專利名稱：用于制備l-乳酸的凝結(jié)芽孢桿菌及其應用方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及的是一種乳酸制備技術(shù)領域的菌株及其應用方法，具體是一種利用五 碳糖/六碳糖的用于制備高濃度L-乳酸的凝結(jié)芽孢桿菌及其應用方法。
背景技術(shù)：
乳酸(Lactic Acid)是一種重要的，多用途的有機酸，廣泛應用于食品、化工、醫(yī)藥 等領域，其中最重要、最廣泛的工業(yè)應用為聚乳酸合成的單體。由乳酸聚合生成的聚乳酸具 有良好的生物相容性和生物可降解性，因此被產(chǎn)業(yè)界認為是新世紀最有發(fā)展前途的新型可 再生材料。乳酸分子中存在一個手性中心，具有旋光性，是一種手性分子。根據(jù)旋光性的不 同，乳酸可分為L-乳酸、D-乳酸和消旋乳酸。由于聚L-乳酸使用規(guī)模最為廣泛，因此光學 純L-乳酸的生產(chǎn)一直受到普遍關(guān)注。生產(chǎn)乳酸的方法主要有化學合成法、酶催化法和發(fā)酵法。與化學法和酶催化法相 比，微生物發(fā)酵法不僅能以淀粉、纖維素等可再生資源分解所得到的葡萄糖等為原料，通過 菌種和培養(yǎng)條件的選擇發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，能獲得光學純的L-乳酸、D-乳酸或是兩者一定比 例的混合物，而且生產(chǎn)成本低，產(chǎn)品安全性高，目前是大規(guī)模生產(chǎn)乳酸的主要方法。乳桿 菌(Lactobacillus)、鏈球菌(Streptococcus)、腸球菌(Enterococcus)、根霉(Rhizopus) 等菌具有乳酸生成能力，如中國專利文獻號200480036931. 1。嗜熱的芽孢桿菌是一種新 的可用于L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)的微生物。由于芽孢桿菌具有營養(yǎng)要求低，具有較高的發(fā)酵溫 度(45 60°C )，可實現(xiàn)開放式發(fā)酵，同時大大減少了發(fā)酵過程中污染雜菌的機會，提高 了 L-乳酸的光學純度，因此近年來關(guān)于利用芽孢桿菌生產(chǎn)乳酸的研究逐漸增多。日本專 利文獻號JP5840093、JP606200、JP327291、美國專利文獻號US5079164、中國專利申請?zhí)?200810098908. 5均報道了芽孢桿菌生產(chǎn)乳酸。經(jīng)過對現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，中國專利申請?zhí)?00710176060. 9,200910028930. 7、
02806664. 2都報道了凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)L-乳酸。但上述技術(shù)中所用凝結(jié)芽孢 桿菌沒有顯示利用五碳糖如木糖生產(chǎn)高濃度高純度乳酸。尤其在“一種生產(chǎn)L-乳酸的方法 及其專用凝結(jié)芽孢桿菌”中使用的微生物為凝結(jié)芽孢桿菌，根據(jù)該菌株的特性，該菌株不能 夠利用木糖。進一步檢索發(fā)現(xiàn)，美國專利文獻號US 2005/0250192A1中記載了能夠利用葡萄糖 和木糖生產(chǎn)乳酸的多株凝結(jié)芽孢桿菌生產(chǎn)L-乳酸等。在分離得到的多株菌中，Bacillus sp. 36D1具有最強的利用六碳糖和五碳糖的能力。但該技術(shù)所記載的菌株生產(chǎn)乳酸產(chǎn)量較 低，如Bacillus sp. 36D1利用純葡萄糖L-乳酸報道產(chǎn)量約25. 2g/L左右；利用純木糖L-乳 酸報道產(chǎn)量約23. 4g/L左右；利用甘蔗渣中還原糖(主要為五碳糖-木糖，六碳糖-葡萄 糖)為底物發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，報道的L-乳酸最高產(chǎn)量約55. 5g/L左右，且發(fā)酵時間很長， 高達190多小時。目前，乳酸的工業(yè)化生產(chǎn)主要原料是葡萄糖，或者玉米、大米等淀粉含量較高的農(nóng) 作物產(chǎn)品，存在的主要問題是生產(chǎn)成本高。利用富含碳水化合物的有機廢棄物發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，不僅能夠降低乳酸的生產(chǎn)成本，而且可以解決廢棄物的資源化問題。作為世界范圍內(nèi)提 倡的環(huán)境保護和減少能源需求的一個環(huán)節(jié)，當前在國內(nèi)外都在充分地進行有機廢棄物的再 利用。然而上述物質(zhì)中含有五碳糖(如木糖、阿拉伯糖等)和六碳糖(如葡萄糖)，大多數(shù) 乳酸生產(chǎn)菌株無法利用其中的五碳糖，因此限制其在乳酸生產(chǎn)中的應用。在我國，一部分木 糖醇是利用從玉米芯水解液中提取的木糖為原料制得的；在該工藝中，產(chǎn)生了大量的副產(chǎn) 物，且木糖醇生產(chǎn)的副產(chǎn)物中含有50% 70%的碳水化合物，如不利用既造成浪費又造成 污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種用于制備L-乳酸的凝結(jié)芽孢桿 菌及其應用方法，可以直接利用木糖醇生產(chǎn)副產(chǎn)物中的各種還原糖發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，發(fā)酵 獲得高濃度的L-乳酸，在節(jié)約成本的同時提高生產(chǎn)效率，適合于工業(yè)生產(chǎn)中推廣應用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明涉及一種用于制備L-乳酸的凝結(jié)芽孢桿菌為凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)XZL4和XZL9，于2009年12月4日保藏于布達佩斯條約指定的微生物國際保藏 單位德國微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，地址布倫瑞克英豪豐大街 7B 郵編 D-38124(Inhoffenstr. 7B, Braunschweig, D-38124)，保藏編號分別為 DSM No. 23183 和 DSM No. 23184。所述的凝結(jié)芽孢桿菌(B. COagulans)XZL4DSM No. 23183為革蘭氏陽性菌，其核苷 酸序列如Seq. ID No. 1所示，細胞直桿，營養(yǎng)細胞的菌體大小為(0. 8 0. 9) μ mX (3. O 5.0) μπι。形成內(nèi)生孢子。在含有木糖、酵母粉和蛋白胨的瓊脂平板上形成表面光滑、乳白 色、邊緣整齊的圓形菌落，由山東某玉米芯加工廠附近的土壤中分離得到。所述的凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans)XZL9 DSM No. 23184為革蘭氏陽性菌，其核苷 酸序列如Seq. ID No. 2所示，細胞直桿，營養(yǎng)細胞的菌體大小為(0. 8 0. 9) μ mX (3. 0 5.0) μπι。形成內(nèi)生孢子。在含有木糖、酵母粉和蛋白胨的瓊脂平板上形成細小、淡乳白色、 邊緣整齊的圓形菌落，由山東某玉米芯加工廠附近的土壤中分離得到。本發(fā)明涉及上述用于制備L-乳酸的凝結(jié)芽孢桿菌的應用方法，首先對凝結(jié)芽孢 桿菌進行種子培養(yǎng)獲得種子培養(yǎng)液，然后以含有五碳糖或六碳糖或其組合的農(nóng)業(yè)和工廢棄 物(如糖蜜、糖漿、甘蔗渣等木糖醇生產(chǎn)副產(chǎn)物)作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源進行發(fā)酵后得到 L-乳酸。所述的發(fā)酵是指采用發(fā)酵培養(yǎng)基，按10%體積比的接種量接入種子培養(yǎng)液，在 50°C 60°C環(huán)境下培養(yǎng)48 72小時，溫度優(yōu)選50°C 55°C。所述的發(fā)酵中包含補料流加工藝，該補料流加工藝是指當發(fā)酵液中總還原糖含 量低于20 30g/L時補加碳源，使總還原糖含量維持在30 70g/L，或達到50 70g/L。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及其含量為碳源40 200g/L、氮源5 12g/L和用于 調(diào)控培養(yǎng)基PH的中和劑50 100g/L，余量為水。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5. 5 6. 2。所述的碳源為五碳或六碳糖或富含五碳糖、六碳糖的原料，為以下三種中的任意 一種
(1)葡萄糖 40 150g/L ；(2)木糖 40 100g/L ；(3)木糖醇生產(chǎn)副產(chǎn)物100 200g/L。所述的木糖醇副產(chǎn)物可從商業(yè)途徑獲得，如山東龍力生物科技有限公司、山東福 田藥業(yè)有限公司、山東邢店生物科技有限公司等公司直接購得，但不同公司不同批次的產(chǎn) 品總糖含量有所不同，本發(fā)明所用的木糖醇生產(chǎn)副產(chǎn)物含有50% 70%的碳水化合物，其 中葡萄糖含量為5% 10% (w/v)，木糖含量為40% 50% (w/v)，阿拉伯糖含量為10% 25% (w/v) ο所述的氮源為酵母粉，具體為酵母粉5 12g/L所述的中和劑為碳酸鈣，具體為碳酸鈣50 100g/L。所述的凝結(jié)芽孢桿菌的種子培養(yǎng)液是指將芽孢桿菌(B.COagulanS)XZL4 DSM No. 23183或XZL9 DSM No. 23184依次進行斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)后獲得培養(yǎng)物。所述的斜面培養(yǎng)是指將凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans) XZL4DSM No. 23183或XZL9 DSMNo. 23184菌種接種于含有15g/L瓊脂的固體斜面培養(yǎng)基上，45 55 °C條件下，培養(yǎng) 24 48小時；所述的種子培養(yǎng)是指將經(jīng)過斜面培養(yǎng)的芽孢桿菌在無菌條件下接種到30ml種 子培養(yǎng)基中，45 55°C條件下，靜止培養(yǎng)10 24小時，加入中和劑控制發(fā)酵液pH，制得種
子培養(yǎng)液。所述的種子培養(yǎng)基每升中含有葡萄糖40 60g，酵母粉5 10g，碳酸鈣20 40g，余量為水，優(yōu)選含有葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，CaCO3 20g/L，余量為水；該種子培 養(yǎng)基的PH為6. 5。本發(fā)明主要原料為葡萄糖、木糖和木糖醇生產(chǎn)副產(chǎn)物，可以直接代謝木糖醇副產(chǎn) 物中的五碳糖和六碳糖生成L-乳酸，免去了單獨進行五碳糖代謝的工藝步驟。通過提供合 適的發(fā)酵工藝條件，使得該L-乳酸生產(chǎn)工藝不僅原料易得，成本低廉，而且達到較高的產(chǎn) 酸能力。本發(fā)明所提供的凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans) XZL4 DSM No. 23183和XZL9 DSM No. 23184既能利用葡萄糖又能利用木糖作為乳酸生產(chǎn)碳源，且生產(chǎn)L-乳酸的能力強。利 用葡萄糖作碳源L-乳酸產(chǎn)量最高可達173g/L，光學純度大于99%，糖酸轉(zhuǎn)化率最高可達 0. 98，發(fā)酵生產(chǎn)能力2. 4g/L/h ；利用木糖作碳源L-乳酸產(chǎn)量最高可達195g/L，光學純度大 于99%，糖酸轉(zhuǎn)化率最高可達0. 98，發(fā)酵生產(chǎn)能力2. 7g/L/h ；利用木糖醇生產(chǎn)副產(chǎn)物中還 原糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，L-乳酸最高產(chǎn)量106g/L，光學純度大于99%，發(fā)酵生產(chǎn)能力 2. 08g/L/h。本發(fā)明所提供的凝結(jié)芽孢桿菌經(jīng)過多次循環(huán)發(fā)酵后菌株不退化，仍能保持較高 的活力。且該菌株可以直接利用葡萄糖、木糖以及木糖醇生產(chǎn)副產(chǎn)物中的各種還原糖發(fā)酵 生產(chǎn)L-乳酸，發(fā)酵獲得高濃度的L-乳酸。因此，利用本發(fā)明方法生產(chǎn)L-乳酸，能節(jié)約成本、 提高生產(chǎn)效率，適合于工業(yè)生產(chǎn)中推廣應用。


圖 1 為凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans) XZL4 DSM No. 23183 和 XZL9 DSM No. 23184 的16SrDNA進化樹分析圖中實線的水平距離(長度之和)代表菌株的進化距離，選取的參照菌是 與本發(fā)明提供的菌株親緣關(guān)系較近的凝結(jié)芽孢桿菌菌株，共11株，其中凝結(jié)芽孢桿 菌(B. coagulans) 2-6 是中國專利菌株(CN 200710176060. 9)，其 16S rDNA 序列為測 序得到(見SEQ ID NO 3)；凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans) 36D1是美國專利菌株(Pub. No :US 2005/0250192A1),其 16SrDNA 序列根據(jù)參考文獻 “Patel，Μ. Α. ；Ou, Μ. S.； Harbrucker, R. ；Aldrich, H. C. ；Buszko, Μ. L. ；Ingram, L. 0. ；Shanmugam, K. Τ. Isolation and characterization of acid-tolerant, thermophilic bacteria for effective fermentation of biomass-derived sugars to lactic acid. Appl.Environ. Microbiol. 2006，72，3228-3235” 獲得(見 SEQ ID NO :4)。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施 例。以下實施例涉及的凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans)XZL4 DSM No. 23183和XZL9 DSM No. 23184的分離、篩選和鑒定方法如下一、菌株的分離、篩選該實施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下營養(yǎng)液體培養(yǎng)基木糖10g/L，酵母粉10g/L，pH為6。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基木糖50g/L，酵母粉10g/L，CaCO3 20g/L，瓊脂粉20g/L，pH為6。菌株篩選培養(yǎng)基木糖100g/L，酵母粉20g/L，CaCO3 75g/L，pH為6。該實施例的具體操作過程如下采集山東省某玉米芯加工廠附近的土壤，稱取2g溶于50ml營養(yǎng)液體培養(yǎng)基中， 50°C富集培養(yǎng)6 10小時。然后稀釋涂布到含營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，50°C培養(yǎng)24 小時。待長出單菌落后，挑選菌落面積和產(chǎn)酸透明圈面積大的菌落，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中， 50°C靜止培養(yǎng)48小時，測定L-乳酸的產(chǎn)量，經(jīng)過多次篩選，挑取兩株L-乳酸產(chǎn)量較高的菌 株。將上述菌株多次傳代培養(yǎng)，然后再進行10個循環(huán)的發(fā)酵測試，其第10次循環(huán)發(fā)酵 產(chǎn)生的L-乳酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率基本保持原有水平，證明上述菌株即是目的菌株，名稱為XZL4 和 XZL9。二、菌株的鑒定上述菌株的形態(tài)特征觀察和生理生化特性鑒定在德國微生物保藏中心(DSMZ)完 成。16SrDNA序列鑒定和比對參照文獻“Altschul，S. F. ；Gish, W. ；Miller, W. ；Myers,Ε. W.； Lipman,D. J. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 1990，215，403—410” 提供 的方法。具體結(jié)果如下本實施例得到兩株以木糖為碳源生成L-乳酸的菌株。所述的兩株菌均為革蘭氏陽性菌，細胞直桿，營養(yǎng)細胞的菌體大小為(0. 8 0. 9) μ mX (3.0 5.0) μ m。形成內(nèi)生孢子。在含有木糖、酵母粉和蛋白胨的瓊脂平板上XZL4 形成表面光滑、乳白色、邊緣整齊的圓形菌落；XZL9形成細小、淡乳白色、邊緣整齊的圓形菌落。具體的生理生化特征如表1和表2所示。表1XZL4生理生化特性 表中結(jié)果“ + ”表示結(jié)果為陽性，“_”表示結(jié)果為陰性，“W”表示菌株弱生長，“V. P.，， 為 Vogesproskauer 縮寫。通過數(shù)據(jù)庫TSBA40 4. 10 Library檢索，XZL4的脂肪酸組成與凝結(jié)芽孢桿菌 (B. coagulans)具有較高的相似性(0. 12)。該菌的16S rDNA的核苷酸序列(見SEQ ID NO 1)不同于所有已報導或者提交到公共數(shù)據(jù)庫的菌株16S rDNA，與芽孢桿菌(B. coagulans) 的同源性最高(99%)，說明該菌是一個全新的菌株。基于以上特征，結(jié)合16S rDNA診斷區(qū) 分析，將本株L-乳酸生產(chǎn)菌鑒定為凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans) XZL4，并將其保藏于德國 微生物保藏中心，保藏號為DSM No. 23183。 表2XZL9生理生化特性
表中結(jié)果“ + ”表示結(jié)果為陽性，“_”表示結(jié)果為陰性，“W”表示菌株弱生長，“V. P.，， 為 Vogesproskauer 縮寫。通過數(shù)據(jù)庫TSBA40 4. 10 Library檢索，XZL9的脂肪酸組成與凝結(jié)芽孢桿菌 (B. coagulans)具有較高的相似性(0. 69)。該菌的16S rDNA的核苷酸序列(見SEQ ID NO 2)不同于所有已報導或者提交到公共數(shù)據(jù)庫的菌株16S rDNA，與芽孢桿菌(B. coagulans) NRIC1526的同源性最高(99% )，說明該菌是一個全新的菌株?；谝陨咸卣?，結(jié)合16S rDNA診斷區(qū)分析，將本株L-乳酸生產(chǎn)菌鑒定為凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans) XZL9，并將其 保藏于德國微生物保藏中心，保藏號為DSM No. 23184。進一步比較和分析了凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans) XLZ4和XLZ9以及2-6和36D1 的16SrDNA序列和在進化地位上的差異(圖1)。從進化地位的角度來說，2_6，XLZ4和XLZ9 與標準菌株ATCC7050歸為同一分支，但36D1則位于另一分支，這說明36D1與2_6，XLZ4 和XLZ9可能是從不同的祖先進化而來。凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans)XLZ9的16S rDNA與 36D1 在第 830,890,1262，1267，1268，1286，1308，1315，1344，1345，1362 位存在堿基差異， 與2-6在第340，1212，1225，1276，1309，1345，1346位與相對應的位置存在不同(位置以 XLZ9為準其余取對應位置)。凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans) XLZ4與36D1在340，830，890， 1214，1225，1264，1268，1269，1275，1316，1345，1346 位存在不同，與 2-6 在第 3 位存在差別 (位置以XLZ4為準其余取對應位置)。凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans) XLZ9與XLZ4在第1， 340，1212，1224，1274，1374，1375位存在不同(位置以XLZ9為準其余取對應位置)。上述凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans) XZL4 DSM No. 23183 和 XZL9 DSM No. 23184 均 通過山東某玉米芯加工廠附近的土壤中分離得到。以下實施例涉及的利用凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans) ZL4 DSM No. 23183和XZL9 DSMNo. 23184發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸方法的步驟如下(1)斜面培養(yǎng)將凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans) XZL4 DSM No. 23183 和 XZL9 DSM No. 23184菌種接種于含有15g/L瓊脂的固體斜面培養(yǎng)基上，50 60°C條件下，培養(yǎng)24 48小時。(2)種子培養(yǎng)將步驟⑴的斜面培養(yǎng)物，在無菌條件下接種到30ml種子培養(yǎng)基 中，50 60°C條件下，靜止培養(yǎng)10 24小時，加入中和劑控制發(fā)酵液pH，制得種子培養(yǎng)液。(3)發(fā)酵培養(yǎng)以10%體積比的接種量，將種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，50 600C條件下培養(yǎng)48 72小時。其中，步驟(1)、(2)、(3)中所述的菌體培養(yǎng)溫度優(yōu)選是50 55°C。其中，步驟⑵、(3)所述的培養(yǎng)過程中加入的中和劑為碳酸鈣，控制pH。上述發(fā)酵培養(yǎng)過程中，每3個小時取發(fā)酵液，先加熱至80 100°C，再6，000轉(zhuǎn)/ 分鐘離心5分鐘，取上清液檢測發(fā)酵液中L-乳酸濃度、D-乳酸濃度、葡萄糖濃度，木糖濃度， 計算糖酸轉(zhuǎn)化率、L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)能力和L-乳酸光學純度。其中，總還原糖的測定方法為DNS法。其中，葡萄糖的測定方法為，發(fā)酵液稀釋后 離心，采用生物傳感分析儀SBA-40C(山東省科學院)測定。生物傳感分析儀SBA-80是以 固定化酶為傳感器的分析儀器，葡萄糖與氧氣、水在酶的催化下生成雙氧水。反應放出的雙 氧水與白金-銀電極接觸，并產(chǎn)生電流信號，該電流信號與葡萄糖濃度成線性比例關(guān)系，通 過測定電流信號強度可得出葡萄糖濃度。木糖測定方法為使用木糖測定試劑盒(南京建成科技有限公司)。L-乳酸和D-乳酸產(chǎn)量(發(fā)酵液乳酸含量或者濃度，g/L)的測定方法 為，采用Agilent 1100液相色譜儀，配備手性分離柱(日本三菱化學公司，MCI GEL-CRSlOff (3 μ) 4. 6ID X 50mm，光學異體分離用)。具體操作條件為0. 002mol/L硫酸銅作 為流動相，流量0. 5ml/min,進樣量20 μ L，紫外檢測器，檢測波長254nm，操作溫度25°C。利 用L-乳酸和D-乳酸標準品做出標準曲線，再根據(jù)標準曲線計算出發(fā)酵液中L-乳酸和D-乳 酸的含量。本發(fā)明中，作為標準品的D-乳酸為德國Sigma-Aldrich公司的產(chǎn)品，其貨號 為L0625-25MG ；作為標準品的L-乳酸為德國Sigma-Aldrich公司的產(chǎn)品，其貨號為 L1750-10G。在如上色譜條件下，D-乳酸保留時間為10. 150分鐘。光學純度(optical purity)是衡量旋光性樣品中一個對映體超過另一個對映體 的量的量度，它可用對映體過量值(enantiomeric excess, ee)表示。本發(fā)明中L-乳酸的 光學純度(ee)按以下公式計算((L-乳酸產(chǎn)量-D-乳酸產(chǎn)量)+ (L-乳酸產(chǎn)量+D-乳酸產(chǎn) 量))X100%。糖酸轉(zhuǎn)化率定義為(g/g) (L-乳酸產(chǎn)量(g/L)-底物消耗量(g/L，葡萄糖或者木 糖或者總糖的消耗量(g/L)) X100%。L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)能力(g/L/h)為L_乳酸產(chǎn)量(g/L) +發(fā)酵時間(h)。下面通過實施例進一步闡述本發(fā)明。實施例1利用凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)XZL4 DSM No. 23183 和 XZL9 DSM No. 23184 在 三角瓶中以葡萄糖為碳源分批發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸本實施例中所使用的各培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基每升中含有木糖30g，酵母粉10g，CaCO3 10g，瓊脂粉15g，余量為水。 所述斜面培養(yǎng)基的pH為6. 5。115°C滅菌20分鐘。種子培養(yǎng)基每升中含有葡萄糖50g，酵母粉10g，CaCO3 20g，余量為水。所述種子 培養(yǎng)基的PH為6. 5。115°C滅菌20分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)基每升中含有葡萄糖55 150g，酵母粉10g，CaCO3 60g，余量為水；所 述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5. 5 7。115°C條件下滅菌20分鐘。
本實施例所述發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)將凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans)XZL4 DSM No. 23183 和 XZL9 DSM No. 23184分別接種于斜面培養(yǎng)基上，50°C培養(yǎng)24小時；(2)種子培養(yǎng)將步驟(1)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于裝有30ml 種子培養(yǎng)基的IOOml三角瓶中，50°C靜止培養(yǎng)20小時，制得種子培養(yǎng)液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將IOml步驟⑵制得的種子培養(yǎng)液接入裝有90ml發(fā)酵培養(yǎng)基的 300ml三角瓶中，50°C靜止培養(yǎng)，當葡萄糖和L-乳酸含量保持穩(wěn)定時，結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發(fā)酵液中 L-乳酸濃度和葡萄糖濃度，計算L-乳酸生產(chǎn)速率。該實驗共設3次重復，結(jié)果見表3。表3以葡萄糖為碳源L-乳酸的生成情況 實施例2利用凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)XZL4 DSM No. 23183 和 XZL9 DSM No. 23184 在 三角瓶中以木糖為碳源分批發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸本實施例中所使用的各培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例1。發(fā)酵培養(yǎng)基每升中含有木糖55 100g，酵母粉10g，CaCO3 60g，余量為水；所述 發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5. 5 7。115°C條件下滅菌20分鐘。該發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例1 ；(2)種子培養(yǎng)同實施例1 ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)同實施例1。當木糖和L-乳酸含量保持穩(wěn)定時，發(fā)酵結(jié)束，根據(jù)上述具體實施方式
中所述的檢 測和計算方法，檢測發(fā)酵液中L-乳酸濃度和木糖濃度，計算L-乳酸生產(chǎn)速率。該實驗共設 3次重復，結(jié)果見表4。表4以木糖為碳源L-乳酸的生成情況 實施例3利用凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)XZL4 DSM No. 23183 和 XZL9 DSM No. 23184 在 三角瓶中以木糖醇生產(chǎn)副產(chǎn)物為碳源分批發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例1。發(fā)酵培養(yǎng)基每升中含有木糖醇生產(chǎn)副產(chǎn)物75 150g，酵母粉10g，CaCO3 60g，余 量為水；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5. 5 7。115°C條件下滅菌20分鐘。該發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例1 ；(2)種子培養(yǎng)同實施例1 ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將IOml步驟⑵制得的種子培養(yǎng)液接入裝有90ml發(fā)酵培養(yǎng)基的 300ml三角瓶中，50°C靜止培養(yǎng)48小時，結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發(fā)酵液中 L-乳酸濃度和總還原糖濃度，計算L-乳酸生產(chǎn)速率。該實驗共設3次重復，結(jié)果見表5。表5以木糖醇生產(chǎn)副產(chǎn)物為碳源L-乳酸的生成情況 實施例4利用凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)XZL4 DSM No. 23183 和 XZL9 DSM No. 23184 在 三角瓶中以木糖醇生產(chǎn)副產(chǎn)物為碳源，55°C分批發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸本實施例中所使用的各培養(yǎng)基的組成如下
斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例1。發(fā)酵培養(yǎng)基每升中含有木糖醇生產(chǎn)副產(chǎn)物150g，酵母粉10g，CaCO3 100g，余量為 水；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5. 5 7。115°C條件下滅菌20分鐘。該發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例1。(2)種子培養(yǎng)同實施例1。(3)發(fā)酵培養(yǎng)將IOml步驟(2)制得的種子培養(yǎng)液接入裝有90ml發(fā)酵培養(yǎng)基的 300ml三角瓶中，55°C靜止培養(yǎng)48小時，結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發(fā)酵液中 L-乳酸濃度和總還原糖濃度，計算L-乳酸生產(chǎn)速率。該實驗共設3次重復。結(jié)果表明XZL4 DSM No. 23183生產(chǎn)L-乳酸濃度為57 士 3g/ L，L-乳酸生產(chǎn)速率為1. 19g/L/h ；XZL9 DSM No. 23184生產(chǎn)L-乳酸濃度為53 士 2g/L，L_乳 酸生產(chǎn)速率為1. 10g/L/h。實施例5利用凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)XZL4 DSM No. 23183 和 XZL9 DSM No. 23184 在 三角瓶中以木糖醇生產(chǎn)副產(chǎn)物為碳源，60°C分批發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸本實施例中所使用的各培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例1。發(fā)酵培養(yǎng)基每升中含有木糖醇生產(chǎn)副產(chǎn)物200g，酵母粉5g，CaCO3 100g，余量為 水；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5. 5 7。115°C條件下滅菌20分鐘。該發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例1 ；(2)種子培養(yǎng)同實施例1 ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將IOml步驟(2)制得的種子培養(yǎng)液接入裝有90ml發(fā)酵培養(yǎng)基的 300ml三角瓶中，60°C靜止培養(yǎng)48小時，結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發(fā)酵液中 L-乳酸濃度和總還原糖濃度，計算L-乳酸生產(chǎn)速率。該實驗共設3次重復。結(jié)果表明XZL4 DSM No. 23183生產(chǎn)L-乳酸濃度為48 士 6g/ L, L-乳酸生產(chǎn)速率為1. 0g/L/h ；XZL9 DSM No. 23184生產(chǎn)L-乳酸濃度為44士 2g/L，L-乳 酸生產(chǎn)速率為0. 92g/L/h。實施例6利用凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)XZL4 DSM No. 23183 和 XZL9 DSM No. 23184 在 50升全自動發(fā)酵罐中以100g/L葡萄糖為碳源，補料(糖)流加發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸本實施例中所使用的各培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例1。發(fā)酵培養(yǎng)基每升中含有葡萄糖100g，酵母粉12g，CaCO3 100g，余量為水；所述發(fā) 酵培養(yǎng)基的pH為5. 5 7。115°C條件下滅菌20分鐘。該發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例1 ；
(2)種子培養(yǎng)將步驟(1)培養(yǎng)的菌株在無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于裝有30ml 種子培養(yǎng)基的IOOml三角瓶中，50°C靜止培養(yǎng)20小時，制得種子培養(yǎng)液1 ；將30ml種子培養(yǎng) 液1在無菌條件下接入裝有300ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，50°C靜止培養(yǎng)20小時， 制得種子培養(yǎng)液2 ；繼續(xù)以相同方式擴大種子培養(yǎng)，得到4升種子培養(yǎng)液3。(3)發(fā)酵培養(yǎng)將4升步驟(2)制得的種子培養(yǎng)液3在無菌條件下接入裝有36升 發(fā)酵培養(yǎng)基的50升全自動發(fā)酵罐(上海保興BIOTECH)中，50°C靜止培養(yǎng)。每3個小時取 樣一次，測定發(fā)酵液中的殘?zhí)橇亢蚅-乳酸濃度，當葡萄糖濃度降到20 30g/L時，流加葡 萄糖，使葡萄糖濃度達到50 70g/L，共計補糖2次。當發(fā)酵過程中總糖消耗速率趨于平 穩(wěn)，結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發(fā)酵液中 L-乳酸濃度和殘留葡萄糖濃度，計算L-乳酸生產(chǎn)速率。該發(fā)酵實驗共設3次重復。結(jié)果表明XZL4 DSM No. 23183生產(chǎn)L-乳酸濃度為 173士3g/L，發(fā)酵時間為72小時，L-乳酸生產(chǎn)速率為2. 40g/L/h，糖酸轉(zhuǎn)化率為0. 98，光學 純度為99. 2% ；XZL9 DSM No. 23184生產(chǎn)L-乳酸濃度為171 士5g/L，發(fā)酵時間為72小時， L-乳酸生產(chǎn)速率為2. 38g/L/h，糖酸轉(zhuǎn)化率為0. 96，光學純度為99. 3%。實施例7利用凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)XZL4 DSM No. 23183 和 XZL9 DSM No. 23184 在 50升全自動發(fā)酵罐中以100g/L的木糖為碳源，補料(糖)流加發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸本實施例中所使用的各培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例1。發(fā)酵培養(yǎng)基每升中含有木糖100g，酵母粉12g，CaCO3 100g，余量為水；所述發(fā)酵 培養(yǎng)基的pH為5. 5 7。115°C條件下滅菌20分鐘。該發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例1 ；(2)種子培養(yǎng)同實施例6 ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將4升步驟⑵制得的種子培養(yǎng)液3在無菌條件下接入裝有36升 發(fā)酵培養(yǎng)基的50升全自動發(fā)酵罐(上海保興BIOTECH)中，50°C靜止培養(yǎng)。每3個小時取 樣一次，測定發(fā)酵液中的殘?zhí)橇亢蚅-乳酸濃度，當木糖濃度降到20 30g/L時，流加木糖， 使木糖濃度達到50 70g/L，共計補糖2次。當發(fā)酵過程中木糖消耗速率趨于平穩(wěn)，結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發(fā)酵液中 L-乳酸濃度和殘留木糖濃度，計算L-乳酸生產(chǎn)速率。該實驗共設3次重復。結(jié)果表明XZL4 DSM No. 23183生產(chǎn)L-乳酸濃度為195士 lg/ L, L-乳酸生產(chǎn)速率為2. 70g/L/h，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.98，光學純度為99.3% ；XZL9 DSM No. 23184生產(chǎn)L-乳酸濃度為186士4g/L，發(fā)酵時間為72小時，L-乳酸生產(chǎn)速率為2. 58g/ L/h，糖酸轉(zhuǎn)化率為0. 97，光學純度為99. 4%。實施例8利用凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)XZL4 DSM No. 23183 和 XZL9 DSM No. 23184 在 50升全自動發(fā)酵罐中以100g/L木糖醇生產(chǎn)副產(chǎn)物為碳源，補料(糖)流加發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸本實施例中所使用的各培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例1。發(fā)酵培養(yǎng)基每升中含有木糖醇生產(chǎn)副產(chǎn)物100g，酵母粉12g，CaC03 100g，氯化鈉 0. Ig,磷酸二氫鉀0. 5g，硫酸鎂0. 2g，余量為水；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5. 5 7。115°C 條件下滅菌20分鐘。該發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例1 ；(2)種子培養(yǎng)同實施例6 ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將4升步驟⑵制得的種子培養(yǎng)液3在無菌條件下接入裝有36升 發(fā)酵培養(yǎng)基的50升全自動發(fā)酵罐(上海保興BIOTECH)中，50°C靜止培養(yǎng)。每3個小時取 樣一次，測定發(fā)酵液中的殘?zhí)橇亢蚅-乳酸濃度，當總糖濃度降到20 30g/L時，流加木糖 醇生產(chǎn)副產(chǎn)物，使底物濃度達到50 70g/L，共計補糖2次。當發(fā)酵過程中總糖消耗速率趨 于平穩(wěn)，結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發(fā)酵液中 L-乳酸濃度和總還原糖濃度，計算L-乳酸生產(chǎn)速率。該實驗共設3次重復，發(fā)酵時間為48小時。結(jié)果表明XZL4 DSM No. 23183生 產(chǎn)L-乳酸濃度為95士2g/L，L-乳酸生產(chǎn)速率為1. 98g/L/h，光學純度為99. 1 % ；XZL9 DSM No. 23184生產(chǎn)L-乳酸濃度為92 士 5g/L，L-乳酸生產(chǎn)速率為1. 92g/L/h，光學純度為 99. 3%。實施例9 利用凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans) XZL4 DSM No. 23183 和 XZL9 DSM No. 23184在50升全自動發(fā)酵罐中以200g/L木糖醇生產(chǎn)副產(chǎn)物為碳源，補料(糖)流加發(fā) 酵生產(chǎn)L-乳酸本實施例中所使用的各培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例1。發(fā)酵培養(yǎng)基每升中含有木糖醇生產(chǎn)副產(chǎn)物200g，酵母粉12g，CaCO3 100g，氯化鈉 0. Ig,磷酸二氫鉀0. 5g，硫酸鎂0. 2g，余量為水；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5. 5 7。115°C 條件下滅菌20分鐘。該發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)同實施例1 ；(2)種子培養(yǎng)同實施例6 ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)同實施例8。發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發(fā)酵液中 L-乳酸濃度和總還原糖濃度，計算L-乳酸生產(chǎn)速率。該實驗共設3次重復，發(fā)酵時間為72小時。結(jié)果表明XZL4 DSM No. 23183生 產(chǎn)L-乳酸濃度為98士5g/L，L-乳酸生產(chǎn)速率為1.36g/L/h，光學純度為99.2% ；XZL9 DSM No. 23184生產(chǎn)L-乳酸濃度為94士 5g/L，L-乳酸生產(chǎn)速率為1. 31g/L/h，光學純度為 99. 1%。實施例10 利用凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans)XZL4 DSM No. 23183 和 XZL9 DSMNo. 23184在50升全自動發(fā)酵罐中以150g/L木糖醇生產(chǎn)副產(chǎn)物為碳源，補料(糖)流加發(fā) 酵生產(chǎn)L-乳酸 二氫鉀0 20分鐘。

本實施例中所使用的各培養(yǎng)基的組成如下 斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實施例1。
發(fā)酵培養(yǎng)基木糖醇生產(chǎn)副產(chǎn)物150g，酵母粉12g，CaCO3 100g，氯化鈉0. lg，磷酸 ,5g，硫酸鎂0. 2g，余量為水；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5. 5 7。115°C條件下滅菌
該發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法包括以下步驟 ⑴斜面培養(yǎng)同實施例1;
(2)種子培養(yǎng)同實施例6;
(3)發(fā)酵培養(yǎng)同實施例8。
發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發(fā)酵液中 L-乳酸濃度和總還原糖濃度，計算L-乳酸生產(chǎn)速率。該實驗共設3次重復，發(fā)酵時間為51小時。結(jié)果表明XZL4 DSM No. 23183生 產(chǎn)L-乳酸濃度為106士3g/L，L-乳酸生產(chǎn)速率為2. 08g/L/h,光學純度為99. 1 % ；XZL9 DSM No. 23184生產(chǎn)L-乳酸濃度為100 士6g/L，L-乳酸生產(chǎn)速率為1. 96g/L/h，光學純度為 99. 3%。

序列表
<110>上海交通大學
<120>用于制備L-乳酸的凝結(jié)芽孢桿菌及其應用方法 <160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1466
<212>DNA
<213> 凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans)XZL4 DSM No. 2318316s rDNA 序列 <400>1 ctctgccacc actctcgtgg tgatccgcga ctgggaatgg attgtagcac ttcctccggt gtcaagggtt accatgcacc gaggatgtca
CgCttgtgCg
cggagtgctt tcatcgttta
ttcggcggctggctccgtaaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaa60tgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgc120ttactagcgattccggcttcatgcaggcgggttgcagcctgcaatccgaa180ttttctgggattggcttaacctcgcggtctcgcagccctttgtaccatcc240gtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccacc300ttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactcaatgctggcaactaag360gcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgaca420acctgtcactctgtcccccgaaggggaaggccctgtctccagggaggtca480agacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccac540ggcccccgtcaattcctttgagtttcagccttgcggccgtactccccagg600aatgcgttagctgcagcactaaagggcggaaaccctctaacacttagcac660cggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgc720
15
<400>4
agaaaggaggtgatccagccgcaccttccgatacggctaccttgttacgacttcacccca60
atcatctgtcccaccttcggcggctggctccgtaaaggttacctcaccgacttcgggtgt120
tacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcgg180
catgctgatccgcgattactagcgattccggcttcatgcaggcgggttgcagcctgcaat240
ccgaactgggaatggttttctgggattggcttaacctcgcggtctcgcagccctttgtac300
catccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatcc360
ccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaa420
ctaaggtcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctga480
cgacaaccatgcaccacctgtcactctgtcccccgaaggggaaggccctgtctccaggga540
ggtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgc600
tccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagccttgcggccgtactcc660
ccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaagggcggaaaccctctaacactt720
agcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgct780
ttcgcgcctcagcgtcagttacagaccagagagccgccttcgccactggtgttcctccac840
atctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagccc900
cccagtttccaatgaccgcttgcggttgagccgcaagatttcacatcagacttaagaaac960
cgcctgcgcgcgctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccg1020
cggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggccgggtaccgtcaaggcgccgccct1080
gttcgaacggcacttgttcttccccggcaacagagttttacgacccgaaggccttcttca1140
ctcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcct1200
cccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgatcaccctctcaggtcggc1260
tacgcatcgttgccttggtgagccgttaccccaccaactagctaatgcgccgcgggccca1320
tctgtaagtgacagcaaaagccgtctttcctttttcctccatgcggaggaaaaaactatc1380
cgatattagccccggtttcccggcgttatcccgatcttacaggcaggttacccacgtgtt1440
actcacccgtccgccgctaaccttttaaaagcaagcttttaaaaggtccgcacgacttgc1500
atgtattaggcacgccgccagcgttcgtcctgagccaggatcaaactc1548
權(quán)利要求
一種用于制備L 乳酸的凝結(jié)芽孢桿菌，其特征在于，具體為凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)XZL4和XZL9，其中所述的凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)XZL4DSM No.23183為革蘭氏陽性菌，其16S rRNA基因的核苷酸序列如Seq.ID No.1所示；所述的凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)XZL9DSM No.23184為革蘭氏陽性菌，其16S rRNA基因的核苷酸序列如Seq.ID No.2所示。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于制備L-乳酸的凝結(jié)芽孢桿菌的應用方法，其特征在 于，以含有五碳糖或六碳糖或其組合的農(nóng)業(yè)和工業(yè)產(chǎn)品和廢棄物作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源， 進行發(fā)酵后得到L-乳酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于制備L-乳酸的凝結(jié)芽孢桿菌的應用方法，其特征是，所 述的發(fā)酵是指采用發(fā)酵培養(yǎng)基按10%體積比的接種量在50°C 60°C環(huán)境下培養(yǎng)48 72 小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的用于制備L-乳酸的凝結(jié)芽孢桿菌的應用方法，其特征 是，所述的發(fā)酵中包含補料流加工藝，該補料流加工藝是指當發(fā)酵液中總還原糖含量低于 20 30g/L時補加碳源，使總還原糖含量維持在30 70g/L，或達到50 70g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于制備L-乳酸的凝結(jié)芽孢桿菌的應用方法，其特征是，所 述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及其含量為碳源40 200g/L、氮源5 12g/L和用于調(diào)控培養(yǎng)基 PH的中和劑50 100g/L，余量為水。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于制備L-乳酸的凝結(jié)芽孢桿菌的應用方法，其特征是， 所述的碳源為以五碳糖或六碳糖或其組合為有效組分的葡萄糖、木糖或農(nóng)業(yè)和工業(yè)廢棄 物，其中葡萄糖濃度為40 150g/L，木糖濃度為40 100g/L，木糖醇生產(chǎn)副產(chǎn)物濃度為 100 200g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于制備L-乳酸的凝結(jié)芽孢桿菌的應用方法，其特征是， 所述的芽孢桿菌的種子培養(yǎng)液是指將芽孢桿菌(B. coagulans) XZL4DSM No. 23183和 XZL9DSM No. 23184依次進行斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)后獲得的培養(yǎng)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于制備L-乳酸的凝結(jié)芽孢桿菌的應用方法，其特征是， 所述的斜面培養(yǎng)是指將凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans) XZL4DSM No. 23183和XZL9DSM No. 23184菌種接種于含有15g/L瓊脂的固體斜面培養(yǎng)基上，50 60°C條件下，培養(yǎng)24 48小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于制備L-乳酸的凝結(jié)芽孢桿菌的應用方法，其特征是，所 述的種子培養(yǎng)是指將經(jīng)過斜面培養(yǎng)的芽孢桿菌在無菌條件下接種到30ml種子培養(yǎng)基中， 50 60°C條件下，靜止培養(yǎng)10 24小時，加入中和劑控制發(fā)酵液pH，制得種子培養(yǎng)液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用于制備L-乳酸的凝結(jié)芽孢桿菌的應用方法，其特征是， 所述的種子培養(yǎng)基每升中含有葡萄糖40 60g，酵母粉5 10g，CaCO3 20 40g，余量為 水；該種子培養(yǎng)基的PH為6. 5。
全文摘要
一種乳酸制備技術(shù)領域的用于制備L-乳酸的凝結(jié)芽孢桿菌及其應用方法，以五碳糖或六碳糖為原料，或以含有五碳糖和六碳糖或其組合的農(nóng)業(yè)和工業(yè)廢棄物為原料，進行發(fā)酵后得到L-乳酸。應用本發(fā)明方法產(chǎn)量最高可達195g/L，光學純度大于99％，糖酸轉(zhuǎn)化率最高可達0.98，發(fā)酵生產(chǎn)能力2.7g/L/h。本發(fā)明提供的凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)XZL4(DSM No.23183)和XZL9(DSM No.23184)可以直接利用木糖醇生產(chǎn)副產(chǎn)物中的各種還原糖發(fā)酵生產(chǎn)高濃度L-乳酸，在節(jié)約成本的同時提高生產(chǎn)效率，適合于工業(yè)生產(chǎn)中推廣應用。
文檔編號C12P7/56GK101914465SQ201010176868
公開日2010年12月15日 申請日期2010年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月20日
發(fā)明者唐鴻志, 王麗敏, 蘇斐, 許平, 趙博, 陶飛, 馬翠卿 申請人:上海交通大學