一株巨大芽孢桿菌z2013513及其生產(chǎn)苯基乳酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株巨大芽孢桿菌Z2013513（BacillusmegateriumZ2013513），保藏編號為CCTCCNO：M2013244；本發(fā)明還涉及利用巨大芽孢桿菌Z2013513以苯基丙酮酸為底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化合成苯基乳酸的方法。本發(fā)明的巨大芽孢桿菌Z2013513來源于傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，屬于一般安全菌種，可以在食品中應(yīng)用；該菌株在牛肉膏蛋白胨或者LB培養(yǎng)基上生長良好，容易擴(kuò)大培養(yǎng)收集菌體，通過生長細(xì)胞和靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化所得的苯基乳酸含量分別可高達(dá)5.4g/L和16.1g/L，抑制食品中腐敗菌的能力較強(qiáng)。
【專利說明】一株巨大芽孢桿菌Z2013513及其生產(chǎn)苯基乳酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一株巨大芽孢桿菌Z2013513 {Bacillusmegaterium Z2013513)及其生產(chǎn)苯基乳酸的方法。
【背景技術(shù)】[0002]苯基乳酸,又稱3_苯基乳酸或2_羥基-3-苯基丙酸(Phenyllactic acid,簡稱PLA)，相對分子質(zhì)量為166，熔點(diǎn)121~125°C，無氣味，對酸、熱穩(wěn)定，在121°C加熱也不被破壞，存在于天然蜂蜜中。該有機(jī)酸是由多種微生物(尤其是乳酸菌)代謝苯丙氨酸產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，是賦予乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品抗真菌和長貨架期的主要活性物質(zhì)之一。PLA作為一種新型、安全、廣譜的抑菌物質(zhì)受到了廣泛關(guān)注。這種由公認(rèn)為安全的乳酸菌代謝產(chǎn)生的芳香族有機(jī)酸經(jīng)研究表明其對人和動物細(xì)胞均無毒性。另外，與多數(shù)天然防腐劑相比，PLA具有更廣的抑菌譜，特別是能夠抑制真菌污染，而且其水溶性和熱穩(wěn)定性好，作用PH范圍寬，這些優(yōu)點(diǎn)利于其在食品工業(yè)的廣泛應(yīng)用。眾多研究已經(jīng)證實(shí)PLA具有廣譜且高效的抗菌活力，并且可以替代抗生素用于家畜飼養(yǎng)。比如，已有的資料表明PLA可以有效抑制包括食源性致病細(xì)菌，如monocytogenes^ Enterococcus faecal is ^ Staphylococcusaureus、Escherichia coli> Provideneia stuartii^ Klebsiella ojyioca,酵母和霉菌，如 Aspergillus ochraceus> PeniciIlium roqueforti > Penicillium citri/w 等多種微生物的生長。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中生產(chǎn)3-苯基乳酸的方法主要有化學(xué)法和生物合成法。化學(xué)方法存在的問題是產(chǎn)物光學(xué)純度不夠高，技術(shù)復(fù)雜、污染環(huán)境嚴(yán)重、產(chǎn)品成本高以及產(chǎn)品質(zhì)量難以控制等。由于盧-苯基乳酸未來可能主要應(yīng)用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域，在消費(fèi)者崇尚天然、營養(yǎng)食品的今天，世界各國的研究者把研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到了生物合成法方面；生物合成法即通過完整的微生物細(xì)胞的立體選擇性生物催化來實(shí)現(xiàn)。因此篩選高立體選擇性的優(yōu)良微生物菌株是該方法的關(guān)鍵。早在1986年，Kamata等就用乳糖發(fā)酵短桿菌
Lactofermentum tMM生產(chǎn)? R_3_苯基乳酸，產(chǎn)量為1.94 g/L，并且申請了專利；1998年，Die μ Leveux等從白地霉Geotrichum Candidum的培養(yǎng)液中也分離到了 R-3-苯基乳酸，該菌株在TSBYE培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生R-3-苯基乳酸的量為0.6 g/L~I g/L ;2000年，Lavermicocca等發(fā)現(xiàn)從發(fā)酵面團(tuán)中分離到的植物乳桿菌plantarum 21B能分泌R-3-苯基乳酸，他們將植物乳桿菌接種在小麥粉水解液中，30°C培養(yǎng)發(fā)酵24 h，產(chǎn)生的R-3-苯基乳酸量為0.009 mol/L。2002年，Katrin等從青貯草中也分離到了一lL.plemtarum MiLAB 393，它產(chǎn)生的S型和R型3-苯基乳酸的比例為9:1 ; 1996年，Hashimoto等從土壤中篩選到了一株假單胞菌Aewt/offlmas sp.BC218,能將苯乙醒-氰醇轉(zhuǎn)化為S-3-苯基乳酸。這一轉(zhuǎn)化有較高的對映選擇性，生成的S-3-苯基乳酸的e.e.值為75%，再經(jīng)過優(yōu)先結(jié)晶，e.e.值可達(dá)到99%。該菌株經(jīng)誘變后，S-3-苯基乳酸的產(chǎn)量是出發(fā)菌株的12倍；Diversa公司用腈酶(EC 3.5.5.1) (Nitrilases)可以制備e.e.值為99%的 S-3-苯基乳酸；近來,Thierry 等報導(dǎo)費(fèi)氏桿菌freudenreichii)在奶酪發(fā)酵過程中產(chǎn)生了 3-苯基乳酸，這些3-苯基乳酸是由苯基丙酮酸在羥基還原酶作用下得到的。目前盧-苯基乳酸已在Diversa公司進(jìn)行了工業(yè)化生產(chǎn)。
[0004]然而這些利用不同微生物以簡單碳源從頭合成PLA的過程復(fù)雜，產(chǎn)量較低，并且多數(shù)報道所涉及的微生物或者所需營養(yǎng)要求高，或者生長緩慢，并不適用于大規(guī)模的生產(chǎn)應(yīng)用。苯丙酮酸作為一種較為廉價的大宗化學(xué)原料，以其為底物，利用微生物的酶催化專一性和高效性，一步合成PLA正成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。本發(fā)明從食品中篩選出具有高效催化苯丙酮酸合成PLA的安全菌株,在此基礎(chǔ)上開發(fā)出微生物高效轉(zhuǎn)化苯丙酮酸合成PLA的生物合成技術(shù)，有效地解決了乳酸菌等生產(chǎn)菌株?duì)I養(yǎng)要求高、生長緩慢的問題，顯著地提升了產(chǎn)物的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的第一目的是提供一株來源安全、培養(yǎng)方法簡單、高合成苯基乳酸的微生物菌株。
[0006]本發(fā)明的第二個目的是提供一種利用上述菌株生產(chǎn)苯基乳酸的方法。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第一目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
一、一株巨大芽孢桿菌 Z2013513 (.Bacillus megaterium Z2013513)，其已于 2013 年 6月4日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號:CCTCC NO:M 2013244。
[0008]本發(fā)明菌株的形態(tài)學(xué)及生理生化特征如下:
菌落顏色:米黃色；`
需氧方式:好氧生長；
菌落大小:1.2 ~2.5X2.0 ~10.Ομ-- ;
最適宜生長溫度:35-40°C ；
最適宜生長初始pH: 7 ；
菌體形態(tài):桿狀，末端圓，單個或呈短鏈排列，能運(yùn)動；
革蘭氏染色:陽性；
芽孢:1.0~1.2 X 1.5~2.0微米，橢圓形，中生。
[0009]上述巨大芽孢桿菌Z2013513的獲取方法，經(jīng)出發(fā)菌株的選育，LB培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)及苯基丙酮酸為底物轉(zhuǎn)化，再同時分別經(jīng)金黃色葡萄球菌及桔青霉菌平板篩選而得到
具體地說，所述巨大芽孢桿菌Z2013513的篩選純化方法包括如下步驟:
1、出發(fā)菌株的選育
以市售臘腸或者豆腐乳為菌源，取適量樣品于無菌生理鹽水中振蕩處理2h后，取菌懸液于80°C處理lOmin。取處理后的菌懸液ImL接種于IOmL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基于30_40°C富集培養(yǎng)12h。取0.1mL富集培養(yǎng)液分別涂抹于含2%瓊脂的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)2-3天，獲得單菌落。隨機(jī)挑選若干個單菌落進(jìn)一步在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上劃線分離，獲得出發(fā)菌株并4°C下斜面保存?zhèn)溆茫?br> 2、菌體活化及轉(zhuǎn)化液制備
將所選育的菌株分別接種至LB培養(yǎng)基，370C，200轉(zhuǎn)/分鐘活化培養(yǎng)10小時，然后取培養(yǎng)物按照10% (v/v)接種量接入SYG液體培養(yǎng)基，35-400C，200轉(zhuǎn)/分鐘，繼續(xù)培養(yǎng)8小時。培養(yǎng)物經(jīng)4°C，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘后棄去上清液，加入適量轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基懸浮菌體，置于30-40°C，200轉(zhuǎn)/分鐘搖床轉(zhuǎn)化4-8小時。轉(zhuǎn)化液經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10 min后取上清液進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。
[0010]3、金黃色葡萄球菌平板篩選
取長滿金黃色葡萄球菌(Asl.89)的斜面試管一只，加入無菌蒸餾水10mL，制成菌懸液，取0.1mL接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基表面并均勻涂布，在平板不同位置等距離放置高溫滅菌的牛津杯，取上述步驟2)所得上清液200 μ L加入牛津杯中，37°C培養(yǎng)22小時，挑出在牛津杯的周圍產(chǎn)生抑菌圈的菌株；
4、桔青霉菌平板篩選
在無菌培養(yǎng)皿中倒入PDA固體培養(yǎng)基，將桔青霉菌制成孢子懸液，取0.1mL接種于PDA平板培養(yǎng)基上并均勻涂布，在平板不同位置等距離放置高溫滅菌的牛津杯，取上述步驟2)所得上清液200 μ L加入牛津杯，28 V培養(yǎng)60小時，挑出在牛津杯的周圍產(chǎn)生抑菌圈的菌株;
挑選能夠同時抑制上述金黃色葡萄球菌和青霉菌、且抑菌圈較大的發(fā)酵液所對應(yīng)的菌株,命名為巨大芽孢桿菌 Ζ2013513 (.Bacillus megaterium Z2013513)。
[0011]二、一種利用巨大芽孢桿菌Z2013513生產(chǎn)苯基乳酸的方法，該方法以苯基丙酮酸為底物，利用本發(fā)明菌株的生長細(xì)胞或靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成苯基乳酸。
[0012]具體包括如下步驟: O種子培養(yǎng):將巨大芽孢桿菌Z2013513單菌落接種至LB培養(yǎng)基中活化，35_40°C，200rpm活化培養(yǎng)8小時；
2)擴(kuò)大培養(yǎng):將上述步驟I)所得種子培養(yǎng)液按10%接種量接入SYD培養(yǎng)基中，35-40°C，搖床200轉(zhuǎn)每分，培養(yǎng)8小時至細(xì)胞生長對數(shù)中期，將所得培養(yǎng)液于4°C下，4000rpm離心5min，并用無菌生理鹽水洗滌2次收集靜息細(xì)胞菌體；
3)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)苯基乳酸:將步驟2)所得菌體轉(zhuǎn)到轉(zhuǎn)化液中40°C轉(zhuǎn)化4-18小時。
[0013]所述步驟3)中生長細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)苯基乳酸的優(yōu)選方案為:擴(kuò)大培養(yǎng)4個小時后，分別在之后6個小時里，每小時加0.375mL的流加培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)化8小時。
[0014]所述步驟3)中靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)苯基乳酸的優(yōu)選方案為:將步驟2)的菌體懸浮于10 mL轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中并于30°C，200rpm搖床中轉(zhuǎn)化。在前14小時內(nèi)，每2小時補(bǔ)加0.5mL流加培養(yǎng)基，共加入約320 mg苯丙酮酸和350 mg葡萄糖，40°C轉(zhuǎn)化18小時。
[0015]所述步驟3)中靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)苯基乳酸的優(yōu)選轉(zhuǎn)化方法為分批發(fā)酵轉(zhuǎn)化:將步驟2)菌體懸浮于10 mL轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中并于40°C，200rpm搖床中轉(zhuǎn)化若干小時，每2h取樣，1000Orpm離心IOmin,取上清液加入2倍體積的乙酸乙酯萃取,減壓蒸發(fā)濃縮,得到苯基乳酸的粗品，然后用同體積0.05%三氟乙酸水溶液溶解，經(jīng)適當(dāng)稀釋后采用高效液相色譜(HPLC)法測定苯丙酮酸和苯基乳酸的含量，經(jīng)4h轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中苯丙酮酸幾乎消耗殆盡。
[0016]所述LB培養(yǎng)基包含:酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。
[0017]所述SYD培養(yǎng)基包含:葡萄糖20g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L0
[0018]所述的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為:葡萄糖20g/L，苯丙酮酸鈉4g/L，pH7的磷酸緩沖液。
[0019]所述的流加培養(yǎng)基為:葡萄糖100g/L，苯丙酮酸鈉78g/L，pH7的磷酸緩沖液。[0020]進(jìn)一步的苯基乳酸的純化方法為:
1)將所得的轉(zhuǎn)化液1000Orpm離心lOmin，棄除沉淀，上清液調(diào)PH為2.0 ;
2)取上述步驟I)所得上清液加入2倍體積的乙酸乙酯萃取，后取有機(jī)相減壓蒸發(fā)至干，得到苯基乳酸的粗品；
3)用同體積的0.05%的三氟乙酸水溶液溶解步驟2)所得的苯基乳酸的粗品，經(jīng)適當(dāng)稀釋后采用高效液相色譜(HPLC)法測定苯基乳酸的含量。
[0021]其中，HPLC測定條件為:色譜柱為島津VP-0DSC18，流動相為0.05%的三氟乙酸/甲醇(A)和0.05%的三氟乙酸/水(B)的混合液，流速lmL/min，檢測波長210nm，柱溫30°C，進(jìn)樣量10 μ L，進(jìn)樣前用0.22mm濾膜過濾。
[0022]本發(fā)明的有益效果在于:
本發(fā)明的巨大芽孢桿菌Z2013513屬于一般認(rèn)為安全菌種，具有較高的安全性；該菌株在LB和SYG培養(yǎng)基上生長良好，營養(yǎng)要求低，生長周期短，容易培養(yǎng)和保存，通過生長細(xì)胞轉(zhuǎn)化可得苯基乳酸5.4g/L，通過靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化所得的苯基乳酸含量可高達(dá)16.1 g/L，且轉(zhuǎn)化的苯基乳酸易于提純，抑制食品中腐敗菌的能力較強(qiáng)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為巨大芽孢桿菌Z2013513的顯微照片(1000X )。
[0024]圖2為巨大芽孢桿菌Z2013513的靜息細(xì)胞分別在轉(zhuǎn)化苯丙酮酸之前、轉(zhuǎn)化2小時，4小時所產(chǎn)苯基乳酸的HPLC`圖譜。
[0025]圖3為巨大芽孢桿菌Z2013513生長細(xì)胞流加底物轉(zhuǎn)化苯丙酮酸生成苯基乳酸圖。
[0026]圖4為巨大芽孢桿菌Z2013513靜息細(xì)胞流加底物轉(zhuǎn)化苯丙酮酸生成苯基乳酸圖。
[0027]本發(fā)明所述的生物材料，其分類命名為巨大芽孢桿菌Z2013513 {Bacillusmegaterium Z2013513),已于2013年6月4日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址是:中國.武漢.武漢大學(xué))，保藏編號:CCTCC NO:M 2013244。
[0028]【具體實(shí)施方式】:
下面列舉實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，但并不因此限制本發(fā)明的內(nèi)容。
[0029]本發(fā)明所采用的培養(yǎng)基:
牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g。
[0030]斜面保藏培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物5g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，瓊脂20 g。
[0031]LB培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl IOgo
[0032]轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20g，苯丙酮酸鈉4g，0.2mol/L pH7磷酸緩沖液。
[0033]流加培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖100g，苯丙酮酸鈉78g，0.2mol/L pH7磷酸緩沖液。
[0034]SYG培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g。
[0035]PDA固體培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，水1000mL,自然pH。
[0036]本發(fā)明產(chǎn)物的HPLC測定條件為:色譜柱:VP_0DSC18，流動相為0.05%的三氟乙酸/甲醇(A)和0.05%的三氟乙酸/水(B)的混合液,流速lmL/min,檢測波長210 nm,柱溫30 0C，進(jìn)樣量10 μ L，進(jìn)樣前用0.22mm濾膜過濾。
[0037]實(shí)施例1:本實(shí)施例說明巨大芽孢桿菌Z2013513的篩選及純化鑒定方法。
[0038]1、出發(fā)菌株的選育以市售臘腸或者豆腐乳為菌源，取適量樣品于無菌生理鹽水中振蕩處理2h后，取菌懸液于80°C處理lOmin。取處理后的菌懸液ImL接種于IOmL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基于35°C富集培養(yǎng)12h。取0.1mL富集培養(yǎng)液分別涂抹于含2%瓊脂的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)3天，獲得單菌落。隨機(jī)挑選若干個單菌落進(jìn)一步在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上劃線分離，獲得出發(fā)菌株并保存于4°C備用；
2、菌體活化及轉(zhuǎn)化液制備
將所選育的菌株分別接種至LB培養(yǎng)基，37°C，200轉(zhuǎn)/分鐘活化培養(yǎng)10小時，然后取培養(yǎng)物按照10% (v/v)接種量接入SYG液體培養(yǎng)基，400C，200轉(zhuǎn)/分鐘，繼續(xù)培養(yǎng)8小時。培養(yǎng)物經(jīng)4°C，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘后棄去上清液，加入適量轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基懸浮菌體，置于37°C，200轉(zhuǎn)/分鐘搖床轉(zhuǎn)化8小時。轉(zhuǎn)化液經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10 min后取上清液進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。
[0039]3、金黃色葡萄球菌平板篩選
取長滿金黃色葡萄球菌(Asl.89，購自于中科院微生物研究所國家菌種保藏中心)的斜面試管一只，加入無菌蒸餾水10mL，制成菌懸液，取0.1mL接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基表面并均勻涂布，在平板不同位置等距離放置高溫滅菌的牛津杯，取上述步驟2)所得上清液200 μ L加入牛津杯中，37°C培養(yǎng)22小時，挑出在牛津杯的周圍產(chǎn)生抑菌圈的菌株；
4、桔青霉菌平板篩選
在無菌培養(yǎng)皿中倒入PDA固體培養(yǎng)基，將桔青霉菌制成孢子懸液，取0.1mL接種于PDA平板培養(yǎng)基上并均勻涂布，在平板不同位置等距離放置高溫滅菌的牛津杯，取上述步驟2)所得上清液200 μ L加入牛津杯，28°C培養(yǎng)60小時，挑出在牛津杯的周圍產(chǎn)生抑菌圈的菌株;
挑選能夠同時抑制上述金黃色葡`萄球菌和青霉菌、且抑菌圈較大的發(fā)酵液所對應(yīng)的菌株,命名為巨大芽孢桿菌 Z2013513 (.Bacillus megaterium Z2013513)。
[0040]該菌株的形態(tài)學(xué)及生理生化特征如下:
菌落顏色:米黃色；
需氧方式:好氧生長；
菌落大小:1.2 ~2.5X2.0 ~10.Ομ-- ;
最適宜生長溫度:35-40攝氏度；
最適宜生長初始pH: 7 ；
菌體形態(tài):桿狀，末端圓，單個或呈短鏈排列，能運(yùn)動；
革蘭氏染色:陽性；
芽孢:1.0~1.2 X 1.5~2.0微米，橢圓形，中生。
[0041]實(shí)施例2:本實(shí)施例說明巨大芽孢桿菌Z2013513的鑒定方法。
[0042]1、芽孢菌株的鑒定:
對該菌的16SrDNA部分的序列的測定及比對分析，鑒定為巨大芽孢桿菌，經(jīng)微生物保藏程序的鑒定和保藏，將其分類命名為巨大芽孢桿菌Z2013513 (.BadIlus megateriumZ2013513)，其保藏登記號為:M2013244。
[0043]2、巨大芽孢桿菌Z2013513的特征:
形態(tài)學(xué)特征:將巨大芽孢桿菌Z2013513菌株在LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)8小時，形成明顯的菌落，直徑在1.0~2.0 mm之間，圓形，培養(yǎng)基內(nèi)呈圓狀，邊緣整齊，乳白色，不透明，表面濕潤光滑，不產(chǎn)生色素。在顯微鏡下觀察，革蘭氏染色陽性，運(yùn)動，細(xì)胞短桿狀，0.29~0.45_Χ1.58 ~4.20 mm,產(chǎn)孢子。
[0044]培養(yǎng)特征:
最適生長溫度35-40°C,好氧生長,最適生長初始pH為7.0。
[0045]實(shí)施例3:本實(shí)施例說明本發(fā)明菌株的生長細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)苯基乳酸中的方法。
[0046]I)種子培養(yǎng):將巨大芽孢桿菌Z2013513單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基35°C，200轉(zhuǎn)每分活化培養(yǎng)8小時；
2)擴(kuò)大培養(yǎng):將上述步驟I)所得種子培養(yǎng)液按10%接種量接入SYD培養(yǎng)基中，40°C，搖床200轉(zhuǎn)每分培養(yǎng)4h獲得生長細(xì)胞；
3)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)苯基乳酸
擴(kuò)大培養(yǎng)4個小時后，分別在之后6個小時里，每小時補(bǔ)加0.375mL的流加培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)化8小時。
[0047]取步驟3)轉(zhuǎn)化液，經(jīng)1000Orpm離心5分鐘，得上清液，上清液中加入2倍體積的乙酸乙酯萃取，減壓蒸發(fā)濃縮，得到苯基乳酸的粗品，然后用0.05%三氟乙酸水溶液溶解，采用高效液相色譜(HPLC)法測定苯基乳酸的含量，苯基乳酸最終含量達(dá)到5.4g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到45% (圖3)。
[0048]實(shí)施例4:本實(shí)施例說明本發(fā)明菌株的靜息細(xì)胞批式發(fā)酵生產(chǎn)苯基乳酸中的方法。
[0049]I)種子培養(yǎng)養(yǎng):將巨大芽孢桿菌Z2013513單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基35_40°C，200rpm活化培養(yǎng)8小時；
2)擴(kuò)大培養(yǎng):將上述步驟I)所得種子培養(yǎng)液按10%接種量接入SYD培養(yǎng)基，35°C，200rpm培養(yǎng)8小時至細(xì)胞生長對數(shù)中期，所得培養(yǎng)液于4°C，4000rpm離心5min收集菌體，并用無菌生理鹽水洗滌2次；
3)靜息細(xì)胞批式轉(zhuǎn)化生產(chǎn)苯基乳酸
將步驟2)菌體懸浮于10 mL轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中并于40°C，200rpm搖床中轉(zhuǎn)化若干小時，每2h取樣，1000Orpm離心IOmin,取上清液加入2倍體積的乙酸乙酯萃取,減壓蒸發(fā)濃縮,得到苯基乳酸的粗品，然后用同體積0.05%三氟乙酸水溶液溶解，經(jīng)適當(dāng)稀釋后采用高效液相色譜(HPLC)法測定苯丙酮酸和苯基乳酸的含量。經(jīng)4h轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中苯丙酮酸幾乎消耗殆盡，同時生成苯基乳酸2.7g/L，苯丙酮酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到67.5%如圖2所示。
[0050]實(shí)施例5:本實(shí)施例說明本發(fā)明菌株的靜息細(xì)胞分批流加發(fā)酵生產(chǎn)苯基乳酸的方法。
[0051]I)種子培養(yǎng):將巨大芽孢桿菌Z2013513單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基35°C，200rpm活化培養(yǎng)8小時；
2)擴(kuò)大培養(yǎng):將上述步驟I)所得種子培養(yǎng)液按10%接種量接入SYD培養(yǎng)基，40°C，200rpm培養(yǎng)8小時至細(xì)胞生長對數(shù)中期，所得培養(yǎng)液于4°C，4000rpm離心5min收集菌體，并用無菌生理鹽水洗滌2次；
3)分批流加法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)苯基乳酸將步驟2)菌體懸浮于10 mL轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中并于40°C，200rpm搖床中開始轉(zhuǎn)化。從第2h開始的前14小時內(nèi)，每2小時往轉(zhuǎn)化液中補(bǔ)加0.5mL流加培養(yǎng)基，總計加入約320 mg苯丙酮酸和350 mg葡萄糖,40°C下共轉(zhuǎn)化18小時結(jié)束。最終苯基乳酸含量可達(dá)16.lg/L,轉(zhuǎn)化率達(dá)到50% (圖4)。
[0052] 結(jié)果表明，該菌的靜息細(xì)胞，采用流加的轉(zhuǎn)化策略可有效的轉(zhuǎn)化苯丙酮酸生成苯基乳酸，本方法采用的工藝和菌株轉(zhuǎn)化苯丙酮酸合成苯基乳酸的產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)率顯著優(yōu)于以乳酸菌為基礎(chǔ)的生物轉(zhuǎn)`化指標(biāo)。
【權(quán)利要求】
1.一株巨大芽孢桿菌，其特征在于，其分類命名為巨大芽孢桿菌Z2013513 {Bacillusmegaterium Z2013513),已于2013年6月4日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號:CCTCC NO:M 2013244。
2.利用權(quán)利要求1所述巨大芽孢桿菌Z2013513生產(chǎn)苯基乳酸的方法，其特征在于，經(jīng)種子培養(yǎng)，擴(kuò)大培養(yǎng)后，由生長細(xì)胞或靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)苯基乳酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，生長細(xì)胞生產(chǎn)苯基乳酸的步驟包括: 1)種子培養(yǎng):將巨大芽孢桿菌Z2013513單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基，35-40°C，200rpm活化培養(yǎng)8小時； 2)擴(kuò)大培養(yǎng):將上述步驟I)所得種子培養(yǎng)液按10%接種量接入SYD培養(yǎng)基中，35-400C，搖床200轉(zhuǎn)每分培養(yǎng)4h獲得生長細(xì)胞； 3)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)苯基乳酸 擴(kuò)大培養(yǎng)4個小時后，分別在之后6個小時里，每小時加0.375mL的流加培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)化8小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于: 所述LB培養(yǎng)基包含:酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L ； 所述SYD培養(yǎng)基包含:葡萄糖20g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L ； 所述的流加培養(yǎng)基為:`葡萄糖100g/L，苯丙酮酸鈉78g/L，pH7的磷酸緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述靜息細(xì)胞生產(chǎn)苯基乳酸的步驟包括: O種子培養(yǎng)養(yǎng):將巨大芽孢桿菌Z2013513單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基，35-40°C，200rpm活化培養(yǎng)8小時； 2)擴(kuò)大培養(yǎng):將上述步驟I)所得種子培養(yǎng)液按10%接種量接入SYD培養(yǎng)基中，35-40 °C，搖床200轉(zhuǎn)每分，培養(yǎng)8小時至細(xì)胞生長對數(shù)中期，將所得培養(yǎng)液于4 °C下，4000rpm離心5min，并用無菌生理鹽水洗滌2次收集靜息細(xì)胞菌體； 3)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)苯基乳酸 將上述步驟2)所得菌體轉(zhuǎn)到轉(zhuǎn)化液中，40°C轉(zhuǎn)化4-18小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，將步驟2)的菌體懸浮于10ml轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中并于30°C，200rpm搖床中轉(zhuǎn)化； 在前14小時內(nèi)，每2小時補(bǔ)加0.5ml流加培養(yǎng)基,共加入約320 mg苯丙酮酸和350 mg葡萄糖，40°C轉(zhuǎn)化18小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟3)的轉(zhuǎn)化方法為分批發(fā)酵轉(zhuǎn)化:將步驟2)菌體懸浮于10 mL轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中并于40°C，200rpm搖床中轉(zhuǎn)化若干小時，每2h取樣，1000Orpm離心IOmin,取上清液加入2倍體積的乙酸乙酯萃取,減壓蒸發(fā)濃縮,得到苯基乳酸的粗品，然后用同體積0.05%三氟乙酸水溶液溶解，經(jīng)適當(dāng)稀釋后采用高效液相色譜(HPLC)法測定苯丙酮酸和苯基乳酸的含量。
8.根據(jù)權(quán)利要求5、6或7所述的任一方法,其特征在于: 所述LB培養(yǎng)基包含:酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L ； 所述SYD培養(yǎng)基包含:葡萄糖20g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L ； 所述的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為:葡萄糖20g/L，苯丙酮酸鈉4g/L，pH7的磷酸緩沖液； 所述的流加培養(yǎng)基為:葡萄糖100g/L，苯丙酮酸鈉78g/L，pH7的磷酸緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，還包括進(jìn)一步的純化苯基乳酸: 1)將上述權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所得的轉(zhuǎn)化液1000Orpm離心IOmin,棄除沉淀,上清液調(diào)PH為2.0 ; 2)取上述步驟I)所得上清液加入2倍體積的乙酸乙酯萃取，后取有機(jī)相減壓蒸發(fā)至干，得到苯基乳酸的粗品； 3)用同體積的0.05%的三氟乙酸水溶液溶解步驟2)所得的苯基乳酸的粗品，經(jīng)適當(dāng)稀釋后采用高效液相色 譜法測定苯基乳酸的含量。
【文檔編號】C12N1/20GK103710291SQ201410000615
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月2日
【發(fā)明者】王立梅, 朱益波, 齊斌, 朱穎越, 鄭麗雪 申請人:常熟理工學(xué)院