專利名稱：?jiǎn)渭儼捳畈《劲蛐虸gM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型是涉及生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種以膠體金免疫層析法快速檢測(cè)單純皰疹病毒II型IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙
背景技術(shù)：
單純皰疹病毒(herpes simplex virus, HSV)能引起人類多種疾病，如齦口炎 (gingivostomatitis)、角膜結(jié)膜炎(keratoconjunctivitis)、腦炎(encephalitis)以及生殖系統(tǒng)感染和新生兒的感染。在感染宿主后，常在神經(jīng)細(xì)胞中建立潛伏感染，激活后又會(huì)出現(xiàn)無(wú)癥狀的排毒，在人群中維持傳播鏈，周而復(fù)始的循環(huán)。人群中HSV感染非常普遍，感染率約為80 90%，病人和健康帶毒者是傳染源。單純皰疹病毒分為I型和II型，其感染途徑主要通過(guò)分泌物和與易感染的人密切接觸有關(guān)。II型病毒多感染腰以下部位，引起生殖器皰疹，它主要通過(guò)性生活傳播，并可能與宮頸癌有關(guān)。孕婦在妊娠期間感染了 HSV，可引起胎兒先天性感染。新生兒(小于7周齡) 感染HSV后可能會(huì)引起廣泛的內(nèi)臟感染和中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，死亡率較高。而新生兒感染的主要途徑是出生過(guò)程中接觸生殖道分泌物所致。為了減少胎兒和新生兒的感染，妊娠婦女應(yīng)作HSV血清學(xué)檢查，盡量避免在HSV感染期間受孕或生產(chǎn)。目前對(duì)單純皰疹病毒II型檢測(cè)的主要方法是單純皰疹病毒II型特異性抗體檢測(cè)。 檢測(cè)單純皰疹病毒II型IgM判定是否為現(xiàn)癥感染，檢測(cè)IgG判定是否曾經(jīng)感染過(guò)。檢測(cè)兩種抗體有利于對(duì)被檢對(duì)象的進(jìn)行全面的判定，指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育。目前單純皰疹病毒II型抗體的檢測(cè)方法主要是ELISA等檢測(cè)方法。在膠體金的檢測(cè)方法中，有單獨(dú)檢測(cè)單純皰疹病毒 II型IgM或IgG的報(bào)道，但用膠體金類免疫層析技術(shù)同時(shí)檢測(cè)單純皰疹病毒II型IgM和IgG 抗體的檢測(cè)試紙尚未有相關(guān)報(bào)道。和用兩種試劑分別檢測(cè)IgM和IgG抗體相比，同時(shí)檢測(cè) IgM和IgG抗體能減少檢測(cè)人員的工作量，節(jié)約成本；同時(shí)減少采血量，減少患者的痛苦。免疫層析膠體金技術(shù)是新型的診斷技術(shù)，在抗體檢測(cè)方面已得到較為廣泛運(yùn)用， 基本原理如下利用膠體金標(biāo)記一種抗原或抗體，在試劑的NC膜上包被相應(yīng)的配對(duì)抗原或抗體，檢測(cè)時(shí)當(dāng)樣品中含相應(yīng)的特異性抗體或抗原時(shí)，膠體金標(biāo)記顆粒和樣品中配體相結(jié)合形成復(fù)合物，然后在NC膜上層析，再被包被抗原或抗體捕獲，形成肉眼可見(jiàn)的檢測(cè)T線， 通過(guò)檢測(cè)線的有無(wú)實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)果的判定。具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是提供一種單純皰疹病毒II型IgM和IgG抗體檢測(cè)試紙，具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)用新型提供一種單純皰疹病毒II型IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙，其特征在于塑料支撐板(8) —端粘貼上樣墊(1)，上樣墊(1)的一端緊密壓接含有標(biāo)記單純皰疹病毒 II型特異性的抗原gG-2的膠體金墊0)，膠體金墊(2) —端緊密壓接硝酸纖維素NC膜(3)，硝酸纖維素膜包被有相互分離的檢測(cè)線Tl (5)、檢測(cè)線T2 (6)和質(zhì)控C線，檢測(cè)線Tl (5)為抗人IgM抗體，檢測(cè)線T2 (6)為抗人IgG抗體，質(zhì)控C線(7)為抗單純皰疹病毒II型gG_2 抗體，硝酸纖維素膜的另一端連接吸樣墊(4)形成試紙。所述的單純皰疹病毒II型IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙，其特征在于所述的抗原為單純皰疹病毒II型特異性的抗原gG-2，抗原可以利用基因工程重組表達(dá)。所述的單純皰疹病毒II型IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙，其特征在于所述的上樣墊(1)為玻璃纖維膜或無(wú)紡布，吸樣墊由吸水濾紙構(gòu)成。所述的單純皰疹病毒II型IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙，所述的抗原的包被方法為以0. OlM PH 7. 2磷酸鹽緩沖液(PBS)將抗人IgM抗體配制成l-ang/ml的溶液，以0. OlM PH 7. 2磷酸鹽緩沖液(PBS)將抗人IgG抗體配制成l-2mg/ml的溶液，用噴膜儀在NC膜下部以1-1. 5ul/cm的參數(shù)進(jìn)行劃線，包被Tl、T2線，同時(shí)在NC膜上部包被抗單純皰疹病毒 II型gG-2抗原抗體作為C線，劃線后將NC膜在干燥間，溫度20-25°C，濕度小于40%，干燥 3-5小時(shí)。所述的單純皰疹病毒II型IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙，所述的抗原標(biāo)記膠體金顆粒的方法為以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑為20 — 40nm的膠體金溶液，制備完成后取IOOml膠體金液放在燒杯內(nèi)，用0. 2MK2C03調(diào)至pH7. 5，按IOOml膠體金溶液加入0. 5-2mg單純皰疹病毒II型gG-2抗原，室溫?cái)嚢?小時(shí)，加入1 %牛血清白蛋白BSA， 1 %聚乙二醇PEG20000封閉20min，10000r/m離心20分鐘，棄上清，用膠體金工作液復(fù)溶至100ml，按Iml溶液鋪20cm2的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無(wú)紡布上，再置干燥間，溫度 20-250C，濕度小于40%，干燥3-5小時(shí)，制成膠體金墊。所述的單純皰疹病毒II型IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙，所述的試紙的裝配方法為在干燥室內(nèi)，溫度20-25 °C，濕度小于40 %，取塑料支撐板板，將已包被的NC膜放置在塑料支撐板的中部粘貼，在NC膜T線一側(cè)搭接膠體金墊(搭膠體金墊的1/ 粘貼，在膠體金墊另一側(cè)搭接粘貼上樣墊，搭膠體金墊的1/5 ；在NC膜C線一側(cè)搭接吸樣墊，搭吸樣墊的 1/10 ；最后用裁剪機(jī)將貼好塑料板切成2-5mm寬的試紙條，切好的試紙條可以再裝入塑料卡內(nèi)，形成檢測(cè)卡。所述的單純皰疹病毒II型IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙，檢測(cè)方法為將被檢血清或血漿平衡至溫室，將試紙條或試劑卡平放，在上樣墊上加入5-20ul被檢樣品，再加入 50-100ul的樣品稀釋液，使膠體金溶解并在NC膜上層析，然后用肉眼直接觀察在15分鐘內(nèi) C、Tl、T2線的出現(xiàn)情況，并判定檢測(cè)結(jié)果。本實(shí)用新型的有益效果是提供一種利用免疫層析膠體金技術(shù)檢測(cè)單純皰疹病毒 II型IgM和IgG抗體的新型試紙。采用膠體金標(biāo)記單純皰疹病毒II型特異性抗原，包被抗人IgM和IgG抗體實(shí)現(xiàn)對(duì)血液中抗單純皰疹病毒II型抗體的檢測(cè)，一次檢測(cè)獲得兩種檢測(cè)指標(biāo)，節(jié)約時(shí)間和成本，減輕患者的痛苦。具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。

圖1是單純皰疹病毒II型IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙結(jié)構(gòu)示意圖。附圖符號(hào)說(shuō)明[0017]1 上樣墊；2 膠體金墊；3 =NC膜；4 吸樣墊5 檢測(cè)線Tl ；6 檢測(cè)線T2 ；7 質(zhì)控C線；8 塑料支撐板
具體實(shí)施方式
實(shí)施例制備單純皰疹病毒II型IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙1主要材料1. 1單純皰疹病毒II型特異性gG-2抗原、gG-2抗體深圳市菲鵬生物股份有限公司，為重組抗原，gG-2抗原用于膠體金標(biāo)記，gG-2抗體用于NC膜質(zhì)控線包被；鼠抗人IgM 和IgG抗體=Arista公司產(chǎn)品，用于NC膜包被；氯金酸=Sigma公司產(chǎn)品；硝酸纖維素(NC) 膜=Millipore公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白=Sigma產(chǎn)品。其它常用試劑均為分析純?cè)噭?. 2臨床血清由公司在相關(guān)醫(yī)院獲得，其中單純皰疹病毒II型IgG抗體陽(yáng)性樣本 75份，IgM抗體陽(yáng)性樣本10份，其中包括兩種抗體均陽(yáng)性樣本5份。兩種抗體全為陰性正常人樣本50份。1. 3單純皰疹病毒II型IgM抗體檢測(cè)試劑盒(ELISA法)，單純皰疹病毒II型IgG 抗體檢測(cè)試劑盒(ELISA法)國(guó)內(nèi)已注冊(cè)的商用產(chǎn)品。2 方法2. 1單純皰疹病毒II型gG-2重組抗原的膠體金標(biāo)記氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑為40nm的膠體金溶液，制備完成后取三份膠體金，分別用0. 2M K2CO3將溶液調(diào)到pH6. 5、pH7. 5和pH8. 5。然后將溶液置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，按每IOOml溶液加入 0. 5mg、lmg、l. 5mg將重組抗原將蛋白緩慢滴加到膠體金溶液中，繼續(xù)攪拌2小時(shí)，再滴加入到終濃度為0. 1 %的PEG2000和1 %的BSA進(jìn)行封閉20min,標(biāo)記結(jié)束后以10000r/m離心， 棄上清，沉淀按原體積復(fù)溶至不同配比的膠體金工作液硼酸鹽緩沖液，PH8. 5，含BSA、羊血清，蔗糖和表面活性劑中。然后將標(biāo)記膠體金溶液按Iml溶液鋪20cm2的比例加樣于無(wú)紡布上，在溫度20-25°C，相對(duì)濕度在< 40%的干燥間干燥3-5小時(shí)，制成膠體金墊。2. 2NC膜包被用 0. OlM pH7. 2PBS將鼠抗人 IgM分別稀釋成0. 5mg/mlUmg/ml,2mg/ ml,鼠抗人IgG分別稀釋成0. 5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml，然后用噴膜儀在NC膜下部按lul/cm 進(jìn)行分別劃線包被，同時(shí)在NC膜上部包被抗gG-2抗體，用于產(chǎn)品的質(zhì)控，包被完成后將NC 膜在在溫度20-25°C，相對(duì)濕度在< 40%的干燥間干燥3-5小時(shí)。2. 3單純皰疹病毒II型IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙的組裝在干燥室內(nèi)(溫度 20-25°C，相對(duì)濕度< 40% )取塑料支撐板，將已包被的NC膜放置在塑料支撐板的中部粘貼，在NC膜T線一側(cè)搭接膠體金墊(搭膠體金墊的1/ 粘貼，在膠體金墊另一側(cè)搭接粘貼上樣墊(搭膠體金墊的1/5)；在NC膜C線一側(cè)搭接吸樣墊(搭吸樣墊的1/10)；然后用裁剪機(jī)將貼好塑料板切成3mm或4mm寬的試紙條。切好的試紙條可以再裝入塑料卡內(nèi)，形成單純皰疹病毒II型IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑卡。2. 4檢測(cè)方法將被檢血清或血漿平衡至溫室，將制備好的試紙條或試劑卡平放，在上樣墊上加入IOul被檢樣品，若樣品中含抗單純皰疹病毒II型IgM或IgG抗體，則和樣品墊上的標(biāo)記gG-2抗原的膠體金結(jié)合，形成復(fù)合物，并擴(kuò)散到NC膜上進(jìn)一步層析，當(dāng)遇到包被在NC膜上Tl線處的鼠抗人IgM時(shí)，復(fù)合物則又和包被抗IgM抗體結(jié)合，被捕獲在包被處；當(dāng)遇到包被在NC膜上T2線處IgG時(shí)，復(fù)合物則又和包被抗體結(jié)合，被捕獲在包被線T2處； 當(dāng)被捕獲的膠體金復(fù)合物達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，則形成一條肉眼可見(jiàn)的Tl或T2線；若血清中不含特異性抗體，則不能形成免疫復(fù)合物，亦不能形成T線，C線作為試劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，陽(yáng)性和陰性樣品檢測(cè)時(shí)均會(huì)出現(xiàn)。用肉眼直接觀察在5、10、15、20、和30分鐘內(nèi)C、T線的出現(xiàn)情況，并判定檢測(cè)結(jié)果。2. 5試紙工藝參數(shù)調(diào)試將濃度不同標(biāo)記、包被的試劑進(jìn)行組合配對(duì)，制備小樣，利用質(zhì)控血清對(duì)試劑進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)最佳組合。2. 6臨床血清檢測(cè)用本試劑按檢測(cè)方法對(duì)所有臨床血清進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用商用檢測(cè)ELISA試劑進(jìn)行對(duì)照檢測(cè)。3 結(jié)果3. 1試紙參數(shù)確定根據(jù)小樣的檢測(cè)結(jié)果，確定了試紙的最佳標(biāo)記pH值為7. 5 ；重組混合抗原的最佳標(biāo)記量為lmg/100ml膠體金溶液；最佳的膠體金工作液為IOmM硼酸酸鹽緩沖液，PH8. 5，含0. 5% 85八、10%羊血清，2%蔗糖，0. 2% Tween 20 ；最佳包鼠抗人IgM和IgG 包被濃度均為lmg/ml。檢測(cè)結(jié)果的最佳判定時(shí)間為5-15分鐘。但以上參數(shù)在制備不同批次產(chǎn)品時(shí)可能需要適當(dāng)調(diào)整。3. 2臨床血清檢測(cè)以ELISA試劑為對(duì)照，對(duì)IgG抗體進(jìn)行檢測(cè)，本試劑IgG檢測(cè)出陽(yáng)性73份，ELISA檢測(cè)出IgG陽(yáng)性75份，靈敏度=73/75 = 97.3% ；本試劑IgG陰性樣本檢測(cè)均為陰性，相對(duì)特異性100%。P > 0. 05。以ELISA試劑為對(duì)照，對(duì)IgM抗體進(jìn)行檢測(cè)， 本試劑IgM檢測(cè)出陽(yáng)性9份，ELISA檢測(cè)出IgM陽(yáng)性10份，靈敏度=9/10 = 90.0% ；本試劑IgM陰性樣本檢測(cè)均為陰性，相對(duì)特異性100%。P > 0. 05。IgM和IgG同時(shí)為陽(yáng)性的樣本本試劑檢測(cè)和ELISA試劑完全一致。臨床檢測(cè)表明本試劑的性能和ELISA試劑相比無(wú)顯著性差異，適合用于臨床檢測(cè)。
權(quán)利要求1.一種單純皰疹病毒II型IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙，其特征在于塑料支撐板(8) 一端粘貼上樣墊(1)，上樣墊(1)的一端緊密壓接含有標(biāo)記單純皰疹病毒II型gG-2抗原的膠體金墊O)，膠體金墊( 一端緊密壓接硝酸纖維素NC膜(3)，硝酸纖維素膜包被有相互分離的檢測(cè)線Tl (5)、檢測(cè)線T2 (6)和質(zhì)控C線，檢測(cè)線Tl (5)為抗人IgM抗體，檢測(cè)線 T2(6)為抗人IgG抗體，質(zhì)控C線(7)為抗單純皰疹病毒II型gG-2抗體，硝酸纖維素膜的另一端連接吸樣墊(4)形成試紙。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單純皰疹病毒II型IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙，其特征在于所述的抗原為單純皰疹病毒II型特異性gG-2抗原，抗原可以利用基因工程重組表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單純皰疹病毒II型IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙，其特征在于所述的上樣墊(1)為玻璃纖維膜或無(wú)紡布，吸樣墊由吸水濾紙構(gòu)成。
專利摘要本實(shí)用新型公開(kāi)了一種單純皰疹病毒Ⅱ型IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙。特征在于塑料支撐板(8)一端粘貼上樣墊(1)，上樣墊(1)的一端緊密壓接含有標(biāo)記單純皰疹病毒Ⅱ型gG-2抗原的膠體金墊(2)，膠體金墊(2)一端緊密壓接硝酸纖維素NC膜(3)，硝酸纖維素膜包被有相互分離的檢測(cè)線T1(5)、檢測(cè)線T2(6)和質(zhì)控C線，檢測(cè)線T1(5)為抗人IgM抗體，檢測(cè)線T2(6)為抗人IgG抗體，質(zhì)控C線(7)為抗單純皰疹病毒Ⅱ型gG-2抗原的抗體，硝酸纖維素膜的另一端連接吸樣墊(4)形成試紙。檢測(cè)時(shí)將樣品加在上樣墊上，15分鐘內(nèi)肉眼直接觀察，判定檢測(cè)結(jié)果。具有操作簡(jiǎn)便、快速、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/571GK202182883SQ20112018608
公開(kāi)日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月3日
發(fā)明者劉寅, 岳曉燕, 張有青, 王晶, 羅云萍, 霍五奎, 馬雪明 申請(qǐng)人:正元盛邦(天津)生物科技有限公司