專利名稱：以粘粒為基礎(chǔ)構(gòu)建重組單純皰疹病毒及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以粘粒為基礎(chǔ)構(gòu)建重組單純皰疹病毒的簡便而高效的方法，及用這種方法構(gòu)建的重組單純皰疹病毒HSV1-lacZ100及其用途。
構(gòu)建有感染性的單純皰疹病毒載體的策略有二無需輔助病毒的重組型病毒策略和依賴于輔助病毒的“微”(“mini”)病毒策略。前者是基于對整個病毒基因組的操作，將目的基因插入病毒基因組中，構(gòu)建成重組病毒型單純皰疹病毒；后者基于對復(fù)制及包裝成感染性病毒顆粒所必需的病毒最基本順式元件的認(rèn)識和應(yīng)用，構(gòu)建成重組質(zhì)粒型單純皰疹病毒載體?？梢园押笳呖闯墒乔罢叩囊环N極端的例子。
由于單純皰疹病毒基因組十分龐大(約152kb)，因而難以通過對基因組進(jìn)行直接操作而插入外源基因。至今構(gòu)建重組HSV病毒的最常見方法有2種1)將外源基因表達(dá)單位插入克隆于質(zhì)粒中的HSV胸苷激酶基因(HSV tk)中，用此質(zhì)粒與HSV-1基因組DNA共轉(zhuǎn)染敏感細(xì)胞(如vero或BHK細(xì)胞)，利用外源基因表達(dá)單位兩側(cè)的tk基因序列與HSV-1DNA中的相應(yīng)序列發(fā)生同源重組而產(chǎn)生重組HSV病毒。利用tk基因的負(fù)篩選作用(如用核苷類似物ganciclovir)篩選重組病毒。這種方法獲得的重組HSV病毒中，外源基因表達(dá)單位插在tk基因中。2)克隆HSV-1基因組中的其它基因片段，在其中插入報告基因如lacZ基因表達(dá)單位，與HSV-1基因組DNA在細(xì)胞中進(jìn)行同源重組產(chǎn)生重組HSV病毒。利用報告基因產(chǎn)物的呈色反應(yīng)挑選出重組病毒。
以上兩種方法都存在重組率低、背景高(即產(chǎn)生野生型病毒多)的缺點，導(dǎo)致重組病毒的篩選效率低并且過程繁瑣。
本發(fā)明的目的是建立一種高效而快速獲得重組HSV病毒的新方法。為此設(shè)計了一種利用含有HSV-117株全基因組的粘粒來構(gòu)建重組HSV病毒的策略。本發(fā)明的優(yōu)點在于，將HSV-1龐大的基因組“化大為小”，實現(xiàn)了HSV基因組的可操作性；不需要與野生型HSV-1基因組DNA共轉(zhuǎn)染，從而降低了背景，理論上獲得含有外源基因的重組病毒的概率應(yīng)達(dá)到或接近100％。用該方法我們成功地獲得了能表達(dá)lacZ基因的重組單純皰疹病毒HSV1-lacZ100，實際重組概率在50％以上。
本發(fā)明的HSV1-lacZ100重組病毒的特征是在HSV-117株病毒基因組的UL44基因的XbaⅠ位點中插入了長約4.3kb的lacZ基因表達(dá)單位CMV-lacZ-polyA。
用于本發(fā)明的原始材料有以下幾種Set C粘粒包含cos6,cos28,cos14,cos56,cos48共5個粘粒。這套粘粒為Davison AJ.提供(Conningham C,Davision AJ.A cosmid-based system for constructing mutants of herpes simplexvirus type l.Virology,1993,197:116-124)。tgCMV-HyTK:(Lupton SD.,Brunton,LL.,Kalberg VA. and Overell RW.Dominant positiveand negative selection using a hygromycin phosphotransferase-thymidine kinase fusion gene.Mol.Cell Biol.1991,11:3374-3378)pSV-β-Gallactosidase:Promega公司，#E1081
本發(fā)明的HSV-lacZ100的構(gòu)建過程如下1．pCMV-lacZ-polyA質(zhì)粒的構(gòu)建polyA片段，插入pCMV-HyTK質(zhì)粒(用HindⅢ和BamHⅠ切去154bp的polyA)的相應(yīng)位點中構(gòu)成中間質(zhì)粒pCMV-HyTK-laeZ-polyA；再用NheⅠ和HindⅢ雙酶切該中間質(zhì)粒以去除2.1kb的HyTK基因，補平末端后自連構(gòu)成pCMV-lacZ1；用XhoⅠ和BamHⅠ切該質(zhì)粒，末端補平后加XbaⅠlinker(8mer)，經(jīng)XbaⅠ酶切后相連，構(gòu)建成pCMV-lacZ-polyA。用XbaⅠ酶切可將4.5kb的CMV-lacZ-polyA表達(dá)盒切出。含有該質(zhì)粒的菌種命名為E.coli DH5 α/pCMV-lacZ-polyA。2．cos56-1acZ的構(gòu)建將兩端加有XbaⅠ位點的CMV-lacZ-polyA片段插入cos56的XbaⅠ位點中，構(gòu)建成cos56-lacZ。利用粘粒cos56中的HSV-1片段在UL44基因中含有單一XbaⅠ酶切位點的特點，將上述4.5kb的CMV-lacZ-polyA片段與用XbaⅠ線性化的cos56相連，轉(zhuǎn)化MAX Efficiency DH5α(GIBCO BRL公司產(chǎn)品)感受態(tài)菌，涂布于含有X-gal及IPTG的amp+平板上，挑取蘭色菌落提取重組質(zhì)粒，用XbaⅠ酶切鑒定。XbaⅠ酶切鑒定結(jié)果表明4.5kb的CMV-lacZ-polyA片段已成功地插入到cos56的XbaⅠ位點中(插入方向未鑒定)。該位點位于HSV-1 UL44基因中，該基因編碼HSV-1糖蛋白C(gC)，對于HSV-1在培養(yǎng)細(xì)胞中的感染和產(chǎn)毒性復(fù)制不是必需的。3．5個粘粒共轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞將cos6,cos28,cos14,cos56-lacZ,cos48等量混合，用PacⅠ(Biolab)酶切過夜，依次用酚、酚/氯仿及氯仿抽提，乙醇沉淀DNA,12000rpm離心10分鐘，棄盡上清，將DNA沉淀溶于適量無菌TE液中，使總DNA濃度達(dá)到約1μg/μl。取10μl上述DNA溶液及20μllipofectamine(Gibco BRL)按產(chǎn)品說明書轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞(2×106),24h后換成含2％胎牛血清的1640液37℃培養(yǎng)。2-3天后，在光鏡下可觀察到噬斑出現(xiàn)并隨時間而增大增多。5天后，80％以上的細(xì)胞病變(變大變圓)。將此時的細(xì)胞連同培養(yǎng)液一起于-20℃和37℃反復(fù)凍融3次，1500rpm離心10分鐘，取0.1ml上清(其余分裝保存于-20℃?zhèn)溆?用于感染80％鋪滿的BHK細(xì)胞(約2×106),24小時后用X-gal染色液染色30-60分鐘，光鏡下觀察到大量藍(lán)色噬斑。表明成功地獲得了攜帶并表達(dá)lacZ基因的重組單純皰疹病毒。4．HSV1-lacZ病毒的純化用上述病毒上清經(jīng)適當(dāng)稀釋后感染BHK細(xì)胞，36h后挑取的彼此分離良好的12個噬斑接種于12孔板的BHK細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，3d后分別保留各孔上清。用X-gal液染色細(xì)胞。在12個噬斑中，藍(lán)染的有7個，未被藍(lán)染的5個。取藍(lán)染的第12孔相應(yīng)上清，再進(jìn)行一次空斑純化后大量擴(kuò)增。
本發(fā)明的HSV1-lacZ100病毒可用于1)作為研究神經(jīng)傳導(dǎo)的示蹤劑；2)作為抗單純皰疹病毒藥物及其它抗病毒藥物的靶病毒；3)作為HSV1擴(kuò)增子載體研究中的輔助病毒以更靈敏地監(jiān)測輔助病毒滴度變化。
本發(fā)明的cos56-lacZ粘?？杀４嬗贛AX Efficiency DH5α(GIBCO BRL公司產(chǎn)品)株中。含cos56-lacZ粘粒的菌株命名為MAX Efficiency DH5α/cos56-lacZ，在含50-100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(1％tryptone,0.5％yeast extract,1％NaCl)傳代培養(yǎng)。
本發(fā)明的HSV1-lacZ100病毒可在BHK細(xì)胞或其它敏感細(xì)胞中傳代培養(yǎng)。含有HSV1-lacZ100病毒的培養(yǎng)液或細(xì)胞反復(fù)凍融后的裂解液上清均可保存于-20℃至-70℃。含有HSVl-lacZ100病毒的培養(yǎng)上清已于1998年4月30日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會微生物中心，登記入冊的編號為0348以下實施例對本發(fā)明的HSV1-lacZ100的制備和用途作了詳細(xì)說明，但不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。實施例1HSV1-lacZ100病毒的滴度測定在6孔板中接種1×106/孔BHK細(xì)胞，37℃培養(yǎng)24h。換液，每孔加1ml培養(yǎng)液。在第1孔中加入100μl上述上清液，混勻后取100μl加入第2孔中，再取出100μl加入第3孔中，依次進(jìn)行1∶10稀釋。37℃培養(yǎng)3小時后，棄去各孔中培養(yǎng)液，加覆蓋液(含有1.5％甲基纖維素及2％胎牛血清的Eagle’s培養(yǎng)液)5ml/孔，37℃培養(yǎng)3天。棄去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液洗細(xì)胞3次，用含2％甲醛和0.2％戊二醛的PBS緩沖液于4℃固定細(xì)胞5分鐘后用PBS緩沖液洗1次，加X-gal染色液(含1mg/ml X-gal,5mmol/L鐵氰化鉀，5mmol/L亞鐵氰化鉀，2mmol/L MgCl2的PBS緩沖液)覆蓋細(xì)胞。30-60分鐘后觀察并計數(shù)藍(lán)斑數(shù)。計數(shù)第5孔及第6孔藍(lán)斑數(shù)分別為20和4個(1至4孔中藍(lán)斑均過密，難以計數(shù))。由此計算HSV1-lacZ的滴度為2-4×106pfu/ml。實施例2HSV1-lacZ100病毒的傳代將經(jīng)2次空斑純化的HSVl-lacZ100連續(xù)在BHK細(xì)胞上傳5代，檢測該重組病毒感染的藍(lán)斑率仍為100％，表明獲得的HSV-lacZ100病毒可穩(wěn)定傳代。實施例3HSVl-lacZ100病毒感染其它細(xì)胞用HSVl-lacZ100病毒(moi=0.1～1)感染培養(yǎng)的Vero細(xì)胞，HeLa細(xì)胞，Wish細(xì)胞，A549細(xì)胞，37℃培養(yǎng)24h后用X-gal檢測，均可觀察到大量藍(lán)染的細(xì)胞。說明該病毒在體外對多種細(xì)胞具有感染性，并表達(dá)lacZ基因。實施例4用HSV1-lacZ100初步檢測V-H+ATP酶抑制劑ConA的抗病毒作用V-H+ATP酶抑制劑ConA由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)所病毒室研制和提供。該制劑濃度為625umol/L(50％DMSO中)。本實驗用HSV1-lacZ100病毒感染BHK細(xì)胞為模型，初步觀察了ConA的抗單純皰疹病毒作用。
在6孔板中等量接種BHK細(xì)胞，27℃培養(yǎng)過夜，使用前細(xì)胞約80％鋪滿。用1640完全培養(yǎng)液(含10％FBS)將ConA分別稀釋至終濃度為5umol/L,1umol/L,200nmol/L,40nmol/L,8nmol/L。棄去培養(yǎng)液，1,2,3,4,5孔依次加入上述濃度的ConA液2ml，第6孔加不含ConA的培養(yǎng)液。37℃培養(yǎng)2h。每孔加入100ul HSV1-lacZ100病毒液(約106pfu/ml),37℃培養(yǎng)24h。棄去培養(yǎng)液，用PBS液洗細(xì)胞3次，加固定液(2％甲醛，0.2％戊二醛，PBS液中)于4℃固定5min，棄去固定液，用PBS液洗一次。加X-gal溶液(5mmol/L鐵氰化鉀，5mmol/L亞鐵氰化鉀，2mmol/L MgCl2,X-gal 1mg/ml)37℃覆蓋1h。肉眼觀察見第5孔和第6孔出現(xiàn)密集的藍(lán)斑，而1,2,3,4孔均不明顯。在倒置顯微鏡下觀察，見第5孔和第6孔中細(xì)胞成片藍(lán)染，而1,2,3,4孔中細(xì)胞多為單個細(xì)胞藍(lán)染。該結(jié)果提示濃度40nmmol/L至5umol/L的ConA可明顯抑制HSV1病毒的復(fù)制，濃度為8nmol/L的ConA已基本沒有抑制作用。結(jié)果表明ConA對病毒的產(chǎn)毒性復(fù)制有明顯的抑制作用，其作用機(jī)理正在研究中。
用HSVl-lacZ100代替野生型HSV-1研究藥物的抗病毒作用的特點是，可通過lacZ基因表達(dá)產(chǎn)物的顯色反應(yīng)使結(jié)果觀察和判斷更敏感和客觀。
權(quán)利要求
1．一種用于產(chǎn)生重組單純皰疹病毒的方法，由以下步驟組成(1)SetC為一套含有HSV117株全基因組DNA的5個重組粘粒。由cos6,cos28,cos14,cos56及cos48組成。(2)將外源基因X表達(dá)盒DNA片段的兩端加XbaⅠ接頭，插入重組粘粒cos56的單一XbaⅠ位點中構(gòu)成cos56-X。將cos6,cos28,cos14,cos56-X及cos48 5個粘粒的組合命名為Set X。(3)將Set X(5個粘粒摩爾量相等)DNA經(jīng)PacⅠ酶切后，用脂質(zhì)體方法共轉(zhuǎn)染HSV敏感細(xì)胞，被導(dǎo)入的5個片段在細(xì)胞中發(fā)生同源重組而生成重組病毒HSV1-X毒種。(4)將得到的毒種進(jìn)行空斑篩選和純化，獲得重組病毒HSV1-X.。
2．根據(jù)權(quán)利要求1，將外源基因表達(dá)盒插入cos6的XbaⅠ位點中，與其余4個粘?；蚱涓臉?gòu)體組合共轉(zhuǎn)染細(xì)胞而產(chǎn)生的重組HSV病毒。
3．構(gòu)建了含有CMV-lacZ-polyA表達(dá)盒的重組質(zhì)粒pCMV-lacZ-polyA。其中CMV為人巨細(xì)胞病毒的立早啟動子，lacZ為大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因，polyA為SV40病毒小t抗原內(nèi)含子和加尾信號。用XbaⅠ酶切可將4.3kb的CMV-lacZ-polyA片段切出。
4．根據(jù)權(quán)利要求1和2，產(chǎn)生一種表達(dá)大腸桿菌β-半乳糖苷酶的重組單純皰疹病毒HSV1-lacZ100。由以下步驟組成(1)將大腸桿菌lacZ基因表達(dá)盒插入cos56中XbaⅠ位點構(gòu)建成cos56-CMV-lacZ-polyA。將重組粘粒cos6,cos28,cos14,cos48及cos56-CMV-lacZ-polyA 5個粘粒組合命名為Set-lacZ。(2)Set-lacZ DNA共轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，獲得表達(dá)大腸桿菌β-半乳糖苷酶的重組單純皰疹病毒HSV1-lacZ100毒種。(3)HSV1-lacZ100毒種經(jīng)空斑純化后在BHK細(xì)胞中可穩(wěn)定傳代及大量擴(kuò)增。
5．根據(jù)權(quán)利要求1,X可換成任何表達(dá)其它外源基因的DNA片段。
6．根據(jù)權(quán)利要求4,HSV1-lacZ100病毒可作為靶病毒用作篩選和評價抗單純皰疹病毒的藥物及其它廣譜抗病毒藥物。
7．根據(jù)權(quán)利要求4,HSV1-lacZ100病毒可用作動物體內(nèi)神經(jīng)傳導(dǎo)研究的示蹤劑。
8．根據(jù)權(quán)利要求3,cos56-CMV-lacZ-polyA可與cos6,cos28,cos14,cos48的改建體形成組合產(chǎn)生新的重組病毒，達(dá)到用大腸桿菌β-半乳糖苷酶的活性監(jiān)測新生成重組病毒的目的。
全文摘要
本發(fā)明敘述了一種以含有HSV1全基因組的5個粘粒(cos6,cos28,cos14,cos56,cos48)為基礎(chǔ)的簡便而高效地產(chǎn)生重組單純皰疹病毒的方法。將含有外源基因的粘粒與其余4個粘粒等摩爾混合,經(jīng)PacI酶切后共轉(zhuǎn)染對HSV－1感染敏感的細(xì)胞,通過5個HSV片段的同源重組而產(chǎn)生含有外源基因的重組單純皰疹病毒。依照這種方法,產(chǎn)生了能表達(dá)大腸桿菌lacZ基因的單純皰疹病毒HSV1－lacZ100。HSV1－lacZ100的用途有:1)作為研究神經(jīng)傳導(dǎo)的示蹤劑;2)作為抗單純皰疹病毒藥物及其它抗病毒藥物的靶病毒;3)作為HSV1擴(kuò)增子載體研究中的輔助病毒以更靈敏地監(jiān)測輔助病毒滴度變化。
文檔編號A61K39/245GK1234441SQ9810175
公開日1999年11月10日 申請日期1998年5月4日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月4日
發(fā)明者吳小兵, 伍志堅, 董小巖, 侯云德 申請人:病毒基因工程國家重點實驗室