歸一化法計算，在318nm下，阿魏酸松柏酯峰面積百分比為62.0％(62.0％-62.6％)，提取率為28.5％(28.5％-63.4％)。此阿魏酸松柏酯富集物具有明顯抗氧化和抗血小板聚集作用。
實施例3把正己烷、乙酸乙酯、乙醇和水按1∶1∶1∶1混合，靜置分層，取上層(有機層)為固定相、下層(醇水)為流動相，進行逆流色譜。以淋洗方式，固定相5ml/min、300rpm流速注入高效逆流色譜儀(轉子為240ml)，待轉子充滿固定相后，流動相以2ml/min、1500rpm流速注入高效逆流色譜儀，兩相平衡后進樣。進樣方式將1.5g當歸油溶于4ml混合溶劑(2ml流動相+2ml固定相)中進樣，收集阿魏酸松柏酯色譜峰，經(jīng)HPLC檢測，按照歸一化法計算，在318nm下，阿魏酸松柏酯峰面積百分比＞93％，提取率為71.2％。此阿魏酸松柏酯富集物具有明顯抗氧化和抗血小板聚集作用。
實施例4，與實施例1基本相同，但所用的中藥原料改為川芎。
實施例5，與實施例1基本相同，但所用的中藥原料改為藁本。
實施例6，與實施例1基本相同，但所用的中藥原料改為遼藁本。
實施例7，與實施例1基本相同，但所用的有機溶劑改為5倍中藥用量。
實施例8，與實施例1基本相同，但所用的有機溶劑改為20倍中藥用量。
實施例9，與實施例1基本相同，但精油改用混合溶劑萃取，萃取所用的混合溶劑為精油體積的0.5倍；逆流萃取時，有機相與含低級醇的水相的體積比為1∶2，其中水相低級醇含量為10％。
實施例10，與實施例9基本相同，但萃取所用的混合溶劑為精油體積的10倍；逆流萃取時，有機相與含低級醇的水相的體積比為1∶1，其中水相低級醇含量為90％。
實施例11，取本發(fā)明阿魏酸松柏酯富集物10g、植物油190g攪拌、混勻，經(jīng)100目篩過濾，制成藥液。將上述藥液和囊材(甘油∶明膠∶水的比例按重量計為1∶3∶3份)在軟膠囊機上常規(guī)壓制成含莪術油活性組份軟膠囊1000粒。建議服用劑量為1～3粒/天。
實施例12，取硬脂酯130g、凡士林10g、液體石蠟60g、單甘酯40g，加熱熔融，保溫80℃～90℃，加入阿魏酸松柏酯富集物10g。攪拌溶解后，另取甘油100g，三乙醇胺4g，蒸餾水646g，混勻保溫80℃～90℃；將上述油液邊攪拌邊緩緩加入，依同一方向不斷攪拌至冷疑即得?？捎米髅嫠?。
權利要求
1.一種富含阿魏酸松柏酯的中藥提取物在制備抗衰老和防治心腦血管疾病的藥物或保健品或化妝品中的應用。
2.一種權利要求1所述的富含阿魏酸松柏酯的中藥提取物的制備方法，步驟是富含阿魏酸松柏酯的原料中藥粉末，經(jīng)二氧化碳超臨界萃取或有機溶劑提取后揮去有機溶劑制備成精油；再把上述精油以0.5～10倍精油體積的混合溶劑萃取或有機溶劑提取，下層水醇相萃取物或有機溶劑提取殘余物，蒸干溶劑即得阿魏酸松柏酯富集物；或將上述精油或低純度阿魏酸松柏酯富集物應用高效逆流色譜，以有機溶劑為固定相，含醇10％～90％的水相為流動相進行逆流萃取，318nm檢測，收集阿魏酸松柏酯的峰，揮去溶劑即得阿魏酸松柏酯富集物。
3.按照權利要求2所述的富含阿魏酸松柏酯的中藥提取物的制備方法，其特征在于，二氧化碳超臨界萃取時的參數(shù)如下萃取壓力20～30MPa，萃取溫度35～50℃，萃取時間2～4h；用有機溶劑提取時，所述的有機溶劑于為中藥粉末質量的5～20倍；所述混合溶劑的組成和比例是有機相與含低級醇的水相的體積比為1∶0～2，其中水相低級醇含量為10％～90％。
4.按照權利要求3所述的富含阿魏酸松柏酯的中藥提取物的制備方法，其特征在于，所述液體有機相選自正己烷、環(huán)己烷、甲基環(huán)己烷、正庚烷、正辛烷或乙酸乙酯中的一種或幾種組合；所述低級醇選自甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇或正丁醇中的一種或幾種組合；制得的阿魏酸松柏酯富集物，經(jīng)HPLC分析，318nm檢測，按色譜歸一化法計算，阿魏酸松柏酯含量為40％～99％；精油中阿魏酸松柏酯的提取率20～95％。
5.按照權利要求2或3或4所述的富含阿魏酸松柏酯的中藥提取物的制備方法，其特征在于，所述制備方法中所述富含阿魏酸松柏酯的中藥是當歸、川芎、藁本或遼藁本。
全文摘要
富含阿魏酸松柏酯的中藥提取物在制備抗衰老和防治心腦血管疾病的藥物、保健品或化妝品中的應用。該中藥提取物通過其抗氧化和抗血小板聚集作用在藥物、保健品或化妝品中產(chǎn)生抗衰老和防治心腦血管疾病效果。該中藥提取物的制備方法富含阿魏酸松柏酯的中藥粉末，經(jīng)二氧化碳超臨界萃取或有機溶劑提取后揮去有機溶劑制成精油；把上述精油以混合溶劑萃取或有機溶劑提取，下層水醇相萃取物或有機溶劑提取殘余物，蒸干溶劑即得阿魏酸松柏酯富集物；或將上述精油或低純度阿魏酸松柏酯富集物應用高效逆流色譜，以有機溶劑為固定相，含醇的水相為流動相進行逆流萃取，318nm檢測，收集阿魏酸松柏酯的峰，揮去溶劑即得含高純度阿魏酸松柏酯富集物。
文檔編號A61K8/97GK101049330SQ20071002224
公開日2007年10月10日 申請日期2007年5月10日 優(yōu)先權日2007年5月10日
發(fā)明者李紹平, 于玥, 李蘇穎, 張慶文 申請人:李紹平