專利名稱：小鼠人工染色體載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定地?cái)y帶在嚙齒類體內(nèi)且可進(jìn)行子代傳遞(子孫伝達(dá))的小鼠人工染色體載體。本發(fā)明還涉及一種攜帶上述小鼠人工染色體載體的細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步涉及攜帶上述小鼠人工染色體載體的小鼠等非人類動物。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因小鼠由于通過導(dǎo)入基因搭載載體來利用靶基因和表達(dá)產(chǎn)物而被廣泛使用。但是，在迄今為止的轉(zhuǎn)基因小鼠中，基因?qū)氲奈稽c(diǎn)是隨機(jī)的，有時(shí)導(dǎo)入基因的表達(dá)由于導(dǎo) 入的位置效應(yīng)而被抑制，另外，對現(xiàn)有的基因?qū)敕ǘ裕瑹o法控制拷貝數(shù)，尺寸也限定在200kb左右。由此，難以將對于哺乳動物基因并不罕見的超過200kb大小的基因或基因簇克隆到包含控制區(qū)域的載體上。因此，現(xiàn)有的基因?qū)敕ù嬖跓o法重現(xiàn)及檢驗(yàn)導(dǎo)入基因原本的功能的限制。針對這樣的問題，本發(fā)明人等開發(fā)了使用染色體水平導(dǎo)入基因這樣新的染色體導(dǎo)入法的染色體導(dǎo)入小鼠的制作技術(shù)(非專利文獻(xiàn)I)。通過該技術(shù)將人類染色體或其片段導(dǎo)入小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞來制作嵌合小鼠，結(jié)果顯示人類染色體片段被獨(dú)立攜帶，多個(gè)人類基因進(jìn)行組織特異性表達(dá)，也存在經(jīng)過減數(shù)分裂可片段性地進(jìn)行子代傳遞的人類染色體。另外，本發(fā)明人等將人類21號染色體總長(約35Mb)導(dǎo)入小鼠，制作在實(shí)用方面也具有高價(jià)值的唐氏綜合征模型小鼠(非專利文獻(xiàn)2)。對該小鼠進(jìn)行分析，結(jié)果導(dǎo)入的人類21號染色體上的基因重現(xiàn)生理性的表達(dá)模式，顯示染色體載體的有效性。進(jìn)而，本發(fā)明人等利用染色體工程技術(shù)方法，S卩，使用人工端粒序列的端粒截短技術(shù)進(jìn)行的染色體缺失以及Cre/loxP系統(tǒng)進(jìn)行的染色體克隆，可構(gòu)建僅含有目標(biāo)區(qū)域的人類人工染色體，其結(jié)果也顯示了成功地構(gòu)建了含有兆堿基(Mb)大小的特定人類染色體區(qū)域的人類人工染色體(HAC, Human Artificial Chromosme)載體,該載體在小鼠個(gè)體中起作用(非專利文獻(xiàn)3)。進(jìn)而，應(yīng)用上述技術(shù)構(gòu)建了不含已知基因的新型HAC載體(非專利文獻(xiàn)4)。另外，本發(fā)明者人等基于上述背景，將搭載有靶基因的HAC載體導(dǎo)入任何的細(xì)胞，成功實(shí)現(xiàn)了靶基因的穩(wěn)定表達(dá)。進(jìn)而，作為應(yīng)用HAC載體建模人型小鼠的實(shí)例，將人類7號染色體上的藥物代謝酶CYP3A基因簇(IMb)和人類X連鎖型肌營養(yǎng)不良癥的致病基因即人類DMD基因(2. 5Mb)分別克隆到HAC載體上(CYP3A-HAC，DMD-HAC)，導(dǎo)入小鼠ES細(xì)胞制作小鼠(專利文獻(xiàn)I，非專利文獻(xiàn)5)。由導(dǎo)入有CYP3A-HAC的小鼠的組織攜帶率和表達(dá)分析表明，HAC上的CYP3A基因簇被攜帶在小鼠的各組織中(專利文獻(xiàn)I的圖8)，其表達(dá)模式與人類組織中的模式相同，在肝臟、小腸中特異性表達(dá)。進(jìn)而，由DMD-HAC導(dǎo)入小鼠的組織攜帶率和表達(dá)分析的分析表明，在小鼠的各個(gè)組織中攜帶有DMD-HAC(非專利文獻(xiàn)5的圖4A)，已知在人類中組織特異性表達(dá)的剪接異構(gòu)體中的至少3種以與人類同樣的方式進(jìn)行表達(dá)。由這一系列的結(jié)果暗示了作為代替以往的轉(zhuǎn)基因小鼠的HAC導(dǎo)入小鼠用于新的基因(組)導(dǎo)入方法的有用性。
含有人類人工染色體的哺乳類人工染色體載體具有以往的載體體系(病毒、YAC、BAC、PAC、粘粒、質(zhì)粒)中所沒有的優(yōu)點(diǎn)，因此，可期待用作新的基因的功能分析及人型模型動物的制作體系。例如在專利文獻(xiàn)2及3中公開有一種HAC載體，其由改變?nèi)祟?4號染色體或人類21號染色體并縮小其大小而成的染色體的片段構(gòu)成且較穩(wěn)定地?cái)y帶在細(xì)胞中。但是，在使對以往的基因改造小鼠而言不可能的Mb單位的基因?qū)胱優(yōu)榭赡艿娜祟?1號染色體導(dǎo)入小鼠(唐氏綜合征模型小鼠)或HAC載體導(dǎo)入小鼠中，存在如下等問題這些人類染色體載體的攜帶率降低、在組織間或個(gè)體間變異、子代傳遞的頻率不穩(wěn)定。因此，常需要考慮HAC載體等的攜帶率，另外，在對特定的基因區(qū)域所具有的功能及與疾病的關(guān)系進(jìn)行研究的情況下，有時(shí)也難以在組織細(xì)胞水平下詳細(xì)且準(zhǔn)確地對靶基因的表達(dá)動態(tài)及表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析，阻礙高重現(xiàn)性的均勻分析。進(jìn)而，另外，在對小鼠細(xì)胞和人類細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合時(shí)，已知人類染色體在小鼠細(xì) 胞內(nèi)不穩(wěn)定。這樣，由于含有人類人工染色體載體的人類染色體在小鼠細(xì)胞內(nèi)攜帶率不恒定，因此，在將人類人工染色體載體導(dǎo)入小鼠細(xì)胞的情況及制作轉(zhuǎn)基因小鼠的情況下，無法充分地發(fā)揮作為人工染色體載體的優(yōu)點(diǎn)。在轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞或制作轉(zhuǎn)基因小鼠的基礎(chǔ)上，今后通過提高導(dǎo)入基因的攜帶率或使其恒定，可進(jìn)行更詳細(xì)且準(zhǔn)確并且重現(xiàn)性高的基因功能的分析或基因表達(dá)產(chǎn)物的有效的回收。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I國際公開W02009/063722號小冊子專利文獻(xiàn)2國際公開W02004/031385號小冊子專利文獻(xiàn)3日本特開2007-295860號公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)ITomizuka 等，Nat Genet, 16 133-143,1997非專利文獻(xiàn)2Shinohara 等，HMG，10 :1163-75，2001非專利文獻(xiàn)3Kuroiwa 等，Nat Biotech，18 :1086-1090，2000非專利文獻(xiàn)4Katoh 等，BBRC, 321 :280-290, 2000非專利文獻(xiàn)5Hoshiya 等，Mol Ther, 17 :309-17, 2009

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題迄今為止所報(bào)告的許多哺乳類人工染色體為人類人工染色體(日本特開2005-230020 ；日本特開 2008-54501 ；日本特開 2007-306928 ；日本特開 2007-295860)，但也存在極少數(shù)關(guān)于小鼠人工染色體的報(bào)告，該人工染色體的特征在于，利用小鼠著絲粒的一部分的序列(S. Stewart 等(2002) Gene Therapy 9:719-723)。如上所述，在將天然人類染色體片段移入小鼠細(xì)胞時(shí)，人類染色體片段在小鼠細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定(例如，Shinohara 等(2000)Chromosome Research,8 :713-725)。這在小鼠個(gè)體內(nèi)也同樣，人類人工染色體在小鼠各組織內(nèi)不穩(wěn)定，攜帶在小鼠組織細(xì)胞內(nèi)的人類人工染色體的比例(攜帶率)有降低的趨勢，小鼠組織細(xì)胞的攜帶率不恒定?；蛘?，在小鼠個(gè)體間也同樣，人類人工染色體在小鼠個(gè)體間的攜帶率不恒定。由于這樣的在小鼠組織間及個(gè)體間的不均勻的攜帶率，難以使用通過人類人工染色體導(dǎo)入靶基因(組)的小鼠細(xì)胞或者小鼠個(gè)體對導(dǎo)入基因進(jìn)行詳細(xì)且準(zhǔn)確并且重現(xiàn)性高的分析。如上所述，對于源自包括小鼠的嚙齒類的人工染色體，與其相關(guān)的報(bào)告非常少，不存在可穩(wěn)定地維持在嚙齒類細(xì)胞內(nèi)或個(gè)體內(nèi)的人工染色體。本發(fā)明的目的在于提供一種小鼠人工染色體載體，其中，所導(dǎo)入的靶基因(組)可穩(wěn)定地維持在嚙齒類細(xì)胞內(nèi)或嚙齒類個(gè)體內(nèi)，由此可進(jìn)行詳細(xì)且準(zhǔn)確并且重現(xiàn)性高的分析。用于解決課題的手段概括而言，本發(fā)明包含以下的特征。(I) 一種小鼠人工染色體載體，特征在于，含有源自小鼠染色體的天然著絲粒、從著絲粒附近的小鼠染色體長臂部位中缺失長臂遠(yuǎn)端而成的源自小鼠染色體的長臂片段及端粒序列，以及可被穩(wěn)定地?cái)y帶在哺乳類的細(xì)胞及組織中。 (2)根據(jù)上述⑴所述的小鼠人工染色體載體，其中，小鼠染色體為I 19號染色體中的任何一個(gè)。(3)根據(jù)上述⑴或(2)所述的小鼠人工染色體載體，其中，源自小鼠染色體的長臂片段由從小鼠I 19號染色體中的任何一個(gè)的長臂中缺失其總內(nèi)源性基因數(shù)的至少99. 5%而成的剩余部分構(gòu)成。(4)根據(jù)上述(I) (3)中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，其中，含有保藏細(xì)胞株DT40 B6bT-l (FERM BP-11128)中所含的小鼠人工染色體作為基本結(jié)構(gòu)。(5)根據(jù)上述⑴ ⑷中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，其中，哺乳類為嚙齒類。(6)根據(jù)上述(5)所述的小鼠人工染色體載體，其中，嚙齒類為小鼠、大鼠或倉鼠。(7)根據(jù)上述⑴ (6)中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，還含有一個(gè)或多個(gè)DNA序列插入位點(diǎn)。(8)根據(jù)上述(7)所述的小鼠人工染色體載體，其中，DNA序列插入位點(diǎn)為位點(diǎn)特異重組酶的識別位點(diǎn)。(9)根據(jù)上述(7)或⑶所述的小鼠人工染色體載體，其中，DNA序列插入位點(diǎn)為IoxP 序列、FRT 序列、(pC3 IattB及(pC3 IattP序列、R4attB 及 R4attP 序列、TP901-IattB 及TP901_lattP 序列或者 BxblattB 及 BxblattP 序列。(10)根據(jù)上述⑴ (9)中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，還含有報(bào)告基因、選擇標(biāo)記基因或兩者。(11)根據(jù)上述(I) (10)中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，還含有外源DNA序列。(12)根據(jù)上述⑴ (11)中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，其中，外源DNA序列的尺寸為200kb以上。(13)根據(jù)上述(11)或(12)所述的小鼠人工染色體載體，其中，外源DNA序列為人類DNA序列。(14)根據(jù)上述(11) (13)中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，其中，外源DNA序列為藥物代謝相關(guān)基因的DNA序列。(15)根據(jù)上述(14)所述的小鼠人工染色體載體，其中，藥物代謝相關(guān)基因是編碼參與第一相反應(yīng)或第二相反應(yīng)的酶的基因。(16)根據(jù)上述(15)所述的小鼠人工染色體載體，其中，參與第一相反應(yīng)的酶是編碼選自由 CYP1A、CYPIB, CYP2A、CYP2B、CYP2C、CYP2D、CYP2E、CYP2J、CYP3A、CYP4A、CYP4B 及它們的亞家族等CYP以及CES構(gòu)成的組中的至少一個(gè)的酶。(17)根據(jù)上述(15)所述的小鼠人工染色體載體，其中，參與第二相反應(yīng)的酶是編碼選自由UGTl及UGT2構(gòu)成的組中的至少一個(gè)的酶。(18)根據(jù)上述(14)所述的小鼠人工染色體載體 ，其中，藥物代謝相關(guān)基因是編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。(19)根據(jù)上述(18)所述的小鼠人工染色體載體，其中，編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因是編碼選自由MDR1、MDR2、MRP2、OAT、OATP, OCT及BCRP構(gòu)成的組中的至少一個(gè)的基因。(20)根據(jù)上述(14)所述的小鼠人工染色體載體，其中，藥物代謝相關(guān)基因是編碼核受體的基因。(21)根據(jù)上述(20)所述的小鼠人工染色體載體，其中，編碼核受體的基因是編碼選自由PXR、AhR、CAR及PPAR α構(gòu)成的組中的至少一個(gè)的基因。(22)根據(jù)上述(11) (13)中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，其中，外源DNA序列為人類染色體的長臂或短臂的DNA序列。(23)根據(jù)上述(11) (21)中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，其中，外源DNA序列含有選自由編碼參與第一相反應(yīng)的酶的基因、編碼參與第二相反應(yīng)的酶的基因、編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因及編碼核受體的基因構(gòu)成的組中的至少兩個(gè)基因序列。(24)根據(jù)上述(22)所述的小鼠人工染色體載體，其中，人類染色體為含有疾病基因的致病區(qū)域(疾患遺伝子O原因領(lǐng)域)的人類染色體的長臂或短臂的DNA序列。(25)根據(jù)上述(11) (13)中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，其中，外源DNA序列為編碼細(xì)胞因子類、激素類、生長因子類、營養(yǎng)因子類、造血因子類、凝血 溶血因子類、免疫球蛋白類、G蛋白偶聯(lián)受體類、酶類等多肽類的基因或DNA的序列，或者與腫瘤、肌營養(yǎng)不良癥、血友病、神經(jīng)變性疾病、自身免疫病、過敏性疾病、遺傳性疾病等疾病相關(guān)的治療用基因或DNA的序列。(26)根據(jù)上述(I) (25)中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，其中，細(xì)胞為肝細(xì)胞、腸細(xì)胞、腎細(xì)胞、脾細(xì)胞、肺細(xì)胞、心臟細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、腦細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、淋巴球細(xì)胞、巨核細(xì)胞、精子或卵子。(27)根據(jù)上述(I) (25)中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，其中，組織為源自肝臟、腸、腎臟、脾臟、肺、心臟、骨骼肌、腦、骨髓、睪丸或卵巢的組織。(28)攜帶上述⑴ (27)中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體的細(xì)胞。(29)根據(jù)上述(28)所述的細(xì)胞，其中，細(xì)胞選自由體細(xì)胞、非人類生殖細(xì)胞、干細(xì)胞及前體細(xì)胞構(gòu)成的組。(30)根據(jù)上述(29)所述的細(xì)胞，其中，干細(xì)胞為胚胎干(ES)細(xì)胞或誘導(dǎo)性多能干(iPS)細(xì)胞。(31)根據(jù)上述(28) (30)中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中，細(xì)胞為原代培養(yǎng)細(xì)胞、繼代細(xì)胞或細(xì)胞系。(32)根據(jù)上述(28) (31)中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中，細(xì)胞為可產(chǎn)生人類抗體的細(xì)胞。(33) 一種醫(yī)藥組合物，含有攜帶含有疾病治療用的外源DNA序列的小鼠人工染色體載體的上述(28) (32)中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞。(34) 一種非人類動物，特征在于攜帶上述(I) (27)中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體。(35)根據(jù)上述(34)所述的非人類動物，該非人類動物為疾病模型動物。(36)根據(jù)上述(34)所述的非人類動物，該非人類動物為可表達(dá)外源的人類藥物代謝相關(guān)基因的動物。(37)根據(jù)上述(34)所述的非人類動物，該非人類動物為可產(chǎn)生人類抗體的動物。(38)根據(jù)上述(34) (37)中任一項(xiàng)所述的非人類動物，其中，對應(yīng)于小鼠人工染色體載體中所含的外源DNA的內(nèi)源基因被破壞或內(nèi)源基因的表達(dá)降低。(39) 一種蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，該方法包括對攜帶含有外源DNA序列的小鼠人工染色體載體的上述(28) (32)中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并回收所產(chǎn)生的由該DNA所編碼的蛋白質(zhì)。(40) 一種人類抗體的制造方法，該方法包括使用攜帶含有人類抗體基因的小鼠人工染色體載體的上述(37)或(38)所述的非人類動物產(chǎn)生人類抗體并回收該抗體。(41) 一種篩選對于治療疾病有效的物質(zhì)的方法，該方法包括對作為疾病模型動物的上述(35)所述的非人類動物施用候選藥劑，并對該藥劑的治療效果進(jìn)行評價(jià)。(42) 一種藥物或食品的藥理作用及/或代謝及/或毒性的試驗(yàn)方法，該方法包括對攜帶含有人類藥物代謝相關(guān)基因的小鼠人工染色體載體的上述(36)或(38)所述的非人類動物或者源自該動物的細(xì)胞、器官或組織施用藥物或食品，并對該藥物或食品的藥理作用及/或代謝及/或毒性進(jìn)行測定。(43) 一種藥物或食品毒性的試驗(yàn)方法，該方法包括將由攜帶含有人類藥物代謝相關(guān)基因的小鼠人工染色體載體的上述(36)或(38)所述的非人類動物得到的微粒體或微粒體級分S9與培養(yǎng)細(xì)胞或者細(xì)菌和藥物及/或者食品一起進(jìn)行培養(yǎng)，并測定藥物或食品對該細(xì)胞或細(xì)菌造成的影響。(44) 一種細(xì)胞或個(gè)體內(nèi)的大尺寸DNA的穩(wěn)定化方法，該方法包括使用上述(I)
(27)中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，并將200kb以上的大尺寸的外源DNA以90%以上的攜帶率穩(wěn)定地維持在嚙齒類細(xì)胞或嚙齒類個(gè)體內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明，在將靶基因(組)導(dǎo)入嚙齒類細(xì)胞內(nèi)或嚙齒類個(gè)體內(nèi)的情況下，設(shè)有DNA序列插入位點(diǎn)的小鼠人工染色體載體可以使靶基因(組)穩(wěn)定且以相同攜帶率攜帶在以往困難的全部的細(xì)胞或者組織中，另外，可以與作為目標(biāo)的外源DNA序列或基因共同插入報(bào)告基因，因此，可將載體導(dǎo)入細(xì)胞可視化且可進(jìn)行詳細(xì)且準(zhǔn)確并且重現(xiàn)性高的分析或表達(dá)產(chǎn)物的有效的回收。本說明書包含本申請的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)即日本專利申請2010-1425號的說明書及/或附圖中所記載的內(nèi)容。


圖I表示實(shí)施例I及2的步驟的示意圖。圖中的細(xì)胞名稱等由以下的形式表示。細(xì)胞名稱(細(xì)胞內(nèi)基因改造；攜帶染色體片段名稱，導(dǎo)入基因-攜帶染色體名稱)。圖中的記號等如下所述。BSr :殺稻瘟素(BS)抗性基因；pUr0 :嘌呤霉素抗性基因；人工端粒人工端粒(TTAGGG)重復(fù)序列；EGFP :綠色熒光蛋白表達(dá)基因；neo :新霉素(G418)抗性基因；IoxP :位點(diǎn)特異性DNA序列插入位點(diǎn)；3’ HPRT =HPRT基因的從第3號至第9號外顯子的序列；
圖2表示實(shí)施例3的步驟的示意圖。圖中的細(xì)胞名稱等由以下的形式表示。細(xì)胞名稱(細(xì)胞內(nèi)基因改造；攜帶染色體片段名稱，導(dǎo)入基因-攜帶染色體名稱)。圖中的記號等如下所述。hChr7 :人類7號染色體；CYP3Acluster :人類CYP3A基因簇；5’HPRT =HPRT基因的第I號和第2號外顯子的序列；1οχΡ :位點(diǎn)特異性DNA序列插入位點(diǎn)；hyg :潮霉素抗性基因；hisD :組氨醇抗性基因；人工端粒人工端粒(TTAGGG)重復(fù)序列；EGFP :綠色熒光蛋白表達(dá)基因；neo :新霉素(G418)抗性基因；3’HPRT =HPRT基因的第3號至第9號外顯子的序列；puro :嘿呤霉素抗性基因；圖3表示實(shí)施例4的步驟的示意圖。圖中的細(xì)胞名稱等由以下的形式表示。細(xì)胞名稱(細(xì)胞內(nèi)基因改造；攜帶染色體片段名稱，導(dǎo)入基因-攜帶染色體名稱)。圖中的記號等如下所述。puro :嘌呤霉素抗性基因；人工端粒人工端粒(TTAGGG)重復(fù)序列；5’ HPRT HPRT基因的第I號和第2號外顯子的序列；hyg :潮霉素抗性基因；1οχΡ :位點(diǎn)特異性DNA序列插入位點(diǎn)；圖4表示實(shí)施例5的步驟的示意圖。圖中的細(xì)胞名稱等由以下的形式表示。細(xì)胞名稱(細(xì)胞內(nèi)基因改造；攜帶染色體片段名稱，導(dǎo)入基因-攜帶染色體名稱)。圖中的記號等如下所述。puro :嘿吟霉素抗性基因；人工端粒人工端粒(TTAGGG)重復(fù)序列；neo :新霉素(G418)抗性基因；1οχΡ :位點(diǎn)特異性DNA序列插入位點(diǎn)；3’ HPRT :HPRT基因的第3號至第9號外顯子的序列；圖5表示實(shí)施例6的步驟的示意圖。圖中的細(xì)胞名稱等由以下的形式表示。細(xì)胞名稱(細(xì)胞內(nèi)基因改造；攜帶染色體片段名稱，導(dǎo)入基因-攜帶染色體名稱)。圖中的記號等如下所述。neo :新霉素(G418)抗性基因；1οχΡ :位點(diǎn)特異性DNA序列插入位點(diǎn)；3’HPRT HPRT基因的第3號至第9號外顯子的序列；puro :嘌呤霉素抗性基因；人工端粒人工端粒(TTAGGG)重復(fù)序列；EGFP :綠色熒光蛋白表達(dá)基因；5’HPRT :HPRT基因的第I號和第2號外顯子的序列；圖6表示小鼠A9細(xì)胞(mouse A9 (neo))(左)及小鼠A9細(xì)胞和小鼠成纖維細(xì)胞(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast) (mChrll-BSr))的細(xì)胞融合克隆(小鼠A9x小鼠胚胎成纖維細(xì)胞雜種(neo ；mChrlI-BSr))；圖7表示以小鼠Cot-IDNA作為探針時(shí)DT40(mChrlI-Bsr)克隆的FISH分析結(jié)果。圖8表示導(dǎo)入至雞DT40細(xì)胞內(nèi)的小鼠染色體(mChrlI-BSr)為小鼠11號染色體的SKY FISH分析結(jié)果(左)以及SKY FISH染色質(zhì)圖像(右)；圖9表示小鼠11號染色體的AL671968區(qū)域中的端粒截短用的載體及利用該載體進(jìn)行同源重組的小鼠11號染色體等位基因的部分結(jié)構(gòu)；圖10表示使用pBS-TEL/puro MAC載體在小鼠11號染色體區(qū)域AL671968中進(jìn)行端粒截短的含有小鼠人工染色體MAC的等位基因的DT40 (MAC) [DT40 (B6bT_l)]克隆的單色FISH分析結(jié)果(右)。左圖的DT40(mChrll-BSr)表示端粒截短實(shí)施前的DT40 (mChrll-BSr)克??；圖11表示GFP-neo-loxP_3’HPRT型的IoxP打靶載體(pMACl)及利用該載體進(jìn)行同源重組的小鼠人工染色體MAC的等位基因的部分結(jié)構(gòu)；圖12表示將小鼠Cot-IDNA及GFP-PGKneo-loxP-3’ HPRT盒作為探針時(shí)DT40 (MACl)克隆的雙色FISH分析結(jié)果；圖13表示將小鼠Cot-IDNA作為探針時(shí)CH0(HPRT_ ；MAC1)克隆的單色FISH分析結(jié)果;圖14表示將小鼠次要衛(wèi)星(minor satellite)DNA作為探針時(shí)小鼠ES(MACl)克隆的單色FISH分析結(jié)果；圖15表示用于在位于人類7號染色體上的CYP3A基因座附近且著絲粒側(cè)(約 300Kb著絲粒側(cè))的AC004922區(qū)域插入IoxP的打靶載體(pMPloxPHyg)及利用該載體進(jìn)行同源重組的人類7號染色體等位基因的部分結(jié)構(gòu)(圖15a)。另外，圖15b表示對于用線性化的該載體轉(zhuǎn)染后的含有人類7號染色體片段的DT40細(xì)胞克隆的潮霉素耐性株，利用DNA雜交分析同源重組體的結(jié)果。對于圖15b中的箭頭，上面的箭頭表示非同源重組體(約
10.9kb)，下面的箭頭表示同源重組體(約8. 9kb)；圖16表示用于在位于人類7號染色體上的CYP3A基因座附近且端粒側(cè)(約150Kb端粒側(cè))的AC073842區(qū)域插入人類端粒序列的打靶載體(pTELhisD-PT)及利用該載體進(jìn)行同源重組的人類7號染色體等位基因的部分結(jié)構(gòu)；圖17表示將小鼠Cot-IDNA及人類Cot-IDNA作為探針時(shí)CH0(HPRT_，MACl+hChr7-loxP-tel)克隆的雙色FISH分析結(jié)果。圖18表示將人類CYP3A基因簇區(qū)域周邊(AC004922-人類CYP3A基因簇-AC073842)約IMb向MACl進(jìn)行轉(zhuǎn)座克隆而成的小鼠人工染色體CYP3A-MAC的構(gòu)建；圖19表示將人類Cot-IDNA及小鼠Cot-IDNA作為探針時(shí)CHO (CYP3A-MAC，hChr7-ACYP3A)克隆的雙色FISH分析結(jié)果；圖20表示用于構(gòu)建小鼠人工染色體載體MAC2的打靶載體(pMAC2)及利用該載體進(jìn)行同源重組的小鼠人工染色體MAC的等位基因的部分結(jié)構(gòu)；圖21 表示將小鼠 Cot-IDNA 及 5’HPRT-loxP-PGKhygro 盒作為探針時(shí) DT40 (MAC2)克隆的雙色FISH分析結(jié)果；圖22 表示將小鼠 Cot-IDNA 及 5’HPRT-loxP-PGKhygro 盒作為探針時(shí) CH0(HPRT_ ；MAC2)克隆的雙色FISH分析結(jié)果；圖23表示將小鼠次要衛(wèi)星DNA作為探針時(shí)小鼠ES(HPRT-，MAC2)克隆的單色FISH分析結(jié)果；圖24表示PGKneo-loxP-3’ HPRT型的IoxP打靶載體(pMAC3)及利用該載體進(jìn)行同源重組的小鼠人工染色體MAC3的等位基因的部分結(jié)構(gòu)；圖25表示將小鼠Cot-IDNA及小鼠次要衛(wèi)星DNA作為探針時(shí)DT40 (MAC3)克隆的雙色FISH分析結(jié)果；圖26表示將小鼠Cot-IDNA作為探針時(shí)CH0(HPRT_ ；MAC3)克隆的單色FISH分析結(jié)果;圖27表示將小鼠次要衛(wèi)星DNA作為探針時(shí)藥劑耐性克隆B6(HPRT-;MAC3)的單色FISH分析結(jié)果；圖28表示B6(HPRT-;MAC3)克隆的長期培養(yǎng)的攜帶率分析結(jié)果。實(shí)線表示B6 (HPRT- MAC3) _3，虛線表示 B6 (HPRT- MAC3) _s6 的 MAC 載體攜帶率。圖29表示用于在小鼠人工染色體載體MAC3中將特定基因(例如GFP)通過Cre-IoxP法進(jìn)行位點(diǎn)特異性基因插入的步驟，表示GFP插入用載體及利用該載體進(jìn)行同源重組的小鼠11號染色體等位基因的部分結(jié)構(gòu)；圖30表示將小鼠Cot-IDNA及X6. IEGFP作為探針的攜帶有小鼠人工染色體GFP-MAC的CHO細(xì)胞即CHO(GFP-MAC)克隆的雙色FISH分析結(jié)果；圖31表示將小鼠次要衛(wèi)星DNA及GFP作為探針時(shí)小鼠ES細(xì)胞(B6-ES株)中的小鼠人工染色體GFP-MAC的長期培養(yǎng)后的FISH分析結(jié)果；
圖32表示B6(GFP-MAC)克隆的長期培養(yǎng)的攜帶率分析結(jié)果。菱形表示進(jìn)行了藥劑選擇的長期培養(yǎng)的攜帶率，四方形表示未進(jìn)行藥劑選擇的長期培養(yǎng)的攜帶率；圖33表示由攜帶有小鼠人工染色體載體(GFP-MAC)的嵌合體小鼠生產(chǎn)的子代傳遞個(gè)體；圖34表示長期培養(yǎng)后(25TOL)的CHO細(xì)胞中21HAC1或21HAC2和MACl的攜帶率；圖35表示長期培養(yǎng)后(75PDL)的ES細(xì)胞中21HAC2或MACl的攜帶率；圖36表示TC(MACl)小鼠(雌)組織中的實(shí)體熒光顯微鏡圖像；圖37表示TC(MACl)小鼠或TC(21HAC2)小鼠的源自骨髓的細(xì)胞的血液系統(tǒng)細(xì)胞中的GFP陽性率；圖38表示TC(MACl)小鼠或TC(21HAC2)小鼠的源自脾臟的細(xì)胞的血液系統(tǒng)細(xì)胞中的GFP陽性率；圖39表示使用了小鼠次要衛(wèi)星DNA探針的源自TC(MACl)小鼠的尾部成纖維細(xì)胞的單色FISH分析結(jié)果；圖40表示使用了 CYP3A-BAC (RPl 1-757A13)以及小鼠次要衛(wèi)星DNA探針的A9 (CYP3A-MAC)的雙色FISH分析結(jié)果；圖41 表示使用了 CYP3A-BAC(RP11-757A13)DNA 探針的 TT2F (CYP3A-MAC)的單色FISH分析結(jié)果；圖42表示長期培養(yǎng)后(IOOroL)的ES細(xì)胞中的CYP3A-MAC的攜帶率；圖43表示TC(CYP3A_MAC)小鼠(雄)組織中的實(shí)體熒光顯微鏡圖像；圖44表示TC(CYP3A-MAC)小鼠或TC (CYP3A-HAC Λ )小鼠的源自骨髓的細(xì)胞的血液系統(tǒng)細(xì)胞中的GFP陽性率；圖45 表示 TC (CYP3A-MAC)小鼠或 TC (CYP3A-HAC Δ )小鼠的各組織中的 CYP3A-MAC或CYP3A-HACA的攜帶率；圖46 表示使用了 CYP3A-BAC(RP11-757A13)DNA 探針的 TC (CYP3A-MAC)雜合子小鼠或TC (CYP3A-MAC)純合子小鼠中的單色FISH分析結(jié)果；圖47是表示TC (CYP3A-MAC)小鼠的各組織中CYP3A基因簇的組織特異性基因表達(dá)分析的結(jié)果的圖。GAPDH表示甘油醒3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde3_phosphatedehydrogenase)；
圖48是表示TC(CYP3A-MAC)小鼠肝臟中的CYP3A基因簇的時(shí)期特異性基因表達(dá)分析的結(jié)果的圖；圖49表示使用了 CYP3A-BAC(RP11-757A13)以及小鼠Cot-IDNA探針的大鼠ES (CYP3A-MAC)的雙色FISH分析結(jié)果；圖50 表示使用了小鼠 Cot-IDNA 及人類 Cot-IDNA 探針的 CHO (HPRT- ；MAC1，hChr21-loxP)的雙色FISH分析結(jié)果；圖51表示將hChr21q區(qū)域的約33Mb向MACl進(jìn)行轉(zhuǎn)座克隆而成的小鼠人工染色體hChr2 Iq-MAC的構(gòu)建；圖52表示將人類Cot-IDNA及小鼠Cot-IDNA作為探針時(shí)CHO(hChr2Iq-MAC，hChr21-hChr21q)克隆的雙色FISH分析結(jié)果；圖53表示使用了人類Cot-IDNA以及小鼠次要衛(wèi)星DNA探針的 TT2F(hChr2Iq-MAC)克隆的雙色FISH分析結(jié)果；圖54表示長期培養(yǎng)后(50PDL)的ES細(xì)胞中的hChr21q_MAC的攜帶率；圖55表示攜帶有hChr21q_MAC的嵌合體小鼠的熒光照片；圖56表示用于向人類21號染色體(hChr21)的DSCR(唐氏綜合征致病區(qū)域)的近端的AP001721插入IoxP序列的打靶載體(pCKloxPHyg)、靶序列及利用同源重組而產(chǎn)生的染色體等位基因；圖57 表示 DT40(hChr21q22. 12-loxP)中的 DNA 印跡分析結(jié)果；圖58表示將人類Cot-IDNA及潮霉素DNA作為探針時(shí)DT40 (hChr21q22. 12-loxP)克隆的雙色FISH分析結(jié)果；圖59表示將人類Cot-IDNA及小鼠Cot-IDNA作為探針時(shí)CHO (HPRT- ；MAC1，hChr21q22. 12-loxP)克隆的雙色FISH分析結(jié)果；圖60表示將hChr21q22. 12-qter區(qū)域的約12Mb向MACl進(jìn)行轉(zhuǎn)座克隆而成的小鼠人工染色體hChr21q22. 12-MAC的構(gòu)建；圖61 表示將人類 Cot-IDNA 及小鼠 Cot-IDNA 作為探針時(shí) CHO (hChr21q22. 12-MAC,hChr21-hChr21q22. 12)克隆的雙色FISH分析結(jié)果；圖62表示使用了人類Cot-IDNA以及小鼠次要衛(wèi)星DNA探針的TT2F(hChr21q22. 12-MAC)克隆的雙色FISH分析結(jié)果；圖63表示長期培養(yǎng)后(50PDL)的ES細(xì)胞中的hChr21q22. 12-MAC的攜帶率；圖64表示長期培養(yǎng)后(25TOL)的CHO細(xì)胞中的21HAC1或21HAC2和MAC2的攜帶率；圖65表示I拷貝FVIII-PAC的結(jié)構(gòu)；圖66表示I 16拷貝FVIII-PAC的構(gòu)建方法；圖67 表示 CHO(FVIIIxl-MAC) 1-3 及 CHO(FVIIIx 1-HAC) 1-2 中的長期培養(yǎng)后的凝集測定(FVIII的活性比較)的結(jié)果；圖68 表示 CHO(FVIIIxl-MAC)及 CHO(FVIIIx 16-MAC)中的凝集測定的結(jié)果(FVIII的活性比較)；圖69表示用于構(gòu)建多基因搭載位點(diǎn)(多整合酶平臺，multi-integraseplatform)盒的進(jìn)入載體(entry vector)構(gòu)建方法；
圖70表示多基因搭載位點(diǎn)(多整合酶平臺)盒的構(gòu)建方法；圖71表示MI-MAC載體的構(gòu)建方法；圖72表示向MI-MAC載體插入基因的方法；圖73表示PXR-MAC的構(gòu)建方法；圖74 表示將源自小鼠 cot-lDNA 及人類 PXR-BAC 的 DNA(RP11-169N13) (CHORI)作為探針時(shí)CHO(PXR-MAC)克隆的雙色FISH分析結(jié)果；圖75表示將源自人類PXR-BAC的DNA(RP11_169N13) (CHORI)作為探針時(shí)TT2F (PXR-MAC)克隆的單色FISH分析結(jié)果；圖76表示GFP-5’HPRT-loxP_hyg型的IoxP打靶載體(pMAC4)及利用該載體進(jìn)行 同源重組的小鼠人工染色體MAC4的等位基因的部分結(jié)構(gòu)；圖77 表示將小鼠 cot-lDNA 及 GFP-5’ HPRT-loxP-hyg 盒作為探針時(shí) DT40 (MAC4)克隆的雙色FISH分析結(jié)果；圖78表示將小鼠Cot-IDNA作為探針時(shí)CH0(HPRT_ ；MAC4)克隆的單色FISH分析結(jié)果;圖79表示用于在位于人類4號染色體上的UGT2基因座附近且端粒側(cè)(約150Kb端粒側(cè))的AC1252392區(qū)域插入人類端粒序列的打靶載體(pTELpuro-UGT2)及利用該載體進(jìn)行同源重組的人類4號染色體等位基因的部分結(jié)構(gòu)；圖80將人類cot-lDNA及嘌呤霉素DNA作為探針使用的DT40 (hChr4_tel)的雙色FISH分析結(jié)果。左圖表示改造前的DT40(hChr4)，右圖表示改造后的DT40(hChr4-tel)；圖81表示用于向人類4號染色體的AC074378插入IoxP序列的打靶載體(pUGT21oxPneo)、靶序列及利用同源重組而產(chǎn)生的染色體等位基因；圖82表示將人類cot-lDNA及新霉素DNA作為探針使用的DT40 (hChr4-loxP_tel)的雙色FISH分析結(jié)果；圖83表示將人類Cot-IDNA及小鼠Cot-IDNA作為探針時(shí)CHO (HPRT- ；MAC4,hChr4-loxP-tel)克隆的雙色FISH分析結(jié)果；圖84表示將人類UGT2基因簇區(qū)域周邊(AC074378-人類UGT2基因簇-AC125239) 2Mb向MAC4進(jìn)行轉(zhuǎn)座克隆而成的小鼠人工染色體UGT2-MAC的構(gòu)建；圖85 表示將 UGT2-BAC(RP11-643N16) (CHORI)DNA 及小鼠 Cot-IDNA 作為探針時(shí)CHO (UGT2-MAC, hChr4_ Δ UGT2)克隆的雙色 FISH 分析結(jié)果；圖86表示將UGT2-BAC(RP11-643N16) (CHORI)及小鼠次要衛(wèi)星DNA作為探針時(shí)A9 (UGT2-MAC)克隆的雙色FISH分析結(jié)果；圖 87 表示將 UGT2-BAC (RPl 1-643N16) (CHORI) DNA 作為探針時(shí) TT2F (UGT2-MAC)克隆的單色FISH分析結(jié)果；圖88表示長期培養(yǎng)后(75PDL)的ES細(xì)胞中的UGT2-MAC的攜帶率；圖89表示用于在位于人類10號染色體上的CYP2C基因座附近且端粒側(cè)(約150Kb端粒側(cè))的AL157834區(qū)域插入人類端粒序列的打靶載體(pTELpuro-CYP2C)及利用該載體進(jìn)行同源重組的人類10號染色體等位基因的部分結(jié)構(gòu)；圖90表示將人類cot-lDNA及嘌呤霉素DNA作為探針使用的DT40 (hChrlO-tel)的雙色FISH分析結(jié)果。左圖表示改造前的DT40 (hChrlO)，右圖表示改造后的DT40 (hChrlO-tel)；圖91表示用于向人類10號染色體的AL138759插入IoxP序列的利用打靶載體(pCYP2CloxPneo)、靶序列及利用同源重組而產(chǎn)生的染色體等位基因；圖92表示將小鼠Cot-IDNA及人類Cot-IDNA作為探針時(shí)(HPRT- ；MAC4,hChrlO-loxP-tel)克隆的雙色FISH分析結(jié)果；圖93表示將人類CYP2C基因簇區(qū)域周邊(AL138759-人類CYP2C基因簇-AL157834)380kb向MAC4進(jìn)行轉(zhuǎn)座克隆而成的小鼠人工染色體CYP2C-MAC的構(gòu)建；圖94 表示將 CYP2C-BAC(RP11-466J14) (CHORI)DNA 及小鼠 Cot-IDNA 作為探針時(shí)CHO (CYP2C-MAC, hChrlO- Δ CYP2C)克隆的雙色 FISH 分析結(jié)果；圖95表示用于向人類7號染色體的AC005045插入IoxP序列的打靶載體 (pMDRlIoxPbs)、靶序列及利用同源重組而產(chǎn)生的染色體等位基因。圖96表示用于在位于人類7號染色體上的MDRl基因座附近且端粒側(cè)(約50Kb端粒側(cè))的AC003083區(qū)域插入人類端粒序列的打靶載體(pTELpuro-MDRl)及利用該載體進(jìn)行同源重組的人類7號染色體等位基因的部分結(jié)構(gòu)；圖97表示將人類cot-lDNA及嘌呤霉素DNA作為探針使用的DT40 (hChr7M-loxP-tel)的雙色 FISH 分析結(jié)果；圖98表示將小鼠Cot-IDNA及人類Cot-IDNA作為探針時(shí)CH0(HPRT_ ；MAC4,hChr7M-loxP-tel)克隆的雙色FISH分析結(jié)果；圖99表示將人類MDRl基因區(qū)域周邊(AC005045-人類MDRl基因-AC003083) 210kb進(jìn)行MAC4載體轉(zhuǎn)座克隆而成的小鼠人工染色體MDRl-MAC的構(gòu)建；圖100 表示將 MDRl-BAC (RPl 1-784L5) (CHORI)DNA 及小鼠 Cot-IDNA 作為探針時(shí)CHO(MDR1-MAC, hChr7-AMDRl)克隆的雙色 FISH 分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下，對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。如上所述，本發(fā)明的第一方面的特征在于，含有源自小鼠染色體的天然著絲粒、從著絲粒附近的小鼠染色體長臂部位中缺失長臂遠(yuǎn)端而成的源自小鼠染色體的長臂片段及端粒序列，以及可被穩(wěn)定地?cái)y帶在哺乳類的細(xì)胞及組織中。本說明書中使用的“源自小鼠染色體的天然著絲?！边@樣的術(shù)語是指任一個(gè)小鼠染色體的著絲粒整體(完整的著絲粒)。因此，這樣的著絲粒不包括使用小鼠染色體的著絲粒序列的一部分偶然或人工得到的具有著絲粒功能的結(jié)構(gòu)體及其它的動物物種的染色體的著絲粒。本說明書中使用的“小鼠人工染色體”或“小鼠人工染色體載體”為通過自上而下法構(gòu)建的人工染色體，不是通過自下而上法構(gòu)建的人工染色體。自上而下法是指通過染色體改造從自然染色體中缺失基因區(qū)域而構(gòu)建具有天然著絲粒的人工染色體載體的方法。自下而上法為通過將著絲粒序列的一部分以克隆化DNA的形式取得并轉(zhuǎn)染于哺乳類細(xì)胞來構(gòu)建具有著絲粒功能的人工染色體的方法。本說明書中使用的“從著絲粒附近的小鼠染色體長臂部位中缺失長臂遠(yuǎn)端而成的源自小鼠染色體的長臂片段”是指優(yōu)選以本發(fā)明的載體在小鼠的細(xì)胞或個(gè)體組織中穩(wěn)定地?cái)y帶的方式且不妨礙小鼠的個(gè)體產(chǎn)生和子代傳遞的方式盡可能地排除內(nèi)源基因的影響，因此，以除去小鼠染色體的長臂中的內(nèi)源基因的方式在與著絲粒接近的長臂部位進(jìn)行缺失而得到的長臂片段。這是指以總內(nèi)源基因(數(shù))的至少99.5%、優(yōu)選至少99.7%、更優(yōu)選至少99. 8%、最優(yōu)選99. 9 100%被除去的方式在與著絲粒接近的長臂部位進(jìn)行缺失而得到的長臂片段。本說明書中的“DNA”只要沒有特別說明，將適用于包括基因或者基因座、cDNA、化學(xué)修飾DNA的全部種類的DNA核酸。本說明書中使用的“攜帶率”是指培養(yǎng)細(xì)胞或在小鼠的組織細(xì)胞中存在的含有人工染色體的細(xì)胞的比例。本發(fā)明的染色體載體“穩(wěn)定地?cái)y帶”是指在細(xì)胞分裂時(shí)不易引起該染色體載體的脫落，即，即使在分裂后也可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地?cái)y帶，因此，該染色體載體可被有效地子代傳遞至子細(xì)胞或子代小鼠。 小鼠染色體可以為小鼠染色體I 19、X及Y中的任一種，但優(yōu)選為I號 19號染色體中的任一種。在后述的實(shí)施例中，例示有11號染色體，但只要具有上述的構(gòu)成，即使為其它的染色體也可同樣地制作小鼠人工染色體載體。在源自小鼠11號染色體片段的人工染色體載體的情況下，上述長臂片段是非限定的，例如由缺失比該11號染色體的長臂的AL671968或者BX572640 (位于比AL671968更靠著絲粒側(cè)。)、CR954170(位于比AL671968及BX572640更靠著絲粒側(cè)。)或AL713875(位于比AL671968更靠著絲粒側(cè)。)更遠(yuǎn)端的區(qū)域而成的長臂片段構(gòu)成?；蛘撸鲜鲩L臂片段為本說明書中的DT40(MAC)，可以含有保藏細(xì)胞株DT40B6bT-l (FERMBP-11128)中所含的小鼠人工染色體作為基本結(jié)構(gòu)(參照圖1、3、4)。另外，在例如源自小鼠15號染色體片段的人工染色體載體的情況下，上述長臂片段是非限定的，例如由缺失比AC121307、AC161799等的位置更遠(yuǎn)端的區(qū)域而成的長臂片段構(gòu)成。在源自小鼠16號染色體片段的人工染色體載體的情況下，上述長臂片段是非限定的，例如由缺失比AC127687、AC140982等的位置更遠(yuǎn)端的區(qū)域而成的長臂片段構(gòu)成。這些基本結(jié)構(gòu)中還含有用于插入外源DNA或基因的IoxP等DNA序列插入位點(diǎn)(例如參照MAC1、MAC2、MAC3、MAC4等；圖1、3、4)。本發(fā)明的載體可以含有用于插入外源DNA或基因序列的位點(diǎn)，因此，通過在該位點(diǎn)插入目標(biāo)外源DNA或基因，可在該載體被導(dǎo)入任何的細(xì)胞時(shí)表達(dá)該目標(biāo)外源DNA或基因，因此可應(yīng)用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)、治療用藥劑的篩選、藥物代謝試驗(yàn)、DNA的功能分析、iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)、基因治療、有用的非人類動物的制作等(例如參照CYP3A-MAC、GFP-MAC等；圖2、5)。本發(fā)明的載體還改造小鼠染色體，并將源自小鼠的天然著絲粒直接用于制作載體。作為現(xiàn)有公知的小鼠人工染色體載體，已知有利用著絲粒序列的一部分制作的基于衛(wèi)星DNA的哺乳類人工染色體(稱為Aces及SATAC),但迄今為止尚未制作利用小鼠染色體的著絲粒整體制作的小鼠人工染色體。另外，上述哺乳類人工染色體與HAC載體同樣地在小鼠個(gè)體的組織中攜帶率不均且不穩(wěn)定(Co Do等，Chromosome Res. 2000 ；8 (3) :83-91)。作為本發(fā)明的載體的有用且意外的特性，可以舉出如下等特性提高包括小鼠、大鼠、倉鼠等嚙齒類的哺乳類的細(xì)胞或個(gè)體組織中的攜帶率，由此在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定攜帶，因此，可以長期穩(wěn)定地?cái)y帶靶基因(組)，可以導(dǎo)入基因量均勻地在嚙齒類個(gè)體間或組織間進(jìn)行長時(shí)間表達(dá)，另外，可提高經(jīng)由多能性細(xì)胞(例如ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞等)分化的嚙齒類的個(gè)體產(chǎn)生及子代傳遞的效率。作為與人類人工染色體(HAC)進(jìn)行比較的有意思的特性，包括血液系統(tǒng)組織的低于20%的非常低的HAC攜帶率，組織間的不均極少，即使對于試驗(yàn)后的任何組織(例如源自肝臟、腸、腎臟、脾臟、肺、心臟、骨骼肌、腦或骨髓的組織)攜帶率也在90%以上，另外，本發(fā)明的小鼠人工染色體與HAC相比，可有效地進(jìn)行繁殖，對HAC而言則不可能，細(xì)胞中可攜帶多個(gè)(多)拷貝的HAC。定義本說明書中使用的術(shù)語的定義除本行業(yè)中所使用的一般的含義以外，具體而言，包含以下的含義。 在本說明書中，在稱為“小鼠人工染色體”或“小鼠人工染色體載體”的情況下，該術(shù)語是指如上述例示所述的由源自小鼠的染色體片段制作的具有上述特征的人工染色體，是通過自上而下法構(gòu)建的人工染色體，而不是通過自下而上法構(gòu)建。重復(fù)上文，自上而下法是指通過染色體改造從自然染色體中缺失基因區(qū)域而構(gòu)建具有天然著絲粒的人工染色體載體的方法。另一方面，自下而上法為通過將著絲粒序列的一部分以克隆化DNA的形式取得并轉(zhuǎn)染于哺乳類細(xì)胞來構(gòu)建具有著絲粒功能的人工染色體的方法。人工染色體可作為獨(dú)立于應(yīng)導(dǎo)入的細(xì)胞中原本的染色體的染色體穩(wěn)定地進(jìn)行復(fù)制及分配。源自小鼠的染色體片段為小鼠的I 19號、X及Y染色體中的任何的染色體的片段(缺失長臂的總內(nèi)源基因數(shù)的至少99. 5%而成的長臂片段)，該片段包括如上面所定義那樣的從著絲粒附近的小鼠染色體長臂的部位缺失長臂遠(yuǎn)端而成的長臂片段。對于本發(fā)明的人工染色體的制作，后述的實(shí)施例、特別是實(shí)施例I 5記載于圖I 圖4，例示有由小鼠11號染色體片段制作人工染色體的方法。由其它的染色體片段制作小鼠人工染色體也可完全相同地進(jìn)行實(shí)施。小鼠的染色體的序列信息可由DDBJ/EMBL/GenBank, Santa Cruz Biotechnology,Inc.等的染色體數(shù)據(jù)庫獲得。本說明書中的染色體的“長臂”是指自小鼠染色體的著絲粒側(cè)含有基因區(qū)域的染色體區(qū)域。另一方面，在小鼠染色體中幾乎不存在短臂。本說明書中的“遠(yuǎn)端”是指距著絲粒遠(yuǎn)的區(qū)域(即，端粒側(cè))。相反，接近著絲粒的區(qū)域(即，著絲粒側(cè))稱為“近端”。長臂遠(yuǎn)端是指位于比長臂的特定部位更靠端粒側(cè)的區(qū)域，長臂近端是指位于比長臂的特定部位更靠著絲粒側(cè)的區(qū)域。該特定部位為缺失存在于源自小鼠的一個(gè)染色體的長臂的總內(nèi)源基因(數(shù))的至少99.5%、優(yōu)選至少99.7%、更優(yōu)選至少99. 8%、最優(yōu)選99. 9 100%而成的位置。本說明書中的“攜帶率”是指在培養(yǎng)細(xì)胞或小鼠的組織細(xì)胞的中存在人工染色體的細(xì)胞的比例。本說明書中的“DNA序列插入位點(diǎn)”是指人工染色體中的可插入目的DNA (包括基因)序列的位點(diǎn)，例如位點(diǎn)特異性重組酶的識別位點(diǎn)等。這樣的識別位點(diǎn)是非限定的，包括例如IoxP (Cre重組酶識別位點(diǎn))、FRT (Flp重組酶識別位點(diǎn))、(pC3 IattB及())C3丨attP(φ€31重組酶識別位點(diǎn))、R4attB及R4attP (R4重組酶識別位點(diǎn))、TP901-IattB及TP901-IattP (TP901-1重組酶識別位點(diǎn))、或者BxblattB及BxblattP (Bxbl重組酶識別位點(diǎn))等。本說明書中的“位點(diǎn)特異性重組酶”為在這些酶的識別位點(diǎn)特異性地引起目標(biāo)DNA序列重組的酶。其例子為Cre整合酶(也稱為Cre重組酶。)、CpC31整合酶、R4整合酶、TP901-1整合酶、Bxbl整合酶等。本說明書中的“端粒序列”為同種或異種的天然端粒序列，或者人工端粒序列。在此，同種是指與人工染色體載體的染色體片段所源自的小鼠同種的動物，另一方面，異種是指該小鼠以外的哺乳動物(其中包括人類)。另外，人工端粒序列是指(TTAGGG)n序列(η是指重復(fù)。)等人工制作的具有端粒功能的序列。向人工染色體的端粒序列的導(dǎo)入可以通過例如國際公開W000/10383中記載那樣的端粒截短(端粒序列的置換)進(jìn)行。端粒截短可以用于在本發(fā)明的人工染色體的制作中縮短染色體。本說明書中的“外源基因”或“外源DNA”為插入于載體的基因插入位點(diǎn)的搭載于載體的目標(biāo)基因或DNA，是指本來不存在于作為對象的細(xì)胞內(nèi)且將在作為對象的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的基因或DNA或者它們的序列。本說明書中的“哺乳動物”這樣的術(shù)語包括人類、猴、黑猩猩等靈長類，小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠等嚙齒類，牛、豬、羊、山羊等有蹄類等，但并不限定于這些動物。本說明書中的“胚胎干細(xì)胞”或“ES細(xì)胞”為由源自哺乳動物的受精卵的胚泡的內(nèi)部細(xì)胞塊所建立的備有分化多能性和半永久的增殖能力的干細(xì)胞(M. J. Evan sand Μ. H. Kaufman(1981)Nature 292 :154-156 ；J. A. Thomson 等(1999)Science 282 1145-1147 J. A. Thomson等(1995)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 92 :7844-7848 ;J. A. Thomson等(1996)Biol. Reprod. 55 :254-259 ;J. A. Thomson and V. S. Marshall (1998) Curr. Top.Dev. Biol. 38 :133-165)。具有與該細(xì)胞同等的性質(zhì)且通過體細(xì)胞的重新編程來人工誘導(dǎo)的細(xì)胞為“誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞”或“iPS細(xì)胞”(K. Takahashi and S. Yamanaka(2006)Cell126 :663-676 ;K.Takahashi 等(2007)Cell 131:861-872 ;J.Yu 等(2007)Science 318 1917-1920)。小鼠人工染色體載體的制作及用途以下，對本發(fā)明的小鼠人工染色體載體的制作及其用途進(jìn)行說明。具體而言，在后述的實(shí)施例I 5(圖I 4)中記載有其步驟。(I)小鼠人工染色體載體的制作本發(fā)明的人工染色體載體可以通過含有以下的工序(a) (C)的方法進(jìn)行制作(a)得到攜帶有小鼠染色體的細(xì)胞的工序；
(b)以不含大部分(99. 5%以上且100%以下)內(nèi)源基因(數(shù))的方式缺失小鼠染色體的長臂遠(yuǎn)端的工序及(c)在長臂近端插入I個(gè)以上DNA序列插入位點(diǎn)的工序。在此，工序(b)及(C)的順序可以反過來。工序(a)為了制作本發(fā)明的人工染色體載體，首先，制作攜帶有小鼠染色體的細(xì)胞。例如將導(dǎo)入有攜帶有用藥劑抗性基因(例如，殺稻瘟素S抗性基因(blasticidin Sregistance gene) (BSr))所標(biāo)記的小鼠染色體的小鼠成纖維細(xì)胞即小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mChrll-BSr)和G418抗性基因即neo基因的小鼠A9細(xì)胞(ATCC VA20110-2209)即小鼠A9(neo)進(jìn)行細(xì)胞融合，可以由攜帶有用藥劑抗性基因所標(biāo)記的小鼠染色體的小鼠A9雜種細(xì)胞即小鼠A9x小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(neo ；mChrll-BSr)并通過將該染色體移入同源重組率高的細(xì)胞中來制作。小鼠成纖維細(xì)胞可以基于文獻(xiàn)所述的方法獲得，例如小鼠成纖維細(xì)胞能夠通過可從日本Clea獲得的C57B6系統(tǒng)的小鼠建立。作為同源重組率高的細(xì)胞，例如可利用雞DT40細(xì)胞(Dieken等，Nature Genetics, 12 :174-182，1996)。另外，上述移入可通過公知的染色體轉(zhuǎn)移法，例如微核細(xì)胞融合法(Koi等，Jpn. J. Cancer Res. ,80 :413-418,1973)來進(jìn)行。工序(b)在攜帶有源自小鼠的單一染色體的細(xì)胞中，缺失該小鼠染色體的長臂遠(yuǎn)端。此時(shí)，重要的是構(gòu)建缺失(或除去或者刪除)存在于長臂上的大部分內(nèi)源基因并攜帶有小鼠著絲粒的人工染色體。這以缺失(或除去或者刪除)存在于長臂上的總內(nèi)源基因的至少99. 5%,優(yōu)選至少99. 7%、更優(yōu)選至少99. 8%、最優(yōu)選99. 9 100%的方式確定切斷位置。由此，導(dǎo)入的人工染色體穩(wěn)定且高攜帶率地?cái)y帶在源自嚙齒類等哺乳動物的、優(yōu)選源自小鼠的細(xì)胞、組織或個(gè)體中，可用于靶基因(組)的正確的分析、物質(zhì)生產(chǎn)等。上述內(nèi)源基因的缺失 例如可通過W000/10383號中記載的端粒截短進(jìn)行。具體而言，在攜帶有小鼠染色體的細(xì)胞中，構(gòu)建攜帶有人工端粒序列的打靶載體，取得通過同源重組在染色體上的期望的位置插入有(人工)端粒序列的克隆，由此，可通過端粒截短得到缺失變異體。即，期望的位置(或位點(diǎn))為應(yīng)缺失的長臂遠(yuǎn)端的切斷位置，人工端粒序列在該位置通過同源重組被取代、插入而缺失長臂遠(yuǎn)端。該位置可通過構(gòu)建打靶載體時(shí)的靶序列的設(shè)計(jì)而適宜設(shè)定。例如，在后述的實(shí)施例中，基于小鼠11號染色體長臂的AL671968 (GenBank登錄號)的DNA序列設(shè)計(jì)靶序列，以在比其靶序列更靠端粒側(cè)引起端粒截短的方式進(jìn)行設(shè)定(參照圖9)。由此，可得到缺失了大部分內(nèi)源基因的小鼠11號染色體片段。在其它的染色體的情況下也可同樣地實(shí)施端粒截短。工序(c)作為DNA序列插入位點(diǎn)，可優(yōu)選插入位點(diǎn)特異性重組酶的識別位點(diǎn)。S卩，已知某種酶識別特定的識別位點(diǎn)并特異性地在該識別位點(diǎn)引起DNA的重組的現(xiàn)象，在本發(fā)明的小鼠人工染色體載體中，利用由這樣的酶和該酶的識別位點(diǎn)構(gòu)成的體系，插入并搭載目標(biāo)基因或DNA序列。作為這樣的體系，例如可以舉出源自細(xì)菌噬菌體Pl的Cre酶和其識別位點(diǎn)即 IoxP 序列的體系(Cre/loxP 體系；B. Sauerin Methods of Enzymology ； 1993, 225 890-900)、源自出芽酵母的Flp酶和其識別位點(diǎn)即FRT (Flp Recombination Target)序列的體系(Flp/FRT體系)、源自鏈霉菌噬菌體的<pC3〗整合酶和其識別位點(diǎn)即(pC31attB/attP序列6的體系、R4整合酶和其識別位點(diǎn)即R4attB/attP序列的體系、TP901-1整合酶和其識別位點(diǎn)即TP901_lattB/attP序列的體系、Bxbl整合酶和其識別位點(diǎn)即BxblattB/attP序列的體系等，只要可作為DNA序列插入位點(diǎn)起作用，則不限定于上述體系。為了插入這樣的位點(diǎn)特異性重組酶的識別位點(diǎn)，可利用公知的方法，例如同源重組法，長臂近端及短臂近端內(nèi)插入的位置及數(shù)目可適宜設(shè)定。在本發(fā)明中，可插入一個(gè)單一種類識別位點(diǎn)或不同種類的識別位點(diǎn)。通過設(shè)定識別位點(diǎn)，可確定外源基因或外源DNA的插入位置，因此，插入位置恒定，不會受到預(yù)想外的位置效應(yīng)(position effect) 0在后述的實(shí)施例中所例示的小鼠人工染色體的情況下，可特異性地表達(dá)在小鼠11號染色體上的BX572640中所插入的位點(diǎn)特異性重組酶的識別位點(diǎn)IoxP序列中所插入的基因(圖11、圖20、圖24)。在本發(fā)明的具有DNA序列插入位點(diǎn)的小鼠人工染色體載體中可優(yōu)選保留目的基因或DNA序列的插入位點(diǎn)并預(yù)先插入報(bào)告基因。作為報(bào)告基因，沒有特別限定，例如可以舉出熒光蛋白(例如綠色熒光蛋白(GFP或EGFP)基因、黃色熒光蛋白(YFP)等)、標(biāo)記蛋白編碼DNA，β -半乳糖苷酶基因、螢光素酶基因等，但優(yōu)選GFP或EGFP。在本發(fā)明的小鼠人工染色體載體中還可以含有選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記物在篩選通過該載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的細(xì)胞時(shí)有效。作為選擇標(biāo)記基因，可例示正選擇標(biāo)記基因及負(fù)選擇標(biāo)記基因中的任一種或兩者。正選擇標(biāo)記基因包括藥劑抗性基因，例如新霉素抗性基因、氨芐西林抗性基因、殺稻瘟素S(BS)抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、慶大霉素(G418)抗性基因、潮霉素抗性基因等。另外，負(fù)選擇標(biāo)記基因包含例如單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因、白喉毒素A片段(DT-A)基因等。通常HSV-TK可與更昔洛韋或昔洛韋( 々π O )組合使用。作為在本發(fā)明的小鼠人工染色體載體中插入報(bào)告基因或目標(biāo)外源基因或者DNA的方法，可優(yōu)選使用同源重組法。同源重組可使用打靶載體進(jìn)行，所述打靶載體是在小鼠染色體上的插入位置的5’側(cè)區(qū)域及3’側(cè)區(qū)域的堿基序列(分別約I 4kb，優(yōu)選約2 4kb)和相同的兩序列(5，臂(arm)及3’臂之間連接應(yīng)插入的DNA盒而得到的。作為出于該目的而使用的載體，例如可以舉出質(zhì)粒J遼菌體、粘粒、病毒等，優(yōu)選為質(zhì)粒。用于構(gòu)建打靶載體的基本質(zhì)粒的例子為V907或V913 (Lexicon Genetics)等,但并不限定于這些?；据d體也可以含有啟動子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記基因、復(fù)制起點(diǎn)等載體構(gòu)建中通常所插入的I或2個(gè)以上的序列或元件。通過上述方法制作的小鼠人工染色體含有源自小鼠的染色體片段(其中含有天然著絲粒、缺失至少99%、優(yōu)選至少99. 5%的內(nèi)源基因的長臂片段及(在存在的情況下) 短臂。)和人工端粒序列。另外，上述著絲粒是為了制作人工染色體而被利用的小鼠染色體的著絲粒結(jié)構(gòu)的整體。本發(fā)明的小鼠人工染色體載體的例子為后述的實(shí)施例中制作的小鼠人工染色體載體，該人工染色體為在小鼠11號染色體中將長臂遠(yuǎn)端在AL671968中缺失而得到的載體(圖I、圖3、圖4、圖9、圖10)。該載體含有本說明書中的DT40 (MAC)即保藏細(xì)胞株DT40B6bT-l (FERMBP-11128)中所含的小鼠人工染色體作為基本結(jié)構(gòu)。由于為基本結(jié)構(gòu)，因此，可以在該DNA結(jié)構(gòu)中插入如下所述的DNA序列插入位點(diǎn)、選擇標(biāo)記基因、外源基因(或DNA)等。上述小鼠人工染色體載體中優(yōu)選含有I個(gè)或多個(gè)DNA序列插入位點(diǎn)、例如位點(diǎn)特異性重組酶的識別位點(diǎn)(例如Cre酶識別位點(diǎn)即IoxP序列)(圖I、圖3、圖4、圖11、圖20、圖24)。在此，位點(diǎn)特異性重組酶的識別位點(diǎn)為例如GFP-PGKneo-loxP-3’ HPRT型的IoxP序列或者5，HPRT-loxP-hyg型或者PGKneo-loxP-3’ HPRT型的IoxP序列或者GFP-5’ HPRT-IoxP-PGKhyg型的IoxP序列，但并不限定于這些。在此，GFP為綠色熒光蛋白基因，PGKneo為磷酸甘油酸激酶啟動子/新霉素抗性基因盒，HPRT為次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因，hyg為潮霉素抗性基因。上述小鼠人工染色體載體中還可以含有報(bào)告基因、選擇標(biāo)記基因(正選擇標(biāo)記基因，負(fù)選擇標(biāo)記基因等)。該載體中還可以含有目標(biāo)外源基因或DNA序列。本發(fā)明的小鼠人工染色體載體具有與現(xiàn)有的人工染色體載體的優(yōu)點(diǎn)相同的優(yōu)點(diǎn)
I)未插入于宿主染色體而獨(dú)立地維持，因此，不會破壞宿主基因；2)以一定的拷貝數(shù)(可為多個(gè)(多)拷貝)穩(wěn)定地?cái)y帶且受到宿主細(xì)胞的生理性表達(dá)控制，因此，不會引起所插入的基因的過量表達(dá)或表達(dá)消失；3)可導(dǎo)入的DNA大小沒有限制，因此，除可導(dǎo)入含有表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)域的基因或多個(gè)基因/亞型以外，嚙齒類細(xì)胞或者嚙齒類個(gè)體中的攜帶率與現(xiàn)有的人工染色體相比提1 ,實(shí)現(xiàn)導(dǎo)入基因的長期間中的穩(wěn)定表達(dá)，且子代傳遞率提1 ,由此，轉(zhuǎn)基因小鼠的制作效率提高，(4)載體導(dǎo)入后組織間的不均少，即攜帶率即使在任何組織中均為90%以上，甚至HAC的情況下低于20%的攜帶率的血液系統(tǒng)組織也為90%以上的攜帶率
坐寸O
(2)外源基因或DNA的導(dǎo)入也可以在本發(fā)明的小鼠人工染色體載體中導(dǎo)入外源基因或DNA。外源基因或DNA序列的大小沒有特別限制，可以為20kb以下，或者也可以超過20kb，例如為50kb以上、IOOkb以上、200kb以上、500kb以上、700kb以上、IMb以上、IOMb以上、20Mb以上、30Mb以上、40Mb以上或50Mb以上。本發(fā)明的載體可與HAC載體同樣地搭載對于BAC、PAC、YAC等人工染色體載體困難的尺寸，即IMb以上的外源DNA(染色體片段)。因此，本發(fā)明的載體如上所述可將200kb以上、例如IMb以上的大片段外源基因或DNA以比HAC穩(wěn)定且高攜帶率(90%以上)攜帶在哺乳類的細(xì)胞內(nèi)、組織內(nèi)或非人類動物個(gè)體內(nèi)、優(yōu)選嚙齒類的細(xì)胞內(nèi)、組織內(nèi)或個(gè)體內(nèi)。作為本發(fā)明的方式之一，本發(fā)明提供一種可將200kb以上的巨大的尺寸的外源基因或DNA在嚙齒類細(xì)胞或嚙齒類個(gè)體內(nèi)以90%以上的攜帶率穩(wěn)定地進(jìn)行維持的載體以及制作該載體的方法。外源基因或DNA為對作為對象的細(xì)胞而言從外部所導(dǎo)入的核酸序列，沒有特別限定，為源自任何的生物物種或者源自任何的組織或細(xì)胞的基因或DNA，優(yōu)選為源自哺乳動物的基因或DNA，更優(yōu)選源自人類的基因或DNA。這樣的基因或DNA包括對細(xì)胞因子類、激素類、生長因子類、營養(yǎng)因子類、造血因子類、免疫球蛋白類、G蛋白偶聯(lián)受體類、酶類等多肽類進(jìn)行編碼的基因或DNA，另外的與包括腫瘤、肌營養(yǎng)不良癥、血友病、神經(jīng)變性疾病(例如阿爾茨海默病、亨廷頓舞蹈癥、帕金森病等)、自體免疫性疾病、過敏性疾病、遺傳性疾病等的各種疾病相關(guān)的治療用基因或DNA，(人類)藥物代謝酶的基因(群)或DNA(人類)藥物代謝相關(guān)基因、人類染色體的長臂或短臂的DNA、(人類)基因組文庫等，但并不限定于這些。細(xì)胞因子類包括例如干擾素類(例如IF-α、IF-β、IF- Y等)、白介素類(例如IL-I、IL-2、IL-4、IL-6、IL-IU IL-12 等)、腫瘤壞死因子(例如 TNF-α、TNF-β )、TGF-β家族蛋白質(zhì)(例如骨形態(tài)生成蛋白(BMP)等)等。激素類包括例如生長激素、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、人胎盤催乳素(hPL)、人垂體促性腺激素、促甲狀腺激素(TSH)、促黃體生成激素釋放因子、胰島素、胰高血糖素、生長激素抑制素、催乳激素等。生長因子類或營養(yǎng)因子類包括例如胰島素樣生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、白蛋白融合睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、血小板源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(TONF)、轉(zhuǎn)化生長因子、神經(jīng)生長因子(NGF)、TNF生長因子等。凝血·溶血因子類包括例如第VII因子、第VIII因子、第X因子、t_PA等。造血因子類包括例如紅細(xì)胞生成素、(粒細(xì)胞)集落刺激因子、血小板生成素等。
免疫球蛋白類包括例如對于各種抗原的人類抗體類，人源化抗體類、嵌合抗體類、合成抗體等重組抗體類等。G蛋白偶聯(lián)受體類包括腎上腺素受體、毒蕈堿型乙酰膽堿受體、腺苷受體、GABA受體(B型)、血管緊張素受體、膽囊收縮素受體、多巴胺受體、胰高血糖素受體、組胺受體、嗅覺受體、阿片受體、分泌素受體、生長激素抑制素受體、胃泌素的受體、P2Y受體等。酶類包括例如天冬酰胺酶、超氧化物歧化酶、尿酸酶、鏈激酶、多巴胺合成酶、腺苷脫氨酶等。 與包括腫瘤、肌營養(yǎng)不良癥、神經(jīng)變性疾病(例如阿爾茨海默病、亨廷頓舞蹈癥、帕金森病等)、自體免疫性疾病、過敏性疾病、遺傳性疾病等的各種疾病相關(guān)的治療用基因包括例如抗肌萎縮蛋白基因、IL-12基因、TNF-α基因、腫瘤抑制基因、多巴胺合成系酶基因、遺傳性酶缺失(遺伝性欠損酵素)的基因類等。藥物代謝酶為與用于分解·排出藥及毒物等異物的代謝反應(yīng)相關(guān)的酶，含有與第一相反應(yīng)(氧化、還原、水解)相關(guān)的酶及與第二相反應(yīng)(結(jié)合)的酶。與第一相反應(yīng)相關(guān)的酶包括例如細(xì)胞色素P450( “CYP”)等公知的酶，具體而言，CYP1A、CYP1B、CYP2A、CYP2B、CYP2C、CYP2D、CYP2E、CYP2J、CYP3A、CYP4A、CYP4B 及它們的亞家族以及 CES 等。作為 CYP亞家族，例如CYP3A的亞家族包括CYP3A4、CYP3A43、CYP3A5、CYP3A7等，另外，CYP2C的亞家族包括CYP2C8、CYP2C9、CYP2C18、CYP2C19等。即，后述的實(shí)施例中所記載的CYP3A-MAC是指CYP3A簇，由CYP3A4、CYP3A43、CYP3A5及CYP3A7構(gòu)成。另一方面，與第二相反應(yīng)(結(jié)合)相關(guān)的酶包括例如UGTl及UGT2等。藥物代謝相關(guān)基因包括例如對轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行編碼的基因、對核受體進(jìn)行編碼的基因等。對轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行編碼的基因的例子為MDRl、MDR2、MRP2、OAT、OATP、OCT、BCRP等，對核受體進(jìn)行編碼的基因的例子為PXR、AhR、CAR、PPARa等。如上所述，可導(dǎo)入于本發(fā)明的載體的與藥物代謝相關(guān)的外源DNA序列可以含有選自對與第一相反應(yīng)相關(guān)的酶進(jìn)行編碼的基因、對與第二相相關(guān)的酶進(jìn)行編碼的基因、對轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行編碼的基因及對核受體進(jìn)行編碼的基因構(gòu)成的組中的至少I個(gè)基因的序列或者至少2個(gè)基因的序列。可以使至少I個(gè)絕緣子序列存在于本發(fā)明的小鼠人工染色體載體中的外源基因或外源DNA的插入位點(diǎn)的附近或插入位點(diǎn)的兩側(cè)。絕緣子序列具有增強(qiáng)子阻斷效應(yīng)(即，相鄰的基因互相不受影響)或染色體邊界效應(yīng)(將保證基因表達(dá)的區(qū)域和抑制基因表達(dá)的區(qū)域隔開進(jìn)行區(qū)別)。這樣的序列包含例如人類β珠蛋白HSl HS5，雞β珠蛋白HS4等。外源基因或DNA的導(dǎo)入可利用作為上述的DNA序列插入位點(diǎn)插入的上面所例示那樣的位點(diǎn)特異性重組酶的體系進(jìn)行。例如構(gòu)建攜帶有Cre酶的識別位點(diǎn)即IoxP序列和外源基因或DNA的打靶載體或者攜帶有插入了 Cre酶的識別位點(diǎn)即IoxP序列的外源基因或DNA的染色體片段，在攜帶有本發(fā)明的小鼠人工染色體載體的細(xì)胞內(nèi)使Cre酶表達(dá)，由此，通過在IoxP序列中與該打靶載體或者該染色體片段的位點(diǎn)特異性重組，可以導(dǎo)入外源基因或DNA。在本發(fā)明的小鼠人工染色體載體中也可以插入攜帶有位點(diǎn)特異性重組酶的識別位點(diǎn)(例如IoxP序列、FRT序列等的環(huán)狀DNA，也可以利用以大腸菌作為宿主的質(zhì)?；蛞越湍缸鳛樗拗鞯沫h(huán)狀YAC等現(xiàn)存的載體插入經(jīng)克隆化的DNA。優(yōu)選的IoxP序列為源自Pl噬菌體的野生的序列，環(huán)狀插入體(4 >寸一卜)向利用Cre酶得到的人工染色體載體上的IoxP序列的插入反應(yīng)是可逆的。一旦插入環(huán)狀插入體時(shí)，在人工染色體載體上殘留2個(gè)IoxP序列。因此，再次 使Cre酶表達(dá)時(shí)，也有可能引起切出環(huán)狀插入體的逆反應(yīng)，難以二次插入插入體來進(jìn)一步改造人工染色體載體。但是，利用進(jìn)行堿基取代的變異IoxP序列及Φ(-'3 I整合酶的識別位點(diǎn)即attB/attP序列的組合等，也可以構(gòu)建依次插入多個(gè)環(huán)狀插入體的體系且不會引起逆反應(yīng)。(3)小鼠人工染色體載體向細(xì)胞的移入及非人類動物的制造本發(fā)明的小鼠人工染色體載體或者含有外源基因或者DNA的本發(fā)明的小鼠人工染色體載體可以移入或?qū)胗谌魏渭?xì)胞。用于移入或?qū)氲姆椒òɡ缥⒑思?xì)胞融合法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣法、顯微注射法、電穿孔法等，優(yōu)選的方法為微核細(xì)胞融合法。微核細(xì)胞融合法為通過含有本發(fā)明的小鼠人工染色體載體的具有微核形成能力的細(xì)胞(例如小鼠A9細(xì)胞)和其它的期望的細(xì)胞的微核融合將該載體移入于該其它的細(xì)胞的方法。具有微核形成能力的細(xì)胞用多倍體誘發(fā)劑(例如秋水酰胺\秋水仙堿等)進(jìn)行處理而微核多核細(xì)胞，進(jìn)行通過細(xì)胞松弛素處理形成微核體的處理后，進(jìn)行與期望的細(xì)胞的細(xì)胞融合。上述可導(dǎo)入載體的細(xì)胞包含動物細(xì)胞、優(yōu)選含有人類細(xì)胞的哺乳動物細(xì)胞，例如卵母細(xì)胞、精子細(xì)胞等生殖細(xì)胞，胚胎干(ES)細(xì)胞、精子干(GS)細(xì)胞、體性干細(xì)胞等干細(xì)胞，體細(xì)胞、胎兒細(xì)胞、成體細(xì)胞、正常細(xì)胞、疾病細(xì)胞、初代培養(yǎng)細(xì)胞、繼代細(xì)胞或細(xì)胞系等。干細(xì)胞包括例如ES細(xì)胞、胚性生殖(EG)細(xì)胞、胚胎癌(EC)細(xì)胞、mGS細(xì)胞、人間充質(zhì)干細(xì)胞等多能干細(xì)胞、誘導(dǎo)性多能干(iPS)細(xì)胞、核移植來源胚胎干(ntES)細(xì)胞等。優(yōu)選的細(xì)胞選自源自哺乳動物(優(yōu)選含有小鼠的嚙齒類)的體細(xì)胞、非人類生殖細(xì)胞、干細(xì)胞及前體細(xì)胞構(gòu)成的組。在細(xì)胞為源自嚙齒類等的哺乳類的細(xì)胞的情況下，在導(dǎo)入有本發(fā)明的載體的哺乳類(例如小鼠等嚙齒類)的細(xì)胞或組織中，可更穩(wěn)定地?cái)y帶載體，即載體自細(xì)胞的脫落顯著降低或不會引起脫落。細(xì)胞例如為肝細(xì)胞、腸細(xì)胞、腎細(xì)胞、脾細(xì)胞、肺細(xì)胞、心臟細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、腦細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、淋巴球細(xì)胞、巨核細(xì)胞、精子、卵子等。組織為例如肝臟、腸、腎臟、脾臟、肺、心臟、骨骼肌、腦、骨髓、睪丸、卵巢等組織，對ES細(xì)胞而言，可以從對象動物的受精卵的胚泡中取出內(nèi)部細(xì)胞塊并將絲裂霉素C處理小鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層進(jìn)行建立并維持(M. J.Evans和M. H. Kaufman(1981)Nature 292 :154-156)。對iPS細(xì)胞而言，通過在體細(xì)胞(含有體性干細(xì)胞)中導(dǎo)入某種特定的再編程因子(DNA或蛋白質(zhì))并用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)，在約3 5周生成集落。再編程因子已知有例如由0ct3/4、Sox2、Klf4及c_Myc構(gòu)成的組合；由0ct3/4、Sox2及Klf4構(gòu)成的組合；由 0ct4、Sox2、Nanog 及 Lin28 構(gòu)成的組合；或者由 0ct3/4、Sox2、Klf4、c_Myc、Nanog 及 Lin28 構(gòu)成的組合等(K. Takahashi and S. Yamanaka, Cell 126:663-676(2006)；W02007/069666 ；M. Nakagawa 等，Nat.Biotechnol. 26 :101-106(2008) ；K. Takahashi 等，Cell 131 :861-872(2007) ;J. Yu 等，Science 318:1917-1920(2007) ;J. Liao 等，CellRes. 18,600-603(2008))。培養(yǎng)實(shí)例包括將絲裂霉素C處理后的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株(例如ST0)作為飼養(yǎng)細(xì)胞，在該飼養(yǎng)細(xì)胞層上使用ES細(xì)胞用培養(yǎng)基，在約37°C的溫度下對載體導(dǎo)入體細(xì)胞(約IO4 IO5細(xì)胞/cm2)進(jìn)行培養(yǎng)。飼養(yǎng)細(xì)胞不是必需的(Takahashi，K.等，Celll31 :861-872(2007))。基本培養(yǎng)基為例如達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、Ham’sF-12培養(yǎng)基、它們的混合培養(yǎng)基等，ES細(xì)胞用培養(yǎng)基可以使用小鼠ES細(xì)胞用培養(yǎng)基、靈長類ES細(xì)胞用培養(yǎng)基Oteprocell ( 'J 口七 > )公司)等。 ES細(xì)胞及iPS細(xì)胞有助于生殖系列，因此，可以通過包括將導(dǎo)入有含有目標(biāo)基因或DNA的本發(fā)明的小鼠人工染色體載體的這些細(xì)胞注入該細(xì)胞所源自的同種哺乳動物的胚的胚泡中，將該胚移植到寄養(yǎng)母體的子宮中使其進(jìn)行生育的方法制造非人類動物(或轉(zhuǎn)基因動物(除人類以外))。另外，通過使得到的雌雄轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行交配，可以制造純合性動物、進(jìn)而其子代動物。經(jīng)由本發(fā)明的小鼠人工染色體載體在ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞等分化多能性細(xì)胞、其它的上述細(xì)胞類中導(dǎo)入人類抗體基因、疾病治療用基因、藥物代謝相關(guān)基因等外源的基因或者DNA，由此可制作可產(chǎn)生人類抗體的細(xì)胞或非人類動物，另外，可制作可產(chǎn)生治療用蛋白質(zhì)的細(xì)胞，另外，可制作藥物代謝相關(guān)疾病等的疾病模型非人類動物。在這樣的非人類動物中，有時(shí)也優(yōu)選與小鼠人工染色體載體中所含的外源基因?qū)?yīng)的內(nèi)源基因被破壞或內(nèi)源基因的表達(dá)降低。破壞的方法可以使用基因打靶法。內(nèi)源基因的表達(dá)的降低法可以使用RNAi法。例如，對這樣的外源基因的例子而言，可以舉出藥物代謝相關(guān)基因、人類抗體基因等。破壞了內(nèi)源基因的非人類動物可以通過進(jìn)一步使內(nèi)源基因雜合缺失的動物彼此進(jìn)行交配而制造，所述內(nèi)源基因可以使攜帶有含有外源基因的小鼠人工染色體載體的嵌合體非人類動物或者其子代和對應(yīng)的使內(nèi)源基因每個(gè)簇缺失的嵌合體動物或者子代進(jìn)行交配而得到。通過上述方法可制作攜帶有小鼠人工染色體載體的細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因非人類動物。具體的非人類動物例子為攜帶有小鼠人工染色體載體的小鼠或大鼠等嚙齒類。即，本發(fā)明提供一種細(xì)胞及非人類動物，其特征在于，攜帶有小鼠人工染色體載體。另外，對由本發(fā)明的非人類動物得到的細(xì)胞、組織或器官而言，也可以用于由這些制作通過外源基因表達(dá)產(chǎn)生蛋白質(zhì)的細(xì)胞株。(4)有用的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)法本發(fā)明還提供一種蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，其含有對攜帶有含有可表達(dá)外源DNA序列的小鼠人工染色體載體的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，回收所產(chǎn)生的由該DNA所編碼的蛋白質(zhì)。作為蛋白質(zhì)，可以舉出例如上述醫(yī)療方面、農(nóng)業(yè)方面等產(chǎn)業(yè)方面有用的蛋白質(zhì)或多肽類。以將對這些蛋白質(zhì)或多肽類進(jìn)行編碼的DNA在啟動子(及根據(jù)必要使用的增強(qiáng)子)的存在下可表達(dá)的方式插入于小鼠人工染色體載體，對適當(dāng)?shù)募?xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染。對得到的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使該DNA表達(dá)而產(chǎn)生該蛋白質(zhì)或多肽，將其從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收。細(xì)胞除哺乳動物細(xì)胞以外，也可以使用Sf細(xì)胞等昆蟲細(xì)胞、鳥類細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞等真核細(xì)胞。包括培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件可依據(jù)細(xì)胞的種類選擇，作為培養(yǎng)條件，可使用公知的條件。例如，作為動物細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、Ham’ s F12培養(yǎng)基、Eagle’ s MEM培養(yǎng)基、Iscove’ s EME培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、這些的混合培養(yǎng)基等。蛋白質(zhì)或多肽類的回收(或分離)可將凝膠過濾色譜法、離子交換色譜法、親和色譜法、HPLC、FPLC等色譜法、鹽析法、硫酸銨沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法、超濾法、結(jié)晶等公知的方法單獨(dú)或組合進(jìn)行實(shí)施。(5)人類抗體的制造法本發(fā)明還提供一種人類抗體的制造方法，其含有使用攜帶有含有人類抗體基因的小鼠人工染色體載體的上述非人類動物產(chǎn)生人類抗體并回收該人類抗體。人類抗體基因?yàn)閷θ祟怚gG、IgM、IgA、IgD、IgE中的任一類或者人類IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2中的任一亞類進(jìn)行編碼的基因。優(yōu)選的人類抗體基因?yàn)镮gG類及其亞類。人類抗體由2條相同序列的重鏈⑶和2條相同序列的輕鏈(L)構(gòu)成，H鏈和L鏈均由可變區(qū)和恒定區(qū)構(gòu)成。人類H鏈及L鏈的可變區(qū)均由3個(gè)超變區(qū)(從N末端側(cè)至C末 端側(cè)以⑶R1、⑶R2、⑶R3的順序)和4個(gè)構(gòu)架區(qū)(從N末端側(cè)至C末端側(cè)以FR1、FR2、FR3、FR4的順序)構(gòu)成，根據(jù)人類H鏈及L鏈的分別各3個(gè)CDR序列確定抗體的特異性。在人類IgG抗體的情況下，由作為重鏈的μ鏈和作為輕鏈的λ鏈或者K鏈構(gòu)成，這些抗體鏈基因分別存在于人類14號染色體、22號染色體、2號染色體上。作為本發(fā)明中使用的人類抗體基因，使用含有各抗體基因座的人類染色體片段，將這些插入不同或相同的小鼠人工染色體中?？贵w基因序列可由NCBI (美國)的數(shù)據(jù)庫等獲得。該一系列的方法為例如日本特開2005-230020號公報(bào)中所記載的技術(shù)的改良。可生產(chǎn)完全人類抗體的非人類動物通過將攜帶有含有人類μ鏈基因座的小鼠人工染色體載體的非人類動物和攜帶有含有人類λ鏈基因座及/或人類K鏈基因座的小鼠人工染色體載體的同種的非人類動物進(jìn)行交配，可以得到持有兩者的H鏈及L鏈基因座的嵌合體非人類動物及其子代動物。通過包括免疫某特定的抗原肽或者抗原多肽且從該動物的血液中分離人類抗體的方法，可在如上制作的可產(chǎn)生完全人類抗體的非人類動物(例如小鼠等的嚙齒類)中生產(chǎn)人類抗體?；蛘撸鲇媚程囟ǖ目乖庖叩姆侨祟悇游锏钠⑴K，使其與骨髓瘤細(xì)胞融合，也可以得到產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。(6)治療物質(zhì)的篩選法本發(fā)明還提供一種篩選對于治療疾病有效的物質(zhì)的方法，其包括對作為該疾病模型動物的上述非人類動物施用候選藥劑并對該藥劑的治療效果進(jìn)行評價(jià)。疾病模型非人類動物為人工制作且具有以因某種蛋白質(zhì)的缺損、變異等引起的生物功能異常、藥物代謝異常、染色體異常等異常作為原因的疾病的動物。具有染色體異常的模型非人類動物的例子為但不限定于具有人類18號或21號染色體三倍體癥的動物。這樣的非人類動物可通過如下方法制作所述方法包括制作在基因或染色體中含有如上所述的異常的基因或染色體片段，將其插入本發(fā)明的小鼠人工染色體載體，導(dǎo)入于ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞，注入于受精卵的胚泡，將該細(xì)胞移植到非人類動物的寄養(yǎng)母體的子宮中，使其生產(chǎn)。通過對如上制作的非人類動物施用候選藥劑并對該藥劑的治療效果進(jìn)行評價(jià)，可以篩選對于治療該疾病有效的物質(zhì)。候選藥劑是非限定的，例如為低分子化合物、高分子化合物、(糖)蛋白質(zhì)、肽、(磷或糖)脂質(zhì)、糖類等。(7)藥物或食品的藥理作用、代謝或毒性的試驗(yàn)方法根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，本發(fā)明還提供一種藥物或食品的藥理作用及/或代謝及/或毒性的試驗(yàn)方法，其包括對攜帶有含有人類藥物代謝相關(guān)基因的小鼠人工染色體載體的上述非人類動物或者源自該動物的細(xì)胞、器官或組織施用藥物或食品并對該藥物或食品的藥理作用及/或代謝及/或毒性進(jìn)行測定。本發(fā)明還提供一種藥物或食品的毒性的試驗(yàn)方法，其包括將由攜帶有含有人類藥物代謝相關(guān)基因的小鼠人工染色體載體的上述非人類動物得到的微粒體或微粒體級分S9與培養(yǎng)細(xì)胞或者細(xì)菌及藥物或者/及食品一起進(jìn)行培養(yǎng)并測定藥物或食品對該細(xì)胞或細(xì)菌造成的(不良)影響(例如變異等)。人類藥物代謝相關(guān)基因?yàn)樯鲜隼镜幕颉Ａ硗?，非人類動物的制作方法也與上述記載的方法相同。在使用攜帶有具有人類藥物代謝相關(guān)基因的小鼠人工染色體載體的上述的非人類動物的上述方法中，例如通過該動物狀態(tài)的觀察、對臟器及染色體造成的影響的試驗(yàn)等，可以對藥物或食品的藥理作用、代謝或毒性進(jìn)行判定。在本發(fā)明的另一方法中，將由該非人類動物得到的微粒體或者微粒體級分S9(9000g級分即含有催化水解、還原、氧化、結(jié)合等的多個(gè)酶的級分)與培養(yǎng)細(xì)胞(特別是動物細(xì)胞、優(yōu)選哺乳類細(xì)胞)或細(xì)菌(優(yōu)選沙門氏菌)一起在藥物及/或食品的存在下進(jìn)行培養(yǎng)。藥物或食品對于細(xì)胞的毒性的檢測可以通過艾姆斯試驗(yàn)或小核試驗(yàn)進(jìn)行。在艾姆斯試驗(yàn)中，基于沙門氏菌的變異判定毒性。在小核試驗(yàn)中，基于細(xì)胞核的染色體的異常判定毒性。這些試驗(yàn)法是眾所周知的，可在本發(fā)明的方法中使用。以下，舉出實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍并不限定于這些具體例。實(shí)施例[實(shí)施例I]
小鼠人工染色體載體MAC的構(gòu)建通過對小鼠染色體進(jìn)行端粒截短來構(gòu)建不含內(nèi)源基因的小鼠人工染色體MAC[DT40 (B6bT)](圖 I)。[A]A9細(xì)胞和小鼠成纖維細(xì)胞(neo ；mChrll-BSr)的雜交細(xì)胞建立將含有用藥劑抗性基因(Bsr基因)標(biāo)記的小鼠11號染色體的小鼠成纖維細(xì)胞即小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mChrll-BSr)和在公知的小鼠A9細(xì)胞中插入有G418抗性基因即neo基因的小鼠A9 (neo)細(xì)胞融合，建立攜帶有用藥劑抗性基因標(biāo)記的小鼠染色體的小鼠A9雜種細(xì)胞即小鼠A9x小鼠胚胎成纖維細(xì)胞雜種(ne0;mChrll-BSr)。為了將用藥劑抗性基因標(biāo)記的小鼠染色體通過微核細(xì)胞融合法導(dǎo)入同源重組頻率高的雞DT40細(xì)胞，通過細(xì)胞融合在已知微核形成率高的小鼠A9細(xì)胞中導(dǎo)入用藥劑抗性基因標(biāo)記的小鼠染色體。[A. I]細(xì)胞融合及雙重藥劑耐性克隆的分離 由可從日本CLEA獲得的C57B6系統(tǒng)的小鼠胚胎進(jìn)行建立，將在小鼠染色體上插入了藥劑抗性基因(Bsr基因)的小鼠成纖維細(xì)胞即小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mChrll-BSr)和插入有作為G418抗性基因的neo基因的小鼠A9細(xì)胞即小鼠A9 (neo)分別用PBS (-)清洗細(xì)胞表面后，通過添加胰蛋白酶來分散細(xì)胞，懸浮于培養(yǎng)液(10^^83、01^1)，將各種細(xì)胞1\106個(gè)同時(shí)植入培養(yǎng)用燒瓶(25cm2)進(jìn)行一天培養(yǎng)。用PBS(-)清洗細(xì)胞表面2次后，用3ml的PEG(1 I. 4)溶液[使 5g, PEG1000, cat : 165-09085，wako 溶解于無血清 DMEM 6ml，添加二甲基亞砜Iml進(jìn)行過濾滅菌]進(jìn)行I分鐘處理，再換成3ml的PEG (I 3)溶液[使5g，PEG1000, cat : 165-09085，wako溶解于無血清DMEM 15ml并進(jìn)行過濾滅菌]進(jìn)行I分鐘處理。對PEG溶液進(jìn)行抽吸后，用無血清DMEM清洗3次，用通常的培養(yǎng)液(10% FBS、DMEM)進(jìn)行一天培養(yǎng)。用PBS(-)清洗細(xì)胞表面后，通過添加胰蛋白酶來分散細(xì)胞，將懸浮于含有6418(800 μ g/ml)及殺稻瘟素S (4 μ g/ml)的雙重選擇培養(yǎng)液(10% FBS, DMEM)的細(xì)胞植入塑料培養(yǎng)皿，進(jìn)行2 3周選擇培養(yǎng)。對通過2次細(xì)胞融合得到的合計(jì)3個(gè)耐性集落進(jìn)行分離并使其增殖，進(jìn)行以下的分析(克隆名小鼠A9x小鼠胚胎成纖維細(xì)胞雜種(neo;mChrll-BSr))。[A. 2]雜種細(xì)胞的選擇 [A. 2. I]PCR由雙重藥劑耐性克隆提取基因組DNA，使用以下的引物進(jìn)行PCR，確認(rèn)攜帶有用藥劑抗性基因(Bsr基因)標(biāo)記的小鼠染色體。Bsr Rl :5，CATGTGGGAGCGGCAATTC3’(序列號 I)Bsr LI :5，TTGAGTGGAATGAGTTCTTCAATCG3，(序列號 2)對PCR而言,使用Perkin-Elmer公司制的Gene Amp 9600作為熱循環(huán)儀、Taq聚合酶使用 Ampli Taq Gold (Applied Biosystems),緩沖液及 dNTP (dATP、dCTP、dGTP、dTTP)根據(jù)標(biāo)注的推薦條件使用。溫度、循環(huán)條件為在95°C 10分鐘的熱變性后，以94°C 30秒、600C 30秒、72°C 30秒進(jìn)行35循環(huán)。對PCR的結(jié)果而言，3個(gè)克隆中的3個(gè)克隆為陽性。表I
權(quán)利要求
1.一種小鼠人工染色體載體，特征在于，含有源自小鼠染色體的天然著絲粒、從著絲粒附近的小鼠染色體長臂部位中缺失長臂遠(yuǎn)端而成的源自小鼠染色體的長臂片段及端粒序列，以及可被穩(wěn)定地?cái)y帶在哺乳類的細(xì)胞及組織中。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小鼠人工染色體載體，其中，小鼠染色體為I 19號染色體中的任何一個(gè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的小鼠人工染色體載體，其中，源自小鼠染色體的長臂片段由從小鼠I 19號染色體中的任何一個(gè)的長臂中缺失其總內(nèi)源性基因數(shù)的至少99. 5%而成的剩余部分構(gòu)成。
4.根據(jù)權(quán)利要求I 3中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，其中，含有保藏細(xì)胞株DT40 B6bT-l (FERM BP-11128)中所含的小鼠人工染色體作為基本結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 4中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，其中，哺乳類為嚙齒類。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的小鼠人工染色體載體，其中，嚙齒類為小鼠、大鼠或倉鼠。
7.根據(jù)權(quán)利要求I 6中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，還含有一個(gè)或多個(gè)DNA序列插入位點(diǎn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的小鼠人工染色體載體,其中,DNA序列插入位點(diǎn)為位點(diǎn)特異重組酶的識別位點(diǎn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的小鼠人工染色體載體，其中，DNA序列插入位點(diǎn)為IoxP序列、FRT 序列、cpC31att:B 及cpC31attP序列、R4attB 及 R4attP 序列、TP901-IattB 及TP901_lattP 序列或者 BxblattB 及 BxblattP 序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求I 9中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，還含有報(bào)告基因、選擇標(biāo)記基因或兩者。
11.根據(jù)權(quán)利要求I 10中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，還含有外源DNA序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求I 11中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，其中，外源DNA序列的尺寸為200kb以上。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的小鼠人工染色體載體，其中，外源DNA序列為人類DNA序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求11 13中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，其中，外源DNA序列為藥物代謝相關(guān)基因的DNA序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的小鼠人工染色體載體，其中，藥物代謝相關(guān)基因是編碼參與第一相反應(yīng)或第二相反應(yīng)的酶的基因。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的小鼠人工染色體載體，其中，參與第一相反應(yīng)的酶是編碼選自由 CYP1A、CYPIB, CYP2A、CYP2B、CYP2C、CYP2D、CYP2E、CYP2J、CYP3A、CYP4A、CYP4B 及它們的亞家族等CYP以及CES構(gòu)成的組中的至少一個(gè)的酶。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的小鼠人工染色體載體，其中，參與第二相反應(yīng)的酶是編碼選自由UGTl及UGT2構(gòu)成的組中的至少一個(gè)的酶。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的小鼠人工染色體載體，其中，藥物代謝相關(guān)基因是編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的小鼠人工染色體載體，其中，編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因是編碼選自由MDRl、MDR2、MRP2、OAT、OATP, OCT及BCRP構(gòu)成的組中的至少一個(gè)的基因。
20.根據(jù)權(quán)利要求14所述的小鼠人工染色體載體，其中，藥物代謝相關(guān)基因是編碼核受體的基因。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的小鼠人工染色體載體，其中，編碼核受體的基因是編碼選自由PXR、AhR、CAR及PPAR α構(gòu)成的組中的至少一個(gè)的基因。
22.根據(jù)權(quán)利要求11 13中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，其中，外源DNA序列為人類染色體的長臂或短臂的DNA序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求11 21中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，其中，外源DNA序列 含有選自由編碼參與第一相反應(yīng)的酶的基因、編碼參與第二相反應(yīng)的酶的基因、編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因及編碼核受體的基因構(gòu)成的組中的至少兩個(gè)基因序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的小鼠人工染色體載體，其中，人類染色體為含有疾病基因的致病區(qū)域的人類染色體的長臂或短臂的DNA序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求11 13中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，其中，外源DNA序列為編碼細(xì)胞因子類、激素類、生長因子類、營養(yǎng)因子類、造血因子類、凝血 溶血因子類、免疫球蛋白類、G蛋白偶聯(lián)受體類、酶類等多肽類的基因或DNA的序列，或者與腫瘤、肌營養(yǎng)不良癥、血友病、神經(jīng)變性疾病、自身免疫病、過敏性疾病、遺傳性疾病等疾病相關(guān)的治療用基因或DNA的序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求I 25中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，其中，細(xì)胞為肝細(xì)胞、腸細(xì)胞、腎細(xì)胞、脾細(xì)胞、肺細(xì)胞、心臟細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、腦細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、淋巴球細(xì)胞、巨核細(xì)胞、精子或卵子。
27.根據(jù)權(quán)利要求I 25中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，其中，組織為源自肝臟、腸、腎臟、脾臟、肺、心臟、骨骼肌、腦、骨髓、睪丸或卵巢的組織。
28.攜帶權(quán)利要求I 27中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體的細(xì)胞。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的細(xì)胞，其中，細(xì)胞選自由體細(xì)胞、非人類生殖細(xì)胞、干細(xì)胞及前體細(xì)胞構(gòu)成的組。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的細(xì)胞，其中，干細(xì)胞為胚胎干(ES)細(xì)胞或誘導(dǎo)性多能干(iPS)細(xì)胞。
31.根據(jù)權(quán)利要求28 30中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中，細(xì)胞為原代培養(yǎng)細(xì)胞、繼代細(xì)胞或細(xì)胞系。
32.根據(jù)權(quán)利要求28 31中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中，細(xì)胞為可產(chǎn)生人類抗體的細(xì)胞。
33.一種醫(yī)藥組合物，含有攜帶含有疾病治療用的外源DNA序列的小鼠人工染色體載體的權(quán)利要求28 32中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞。
34.一種非人類動物，特征在于攜帶權(quán)利要求I 27中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的非人類動物，所述非人類動物為疾病模型動物。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的非人類動物，所述非人類動物為可表達(dá)外源的人類藥物代謝相關(guān)基因的動物。
37.根據(jù)權(quán)利要求34所述的非人類動物，所述非人類動物為可產(chǎn)生人類抗體的動物。
38.根據(jù)權(quán)利要求34 37中任一項(xiàng)所述的非人類動物，其中，對應(yīng)于小鼠人工染色體載體中所含的外源DNA的內(nèi)源基因被破壞或內(nèi)源基因的表達(dá)降低。
39.一種蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，所述方法包括對攜帶含有外源DNA序列的小鼠人工染色體載體的權(quán)利要求28 32中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并回收所產(chǎn)生的由該DNA所編碼的蛋白質(zhì)。
40.一種人類抗體的制造方法，所述方法包括使用攜帶含有人類抗體基因的小鼠人工染色體載體的權(quán)利要求37或38所述的非人類動物產(chǎn)生人類抗體并回收該抗體。
41.一種篩選對于治療疾病有效的物質(zhì)的方法，所述方法包括對作為疾病模型動物的權(quán)利要求35所述的非人類動物施用候選藥劑，并對該藥劑的治療效果進(jìn)行評價(jià)。
42.一種藥物或食品的藥理作用及/或代謝及/或毒性的試驗(yàn)方法，所述方法包括對攜帶含有人類藥物代謝相關(guān)基因的小鼠人工染色體載體的權(quán)利要求36或38所述的非人類動物或者源自該動物的細(xì)胞、器官或組織施用藥物或食品，并對該藥物或食品的藥理作用及/或代謝及/或毒性進(jìn)行測定。
43.一種藥物或食品毒性的試驗(yàn)方法，所述方法包括將由攜帶含有人類藥物代謝相關(guān)基因的小鼠人工染色體載體的權(quán)利要求36或38所述的非人類動物得到的微粒體或微粒體級分S9與培養(yǎng)細(xì)胞或者細(xì)菌和藥物及/或者食品一起進(jìn)行培養(yǎng)，并測定藥物或食品對該細(xì)胞或細(xì)菌造成的影響。
44.一種細(xì)胞或個(gè)體內(nèi)的大尺寸DNA的穩(wěn)定化方法,所述方法包括使用權(quán)利要求I 27中任一項(xiàng)所述的小鼠人工染色體載體，并將200kb以上的大尺寸的外源DNA以90%以上的攜帶率穩(wěn)定地維持在嚙齒類細(xì)胞或嚙齒類個(gè)體內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種小鼠人工染色體載體，涉及攜帶該載體的細(xì)胞或非人類動物以及該細(xì)胞或非人類動物的使用，所述小鼠人工染色體載體的特征在于，含有源自小鼠染色體的天然著絲粒、從著絲粒附近的小鼠染色體長臂部位中缺失長臂遠(yuǎn)端而成的源自小鼠染色體的長臂片段及端粒序列，以及可被穩(wěn)定地?cái)y帶在哺乳類的細(xì)胞及個(gè)體組織中。
文檔編號C12N15/09GK102791857SQ20118001264
公開日2012年11月21日 申請日期2011年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月6日
發(fā)明者押村光雄, 松岡隆之, 滝口正人, 香月康宏 申請人:國立大學(xué)法人鳥取大學(xué), 株式會社科洛莫森特