專利名稱：重組火雞皰疹病毒細(xì)菌人工染色體轉(zhuǎn)移載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組火雞皰疹病毒細(xì)菌人工染色體轉(zhuǎn)移載體，具體涉及轉(zhuǎn)移載體的分 子設(shè)計(jì)、技術(shù)路線、轉(zhuǎn)移載體及其在研制重組HVT活病毒載體基因工程疫苗方面的應(yīng)用，屬 于生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
火雞皰疹病毒(Herpesvirus of turkey,HVT)是一種無致病性的a皰疹病毒，最 初于20世紀(jì)60年代末期從火雞體內(nèi)分離得到，它屬于MDV-3型，基因組為線性、雙股DNA 分子，大小約為160kb。HVT與雞的高度傳染性、致瘤性疾病馬立克氏病(MD)的病原馬立 克氏病病毒(MDV)在遺傳學(xué)和血清學(xué)上具有相關(guān)性，因此，在70年代就開始作為預(yù)防MD 的疫苗株在全球得到了廣泛的應(yīng)用。另外，HVT作為病毒載體攜帶外源保護(hù)性抗原基因方 面，與其它病毒載體相比具有許多優(yōu)勢(shì)使用安全，對(duì)雞及其它動(dòng)物均無致病性；接種雞體 后病毒在雞體內(nèi)形成長達(dá)數(shù)周的病毒血癥，且終生潛伏感染，可刺激機(jī)體產(chǎn)生較高的抗體 水平并維持終生，接種一次即可獲得終生免疫。目前，國外已成功地利用HVT作為載體表達(dá) 了多種禽病原保護(hù)性抗原基因，包括新城疫病毒(NDV)、血清1型MDV、傳染性法氏囊病病毒 (IBDV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、禽白血病病毒(ALV)等的保護(hù)性抗原，而且能抵抗致 死劑量病原的感染，表明HVT是有效的基因工程疫苗活病毒載體。由于HVT基因組龐大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而且具有很強(qiáng)的細(xì)胞結(jié)合性，在真核細(xì)胞中對(duì)其 進(jìn)行重組操作和研究，顯得困難重重。近年來，細(xì)菌人工染色體(BAC)技術(shù)在皰疹病毒上的 應(yīng)用解決了這一難題。通過構(gòu)建HVT全基因組細(xì)菌人工染色體，就可以方便地利用Red/ET、 Cre/loxP等現(xiàn)代基因重組系統(tǒng)對(duì)病毒進(jìn)行反向遺傳操作。在大腸桿菌中就可以完成對(duì)HVT 基因組的遺傳修飾，與在真核細(xì)胞中相比，該重組技術(shù)具有快速有效可靠的優(yōu)點(diǎn)。目前對(duì)于重組HVT的構(gòu)建有兩種方法一種是傳統(tǒng)的方法，即利用重組轉(zhuǎn)移載體 與病毒基因組共轉(zhuǎn)染，將外源基因如lacZ基因等同源重組入病毒基因組中；另一種方法是 利用BAC進(jìn)行重組HVT的構(gòu)建。使用傳統(tǒng)的方法即同源重組，由于受到CEF細(xì)胞的制備繁 瑣、同源重組率低等因素的影響，使得重組HVT的構(gòu)建較為困難，而利用BAC技術(shù)進(jìn)行重組 HVT的構(gòu)建可以簡化繁瑣的病毒篩選過程。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于，構(gòu)建含有表達(dá)選擇標(biāo)記黃嘌呤_鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 (XGPRT，gpt)和細(xì)菌人工染色體(BAC)基本功能基因序列的重組HVT細(xì)菌人工染色體轉(zhuǎn)移 載體pUAB-gpt-BAC，具有氨芐青霉素和氯霉素雙抗性，可簡化重組病毒篩選過程，在研制重 組HVT活病毒載體基因工程疫苗方面具有良好的應(yīng)用前景。技術(shù)方案本發(fā)明根據(jù)大腸桿菌黃嘌呤_鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(XGPRT，gpt)序列設(shè)計(jì)引物，以E.coli DH5a染色體DNA為模板采用PCR方法擴(kuò)增gpt基因，用其作為外源篩選基 因，與質(zhì)粒PEGFP中的CMV啟動(dòng)子及poly (A)連接構(gòu)建gpt表達(dá)盒Egpt (CMV-gpt-polyA)， 經(jīng)酶切測(cè)序鑒定后，插入到含有火雞皰疹病毒(HVT)非必需區(qū)US2兩側(cè)基因的同源臂克隆 質(zhì)粒pUAB中，構(gòu)建帶有篩選基因表達(dá)盒的重組克隆質(zhì)粒pUAB-gpt。將單拷貝細(xì)菌人工染色 體(BAC)載體克隆到pUC18中，制備高拷貝BAC載體基本功能序列，插入到pUAB-gpt中，獲 得重組HVT細(xì)菌人工染色體轉(zhuǎn)移載體pUAB-gpt-BAC。包括1、重組火雞皰疹病毒(HVT)細(xì)菌人工染色體(BAC)轉(zhuǎn)移載體pUAB-gpt-BAC，大小 為16100bp，HVT非必需區(qū)US2兩側(cè)同源臂A和B之間為8800bp含黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn) 移酶基因(XGPRT，gpt)基因表達(dá)盒Egpt的BAC-gpt核心序列，具有氨芐青霉素和氯霉素雙 抗性。2、轉(zhuǎn)移載體pUAB-gpt-BAC，是通過分子設(shè)計(jì)構(gòu)建的，具體包括第一步根據(jù)HVT Fcl26株基因組序列(GenBank登錄號(hào)AF291866)、gpt基因序 列(GenBank登錄號(hào):X00221. 1)和質(zhì)粒pEGFP-Cl 序列(GenBank登錄號(hào)U55763. 1)設(shè)計(jì)了 以下PCR擴(kuò)增引物。
引物序列(5，-3，)酶切位點(diǎn)gpt-Fgc|gctagc]gtcatgagcgaaaaatacatcgNhe Igpt-Ract|ggatcc|ttagcgaccggagattggcgBamU IEgpt-FGC|GAATTCfrATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGEcoR IEgpt-rgc|gtcgac|cgcgttaagatacattgatgagtttggaSal IA-Fcg|ggatcc|acatcgggccacgttccgccBamU Ia-rgc|tctaga|gcgtcgaccg|gaattc|gatgagctgacgtgtggaXba I、EcoR Ib-fG[GAATTClAA|GTCGAClGG|AAGC'niCCACTAATATGGGCACACEcoR I、&3/1、Hindlllb-rgc|tctaga|tggcccatctaggtgattatXba I第二步以E. coli DH5 a染色體DNA為模板，用引物gpt_F、gpt_R擴(kuò)增外源加壓 篩選標(biāo)記基因gpt，用pMD18-T克隆載體克隆，獲得含有g(shù)pt基因的陽性克隆質(zhì)粒pMD-gpt ；第三步用BamH I與Nhe I雙酶切pEGFP_Cl質(zhì)粒，切除GFP基因，同時(shí)連接gpt 片段，獲得含有g(shù)pt基因的表達(dá)質(zhì)粒pEgpt ；然后，以pEgpt為模板，用引物Egpt-F、Egpt-R 進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選標(biāo)記基因gpt的表達(dá)盒Egpt，即CMV-gpt-poly A,與pMD18_T克隆載體 連接，獲得含有g(shù)pt基因表達(dá)盒Egpt的克隆質(zhì)粒pMD-Egpt ；第四步分別用引物A-F、A-R和B-F、B-R進(jìn)行PCR，以HVT感染細(xì)胞總DNA為模 板，分別擴(kuò)增HVT左/右同源臂A/B，用pMD18-T載體克隆，分別獲得含有HVT同源臂A和B 的克隆質(zhì)粒pMD-A和pMD-B ；第五步將pMD-A 用 EcoR I 和 Xba I 雙酶切，pMD_B 用 EcoR I, Sea I 和 Xba I 三酶切，回收PMD-A載體片段和B片段，T4DNA連接酶連接，獲得含有HVT左/右同源臂A/ B的克隆質(zhì)粒pUAB ；第六步用EcoR I和Sal I分別雙酶切pMD-Egpt和pUAB，回收gpt基因表達(dá)盒 Egpt和pUAB載體片段，T4DNA連接酶連接，獲得含有篩選標(biāo)記基因gpt表達(dá)盒Egpt的克隆質(zhì)粒 pUAB-gpt ；第七步用單拷貝BAC載體pIndigoBAC-5構(gòu)建高拷貝BAC載體克隆質(zhì)粒 PUC18-BAC 提取pUC18質(zhì)粒，Hind III單酶切，回收pUC18目的片段，與BAC載體pIndigoBAC-5 連接，電轉(zhuǎn)化宿主菌DH10B，加入37°C的S0C培養(yǎng)基，并將其轉(zhuǎn)移到1. 5mL無菌Eppendorf 管 中，37°C、220r/min振蕩培養(yǎng)lh，4000r/min離心5min，將細(xì)菌沉淀涂布于含氯霉素34 u g/ mL和氨芐青霉素100 u g/mL的雙抗LB培養(yǎng)基平板上，挑取克隆，搖菌16h后提取質(zhì)粒，獲得 高拷貝BAC克隆質(zhì)粒pUC18-BAC，其中S0C培養(yǎng)基為LB中含有0. 2mmol/L葡萄糖，0. lmmol/ L MgS04 和 0. lmmol/L MgCl2 ；第八步將pUC18-BAC與pUAB-gpt分別用Hind III酶切，回收pUAB-gpt線性化片 段和BAC載體的基本功能基因，T4DNA連接酶連接，獲得重組火雞皰疹病毒細(xì)菌人工染色體 HVT-BAC 轉(zhuǎn)移載體 pUAB-gpt-BAC。上述轉(zhuǎn)移載體pUAB-gpt-BAC可在制備重組HVT活病毒載體基因工程疫苗方面可 以得到應(yīng)用。有益效果利用高拷貝質(zhì)粒來制備BAC載體是一種簡單實(shí)用的方法，這種方法制備的BAC載 體功能序列比從單拷貝質(zhì)粒得到的具有更多的優(yōu)點(diǎn)。盡管在理論上，獲得一定量的單拷貝 質(zhì)粒可以通過細(xì)菌的大量培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)，但在操作中會(huì)不可避免的導(dǎo)致蛋白質(zhì)污染以及BAC 載體質(zhì)粒本身的開環(huán)和斷鏈，給下游克隆工作帶來很大的麻煩，即使用較好的質(zhì)量純化試 劑盒，這些問題也難以避免。本發(fā)明將單拷貝BAC載體pIndigoBAC-5插入到高拷貝質(zhì)粒 PUC18，成功構(gòu)建了高拷貝BAC克隆質(zhì)粒pUC18-BAC，用于制備BAC載體DNA，只需要培養(yǎng)少 量的細(xì)菌即可得到足夠數(shù)量的BAC載體DNA。為了能成功構(gòu)建重組HVT細(xì)菌人工染色體，在轉(zhuǎn)移載體中選擇使用何種篩選標(biāo)記 基因是影響實(shí)驗(yàn)過程難易以及成功與否的關(guān)鍵因素?；痣u皰疹病毒與I型馬立克氏病病毒 相似，都具有比較嚴(yán)格的細(xì)胞結(jié)合特性，如果使用非加壓篩選標(biāo)記基因lacZ和EGFP作為遺 傳標(biāo)記基因，由于在表達(dá)非加壓選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞中含有大量的野生病毒，重組病毒難 以篩選出來，病毒的蝕斑純化將變得十分困難。本發(fā)明選用黃嘌呤_鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶基 因作為加壓篩選標(biāo)記，在加壓條件下，霉酚酸(MPA)阻斷了野生病毒的嘌呤代謝途徑，從而 阻斷了野生病毒的DNA復(fù)制，而經(jīng)過同源重組將BAC-gpt目的片段正確插入到病毒的復(fù)制 非必需基因US2區(qū)的重組病毒，能夠表達(dá)黃嘌呤_鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶，該酶利用外源黃嘌呤 完成了鳥嘌呤的外源補(bǔ)救合成，從而使得重組病毒DNA的復(fù)制能夠正常進(jìn)行，經(jīng)過幾輪篩 選野生病毒可全部死亡，而重組病毒逐漸可得到富集和純化。為了加強(qiáng)核糖體小亞基對(duì)翻譯起始序列的識(shí)別，以保證在CEF中能夠高效表達(dá)黃 嘌呤-鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶，本發(fā)明在擴(kuò)增正選擇標(biāo)記基因表達(dá)盒Egpt時(shí)，并不是將編碼151 個(gè)氨基酸的456bp大小的gpt編碼框簡單的直接克隆到CMV早期啟動(dòng)子和SV40多聚腺苷 酸(polyA)尾之間，而是將gpt編碼框的起始密碼子ATG的上游序列按照“K0ZAK規(guī)則”進(jìn) 行了優(yōu)化。本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)如下1、本發(fā)明將單拷貝BAC載體pIndigoBAC-5插入到高拷貝質(zhì)粒pUC18，成功構(gòu)建了高拷貝BAC克隆質(zhì)粒PUC18-BAC，用于制備BAC載體DNA，只需要培養(yǎng)少量的細(xì)菌即可得到 足夠數(shù)量的BAC載體DNA。2、本發(fā)明選用黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶基因作為加壓篩選標(biāo)記，在加壓條件 下，霉酚酸(MPA)阻斷了野生病毒的嘌呤代謝途徑，從而阻斷了野生病毒的DNA復(fù)制，而經(jīng) 過同源重組將BAC-gpt目的片段正確插入到病毒的復(fù)制非必需基因US2區(qū)的重組病毒，能 夠表達(dá)黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶，該酶利用外源黃嘌呤完成了鳥嘌呤的外源補(bǔ)救合成， 從而使得重組病毒DNA的復(fù)制能夠正常進(jìn)行，經(jīng)過幾輪篩選野生病毒可全部死亡，而重組 病毒逐漸可得到富集和純化。3、本發(fā)明在擴(kuò)增正選擇標(biāo)記基因表達(dá)盒Egpt時(shí)，并不是將編碼151個(gè)氨基酸的 456bp大小的gpt編碼框簡單的直接克隆到CMV早期啟動(dòng)子和SV40多聚腺苷酸(polyA)尾 之間，而是將gpt編碼框的起始密碼子ATG的上游序列按照“K0ZAK規(guī)則”進(jìn)行了優(yōu)化，以加 強(qiáng)核糖體小亞基對(duì)翻譯起始序列的識(shí)別，保證在CEF中能夠高效表達(dá)黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸 轉(zhuǎn)移酶。4、本發(fā)明構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體pUAB-gpt-BAC含gpt基因表達(dá)盒的核心序列BAC-gpt， 具有氨芐青霉素和氯霉素雙抗性，可簡化重組病毒篩選過程，在研制重組HVT活病毒載體 基因工程疫苗方面具有良好的應(yīng)用前景。
四

圖1重組HVT-BAC轉(zhuǎn)移載體pUAB-gpt-BAC構(gòu)建的技術(shù)路線圖2gpt與Egpt的擴(kuò)增與克隆M :DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1 :gpt片段PCR產(chǎn)物；2 :pMD_gpt的Nhe I和BamH I雙酶 切產(chǎn)物；3 :Egpt片段PCR產(chǎn)物；4 :pMD-Egpt的EcoR I和Sal I雙酶切產(chǎn)物圖3質(zhì)粒pUAB的酶切圖譜M :DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1 :A片段PCR產(chǎn)物；2 :B片段PCR產(chǎn)物；3 :pMD_A的EcoR I 和XbaI雙酶切產(chǎn)物；4 :pMD-B的EcoR I , Sea I和Xba I三酶切產(chǎn)物；5 :pUAB的EcoR I 和XbaI雙酶切產(chǎn)物圖4質(zhì)粒pUAB-gpt的酶切圖譜M :DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1 :pUAB_gpt的EcoR I和Sal I雙酶切產(chǎn)物圖5質(zhì)粒pUC18-BAC的酶切圖譜M :DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2 :pUC18_BAC的Hind III單酶切產(chǎn)物圖6轉(zhuǎn)移載體pUAB-gpt-BAC的酶切圖譜M :DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1 :pUAB-gpt-BAC 的 BamH I 單酶切產(chǎn)物；2 :pUAB-gpt_BAC 的XbaI單酶切產(chǎn)物；3 :pUAB-gpt-BAC的Nhe I單酶切產(chǎn)物圖7轉(zhuǎn)移載體pUAB-gpt-BAC的的分子圖譜
五具體實(shí)施例方式1試驗(yàn)材料BAC載體pIndigoBAC-5為Epicentre公司產(chǎn)品；AxyPr印質(zhì)粒小量純化試劑盒、 DNA凝膠回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；pMD18_T克隆載體、X_gal、IPTG、限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA Ligase、ATP、dNTP及Taq DNA聚合酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品；含有綠色熒光 蛋白GFP基因的表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Cl、E. coli DH5a、E. coli DH10B、DMEM培養(yǎng)基、胰酶為 Invitrogen公司產(chǎn)品；9 10日齡SPF雞胚、火雞皰疹病毒(Herpesvirus of turkey, HVT) Fcl26株均購自南京天邦生物科技有限公司。引物合成、DNA序列測(cè)定由Invitrogen公司 完成。2試驗(yàn)方法2. 1引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)在GenBank發(fā)表的HVT Fc 126株全長基因組序列(GenBank登錄號(hào) AF291866)、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(XGPRT，gpt)序列(GenBank登錄號(hào) X00221. 1)以及質(zhì)粒pEGFP-Cl序列(GenBank登錄號(hào)U55763. 1)設(shè)計(jì)了以下PCR擴(kuò)增引 物 2. 2gpt基因與Egpt基因的擴(kuò)增與克隆以E. coli DH5 a染色體DNA為模板，以gpt_F、gpt-R作為引物用PCR擴(kuò)增外源加 壓篩選標(biāo)記基因 gpt。PCR 條件:95°C預(yù)變性 5min ；94°C lmin，61°C lmin，72°C lmin，35 個(gè)循 環(huán)；72°C延伸lOmin。用10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，可見一條大小約為500bp的 DNA帶，回收gpt基因的PCR產(chǎn)物，用PMD18-T載體克隆，提取克隆質(zhì)粒pMD-gpt，用Nhe I 和BamH I對(duì)gpt基因克隆質(zhì)粒pMD-gpt進(jìn)行雙酶切鑒定，可見兩條大小分別約為500bp和 2700bp 的 DNA 帶。用BamH I與Nhe I雙酶切pEGFP_Cl質(zhì)粒，切除GFP基因，同時(shí)連接gpt片段，獲得 含有g(shù)pt基因的表達(dá)質(zhì)粒pEgpt ；然后，以pEgpt為模板，以Egpt-F、Egpt-R作為引物擴(kuò)增篩 選標(biāo)記基因 gpt 的表達(dá)盒 Egpt(CMV-gpt-poly A)。PCR 條件95°C預(yù)變性 5min ；94°C lmin， 55°C 90s,72°C 2min，共30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)lOg/L瓊脂糖凝膠電泳分 析，可見一條大小約為1300bp的DNA條帶。用10g/L瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR產(chǎn)物目的片段，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化 E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)菌，涂布于15g/L瓊脂LB平板(含Amp 100 y g/mL)，挑白色菌落培 養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，獲得含有g(shù)pt基因表達(dá)盒Egpt的克隆質(zhì)粒pMD-Egpt。將克隆質(zhì)粒pMD-Egpt 用EcoR I和Sal I雙酶切后，用10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，可見兩條大小分別約為 1300bp 和 2700bp 的條帶(圖 2)。
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2. 3HVT同源臂克隆質(zhì)粒的構(gòu)建用9 10日齡SPF雞胚制備原代雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，在75cmX 75cm細(xì)胞培養(yǎng) 瓶中培養(yǎng)24h，當(dāng)細(xì)胞長成單層后，接種100PFU毒量的HVT。待70%細(xì)胞出現(xiàn)病變，收取病 毒感染的細(xì)胞，凍融三次，SDS堿裂解法提取病變細(xì)胞總DNA。以A-F、A-R，B_F、B-R為引物，以HVT感染細(xì)胞總DNA為模板進(jìn)行PCR，分別擴(kuò)增 出HVT Fcl26株US2基因兩側(cè)的左、右同源臂A和B，同源臂A約2000bp (核苷酸序列位于 137758 139758)和同源臂B約2700bp (核苷酸序列位于140762 143442)。PCR條件 95 V 5min ；94°C lmin，57°C lmin，72°C 3min，進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)后 72°C延伸 lOmin。用 10g/L 瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR產(chǎn)物，用pMD18-T載體克隆，分別獲得含有HVT同源臂A和B的 克隆質(zhì)粒pMD-A和pMD-B。然后，用BamH I和EcoR I雙酶切分析pMD_A，EcoR I, Sea I和Xba I三酶切分 析pMD-B，進(jìn)一步測(cè)序確認(rèn)。然后，將pMD-A用EcoR I和Xba I雙酶切，pMD_B用EcoR I、 Sea I和Xba I三酶切，回收pMD-A載體片段和B片段，T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化DH5 a感 受態(tài)細(xì)菌，提取重組質(zhì)粒，EcoR I和Xba I雙酶切鑒定，獲得含有HVT左/右同源臂A/B的 克隆質(zhì)粒PUAB。將克隆質(zhì)粒pUAB，用EcoR I和Xba I雙酶切，8g/L瓊脂糖凝膠電泳分析， 可見二條長度分別約4700bp和2700bp的DNA片段，與pMD_A載體片段和B片段的理論值 相符合(圖3)。2. 4篩選標(biāo)記基因克隆質(zhì)粒的構(gòu)建用EcoR I和Sal I分別雙酶切pMD-Egpt和pUAB，8g/L瓊脂糖凝膠電泳回收gpt 基因表達(dá)盒Egpt和pUAB載體片段，DNA膠回收試劑盒純化，T4 DNA Ligase連接，轉(zhuǎn)化DH5 a 感受態(tài)細(xì)菌，涂布在用LB配制的15g/L瓊脂平皿上(含Amp 100 u g/mL)，37°C培養(yǎng)14h，挑 單菌落接種入LB (含Amp 100 u g/mL)，振搖培養(yǎng)12h，用質(zhì)粒純化試劑盒提取質(zhì)粒，EcoR I 和Sal I雙酶切鑒定，獲得含有篩選標(biāo)記基因gpt表達(dá)盒Egpt的克隆質(zhì)粒pUAB-gpt。將克隆質(zhì)粒pUAB-gpt，經(jīng)EcoR I和Hind III雙酶切，8g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，可 見二條長度分別約7300bp和1300bp的DNA片段，與pUAB和Egpt基因片段的理論值相符 合(圖4)。2. 5高拷貝BAC克隆質(zhì)粒的構(gòu)建用單拷貝BAC載體pIndigoBAC-5構(gòu)建高拷貝BAC載體克隆質(zhì)粒。其方法是提取 PUC18質(zhì)粒，Hind III單酶切，回收pUC18目的片段，與BAC載體pIndigoBAC-5連接，電轉(zhuǎn)化 宿主菌DH10B(電轉(zhuǎn)條件為0. lem電轉(zhuǎn)杯，2500V、200 Q、25uF)，電擊完成后立即加入37°C 的 S0C 培養(yǎng)基(LB 中含有 0. 2mmol/L 葡萄糖，0. lmmol/L MgS04，0. lmmol/L MgCl2)，并將其 轉(zhuǎn)移到 1. 5mL 無菌 Eppendorf 管中，37°C、220r/min 振蕩培養(yǎng) lh，4000r/min 離心 5min，將 細(xì)菌沉淀涂布于含氯霉素(Chi，34 u g/mL)和氨芐青霉素(Amp，100 u g/mL)的雙抗LB培養(yǎng) 基平板上，挑取克隆，搖菌16h后提取質(zhì)粒，獲得高拷貝BAC克隆質(zhì)粒pUC18-BAC。將高拷貝BAC克隆質(zhì)粒pUC18-BAC，經(jīng)Hind III單酶切，用8g/L瓊脂糖凝膠電泳分 析，可見2條長度分別約7500bp和2700bp的DNA片段，與pUC18和BAC載體基本功能基因 線性化片段的理論值相符合(圖5)。2. 6重組HVT-BAC轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建將pUC18-BAC與pUAB-gpt分別用Hind III酶切，經(jīng)8g/L瓊脂糖凝膠電泳，分別回收pUAB-gpt線性化片段和BAC載體的基本功能基因，DNA膠回收試劑盒純化，T4DNA Ligase連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5 a感受態(tài)細(xì)菌，涂布在用LB配制的15g/L瓊脂平皿上(含 Amp 100u g/ml, Chi 34 ii g/mL)，37°C培養(yǎng) 14h，挑單菌落接種入 LB (含 AmplOO ii g/ml，Chi 34 u g/mL)，振搖培養(yǎng)12h，用質(zhì)粒純化試劑盒提取質(zhì)粒，獲得重組火雞皰疹病毒細(xì)菌人工染 色體(HVT-BAC)轉(zhuǎn)移載體pUAB-gpt-BAC，大小為16100bp，左、右同源臂A和B之間為核心序 列BAC-gpt，大小為8800bp，具有氨芐青霉素和氯霉素雙抗性(Amp 100ug/ml,Chl 34 u g/ mL)，在制備重組HVT活病毒載體基因工程疫苗方面可以得到應(yīng)用。 上述轉(zhuǎn)移載體pUAB-gpt-BAC分別用BamH I、Xba I、Nhe I單酶切，8g/L瓊脂糖 凝膠電泳分析，分別獲得3071bp、5415bp、7741bp三條帶；2429bp、5306bp、8492bp三條帶； 7089bp、9138bp兩條帶；與DNA片段理論值相符合(圖1、圖6)。
權(quán)利要求
重組火雞皰疹病毒HVT細(xì)菌人工染色體BAC轉(zhuǎn)移載體pUAB-gpt-BAC，其大小為16 100bp，HVT非必需區(qū)US2兩側(cè)同源臂A和B之間為8800bp，含黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶基因XGPRT，簡稱gpt基因，gpt基因表達(dá)盒Egpt的核心序列為BAC-gpt，具有氨芐青霉素和氯霉素雙抗性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)移載體pUAB-gpt-BAC，是通過分子設(shè)計(jì)構(gòu)建的，具體包括第一步根據(jù)GenBank登錄號(hào)AF291866的HVT Fcl26株基因組序列、GenBank登錄號(hào) X00221. 1的gpt基因序列和GenBank登錄號(hào)U55763. 1的質(zhì)粒pEGFP-Cl序列設(shè)計(jì)了以下 PCR擴(kuò)增引物引物 序列(5’ -3’ )酶切位點(diǎn)gpt-F GCGCTAGCGTCATGAGCGAAAAATACATCGNhe Igpt-R ACTGGATCCTTAGCGACCGGAGATTGGCGBamH IEgpt-F GCGAATTCTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAG EcoR I Egpt-R GCGTCGACCGCGTTAAGATACATTGATGAGTTTGGASal IA-F CGGGATCCACATCGGGCCACGTTCCGCCBamH IGCTCTAGAGCGTCGACCGGAATTCGATGAGCTGACGTGTGGA XbaI、EcoR IA-RGGAATTCAAGTCGACGGAAGCTTCCACTAATATGGGCACAC EcoR I.Sal I,HindIIIB-FGCTCTAGATGGCCCATCTAGGTGATTATXba IB-R第二步以E.coli DH5a染色體DNA為模板，用引物gpt_F、gpt_R擴(kuò)增外源加壓篩選 標(biāo)記基因gpt，用pMDIS-T克隆載體克隆，獲得含有g(shù)pt基因的陽性克隆質(zhì)粒pMD-gpt ；第三步用BamH I與Nhe I雙酶切pEGFP-Cl質(zhì)粒，切除GFP基因，同時(shí)連接gpt片段， 獲得含有g(shù)pt基因的表達(dá)質(zhì)粒pEgpt ；然后，以pEgpt為模板，用引物Egpt-F、Egpt-R進(jìn)行 PCR擴(kuò)增篩選標(biāo)記基因gpt的表達(dá)盒Egpt，即CMV-gpt-poly Α,與pMD18_T克隆載體連接， 獲得含有g(shù)pt基因表達(dá)盒Egpt的克隆質(zhì)粒pMD-Egpt ；第四步分別用引物A-F、A-R和B-F、B-R進(jìn)行PCR，以HVT感染細(xì)胞總DNA為模板，分 別擴(kuò)增HVT左/右同源臂A/B，用pMDIS-T載體克隆，分別獲得含有HVT同源臂A和B的克 隆質(zhì)粒pMD-A和pMD-B ；第五步將pMD-A用EcoR I和Xba I雙酶切，pMD-Β用EcoR I、Sca I和Xba I三酶 切，回收PMD-A載體片段和同源臂B片段，T4 DNA連接酶連接，獲得含有HVT左/右同源臂 A/B的克隆質(zhì)粒pUAB ；第六步用EcoR I和Sal I分別雙酶切pMD-Egpt和pUAB，回收gpt基因表達(dá)盒Egpt 和pUAB載體片段，T4DNA連接酶連接，獲得含有篩選標(biāo)記基因gpt表達(dá)盒Egpt的克隆質(zhì)粒 pUAB-gpt；第七步用單拷貝BAC載體pIndigoBAC-5構(gòu)建高拷貝BAC載體克隆質(zhì)粒pUC18_BAC 提取PUC18質(zhì)粒，Hind III單酶切，回收pUC18目的片段，與BAC載體pIndigoBAC-5連 接，電轉(zhuǎn)化宿主菌DH10B，加入37°C的SOC培養(yǎng)基，并將其轉(zhuǎn)移到1. 5mL無菌Eppendorf管中，37°C、220r/min振蕩培養(yǎng)lh，4000r/min離心5min，將細(xì)菌沉淀涂布于含氯霉素34 μ g/ mL和氨芐青霉素100 μ g/mL的雙抗LB培養(yǎng)基平板上，挑取克隆，搖菌16h后提取質(zhì)粒，獲得 高拷貝BAC克隆質(zhì)粒pUC18-BAC，其中SOC培養(yǎng)基為LB中含有0. 2mmol/L葡萄糖，0. Immol/ L MgS04 和 0. lmmol/L MgCl2 ；第八步將PUC18-BAC與pUAB-gpt分別用Hind III酶切，回收pUAB-gpt線性化片段 和BAC載體的基本功能基因，T4DNA連接酶連接，獲得重組火雞皰疹病毒細(xì)菌人工染色體 HVT-BAC 轉(zhuǎn)移載體 pUAB-gpt-BAC。
3.權(quán)利要求1或2所述轉(zhuǎn)移載體pUAB-gpt-BAC在制備重組HVT活病毒載體基因工程 疫苗方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組火雞皰疹病毒細(xì)菌人工染色體轉(zhuǎn)移載體，屬于生物制藥領(lǐng)域。從E.coli DH5α染色體DNA中擴(kuò)增黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶基因gpt基因，與質(zhì)粒pEGFP中的CMV啟動(dòng)子及poly(A)連接，，插入到質(zhì)粒pUAB中，構(gòu)建帶有Egpt的重組克隆質(zhì)粒pUAB-gpt。用pUC18克隆單拷貝BAC載體制備高拷貝BAC載體基本功能序列，插入到pUAB-gpt中，獲得重組火雞皰疹病毒細(xì)菌人工染色體轉(zhuǎn)移載體pUAB-gpt-BAC，含gpt基因表達(dá)盒的核心序列BAC-gpt，具有氨芐青霉素和氯霉素雙抗性。本發(fā)明構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體具有研制重組HVT活病毒載體基因工程疫苗的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/66GK101864442SQ201010176530
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月19日
發(fā)明者周宇, 歐陽偉, 王永山, 范紅結(jié) 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院