專利名稱：抗單純皰疹病毒－2感染的多表位dna疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新的抗HSV-2多表位DNA疫苗及應用背景技術(shù)單純皰疹病毒(HSV)感染是人類比較常見的感染性疾病.。HSV-1主要引起唇皰疹、齦口炎、腦炎、角膜結(jié)膜炎等非生殖器感染，而HSV-2引起生殖器感染。大多數(shù)生殖器皰疹由HSV-2引起，可呈慢性復發(fā)過程，目前尚未有根治的良藥。該病在全球的流行情況十分明顯，已占性病的10％左右，由HSV-2感染造成的公共衛(wèi)生問題促使人們研制可預防和控制感染的疫苗。有研究表明，DNA疫苗與常規(guī)的滅活苗、減毒苗、亞單位疫苗相比，DNA疫苗不僅可誘導產(chǎn)生特異性免疫球蛋白，且可同時激發(fā)機體的細胞免疫反應(尤其是CTL免疫)，對病毒感染性疾病等依賴細胞免疫清除病原的疾病預防更為有效。DNA疫苗另一個突出優(yōu)點是免疫原的單一性。只有編碼所需抗原的基因被導入細胞得到表達，載體本身沒有免疫原性。而重組活載體疫苗除目的基因的表達外，其本身還具有龐大而復雜的免疫原蛋白。DNA疫苗不僅可用于預防，而且可用于治療。
本發(fā)明從HSV入侵和繁殖的機理及整個生命周期過程角度出發(fā)，將HSV-2糖蛋白D、B、C基因(gD免疫原性較強、gB和gC與相應的受體結(jié)合能穩(wěn)定病毒在細胞表面的吸附)和即刻早期蛋白ICP27基因(該基因能啟動病毒DNA進入細胞后轉(zhuǎn)錄和表達)作為靶基因串連起來插入到pCDNA3.1，首次構(gòu)建了HSV-2新型多表位DNA疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能有效抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗及其制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)路線為，首先培養(yǎng)擴增HSV-2病毒，并抽提其基因組DNA，同時用生物信息學方法根據(jù)糖蛋白的免疫原性分析，選取所需的抗原表位，設(shè)計相應引物，然后用PCR方法分段擴增所需的目的基因，最后把六段基因連接起來先克隆到pGEM-T載體上，再酶切裝入pcDNA3.1，得到抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗(HV-pcDNA3.1質(zhì)粒)。
本發(fā)明提出的有效抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗，其組成如下將HSV-2病毒胞膜糖蛋白的強免疫原gD、gB、gC和參與病毒復制的即刻早期蛋白ICP27的主要抗原表位區(qū)域，以主要保護性抗原gD為中心，選定6段抗原基因加間隔序列AAY串連到真核表達載體pcDNA3.1，得到HV-pcDNA3.1質(zhì)粒；其中6段抗原基因為ICP27上第377～459氨基酸的一段抗原肽，gD上第1～77、第146～179、第223～306氨基酸的三段抗原肽，gB上第529～606氨基酸的一段抗原肽和gC上第247～282氨基酸的一段抗原肽。
本發(fā)明提出的抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗的制備方法，具體步驟如下1.設(shè)計引物根據(jù)靶抗原免疫原性分析，以人HSV-2全病毒基因組DNA為(SEQ ID NO.7)模板，設(shè)計6對引物(含酶切位點)，分別用于擴增三種包膜糖蛋白gD，gB和gC的主要免疫優(yōu)勢區(qū)段和ICP27片段，引物序列見表1所列表1.DNA疫苗引物序列表

2.抗原靶基因的分段克隆回收取HSV病毒裂解液，用Taqplus高保真DNA聚合酶分別對6段選定的抗原基因進行PCR擴增。這6段抗原基因分別為ICP27上第377～459氨基酸的一段抗原肽(SEQ ID NO.1)，gD上第1～77(SEQ ID NO.2)、第146～179(SEQ IDNO.3)、第223～306(SEQ ID NO.4)氨基酸的三段抗原肽，gB上第529～606(SEQ ID NO.5)氨基酸的一段抗原肽和gC上第247～282(SEQ ID NO.6)氨基酸的一段抗原肽；取PCR擴增產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳觀察是否有目的基因條帶，把得到的目的基因片段割膠回收、定量；3.將六段PCR產(chǎn)物的酶切和連接將純化得到的各段HSV抗原片段分別用EarI酶切成粘性末端，然后用T4 ligase把它們按照下述順序連接(見圖1所示)
ICP27上的377～459，gD上的146～179，gD上的223～306，gB上的529～606，gC上的247～282；gD上的1～77，得到完整的抗原表位，用于連接的間隔序列為AAY；4.將串聯(lián)后的目的基因構(gòu)建質(zhì)粒將上述得到的完整抗原表位和真核表達載體pcDNA3.1同時雙酶切，然后連接起來，構(gòu)成所需的DNA疫苗HV-pcDNA3.1。
由本發(fā)明制備獲得的DNA疫苗，經(jīng)過對小鼠免疫試驗，結(jié)果表明該疫苗能有效引起小鼠特異性的體液免疫和細胞免疫應答。然后進行免疫小鼠毒性攻擊試驗測定其戚率指標，表明該疫苗免疫的有效性，而且具有特異性高、殺傷力強的優(yōu)點。


圖1為多表位DNA復合疫苗抗原示意圖。
圖2為克隆抗原片斷的路線圖示。
具體實施例方式
下面進一步描述本發(fā)明的實施方式。
1.引物設(shè)計參照圖1設(shè)計6對引物，以人HSV-2全病毒基因組DNA為模板，設(shè)計引物(含酶切位點)分別擴增三種包膜糖蛋白gD，gB和gC的主要免疫優(yōu)勢區(qū)段和ICP27片段。引物序列參見表12.抗原靶基因的分段克隆回收取2ul HSV病毒裂解液，用Taqplus高保真DNA聚合酶分別對6段選定的抗原基因進行PCR擴增。條件如下50μl PCR擴增反應體系ddH2O9.5μl10×Buffer 5.0μl4×dNTP(10mM) 1.0μlPrimer F(10μM)1.0μlPrimer R(10μM)1.0μlTemplate 2.0μlTaqplus(5U/μl)0.5μlPCR擴增反應條件 取2μl PCR擴增產(chǎn)物，2.0％瓊脂糖凝膠電泳觀察是否有目的基因條帶。把得到的目的基因片段割膠回收、定量。
3.六段PCR產(chǎn)物的酶切和連接純化得到的各段HSV抗原片段分別用Ear I酶切成粘性末端，然后用T4 ligase把它們按照順序先后聯(lián)接。參照圖1

Ear I酶切條件2ul Buffer；1ul EarI；10ul純化的PCR片段；7.5ul ddH2O；反應Mix于37℃保溫3h。
T4 ligase順序連接各段酶切產(chǎn)物，4℃連接過夜，連接分別如下(1)2ul 10×T4 ligase buffer1ul T4 ligase8.5ul ICP1+8.5ul D2(2)2ul 10×T4 ligase buffer1ul T4 ligase8.5ul D3+8.5ul B4(3)2ul 10×T4 ligase buffer1ul T4 ligase8.5ul C5+8.5ul D6把3段聯(lián)接產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖電泳觀察結(jié)果。切下3段連接片段，(1)號聯(lián)接產(chǎn)物中目的條帶為377bp(A)，(2)號聯(lián)接產(chǎn)物中目的條帶為503bp(B)，(3)號聯(lián)接產(chǎn)物中目的條帶為376bp(II)?；厥者@些目的片段。
用T4 ligase聯(lián)接回收的A和B片段，4℃連接過夜，Mix如下2ul 10×T4 ligase buffer1ul T4 ligase8.5ul A+8.5ul B把A和B的連接產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖電泳觀察結(jié)果。切下600～1000bp條帶對應的位置，回收DNA，進行用PCR擴增。
50μl PCR擴增反應體系ddH2O 39.5μl10×Buffer 5.0μl4×dNTP(10mM)1.0μlPrimer ICP-F(10μM) 1.0μlPrimer B4-R(10μM) 1.0μlTemplate 2.0μl
Taqplus(5U/μl)0.5μlPCR擴增反應條件 取100μl PCR擴增產(chǎn)物，2.0％瓊脂糖凝膠電泳切下880bp條帶(I)，回收目的片段，再用EarI酶切片段I，條件同前。
T4 ligase連接片段I酶切產(chǎn)物和回收的片段II，4℃連接過夜，Mix如下2ul 10×T4 ligase buffer1ul T4 ligase8.5ul I+8.5ul II連接產(chǎn)物用1.4％瓊脂糖電泳，切下1100～1300bp條帶(HV)，回收目的片段。PCR檢驗回收的HV片段是否有6段基因的連接產(chǎn)物50μl PCR擴增反應體系ddH2O39.5μl10×Buffer 5.0μl4×dNTP(10mM) 1.0μlPrimer ICP-F(10μM)1.0μlPrimer D6-R(10μM) 1.0μlTemplate 1.0μlTaqplus(5U/μl)0.5μlPCR擴增反應條件 共有6段抗原肽表位，分別為ICP27上第377～459氨基酸的一段抗原肽，gD上第1～77、第146～179、第223～306氨基酸的三段抗原肽，gB上第529～606氨基酸的一段抗原肽和gC上第247～284氨基酸的一段抗原肽。其中不同類型糖蛋白之間用間隔序列(AAY)連接起來，以提高免疫活性并防止N端被破壞，起保護作用。
4.HV連接片段的克隆測序?qū)⑸鲜龌厥盏腍V片段連接到pGEM-T載體中，16℃連接過夜1ul Progema T4 ligase1ul pGEMT-vector5ul 2×Progema T4 ligase Buffer
3ul HV純化液HV-pGEMT-vector連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞，挑選陽性轉(zhuǎn)化子鑒定。分別對陽性轉(zhuǎn)化子和pcDNA3.1空載體用EcoRI和KpnI雙酶切，EcoRI單切質(zhì)粒，37℃保溫3h3.0ul Buffer H2.0ul EcoRI20.0ul質(zhì)粒5.0ul ddH2O純化得到的EcoRI酶切質(zhì)粒再用KpnI酶切37℃，3h3.0ul Buffer 10.3ul 100×BSA2.0ul KpnI24.7ul質(zhì)粒對于HV-pGEMT-vector雙酶切產(chǎn)物切膠1200bp條帶；pcDNA3.1空質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物則切膠約5.4kb的條帶，分別對其回收定量。HV片段聯(lián)入pcDNA3.1載體，16℃過夜1ul 10×T4 ligase buffer1ul T4 ligase1ul雙切pcDNA3.1回收片段3ul HV雙切回收片段HV，pcDNA3.1連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞，挑選陽性重組子，得HV-pcDNA3.1，并測序驗證。
5.免疫小鼠C57/BL6雌性6周齡小鼠10只，隨機分為2組(空載體pcDNA3.1陰性組和HV-pcDNA3.1+IL2-pcDNA3.1實驗組)，每組5只。方法是初次免疫為10ug質(zhì)粒和1ug脂質(zhì)體融合轉(zhuǎn)染C57/BL6小鼠單個核細胞于皮下注射；14天后二次免疫為100ug質(zhì)粒和10ug脂質(zhì)體混合后直接注射C57/BL6小鼠肌肉中；再過14天后加強免疫一次50ug質(zhì)粒和5ug脂質(zhì)體混合后直接注射C57/BL6小鼠肌肉中。再過14天后檢測。
6.通過以下方法進行HSV-2多表位DNA疫苗的免疫原性鑒定(1)特異性IgG抗體ELISA結(jié)果 血清稀釋400倍時的OD值陰性組為0.113±0.035；實驗組為0.288±0.091，效價約為500。
(2)殺傷性T細胞毒分析結(jié)果 用LDH法測定CTL殺傷率(％)，當效靶比為50∶1時，陰性組為8.301±2.906；實驗組為47.913±15.086。
(3)細胞因子檢測結(jié)果 ELISA測得血清中mIL2和mIFN-γ的含量(ng/L)，陰性組mIL2為685.21±104.20，mIFN-γ為547.71±189.33；實驗組mIL2為1421.16±220.98，mIFN-γ為1956.19±219.60。
(4)T細胞抗原特異性增殖反應測定結(jié)果 MTT法測得的小鼠脾T淋巴細胞刺激指數(shù)(SI)，陰性組為0.709±0.035；實驗組為2.751±0.259。
結(jié)論HSV-2多表位DNA疫苗能有效引起小鼠特異性的體液免疫和細胞免疫應答。
7.具體應用根據(jù)一系列小鼠免疫指標的測定結(jié)果，表明該DNA疫苗構(gòu)建設(shè)計是成功的。然后直接進行HSV-2多表位DNA疫苗免疫小鼠病毒攻擊實驗，通過測定存活率指標，觀察小鼠預防HSV感染的動物試驗效果，進一步反應了該疫苗的有效性。
臨床應用小鼠攻毒實驗成功后，經(jīng)臨床I、II、III期實驗，可作為抗HSV-2病毒的新型DNA疫苗，用于預防和治療感染HSV-2的疾病，如生殖器皰疹、宮頸癌、新生兒皰疹等疾病。
序列表SEQ ID NO.1DPIIGTAAAVLENLATRLRPFLQCYLKARGLCGLDDLCSRRRLSDIKDIASFVLVILARLANRVERGVSEIDYTTVGVGAGETSEQ ID NO.2AKYALADPSLKMADPNRFRGKNLPVLDQLTDPPGVKRVYHIQPSLEDPFQPPSIPITVYYAVLERACRSVLLHAPSESEQ ID NO.3SEDNLGFLMHAPAFETAGTYLRLVKINDWTEITQSEQ ID NO.4RFIPENQRTVALYSLKIAGWHGPKPPYTSTLLPPELSDTTNATQPELVPEDPEDSALLEDPAGTVSSQIPPNWHIPSIQDVAPHSEQ ID NO.5QNHELTLWNEARKLNPNAIASATVGRRVSARMLGDVMAVSTCVPVAPDNVIVQNSMRVSSRPGTCYSRPLVSFRYEDQSEQ ID NO.6EGQPFKATCTAATYYPGNRAEFVWFEDGRRVFDPAQSEQ ID NO.7ATGGACCCTATCATCGGAACGGCGGCCGCCGTGCTGGAAAACCTCGCCACGCGCCTGCGCCCCTTTCTGCAGTGCTACCTGAAGGCCCGAGGCCTGTGCGGGCTGGACGACCTGTGCTCGCGGCGACGCCTGTCGGACATTAAGGATATTGCCTCCTTTGTGTTGGTCATCCTGGCCCGCCTCGCCAACCGCGTCGAGCGCGGCGTGTCGGAGATCGACTACACGACCGTGGGGGTTGGGGCCGGCGAGACGGCCGCTTACAGCGAGGATAACCTGGGATTCCTGATGCACGCCCCCGCCTTCGAGACCGCGGGTACGTACCTGCGGCTAGTGAAGATAAACGACTGGACGGAGATCACACAACGCTTTATCCCCGAAAACCAGCGCACCGTCGCCCTATACAGCTTAAA AATCGCCGGGTGGCACGGCCCCAAGCCCCCGTACACCAGCACCCTGCTGCCGCCGGAGCTGTCCGACACCACCAACGCCACGCAACCCGAACTCGTTCCGGAAGACCCCGAGGACTCGGCCCTCTTAGAGGATCCCGCCGGGACGGTGTCTTCGCAGATCCCCCCAAACTGGCACATCCCGTCGATCCAGGACGTCGCGCCGCACGCTGCCTACCAGAACCACGAGCTGACTCTCTGGAACGAGGCCCGCAAGCTCAACCCCAACGCCATCGCCTCCGCCACCGTCGGCCGGCGGGTGAGCGCGCGCATGCTCGGAGACGTCATGGCCGTCTCCACGTGCGTGCCCGTCGCCCCGGACAACGTGATCGTGCAGAACTCGATGCGCGTCAGCTCGCGGCCGGGGACGTGCTACAGCCGCCCCCTGGTCAGCTTTCGGTACGAAGACCAGGCCGCTTACGAGGGCCAGCCGTTTAAGGCGACGTGCACGGCCGCCACCTACTACCCGGGCAACCGCGCGGAGTTCGTCTGGTTCGAGGACGGTCGCCGGGTATTCGATCCGGCCCAGGCTGCCTACGCCAAATACGCCTTAGCAGACCCCTCGCTTAAGATGGCCGATCCCAATCGATTTCGCGGGAAGAACCTTCCGGTTTTGGACCAGCTGACCGACCCCCCCGGGGTGAAGCGTGTTTACCACATTCAGCCGAGCCTGGAGGACCCGTTCCAGCCCCCCAGCATCCCGATCACTGTGTACTACGCAGTGCTGGAACGTGCCTGCCGCAGCGTGCTCCTACATGCCCCATCGGAGTGATGA
權(quán)利要求
1.一種能有效抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗，其特征在于組成如下將HSV-2病毒胞膜糖蛋白的強免疫原gD、gB、gC和參與病毒復制的即刻早期蛋白ICP27的主要抗原表位區(qū)域，以保護性抗原gD為中心，選定6段抗原基因加間隔序列AAY串連到真核表達載體pcDNA3.1，得到HV-pcDNA3.1質(zhì)粒；其中6段抗原基因為ICP27上第377～459氨基酸的一段抗原肽，gD上第1～77、第146～179、第223～306氨基酸的三段抗原肽，gB上第529～606氨基酸的一段抗原肽和gC上第247～282氨基酸的一段抗原肽。
2.一種能有效抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗的制備方法，其特征在于具體步驟如下(1)設(shè)計引物以人HSV-2全病毒基因組DNA為模板，設(shè)計6對引物，分別用于擴增三種包膜糖蛋白gD，gB和gC的主要免疫優(yōu)勢區(qū)段和ICP27片段，引物序列見表1所列表1.DNA疫苗引物序列表
(2)抗原靶基因的分段克隆回收取HSV病毒裂解液，用Taqplus高保真DNA聚合酶分別對6段選定的抗原基因進行PCR擴增，這6段抗原基因分別為ICP27上第377～459氨基酸的一段抗原肽，gD上第1～77、第146～179、第223～306氨基酸的三段抗原肽，gB上第529～606氨基酸的一段抗原肽和gC上第247～282氨基酸的一段抗原肽；取PCR擴增產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳觀察是否有目的基因條帶，把得到的目的基因片段割膠回收、定量；(3)六段PCR產(chǎn)物的酶切和連接將純化得到的各段HSV抗原片段分別用Ear I酶切成粘性末端，然后用T4 ligase把它們按照下述順序連接ICP27上的377～459，gD上的146～179，gD上的223～306，gB上的529～606，gC上的247～282；gD上的1～77，得到完整的抗原表位，用于連接的間隔序列為AAY；(4)將串聯(lián)后的目的基因構(gòu)建質(zhì)粒將上述得到的完整抗原表位和真核表達載體pcDNA3.1同時雙酶切，然后連接起來，構(gòu)成所需的DNA疫苗HV-pcDNA3.1。
全文摘要
本發(fā)明屬醫(yī)藥和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種抗單純皰疹病毒－2的多表位DNA疫苗及其制備方法。本發(fā)明的DNA疫苗是將HSV－2的gB、gC、gD和即刻早期蛋白ICP27的主要抗原表位區(qū)域加間隔序列串連到真核表達載體pcDNA3.1，獲得HV－pcDNA3.1。該DNA疫苗可以用于預防和治療HSV－2感染的疾病如生殖器皰疹等疾病。該疫苗的特點是特異性高、保護性好，制備方法簡單。
文檔編號A61P31/22GK1748797SQ20051002848
公開日2006年3月22日 申請日期2005年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月9日
發(fā)明者朱乃碩, 徐金華, 許炎, 夏天, 鄭志忠 申請人:復旦大學, 復旦大學附屬華山醫(yī)院