一種重組單純皰疹病毒滴度的測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及病毒感染性的定量測定方法，更具體涉及到重組單純皰瘆病毒感染性的空斑形成單位定量定量測定法，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]病毒感染性的定量是確定單位體積的病毒溶液所包含的具有感染力的病毒的數(shù)量，病毒感染性定量無論是在學(xué)術(shù)研宄中還是在商業(yè)生物產(chǎn)品研發(fā)上都具有重要運(yùn)用價值，例如生產(chǎn)的病毒疫苗、用病毒載體表達(dá)的重組蛋白和病毒抗原等都需要運(yùn)用到病毒定量。目前病毒感染性定量方法主要有空斑實驗法、50%組織培養(yǎng)物感染劑量法、血凝集實驗法、酶聯(lián)免疫吸附測定法和實時熒光定量PCR方法等等。空斑實驗法是個傳統(tǒng)的經(jīng)典實驗方法，它是由噬菌斑定量法發(fā)展而來。空斑實驗法目前還是病毒定量方法中運(yùn)用最廣泛的一種方法，但由此方法又衍生發(fā)明出了很多空斑實驗方法，然后這些技術(shù)方法的基本原理都是通過測定病毒在單層貼壁細(xì)胞中繁殖感染形成的空斑的能力來確定病毒的滴度，定量時間周期較長，操作不夠簡便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明針對目前病毒感染性定量方法定量時間周期較長，操作不夠簡便之不足，而提供一種有關(guān)重組單純皰瘆病毒病毒滴度的測定方法。
[0004]本測定方法為:
1.在34.8 _直徑的塑料細(xì)胞培養(yǎng)皿或6孔板中傳代3 X 16個Vero細(xì)胞，每個孔加2 mL細(xì)胞生長液。
[0005]2.將傳代后的細(xì)胞培養(yǎng)皿放置在37°C含5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜，待細(xì)胞生長密度達(dá)到70-90%準(zhǔn)備接種病毒懸液。
[0006]3.將病毒在磷酸鹽緩沖液(PBS)中做10倍梯度稀釋，具體方法是準(zhǔn)備5管EP管，每管中加900 μ L PBS，編號I號，2號，3號，4號，5號。吸取100 μ L病毒存儲液，加入到I號EP管中，蓋上蓋子，渦旋混勻。再用新的槍頭吸取100 UL I號EP管中混合液，加入到2號EP管中，蓋上蓋子，渦旋混勻，依次操作，到5號EP管時得到的是10_5稀釋度的病毒液。做梯度稀釋時，每次都要換新槍頭，并且槍頭吸取病毒液后應(yīng)對著EP管內(nèi)壁懸空加，不要將槍頭伸入到PBS液面下加，因為槍頭外壁很容易粘上液滴，會造成誤差。
[0007]4.將Ve1細(xì)胞培養(yǎng)皿中的細(xì)胞生長液吸出扔棄，分別吸取各稀釋度的病毒液100μ L加入上單層Vero細(xì)胞中，槍頭吸取病毒液后往細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入時要緩慢，以免將細(xì)胞沖散。加入后要在平臺上將培養(yǎng)皿上下左右慢速晃動，以使病毒液覆蓋到全部細(xì)胞表面。
[0008]5.放入37°C含5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱I個小時，使病毒吸附進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。
[0009]6.將2%瓊脂糖溶液和病毒生長液分別加熱到42°C，取等體積的這兩種溶液混合，配成含1%瓊脂糖的病毒生長液。溫度合適的確定方法是瓶子放手上不燙，否則溫度過高會殺死細(xì)胞。迅速將達(dá)到42°C的瓊脂糖病毒生長液加入到細(xì)胞表面，輕輕晃動鋪勻，這樣可以阻止病毒顆粒從細(xì)胞中出來后通過培養(yǎng)基擴(kuò)散而導(dǎo)致空斑蔓延，超凈工作臺上靜置I分鐘待瓊脂糖凝固。
[0010]7.再將培養(yǎng)皿放入5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱，將培養(yǎng)箱溫度調(diào)到35 °C，放置2天。
[0011]8.將細(xì)胞培養(yǎng)皿放置在倒置顯微鏡下，選取長了 20-200個空斑的培養(yǎng)皿計算空斑數(shù)量，長得太多或太少的都不用計數(shù)，然后計算每毫升空斑數(shù)(PFU)，取平均值。病毒滴度計算公式如下:
PFU/mL=空斑數(shù)量X 1X稀釋倍數(shù)
例如在10_5稀釋度的細(xì)胞培養(yǎng)皿里長的了 20個空斑，那么病毒滴度就是:PFU/mL=20X 10X 105=2X 1079.試劑溶液配方:
磷酸鹽緩沖液(PBS):
1.4 mM KH2PO48 mM Na2HPO4140 mM NaCl
2.7 mM KCl,pH 7.3細(xì)胞生長液:
5OOmL MEM Medium100U/mL青霉素lOOPg/mL鏈霉素)
10% Fetal bovine serum瓊脂糖溶液:
2g瓊脂粉 10mL雙蒸水病毒生長液:
5OOmL MEM Medium100U/mL青霉素lOOPg/mL鏈霉素)
0.2%牛血清白蛋白組分V 25mM HEPES緩沖液 2Pg/mLTPCK-胰酶
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明不需要染色就可以確定病毒滴度的空斑實驗法，使對重組單純皰瘆病毒滴度的定量時間周期短，操作簡便，重復(fù)性好、材料設(shè)備要求低，可以在廣大實驗室和生產(chǎn)研發(fā)單位推廣使用。
[0012]
【附圖說明】
[0013]附圖1:重組單純皰瘆病毒病毒滴度測定方法的流程圖附圖2:感染mtHSV兩天后的Vero細(xì)胞附圖3:感染mtHSV兩天后的Vero細(xì)胞
【具體實施方式】
[0014]實施例1:
1.在34.8 mm直徑的塑料細(xì)胞培養(yǎng)皿中傳代3 X 16個Vero細(xì)胞，加2 mL細(xì)胞生長液。
[0015]2.將傳代后的細(xì)胞培養(yǎng)皿放置在37°C含5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜，待細(xì)胞生長密度達(dá)到80%準(zhǔn)備接種病毒懸液。
[0016]3.制備 Kr1，1(Γ2，Kr3, 10-4，I(Γ5稀釋度病毒接種液各 1000 μ L。
[0017]4.將Vero細(xì)胞培養(yǎng)皿中的細(xì)胞生長液吸出扔棄，吸10_5稀釋度病毒液100 μ L加入上單層Vero細(xì)胞中，輕輕晃動混勾。
[0018]5.放入37°C含5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱I個小時。
[0019]6.加入含1%瓊脂糖的細(xì)胞培養(yǎng)液溶液，輕輕晃動鋪勻，超凈工作臺上靜置2分鐘待瓊脂糖凝固。
[0020]7.再將培養(yǎng)皿放入5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱，將培養(yǎng)箱溫度調(diào)到35 °C，放置2天。
[0021]8.在倒置顯微鏡下，10_5稀釋度的孔長了 20多個空斑，拍攝照片如附圖2所示，空斑計數(shù)達(dá)到22個，根據(jù)公式得到病毒原液滴度為
PFU/mL=2.2 X 10 X 105=2.8 X 1(Γ7 實施例2:
1.在34.8 mm直徑的塑料細(xì)胞培養(yǎng)皿中傳代3 X 16個Vero細(xì)胞，加2 mL細(xì)胞生長液。
[0022]2.將傳代后的細(xì)胞培養(yǎng)皿放置在37°C含5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜，待細(xì)胞生長密度達(dá)到75%準(zhǔn)備接種病毒懸液。
[0023]3.制備 ΙΟ' 1(Γ2，ΙΟ' 1(Γ4，1(Γ5稀釋度病毒接種液各 1000 μ L。
[0024]4.將Vero細(xì)胞培養(yǎng)皿中的細(xì)胞生長液吸出扔棄，吸10_5稀釋度病毒液100 μ L加入上單層Vero細(xì)胞中，輕輕晃動混勾。
[0025]5.放入37°C含5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱I個小時。
[0026]6.加入含1%瓊脂糖的細(xì)胞培養(yǎng)液溶液，輕輕晃動鋪勻，超凈工作臺上靜置2分鐘待瓊脂糖凝固。
[0027]7.再將培養(yǎng)皿放入5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱，將培養(yǎng)箱溫度調(diào)到35 °C，放置2天。
[0028]8.在倒置顯微鏡下，10_5稀釋度的孔長了 20多個空斑，拍攝照片如附圖3所示，空斑計數(shù)達(dá)到25個，根據(jù)公式得到病毒原液滴度為:
PFU/mL=2.5X 1X 105=2.8X10'
【主權(quán)項】
1.一種重組單純皰瘆病毒滴度的測定方法，其特征在該方法包括如下步驟: (I).在6孔板中的每個孔中加入細(xì)胞生長液，將傳代病毒敏感細(xì)胞Vero加至到6孔板的孔中，待細(xì)胞密度達(dá)到70-90% ； (II).將病毒在磷酸鹽緩沖液中稀釋，制備?ο—1，?ο-2, ?ο-3, ?ο-4,10_5稀釋度病毒接種液各 100yL ； (III).放置于培養(yǎng)箱0.8-1.2小時，再加入含0.8-1.2% Agarose的病毒生長液，鋪勻待凝固，放入培養(yǎng)箱2天； (IV).選取長有20-200個空斑的孔皿進(jìn)行空斑計數(shù)，通過公式得到原始病毒溶液感染滴度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(I)中用到的是孔徑為38.5mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿或者細(xì)胞培養(yǎng)6孔板。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟(I)中Ve1細(xì)胞生長密度達(dá)到.70-90%適合接種病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于做病毒梯度稀釋時關(guān)鍵點(diǎn)是需要更換槍頭O
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(III)中瓊脂糖的終濃度為0.8-1.2%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(III)中2%瓊脂糖溶液和病毒生長液要加熱到41-43°Co
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，2%瓊脂糖溶液和病毒生長液是做等體積混合配成使用液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(IV)中適合于做病毒滴度定量的培養(yǎng)皿孔為長了 20-200個空斑的培養(yǎng)皿孔。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(I)中，將傳代病毒敏感細(xì)胞Vero加至到6孔板的孔中，放入36-38°C含5%0)2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中24-26個小時，待細(xì)胞密度達(dá)到70-90% ;步驟(III)中，放置于培養(yǎng)箱0.8-1.2小時，再加入含0.8-1.2% Agarose的病毒生長液，鋪勻待凝固，再將培養(yǎng)皿放入4.8-5.2% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱溫度調(diào)到.34-36°C，放置 1.5-2.5 天。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于本發(fā)明所涉及到的試劑溶液配方如下: 磷酸鹽緩沖液:.1.4 mM KH2PO4.8 mM Na2HPO4 . 140 mM NaCl . 2.7 mM KCl,pH 7.3 ； 細(xì)胞生長液: . 500mL MEM Medium . 100U/mL青霉素.lOOgg/mL鏈霉素.10% Fetal bovine serum瓊脂糖溶液:.2g瓊脂粉.10mL雙蒸水；病毒生長液:.5OOmL MEM Medium.100U/mL青霉素.lOOPg/mL鏈霉素.0.2%牛血清白蛋白組分.25mM HEPES緩沖液.2Pg/mLTPCK-胰酶。
【專利摘要】一種重組單純皰疹病毒滴度的測定方法，包括如下步驟：在6孔板中的每個孔中加入細(xì)胞生長液，將病毒在磷酸鹽緩沖液中稀釋，放置于培養(yǎng)箱0.8-1.2小時，再加入含0.8-1.2%Agarose的病毒生長液；選取長有20-200個空斑的孔皿進(jìn)行空斑計數(shù)，通過公式得到原始病毒溶液感染滴度。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明不需要染色就可以確定病毒滴度的空斑實驗法，使對重組單純皰疹病毒滴度的定量時間周期短，操作簡便，重復(fù)性好、材料設(shè)備要求低，可以在廣大實驗室和生產(chǎn)研發(fā)單位推廣使用。
【IPC分類】C12Q1-70, C12R1-93
【公開號】CN104846120
【申請?zhí)枴緾N201510183396
【發(fā)明人】劉為勇, 王濤
【申請人】湖北創(chuàng)瑞生物科技有限公司
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年4月18日