專利名稱：新型單純皰疹病毒擴增子載體系統(tǒng)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)發(fā)明領(lǐng)域。具體涉及用于1型單純皰疹病毒(HSV-1)擴增子載體的新型包裝系統(tǒng)的構(gòu)建及用途。
I型單純皰疹病毒(HSV-1)能有效感染神經(jīng)細胞并在神經(jīng)元中建立穩(wěn)定的隱性感染而不影響神經(jīng)細胞的功能。因此，HSV-1載體可望用作將外源基因?qū)肷窠?jīng)細胞的一種新型病毒載體。
HSV-1擴增子載體質(zhì)粒只含有HSV-1病毒復制和包裝所必需的順式元件，即復制子oris和包裝信號pac，另外還包括需轉(zhuǎn)移的外源基因以及原核復制子和抗性基因。擴增子病毒包裝所需的反式元件通常由輔助病毒或含病毒基因組的質(zhì)粒DNA等輔助包裝系統(tǒng)提供。因此擴增子病毒是一種高度缺損的病毒顆粒，它不含HSV病毒的任何結(jié)構(gòu)基因，具有很好的安全性。在能提供反式元件的細胞中，HSV-1擴增子載體質(zhì)粒經(jīng)“滾環(huán)”復制產(chǎn)生頭尾相接的嵌合體，然后被切割、包裝成含多拷貝外源基因、DNA總長約150kb的假病毒。因此HSV-1擴增子載體有較高的外源基因表達量。例如，一個10kb大小的擴增子質(zhì)粒包裝成一個150kb的擴增子病毒，其中含有15個拷貝、首尾相接的這種擴增子質(zhì)粒。
與目前常用的幾類病毒載體，比如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體相比，HSV-1擴增子病毒載體的優(yōu)勢在于載體含多個拷貝的外源基因，外源基因的表達量高、包裝容量大(可包裝大到15～30kb的外源基因片段)、載體構(gòu)建簡單等優(yōu)點，因而在基因轉(zhuǎn)移和基因治療領(lǐng)域日益受到更多的關(guān)注。
HSV-1擴增子病毒載體目前亟待解決的問題是找到一種既能簡便、高效產(chǎn)生高滴度擴增子病毒，又能減少、甚至徹底清除擴增子病毒中輔助病毒污染的輔助包裝系統(tǒng)。
目前較常用的質(zhì)粒型HSV-1擴增子載體輔助包裝系統(tǒng)通常有以下幾類。
以HSV-1復制缺陷型突變株輔助病毒(Geller，A.I.，K.Keyomarski，J.Bryan，A.B.Pardee.1990 An efficient deletion mutant packaging system for defective HSV-1 vectors；potential applications to neuronal physiology and human gene therapy.Proc.Natl.Acad.Sci.USA878950-8954)。這類輔助病毒有的是缺失某個病毒復制所必需的基因，該基因編碼的蛋白由細胞反式提供；有的是溫度敏感突變株，這種輔助病毒31℃時能正常復制，而37℃時不能復制。這種方法得到的擴增子病毒中含有大量輔助病毒，這些輔助病毒雖然無法正常復制，但仍有感染能力。此類輔助病毒有以下幾個問題①輔助病毒的基因表達帶來的細胞毒作用和免疫反應(yīng)；②輔助病毒和內(nèi)源性病毒間潛在的相互作用；③混合病毒中擴增子病毒與輔助病毒比例的波動而帶來外源基因的不穩(wěn)定表達；④輔助病毒潛在的致癌作用；⑤輔助病毒回復成野生型病毒的可能。
為了使產(chǎn)生的擴增子病毒中無輔毒污染，近幾年發(fā)展起來了以五個含相互重疊的HSV-1基因組片段的粘粒(SetC粘粒，包括cos6，cos14，cos28，cos48，cos56)為基礎(chǔ)的第二代包裝系統(tǒng)(Cunningham，C.and A.J.Davison 1993 A cosmid-base system for constructingmutants of Herpes Simplex Virus Type 1.Virology 197116-124)。去除位于兩個粘粒上的HSV-1的包裝信號pac后，五個粘粒與擴增子質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞，只有HSV擴增子載體被包裝成病毒，而不產(chǎn)生輔助病毒顆粒。此方法達到了無輔助病毒污染的目的，但五個粘粒共轉(zhuǎn)染的效率較低，因此得到的擴增子病毒滴度較低(＜106PFU/ml)。用這種方法無法實現(xiàn)擴增子病毒載體的大量生產(chǎn)，限制了其臨床應(yīng)用。
最近，有研究者在缺失了包裝信號pac的HSV-1基因組中插入一個細菌人工染色體(BAC)組件，形成含HSV-1基因組的HSV-BAC輔助質(zhì)粒(Stavropoulos，T.A.and Strathdee，C.A.，An Enhanced Packaging System for helper-Dependent Herpes Simplex Virus Vectors，Journal of Virology，1998，727137-7143)。該細菌人工染色體HSV-BAC與擴增子質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞，HSV-BAC反式提供擴增子質(zhì)粒包裝成病毒所需的蛋白，但它自身因無包裝信號而無法包裝出輔助病毒。此方法不但無輔毒產(chǎn)生，而且與SetC粘粒法相比減少了共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒數(shù)，轉(zhuǎn)染效率有較大提高，擴增子病毒達到107PFU/ml。但它仍需要一個質(zhì)粒和一個細菌人工染色體共轉(zhuǎn)染，效率仍不高，而且HSV-BAC分子量大，操作不便。
本發(fā)明的目的在于提供一種既能簡便、高效產(chǎn)生高滴度擴增子病毒，又能有效減少擴增子病毒中輔助病毒含量、直至達到無輔助病毒的新型擴增子病毒生產(chǎn)系統(tǒng)，探索一條使HSV-1擴增子載體病毒進入大規(guī)模生產(chǎn)及臨床治療的途徑。
針對目前擴增子輔助包裝系統(tǒng)存在的轉(zhuǎn)染效率低或不穩(wěn)定、操作復雜、不利于規(guī)模化生產(chǎn)、從而難以獲得高產(chǎn)量、無輔毒的擴增子病毒載體的弊病，本發(fā)明提出了以“含可卸包裝信號pac的HSV-1重組病毒”為輔助病毒的包裝策略。
本發(fā)明提出的rHSV-1/loxP-pac-loxP，其特征在于HSV-1基因組中原有的兩個包裝信號pac缺失，兩側(cè)帶有同向排列的Cre重組酶特異識別位點loxP的HSV病毒包裝信號pac插入HSV-1基因組中。Cre重組酶是噬菌體編碼的343氨基酸的多肽鏈，它能特異地使兩個同向排列的34堿基對的loxP序列間的DNA缺失。Cre重組酶作用于loxP，不依賴于DNA的復制和外源能量(比如ATP)，而且對超螺旋或線性DNA都起作用。(Sternberg，N，Hamilton，D.，J.Mot.Biol.1981，150，467-486)。本發(fā)明所構(gòu)建的rHSV-1/loxP-pac-loxP中，loxP-pac-loxP插入在HSV-1 UL44基因的XbaI位點中(附

圖1)。當rHSV-1/loxP-pac-loxP病毒作為輔助病毒感染表達Cre重組酶的BHK/Cre細胞時，Cre重組酶特異性將rHSV-1/loxP-pac-loxP病毒的loxP-pac-loxP切除，切點處病毒DNA自動連接，不留缺口。因此，在Cre酶存在時，rHSV-1/loxP-pac-loxP病毒無法包裝出子代病毒，但它仍可以在細胞中復制和表達，為擴增子病毒的包裝提供反式蛋白。
本發(fā)明所提出的rHSV-1/loxP-pac-loxP病毒是通過對一套含有HSV-1病毒全基因組的粘粒質(zhì)粒(Set C粘粒，包括cos6，cos14，cos28，cos48，cos56)(Cunningham，C.andA.J.Davison 1993 A cosmid-base system for constructing mutants of Herpes Simplex VirusType 1.Virology 197116-124)進行改造的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的。首先，將位于粘粒質(zhì)粒cos6和cos48上的HSV-1基因組中原有的兩個包裝信號pac切除，成為cos6Δa和cos48Δa。然后，將兩側(cè)裝上同向排列的Cre重組酶特異識別位點loxP的一個拷貝的pac插入cos56上的HSV-1的非必需基因UL44的XbaI位點中，成為cos56/loxP-pac-loxP.將cos6Δa、cos28、cos14、cos56/loxP-pac-loxP、cos48Δa五個粘粒經(jīng)PacI酶切去粘粒骨架部分后，用脂質(zhì)體方法共轉(zhuǎn)染HSV-1敏感細胞(如BHK-21)，5個HSV-1片段在細胞中發(fā)生同源重組而產(chǎn)生重組病毒rHSV-1/loxP-pac-loxP。該重組病毒只含有一個pac位點，且pac兩側(cè)是loxP序列。該重組病毒能在BHK-21細胞中穩(wěn)定傳代。
將HSV擴增子載體DNA轉(zhuǎn)染表達Cre酶的細胞株(如BHK/Cre)，并用rHSV-1/loxP-pac-loxP病毒感染。由于輔助病毒rHSV-1/loxP-pac-loxP包裝信號pac被Cre酶切除，因此無法包裝成病毒顆粒。但是包裝信號的切除并不影響HSV病毒的復制及病毒基因的大量表達，它們?yōu)镠SV擴增子DNA的復制和包裝提供了充足的反式作用蛋白，從而明顯增加子代病毒中擴增子病毒的滴度。
本發(fā)明的單純皰疹病毒載體系統(tǒng)提出了一種較傳統(tǒng)的無輔助病毒生產(chǎn)方法的效率有較大提高擴增子載體生產(chǎn)方法，為擴增子載體的大規(guī)模生產(chǎn)打下了基礎(chǔ)。該系統(tǒng)有望使HSV-1擴增子載體進入基因治療的實際應(yīng)用階段。
本發(fā)明產(chǎn)生的HSV擴增子載體輔助包裝系統(tǒng)可作為各種攜帶不同外源基因的HSV-1擴增子載體的輔助包裝系統(tǒng)，用于哺乳動物細胞的基因轉(zhuǎn)移和神經(jīng)系統(tǒng)(如帕金森氏癥)疾病的基因治療。
除本發(fā)明使用的噬菌體Pl Cre/loxP系統(tǒng)外，其它類似的DNA重組酶系統(tǒng)，比如酵母Flp/Frt系統(tǒng)(Mark et al.Nucleic Acids Research，20，4451-4455(1992))也能用于本發(fā)明中。
除單純皰疹病毒外，其它皰疹病毒，比如Marek’s disease virus(MDV)，也能構(gòu)建擴增子載體(Camp et al，J Virol 65(11)，1991，6320-6324)。本發(fā)明提出的用“可卸包裝信號的輔助病毒”輔助包裝擴增子載體的策略不僅適用于輔助包裝HSV-1擴增子載體，也適用于輔助包裝其它皰疹病毒擴增子載體。
本發(fā)明中用到的原始生物材料有SetC粘粒系統(tǒng)其中包含五個粘粒cos6、cos28、cos14、cos56和cos48(Cunningham，C.and A.J.Davison 1993 A Cosmid-base System for Constructing mutants of Herpes SimplexVirus Type 1.Virology 197116-124)；Cos6Δa、cos48Δa本室構(gòu)建。在cos6和cos48的基礎(chǔ)上，用RecA輔助的限制性核酸內(nèi)切酶切割法分別去除了HSV-1的包裝信號pac(Fraefel，C，Song，S，Geller，A.I.，1996，Helper Virus-Free Transfer of Herpes Simplex Virus Type 1 Plasmid Vectors into Neural Cells，Journal of Virology，70，7190-7197)；pBS246質(zhì)粒GIBCO BRL公司商品質(zhì)粒pMC-Cre表達含核定位信號的Cre重組酶蛋白(Hua Gu 1993 Independent Control ofImmunoglobulin Switch Recombination at Individual switch Regions Evidenced through Cre-loxP-Mediated Gene Targeting，Cell 731155-1164)；p3zf-pacPromega公司商品質(zhì)粒；pBluescript KS(+)Stratagene公司商品質(zhì)粒；pcDNA2.1Invitrogene公司商品質(zhì)粒；pWCDN由本室伍志堅博士構(gòu)建；pWAV2由本室伍志堅博士構(gòu)建；pAV53由本室伍志堅博士提供；pHSV-LacZ由本室吳小兵博士構(gòu)建；本發(fā)明cos56/loxP-pac-loxP粘粒的構(gòu)建過程如下如附圖2所示。用EcoRI和BamHI雙酶切p3zf-pac，回收1.7kb的pac序列，插入pBluescript KS(+)(Stratagene公司)的相應(yīng)位點中，成為pKS-pac.用Hind3和BamH1切下pKS-pac上的pac片段，插入pBS246(Gibco公司)的相應(yīng)點中，成為pBS246-pac.用Pst1單酶切pAV53，回收約1kb的帶一個Xba1酶切位點的小片段，插入pcDNA2.1的相應(yīng)位點。篩選此Xba1位點與pcDNA2.1上的Xba1位點相距較近的克隆，成為pcDNA2.1-Xba1。用Not1酶切pBS246-pac，回收pac片段，插入pcDNA2.1-Xba1的相應(yīng)位點中，成為pcDNA2.1-pac.再用Xba1酶切pcDNA2.1-pac，回收pac片段，插入cos56的Xba1位點中，成為cos56/loxP-pac-loxP。
本發(fā)明提出的粘粒cos56/loxP-pac-loxP保存于大腸桿菌(E.coli.)DH5α株(MAXEfficiency DH5α，GIBCO#18258-012)中，在含有50-100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)。含有cos56/loxP-pac-loxP粘粒的菌種命名為cos56/loxP-pac-loxP/DH5α(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號0414)。
以下實施對本發(fā)明的重組輔助病毒rHSV-1/loxP-pac-loxP的制備和用途作了詳細說明，但不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。
實施例1rHSV-1/loxP-pac-loxP重組病毒的產(chǎn)生、傳代和保存cos6Δa，cos28，cos14，cos56-loxP-pac-loxP，cos48Δa五個粘粒等濃度混合，用PacI酶切后，分別用酚、酚氯仿、氯仿抽提，酒精沉淀后，用蒸餾水溶解DNA。取5μgDNA，用LipofectAMINE(GIBCO公司)轉(zhuǎn)染BHK-21細胞。48小時后挑取病毒斑。經(jīng)過連續(xù)兩次空斑純化后，得到rHSV-1/loxP-pac-loxP重組病毒。
rHSV-1/loxP-pac-loxP重組病毒以MOI＝0.1在約80％匯片的BHK-21細胞上37℃吸附1h后，加適量含10％胎牛血清培養(yǎng)液1640，37℃養(yǎng)約48小時，至完全病變。將細胞與上清一并收集，反復凍融三次，1500rpm離心5min，收集上清，測定滴度并保存在-20℃冰箱中。
實施例2pCHneocre質(zhì)粒的構(gòu)建過程如下用BamHI酶切pWCDN，回收約1.3kb的neor片段，插入pWAV2的相應(yīng)位點，篩選neor啟動子與pWAV2上CMV啟動子方向一致的克隆，成為pSNAV2。用XhoI酶切pMC-Cre，回收約1.7kb的cre片段，與pSNAV2被XhoI酶切后回收的、去掉cmv啟動子和polyA的大片段連接，篩選cre方向與neor方向相反的克隆，成為pCHneocre。如附圖3所示。
實施例3表達Cre重組酶的BHK/CHneocre細胞株的建立、傳代和保存用LipofectAMINE(GIBCO公司)將pCHneocre轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞中，24小時后，在培養(yǎng)液1640中加入終濃度為400μg/ml的G418，連續(xù)培養(yǎng)兩周后，挑單克隆。用RrHSV-1/loxP-pac-loxP重組病毒感染各株克隆，測連續(xù)三代的滴度，篩選出重組病毒滴度最高的細胞株，即為BHK/Cre細胞株。BHK/Cre細胞株可用含10％胎牛血清和400μg/ml G418的1640培養(yǎng)液長期穩(wěn)定傳代，細胞株在含10％胎牛血清和10-20％二甲基亞砜的1640培養(yǎng)液中，液氮保存。
實施例4rHSV-1/loxP-pac-loxP輔助包裝系統(tǒng)功能檢測按照GIBCO BRL公司LipofectAMINE產(chǎn)品說明書，分別將擴增子質(zhì)粒pHSV-LacZ轉(zhuǎn)染BHK/Cre和BHK-21(對照)細胞。24小時后，用rHSV-1/loxP-pac-loxP病毒以MOI＝0.5感染，室溫吸附1h，用無血清1640培養(yǎng)液洗細胞2次，用含10％胎牛血清1640培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)至細胞完全病變(約2-3天)。將細胞與上清一并收集，反復凍融3次，1500rpm離心5min，收集上清。
擴增子病毒和輔助病毒的滴度檢測將分別從BHK/Cre細胞和BHK-21細胞中收集的病毒上清以10倍倍比稀釋，感染BHK-21細胞，吸附1h后，洗去未吸附的病毒，37℃培養(yǎng)至出現(xiàn)病毒斑，用PBS液洗細胞3次，用固定液(含2％甲醛的PBS液)4℃固定5min，再用PBS液洗細胞3次，加檢測液(含1mg/ml X-gal，2mmol MgCl2，5mmol鐵氰化鉀，5mmol亞鐵氰化鉀的PBS液)覆蓋細胞，37℃作用6h，顯微鏡下觀察細胞染藍的情況。結(jié)果顯示BHK/Cre細胞株產(chǎn)生的病毒中，95％以上的病毒斑呈藍色，藍色病毒斑、即擴增子病毒的滴度達到108/ml；而對照組BHK-21細胞產(chǎn)生的病毒斑中呈藍色的少于50％，擴增子病毒的滴度只有107/ml。該結(jié)果證明本發(fā)明能有效減少擴增子病毒中輔助病毒的含量，同時大幅增加擴增子病毒的滴度。
權(quán)利要求
本發(fā)明涉及用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病(或其它系統(tǒng)疾病)的病理生理及基因治療研究和應(yīng)用的單純皰疹病毒I型(HSV-1)擴增子病毒載體系統(tǒng)。1.一種表達外源DNA序列的單純皰疹病毒載體系統(tǒng)，其特征在于由以下成分組成a)一種重組輔助單純皰疹病毒rHSV-loxP-a-loxP，其基因組中去除了2個天然的HSV包裝信號序列，并插入了一個兩側(cè)帶有噬菌體loxP序列的HSV包裝信號序列；b)一種輔助病毒依賴性單純皰疹病毒載體(亦稱擴增子載體)，包括單純皰疹病毒包裝信號序列pac、復制起點oriS、外源DNA序列及大腸桿菌質(zhì)粒骨架；c)一株支持單純皰疹病毒復制并表達重組酶Cre的細胞。
2.為產(chǎn)生權(quán)利要求1中的輔助單純皰疹病毒的一組包含單純皰疹病毒全基因組的粘性質(zhì)粒cos6，cos28，cos14，cos48，cos56，其中cos6和cos48中的HSV包裝信號序列pac被刪除，cos56的HSV DNA的UL44基因中插入了兩側(cè)帶有噬菌體loxP序列的HSV包裝信號序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1，噬菌體loxP序列長34bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求1，兩側(cè)帶有噬菌體loxP序列的HSV包裝信號序列位于重組輔助HSV病毒基因組的其它位置；
5.根據(jù)權(quán)利要求1，噬菌體loxP序列在HSV包裝信號兩側(cè)的插入方向相同。
6.根據(jù)權(quán)利要求1，細胞來源于BHK-21、Vero、293細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1，重組酶Cre表達單位整合在細胞株中。
8.根據(jù)權(quán)利要求1，可誘導表達的重組酶Cre表達單位插入在rHSV-loxP-a-loxP病毒基因組DNA的某一位置中。
9.本發(fā)明提出的單純皰疹病毒載體系統(tǒng)用于HSV擴增子載體的無輔助病毒包裝。
10.本發(fā)明提出的單純皰疹病毒載體系統(tǒng)用于基因轉(zhuǎn)移和基因治療。
全文摘要
本發(fā)明根據(jù)Cre蛋白重組酶特異切除同向排列的loxP序列間DNA的特點,在去除原有包裝信號pac的HSV－1中插入兩側(cè)帶有同向排列的loxP序列的HSV－1包裝信號loxP－pac-loxP,得到“含可卸包裝信號的重組輔助病毒”rHSV-1/loxP-pac-loxP。該輔助病毒在表達Cre重組酶的細胞中只有感染和復制能力,不能包裝出子代病毒。以rHSV-1/loxP-pac-loxP為輔助病病,在表達Cre重組酶的細胞中生產(chǎn)擴增子病毒,達到了大幅減少輔助病毒的同時又增加擴增子病毒滴度的目的;其生產(chǎn)效率比傳統(tǒng)的無輔助病毒生產(chǎn)方法的效率有較大提高,為擴增子載體的大量生產(chǎn)打下了基礎(chǔ)。該系統(tǒng)產(chǎn)生的HSV擴增子病毒可用于基因轉(zhuǎn)移和基因治療。
文檔編號C12N7/01GK1263159SQ9912206
公開日2000年8月16日 申請日期1999年10月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月27日
發(fā)明者曹暉, 吳小兵, 侯云德 申請人:北京東康龍病毒生物技術(shù)工程研究中心