專利名稱：新型纖溶酶cgw－3及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從鏈霉菌C3662發(fā)酵液中制備的新型抗血栓藥物。
臨床上，主要心腦血管疾病大都由于重要部位的血管被血栓阻塞所致。盡管血栓形成與血管及諸多因子有關(guān)，然而溶栓療法是心腦血管栓塞性疾病的一種常規(guī)治療手段。在溶栓劑方面目前主要有兩大類一類是纖溶酶原激活劑，已用到臨床的有尿激酶，鏈激酶，t-PA等，正在研究開發(fā)中的這類藥物還有葡激酶，另一類是可直接降解纖維蛋白的蛋白酶類藥物，如多種蛇毒抗栓酶，蚓激酶，正在研制的納豆激酶等。當(dāng)前使用的溶栓藥物雖然能為臨床治療提供一些可選擇的品種，但還存在不同性質(zhì)的缺陷和問題。有的藥效作用比較緩慢，達(dá)到適宜再灌注血流需時較長(常達(dá)90分鐘以上)，治療效果不理想，此外還有引起出血性副作用，尤其是顱內(nèi)出血，導(dǎo)致過敏反應(yīng)，禿發(fā)，骨質(zhì)疏松等不良反應(yīng)；有一些溶栓藥物來源較困難，如t-PA，尿激酶等；有的不易培養(yǎng)或分離技術(shù)比較繁瑣，如蛇毒、蚓激酶和鏈激酶等；有的具溶栓活性的化合物毒性較大，如本實驗室原來研制的纖溶酶SW-1。因此，期望的新的溶栓劑應(yīng)具有的特征是溶栓效果肯定，毒副作用小，給藥方法容易，制備簡單、價格合理等。
本發(fā)明的目的是從鏈霉菌中制備纖溶酶。鏈霉菌工業(yè)化培養(yǎng)條件成熟，為非致病菌，不產(chǎn)生內(nèi)毒素，其本身具有外泌蛋白的能力，使產(chǎn)物的收取、純化工藝比較簡單，此外鏈霉菌還能產(chǎn)生蛋白降解抑制劑以保護(hù)所分泌的蛋白不受破壞。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)鏈霉菌來源的SW-1比較，其菌種不同，而且毒性顯著降低，因此有可能開發(fā)成為臨床較理想的新型抗血栓藥物。
本發(fā)明的內(nèi)容與要點一、纖溶酶CGW-3的發(fā)酵鏈霉菌C3662來源于南極土壤(保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中，保藏號CGMCC No.)，在合成五號培養(yǎng)基(KNO30.1～0.3％，NaCl 0.01～0.05％，K2HPO40.01～0.05％，F(xiàn)eSO40.0005～0.0002％，MgSO40.01～0.05％，可溶性淀粉1.0～3.0％，瓊脂1.2～2.0％，PH 6.5～7.5)上25～29℃培養(yǎng)7～14天，將該菌種接種于培養(yǎng)基(葡萄糖1.0～3.0％，黃豆餅粉1.0～3.0％，淀粉0.5～2.0％，KH2PO40.01～0.1％，MgSO40.01～0.1％，CaCO30.1～0.5％，PH6.5～7.5)培養(yǎng)24～60小時，轉(zhuǎn)種于同一培養(yǎng)基，25～27℃培養(yǎng)72～120小時，將培養(yǎng)物離心或過濾，得到發(fā)酵液。二、纖溶酶CGW-3的分離與純化鏈霉菌C3662發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨沉淀，Sephadex G-25脫鹽，DEAE Sepharose脫色，CM Sepharose陽離子交換樹脂及疏水層析后，得到CGW-3純品，純度可達(dá)HPLC90％(圖1)，純化流程如圖2所示。三、纖溶酶CGW-3的檢測和鑒別1. CGW-3在纖維蛋白平板(含0.5～1.0％瓊脂糖，0.2～0.5mg/ml纖維蛋白原和0.1～0.5μ/ml凝血酶)，經(jīng)37℃保溫16小時，顯示透明圈，表明CGW-3為具有纖溶性質(zhì)的纖溶酶。同時，CGW-3也具有對纖溶酶原的激活作用。因此，CGW-3既是纖溶酶，又是纖溶酶原激活劑。
2.根據(jù)CGW-3在SDS-PAGE蛋白電泳中的遷移率，其分子量為29KDa。
3. CGW-3在等電聚焦電泳中顯示其等電點為8.5以上。
4. CGW-3的纖溶作用可被PMSF(苯甲基磺酰氟)抑制，而不受EDTA(乙二胺四乙酸)的影響，表明CGW-3可能是一種絲氨酸蛋白酶，而非金屬蛋白酶。
5. CGW-3蛋白的N端15個氨基酸序列為V V G G T R A A Q G E F P F M即纈氨酸—纈氨酸—甘氨酸—甘氨酸—蘇氨酸—精氨酸—丙氨酸—丙氨酸—谷氨酰胺—甘氨酸—谷氨酸—苯丙氨酸—脯氨酸—苯丙氨酸—甲硫氨酸四、CGW-3的藥理作用1. CGW-3的靜脈注射具有明顯的抗栓效果CGW-3用不同劑量在大白鼠舌下靜脈給藥，能明顯延長頸動脈中血栓形成的時間(表一)。
表一 CGW-3對大鼠體內(nèi)血栓形成的延長作用<
>X±SD，n＝10，與對照組比較，P＜0.012. CGW-3對動脈血栓有明顯的溶栓作用CGW-3通過股靜脈給藥，對金黃地鼠腦動脈血栓有明顯的溶栓作用。給藥劑量為40μ/kg時，給藥后10分鐘，用顯微—電視—錄像系統(tǒng)可觀察到血栓溶解及血液流動狀況，在500μ/kg劑量時，5分鐘后，血栓明顯減少。
3. CGW-3急性毒性極低(1)CGW-3(粗品)小鼠口服8000mg/kg無死亡(表二)。
表二 CGW-3(粗品)小鼠口服急性毒性<
2)CGW-3(粗品)小鼠靜脈注射100mg/kg無死亡(表三)表三 CGW-3(粗品)小鼠靜脈注射急性毒性<
3)CGW-3(純品)小鼠靜脈注射62500U/kg無死亡(表四)。
表四CGW-3(純品)小鼠靜脈注射急性毒性
3. CGW-3無致突變作用以組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97，TA98，TA100，及TA102，對CGW-3在1～3000μg/平皿范圍內(nèi)檢測了致突變性(即Ames實驗)結(jié)果見表五。
表五CGW-3誘發(fā)Ames菌株的回變菌落數(shù)(X+SD)
注4-NQO為4-硝基喹啉-n-氧化物，A-AF為2-乙酰氨基芴，MMC為絲裂霉素檢測結(jié)果表明CGW-3在本試驗條件下的Ames試驗結(jié)果為陰性，說明CGW-3無致突變作用。
本發(fā)明的優(yōu)點與積極效果是，鏈霉菌C3662代謝產(chǎn)物-纖溶酶CGW-3，不僅溶栓效果好，毒性低，而且工藝簡便，生產(chǎn)成本低，環(huán)境污染少，顯示了很好的開發(fā)前景。


圖1CGW-3高壓液相分析圖譜，其中橫座標(biāo)表示時間，縱座標(biāo)表示毫伏，峰值9.58處表示CGW-3的保留時間(出峰時間)圖2CGW-2純化流程圖
權(quán)利要求
1.新型纖溶酶CGW-3及其制備方法，其特征是所說的纖溶酶是從鏈霉菌C3662經(jīng)發(fā)酵、分離、純化得到的一種N端為VVGGTRAAQGEFPFM 15個氨基酸序列的有溶血栓作用的活性蛋白。
2.按照權(quán)利要求1所述的新型纖溶酶CGW-3及其制備方法，其特征是鏈霉菌C3662在合成5號斜面培養(yǎng)基25～29℃培養(yǎng)7～14天，接種于葡萄糖-黃豆餅粉培養(yǎng)基，25～29℃培養(yǎng)24-60小時，轉(zhuǎn)種至同一培養(yǎng)基25～29℃培養(yǎng)72～120小時，將培養(yǎng)物離心或過濾，得到發(fā)酵液。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的新型纖溶酶CGW-3及其制備方法，其特征是鏈霉菌C3662發(fā)酵液的分離、純化是經(jīng)硫酸銨沉淀，SephadexG-25脫鹽，DEAESepharose陽離子交換樹脂及疏水層析后，得到純度達(dá)HPLC90％的CGW-3純品。
4.按照權(quán)利要求1或3所述的新型纖溶酶CGW-3及其制備方法，其特征是纖溶酶CGW-3的檢測鑒別包括以下方面(1)CGW-3在含有瓊脂糖、纖維蛋白原和凝血酶的纖維蛋白平板上，37℃保溫16小時應(yīng)顯示透明圈；(2)根據(jù)CGW-3在SDS-PAGE蛋白電泳中的遷移率，其分子量為29KDa；(3)CGW-3在等電聚焦電泳中，顯示其等電點在8.5以上；CGW-3的纖溶作用可被PMSF抑制而不受EDTA的影響，表明它不是金屬蛋白酶，而是一種絲氨酸蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及從一株土壤鏈霉菌C3662的發(fā)酵液中分離純化得到具有纖溶活性并能激活纖溶酶原的蛋白酶CGW－3,其分子量為29KDa,等電點為8.5以上,是一種絲氨酸蛋白酶,其N端15個氨基酸的序列為VVGGTRAAQGEFPFM,CGW－3對大鼠動脈血栓形成有明顯的抗栓和溶栓作用,對小鼠的急性毒性很低,并不具有致突變作用,CGW－3為一新型纖溶酶,纖溶活性好,毒性低,生產(chǎn)工藝簡便,成本低,具有開發(fā)價值。
文檔編號C12N15/58GK1260394SQ9912186
公開日2000年7月19日 申請日期1999年10月21日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月21日
發(fā)明者王以光, 武臨專, 陳昉, 龔勇 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所