專利名稱：：用于馬立克氏病毒疫苗生產(chǎn)的可傳代細(xì)胞系的改進(jìn)的制作方法該申請是發(fā)明人AminAbujoub和PaulM.Coussens于1995年10月27日申請的題目為“SustainableCellLineInfectedWithMarek’sDiseaseVirus”的美國申請No.08/549,045的繼續(xù)。本發(fā)明涉及感染馬立克氏病毒(MDV)的可傳代雞細(xì)胞系。具體地說，本發(fā)明涉及感染火雞皰疹病毒(HVT)和血清型-2MDV疫苗菌株(可以用作活病毒疫苗以保護(hù)家禽抵抗馬立克氏病)的細(xì)胞系，其中根據(jù)生長條件，MDV以溶源性或非溶源性感染保留在這些培養(yǎng)中。馬立克氏病(MD)是地球上任何動物(包括人)最常見的臨床腫瘤疾病(H.G.Purchase，in“Marek’sDiseasesScientificBasisandMethodsofControlClinicaldiseaseanditseconomicimpact.”(L.N.Payne，Ed.)，MartinusNijoffPublishing，Boston，MA，第17-42頁(1985))。MDV是一種具有高度接觸感染性的淋巴組織增生皰疹病毒。有三種MDV血清型致癌血清型-1(MDV-1)、非致癌血清型-2(MDV-2)和非致癌血清型-3即火雞皰疹病毒(HVT)(B.W.CalnekandR.L.Witter，in“DiseasesofPoultryMarek’sDisease”(B.W.Calneketal.，Eds.)，IowaStateUniversityPress，Ames，IA第342-385頁，(1991))。MDV和HVT的復(fù)制是其它細(xì)胞相關(guān)的皰疹病毒復(fù)制的典型，并已廣泛報(bào)道(L.J.N.Ross，in“Marek’sDiseasesScientificBasisandMethodsofControlMolecularBiologyoftheVirus.”(L.N.Pyane，Ed.)，MarinusNijoffPublishing，Boston，MA，第113-150頁，(1985))。已認(rèn)識的三種一般類型的細(xì)胞-病毒相互作用是復(fù)制感染、潛伏和轉(zhuǎn)化。MDV-1感染鳥類導(dǎo)致轉(zhuǎn)化發(fā)生的過程包括1)在B細(xì)胞中非溶源性感染，2)涉及感染的T細(xì)胞的潛伏期，3)第二輪非溶源性感染，同時(shí)發(fā)生永久性免疫抑制，4)致癌轉(zhuǎn)化(B.W.CalnekandR.L.Witter，in“DiseasesofPoultryMarek’sDisease”(B.W.Calneketal.，Eds.)，IowaStateUniversityPress，Ames，IA第342-385頁，(1991))。在感染MDV-2和HVT的鳥類事件中的順序似乎限制在原代溶裂期，隨后在非T細(xì)胞的潛伏或沒有致癌轉(zhuǎn)化的的潛伏(B.W.CalnekandR.L.Witter，in“DiseasesofPoultryMarek’sDisease”(B.W.Calneketal.，Eds.)，IowaStateUniversityPress，Ames，IA第342-385頁，(1991))。一直以來，家禽工業(yè)認(rèn)為有必要研制出可傳代鳥類細(xì)胞系由于制造馬立氏克病疫苗及簡化獲得生產(chǎn)多價(jià)疫苗的重組DNA載體的步驟。盡管已研制出許多鳥類細(xì)胞系(K.Nazerian，AvianPathol.16517-544(1987))，但直至本發(fā)明，在疫苗生產(chǎn)中還沒有鳥類細(xì)胞系能夠取代雞胚成纖維(CEF)細(xì)胞。先前的細(xì)胞系之所以不成功，是因?yàn)樗鼈兓蛘呤怯刹《巨D(zhuǎn)化的細(xì)胞衍生的，或者由化學(xué)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞衍生，而當(dāng)用化學(xué)轉(zhuǎn)化細(xì)胞接種雞時(shí)，使雞體產(chǎn)生腫瘤或者細(xì)胞系可恢復(fù)的病毒最大效價(jià)不足以用于工業(yè)生產(chǎn)。因此，家禽疫苗生產(chǎn)商繼續(xù)將原代CEF細(xì)胞用于生產(chǎn)馬立克氏病疫苗和其它活疫苗和滅活疫苗，這時(shí)一種昂貴和費(fèi)力的方法，取決于制備CEF的無特殊病原體(SPF)蛋的連續(xù)來源。馬立克氏病疫苗是家禽工業(yè)中最廣泛使用的疫苗。在二十世紀(jì)70年代后期，由于馬立克氏病疫苗的研制，由馬立克氏病引起的損失已顯著減少(B.W.CalnekandR.L.Witter，in“DiseasesofPoultryMarek’sDisease”(B.W.Calneketal.，Eds.)，IowaStateUniversityPress，Ames，IA第342-385頁，(1991))。最廣泛使用的馬立克氏病疫苗是活HVT或活HVT和病原血清型-2MDV的二價(jià)混合物。活HVT和血清型-2MDV的二價(jià)混合物能在HVT不完全有效的情況下協(xié)同作用，更有效的抵抗馬立克氏病(R.L.Witter，AvianPathol.1149-62(1982)；R.L.Witter和L.F.Lee，AvianPathol.1375-92(1984)；R.L.Witter，“Marek’sDiseasesScientificBasisandMethodsofControlPrinciplesofVaccination.”(L.N.Pyane，Ed.)，MartinusNijoffPublishing，Boston，MA，第203-250頁，(1985))。盡管馬立克氏病疫苗的生產(chǎn)需要每星期制備CEF細(xì)胞，但它們已被廣泛地使用(M.Pattison，“Marek’sDiseasesScientificBasisandMethodsofControlControlofMarek’sdiseasebythepoultryindustrypracticalconsiderations.”(L.N.Pyane，Ed.)，MartinusNijoffPublishing，Boston，MA，第341-350頁，(1985))。因此，疫苗生產(chǎn)非常依賴于無特殊病原體(SPF)畜群生育的蛋的連續(xù)可靠的供應(yīng)。SPF畜群在特殊條件下飼養(yǎng)，并定期檢驗(yàn)證明沒有鳥類病原體(D.H.Thomton，“Marek’sDiseasesScientificBasisandMethodsofControlqualitycontrolandstandardizationofvaccines.”(L.N.Pyane，Ed.)，MartinusNijoffPublishing，Boston，MA，第267-292頁，(1985))。能生育SPF蛋供應(yīng)的任何中斷都會中斷MDV疫苗的生產(chǎn)。MDV疫苗生產(chǎn)的可傳代細(xì)胞系對世界范圍的家禽工業(yè)具有很大的經(jīng)濟(jì)利益。當(dāng)前馬立克氏病疫苗或者是感染的CEF懸浮液或者是由感染馬立克氏病毒疫苗菌株的CEF經(jīng)超聲處理的無細(xì)胞懸浮液。由于沒有適用于繁殖MDV的可傳代細(xì)胞系，因此MDV疫苗工業(yè)將原代CEF用于病毒疫苗的生產(chǎn)(A.E.Churchill，“Marek’sDiseasesScientificBasisandMethodsofControlProductionofvaccines.”(L.N.Pyane，Ed.)，MartinusNijoffPublishing，Boston，MA，第251-266頁，(1985))。原代CEF的壽命有限(大約2-3星期)，必須每1或2星期制備CEF，增加了生產(chǎn)MDV疫苗的成本。CEF細(xì)胞培養(yǎng)的傳代數(shù)限制了MDV。所有這三種MDV血清型在CEF中的連續(xù)培養(yǎng)導(dǎo)致血清型-1MDV的減弱，而對于血清型-2和3，則失去對抵抗對MDV的效力。培養(yǎng)中血清型-1MDV的減毒已廣泛進(jìn)行了研究，與病毒基因組het區(qū)的擴(kuò)張有關(guān)。該擴(kuò)張可以容易地用Southern分析或用PCR進(jìn)行監(jiān)視。高度傳代的血清型-2和血清型-3抗MDV效力損失的原因還不知道。H.Ogura和T.Fuijwawa(ActaMed.Okayama41141-143(1987))通過化學(xué)轉(zhuǎn)化雞胚細(xì)胞建立了一個(gè)細(xì)胞系(CHCC-OU2)。該細(xì)胞系外表是成纖維細(xì)胞，具接觸抑制性，并且在瓊脂中不形成克隆。作者表示，CHCC-OU2細(xì)胞系不惡性轉(zhuǎn)化，不產(chǎn)生內(nèi)源鳥類逆轉(zhuǎn)錄病毒，但能夠支持新城病病毒和幾個(gè)亞組鳥類逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制。然而，作者沒有將他們的研究延伸到其它鳥類病毒(諸如馬立克氏病毒和傳染性粘液囊病病毒之類)的復(fù)制。因此，本發(fā)明的目的是提供生產(chǎn)MDV疫苗的可傳代細(xì)胞系。另外，本發(fā)明的目的是提供生產(chǎn)可傳代的MDV疫苗細(xì)胞系的方法。此外，本發(fā)明的目的是提供生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)的MDV疫苗細(xì)胞系的方法以及使用有效的疫苗細(xì)胞系的方法。本發(fā)明的另一目的是提供用MDV感染鳥類以提供對馬立克氏病免疫的方法。參考以下說明和附圖，這些和其它目的會變得越來越明顯。圖1A-1D是FC126-OCL和SB1-PCL的顯微照片。FC126-OCL的單層培養(yǎng)顯示，空斑由幾個(gè)感染的大細(xì)胞和許多感染的較小細(xì)胞的混合物組成(圖1A)，而在CEF上的FC126空斑由同樣大小的感染細(xì)胞組成(圖1B)。SB1-OCL的單層培養(yǎng)顯示，空斑由大的感染細(xì)胞組成(圖1C)，而在CEF上的SB1空斑由小的感染細(xì)胞組成(圖1D)。圖2是132bpDR順序的PCR擴(kuò)增。從第14代(列1)、第48代(列2)和MDV-OU2.2第48代(列3)分離的DNA用于PCR擴(kuò)增。右邊標(biāo)數(shù)字的箭頭顯示具有1-5個(gè)拷貝132bpDR順序的DR片斷的位置。左邊的箭頭表示從1kbDNA梯式標(biāo)記(GIBCOBRL，LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)的選定帶的位置。圖3是顯示CHCC-OU2DNAev1的PCR擴(kuò)增分析的瓊脂糖凝膠照片。來自CHCC-OU2、ev1雜合的鳥類細(xì)胞或缺乏ev1的鳥類細(xì)胞的DNA用于PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，用溴化乙錠染色，PCR產(chǎn)物在紫外光下進(jìn)行目測檢驗(yàn)。列1為CHCC-OU2DNA的PCR產(chǎn)物，列2為來自含有ev1的DNA模板的PCR產(chǎn)物，列3為來自含有ev1和ev6的DNA模板的PCR產(chǎn)物，列4為來自含有ev15但不含ev1的DNA模板的PCR產(chǎn)物。列5為含有設(shè)定的ev1引物但沒有DNA模板的對照。位于側(cè)邊的1kb梯式標(biāo)記(GIBCOBRL，LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)用于PCR產(chǎn)物大小的測量。圖4是顯示CHCC-OU2DNAev15的PCR擴(kuò)增分析的瓊脂糖凝膠照片。來自CHCC-OU、ev15雜合的鳥類細(xì)胞或缺乏ev15的鳥類細(xì)胞的DNA用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，用溴化乙錠染色，PCR產(chǎn)物在紫外光下進(jìn)行目測檢驗(yàn)。列1為CHCC-OU2DNA的PCR產(chǎn)物，列2為來自含有ev15的DNA模板的PCR產(chǎn)物，列3為來自含有ev1但不含ev15的DNA模板的PCR產(chǎn)物，列4為含有設(shè)定的ev15引物但沒有DNA模板的對照。位于側(cè)邊的1kb梯式標(biāo)記(GIBCOBRL，LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)用于PCR產(chǎn)物大小的測量。本發(fā)明涉及由雞胚細(xì)胞(CEC)(為雞輔助因子(CHf)陰性、不含病毒，用化學(xué)誘變劑處理，然后感染MDV)衍生的單層培養(yǎng)中可傳代的感染馬立克氏病毒的雞細(xì)胞系，該細(xì)胞系能夠體內(nèi)感染鳥類，其中MDV可以以溶源性或非溶源性感染保留在細(xì)胞系內(nèi)。而且，本發(fā)明涉及在非融合單層培養(yǎng)中生產(chǎn)感染潛伏的馬立克氏病毒的可傳代雞細(xì)胞系的方法，包括將雞胚細(xì)胞(為雞輔助因子(CHf)陰性、不含病毒并用化學(xué)誘變劑處理過)與MDV在培養(yǎng)基中混合，使得CEC感染MDV；從未感染的CEC中純化感染MDV的CEC；繁殖感染MDV的CEC使成單層培養(yǎng)細(xì)胞系，其中MDV可以以溶源性或非溶源性感染保留在細(xì)胞系內(nèi)。本發(fā)明涉及用馬立克氏病毒感染鳥類的方法，包括提供由雞胚細(xì)胞(為雞輔助因子(CHf)陰性、不含病毒，用化學(xué)誘變劑處理，然后感染MDV)衍生的、作為單層培養(yǎng)保持的、感染馬立克氏病毒的可傳代雞細(xì)胞系，其中MDV可以以溶源性或非溶源性感染保留在細(xì)胞系內(nèi)，該細(xì)胞系能夠體內(nèi)感染鳥類；用疫苗接種鳥類。本發(fā)明涉及劑量形式的鳥類疫苗，來自含有感染馬立克氏病毒的、由雞胚細(xì)胞(為雞輔助因子(CHf)陰性、不含病毒，用化學(xué)誘變劑處理，然后感染MDV)衍生的、一直作為單層培養(yǎng)保持的可傳代成纖維細(xì)胞系，其中MDV可以以溶源性或非溶源性感染保留在細(xì)胞系內(nèi)。MDV用來描述三種MDV血清型中的任何一種，即血清型1、血清型2或血清型3(也已知為HVT)，而MDV-OCL可以指含有任何一種或多種MDV混合的任何細(xì)胞系。MDV或MDV-OCL是本發(fā)明的工作對象，并在這里使用，作為實(shí)例提供的具體實(shí)施方案(含有具體MDV菌株的細(xì)胞系)除外。感染具體MDV菌株的細(xì)胞系如下識別MDV-OU2或MDV-OU2.2或MDV-OU2.1是指含有血清型1MDV菌株MD11的任何細(xì)胞系。SB1-OCL特指含有血清型2MDV菌株SB1的任何細(xì)胞系。FC126-OCL特指含有血清型3MDV菌株FC126的任何細(xì)胞系。題目為“SustainableCellLineInfectedwithMarek’sDiseaseVirus”的美國申請No.08/549,045(于1995年10月27日申請)中描述的試驗(yàn)證明，CHCC-OU2細(xì)胞系可以感染血清型-1MDV。MDV穩(wěn)定地保留在細(xì)胞系和繼續(xù)生長的感染細(xì)胞中，然而不能預(yù)期感染的方式。與CEF或其它鳥類細(xì)胞的MDV感染不同，直到單層融合并且細(xì)胞系變?yōu)榻佑|抑制后，在感染的CHCC-OU2單層上的空斑生成才可以見到，才產(chǎn)生傳染性病毒。接觸抑制時(shí)，由MDV感染引起的細(xì)胞病作用(CPE)變得明顯，并產(chǎn)生傳染性病毒。在接觸抑制前，MDV以潛伏或半潛伏狀態(tài)保留在CHCC-OU2中。另一方面，感染MDV的CEF或其它鳥類細(xì)胞無論細(xì)胞單層是融合還是半融合都發(fā)展出空斑，并產(chǎn)生傳染性病毒。因此，當(dāng)培養(yǎng)皿中倒平板的CHCC-OU2細(xì)胞感染的密度與一般用于CEF的密度相同時(shí)，CHCC-OU2細(xì)胞在兩個(gè)星期或更長時(shí)間內(nèi)仍不能發(fā)展出空斑和產(chǎn)生傳染性病毒，而感染的CEF在感染后的2-3天發(fā)展出空斑。這時(shí)因?yàn)榕c具有24小時(shí)的雙倍時(shí)間相比，CHCC-OU2細(xì)胞系具有3-5天的雙倍時(shí)間。從亞融合感染MDV的CHCC-OU2細(xì)胞系(MDV-OU2細(xì)胞系)分離的蛋白質(zhì)的Western印跡法檢測到在潛伏期表達(dá)的MDV蛋白pp38和pp14的表達(dá)，而檢測不到后期蛋白(諸如gB、gC、gE和gI)以及在復(fù)制感染期表達(dá)的所有蛋白(于1995年10月27日申請的題目為“SustainableCellLineInfectedWithMarek’sDiseaseVirus”的美國申請No.08/549,045)。亞融合MDV-OU2細(xì)胞系的免疫熒光分析也只能檢測到pp38和pp14。諸如gB之類的后期蛋白只能在融合細(xì)胞系的免疫熒光分析中檢測到。這些結(jié)果顯示，MDV以潛伏感染存在于亞融合的MDV-OU2細(xì)胞系中。MDV-OU2細(xì)胞系將MDV的感染轉(zhuǎn)移至原代CEF，并在接種MDV-OU2細(xì)胞系的易感雞中誘導(dǎo)馬立克氏病的臨床癥狀(于1995年10月27日申請的美國申請No.08/549,045)。在接種后的不同時(shí)間從感染的鳥收集的外周血淋巴細(xì)胞在CEf單層上培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生MDV空斑。從感染的鳥腎分離的DNA通過PCR也證明了MDV的感染。最后，組織學(xué)評價(jià)揭示出淋巴細(xì)胞浸潤以及從接種鳥分離的不同組織中的早期活性淋巴瘤。這些結(jié)果清楚地證明了MDV-OU2細(xì)胞系可以將MDV轉(zhuǎn)移至原代細(xì)胞和雞中。本發(fā)明表明1)MDV細(xì)胞系含有類潛伏狀態(tài)的MDV，2)讓細(xì)胞生長至融合，使傳染性MDV得到恢復(fù)，3)MDV細(xì)胞系可以無限維持，4)MDV穩(wěn)定地保留在MDV細(xì)胞系中。我們料想不到MDV以潛伏或類潛伏狀態(tài)保留在亞融合CHCC-OU2細(xì)胞系中，并且MDV誘導(dǎo)的CPE直到細(xì)胞達(dá)到融合水平后才變得明顯。保留類潛伏狀態(tài)MDV的CHCC-OU2細(xì)胞系能夠分裂，并將MDV轉(zhuǎn)移給子細(xì)胞。只要感染MDV的CHCC-OU2細(xì)胞系在培養(yǎng)中在亞融合水平傳代，那么純的MDV-OCL細(xì)胞系就可以建立。CPE和傳染性病毒通過使MDV-OCL細(xì)胞系達(dá)到融合而產(chǎn)生。然而，亞融合的MDV-OCL細(xì)胞系仍可以將病毒轉(zhuǎn)移至CEF，并在疫苗中時(shí)誘導(dǎo)免疫。感染血清型3MDV(HVT菌株FC126-OCL)的CHCC-OU2細(xì)胞系于1996年2月22日按照布達(dá)佩斯條約以ATCC12052進(jìn)行了保藏，需要時(shí)通過菌名和數(shù)字可以得到。同樣地，感染血清型2MDV(菌株SB1-OCL)的CHCC-OU2細(xì)胞系于1996年2月22日按照布達(dá)佩斯條約以ATCC12053進(jìn)行了保藏，需要時(shí)通過菌名和數(shù)字可以得到。血清型1于1995年9月28日按照布達(dá)佩斯條約以ATCCCRL11985(MDVOU2.2)進(jìn)行了保藏。這些細(xì)胞的保藏權(quán)力僅授予了保藏中心。CHCC-OU2細(xì)胞系、SB1-OCL細(xì)胞系、MDV-O細(xì)胞系CL和FC126-OCL細(xì)胞系的辨別特征CHCC-OU2細(xì)胞系能夠在細(xì)胞培養(yǎng)中連續(xù)生長，是用甲基硝基亞硝基胍(MNNNG)處理轉(zhuǎn)化的雞胚細(xì)胞衍生的。CHCC-OU2細(xì)胞為成纖維細(xì)胞外觀，并表現(xiàn)錨基依賴性生長。經(jīng)過本發(fā)明的CHCC-OU2細(xì)胞系可以通過以下標(biāo)準(zhǔn)區(qū)別于其它鳥類細(xì)胞系。本發(fā)明的CHCC-OU2細(xì)胞系具有依賴于原始細(xì)胞密度的3-5天的雙倍時(shí)間。在培養(yǎng)中以低細(xì)胞密度(不多于3.3×104細(xì)胞/cm2)倒平板的細(xì)胞以原始速率(低于以3.3×104-5.6×104細(xì)胞/cm2的細(xì)胞密度倒平板的細(xì)胞)復(fù)制。而且，CHCC-OU2細(xì)胞的復(fù)制是接觸抑制的，并且CHCC-OU2細(xì)胞在軟瓊脂中不形成克隆。該特征是本發(fā)明CHCC-OU2細(xì)胞獨(dú)特的，而其它鳥類細(xì)胞不顯示接觸抑制的表型，并且許多由MNNNG處理衍生的細(xì)胞系在軟瓊脂中形成克隆。一旦CHCC-OU2單層達(dá)到1.7×105細(xì)胞/cm2的平均細(xì)胞密度時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入G0期，并停止復(fù)制。不象其它鳥類細(xì)胞，CHCC-OU2細(xì)胞不是惡性的，給鳥注射時(shí)不形成腫瘤。本發(fā)明CHCC-OU2細(xì)胞系還包括以下其它區(qū)別特征。1)CHCC-OU2細(xì)胞系表達(dá)第1類主要組織相容性復(fù)合物(第1類NHC)分子。CHCC-OU2細(xì)胞系表現(xiàn)第I類MHCB13單倍型，并對抗第I類MHCB5單倍型的抗血清具有交叉反應(yīng)性。雞胚成纖維細(xì)胞表達(dá)很少可檢測的第I類MHC分子。其它鳥類細(xì)胞或可移植的腫瘤似乎都不具有第I類MHCB13/B5基因型(NazerianAvianPath.16527-544(1987))。2)通過BamHI、HindIII或SacI降解的CHCC-OU2DNA與鳥類逆轉(zhuǎn)錄病毒探針RAV-2雜交的Southern轉(zhuǎn)移，證明CHCC-OU2細(xì)胞系含有來自內(nèi)源鳥類逆轉(zhuǎn)錄病毒ev1、ev6、ev15的順序。存在20個(gè)以上的內(nèi)源鳥類逆轉(zhuǎn)錄病毒亞型。由于這些亞型是通過孟德爾遺傳學(xué)遺傳的，因此在細(xì)胞系內(nèi)或鳥中ev的具體組合可以作為細(xì)胞系或鳥的標(biāo)記。CHCC-OU2細(xì)胞系的內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒表型是組特異性抗原陰性(ga-)和雞輔助因子陰性(chf-)。當(dāng)CHCC-OU2細(xì)胞含有整合到基因組的ev順序時(shí)，細(xì)胞不能產(chǎn)生傳染性逆轉(zhuǎn)錄病毒，證據(jù)是缺乏逆轉(zhuǎn)錄酶活性，用電子顯微鏡檢查缺乏病毒顆粒。鳥可以是任何具體ev亞型純合的、雜合的或是完全不含ev亞型。已研制出PCR擴(kuò)增分析來測定鳥是ev1或ev15純合的還是雜合的。CHCC-OU2細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增揭示出細(xì)胞對ev1(圖3)和ev15(圖4)都是純合的。還沒有得到ev6的PCR分析。3)CHCC-OU2細(xì)胞易于感染某些鳥類逆轉(zhuǎn)錄病毒亞型。不同的鳥類細(xì)胞系對不同亞型的鳥類逆轉(zhuǎn)錄病毒敏感。亞型A(菌株SRA)在CHCC-OU2細(xì)胞中可很好地復(fù)制，而亞型B(菌株SRB)和D(菌株SRD)幾乎檢測不到復(fù)制，而亞型C(菌株BH-RSV(RAV-7))和E(菌株QV2f)在CHCC-OU2細(xì)胞內(nèi)不能復(fù)制。MDV-OCL細(xì)胞系、FC126-OCL細(xì)胞系和SB1-OCL細(xì)胞系表現(xiàn)與原代CHCC-OU2細(xì)胞系相同的的生長特征。當(dāng)這些細(xì)胞保留MDV病毒時(shí)，他們不轉(zhuǎn)化，給鳥注射時(shí)也不誘導(dǎo)腫瘤。這些細(xì)胞系亞融合時(shí)，所有形態(tài)學(xué)特征與原代CHCC-OU2細(xì)胞系相同。當(dāng)單層細(xì)胞的每個(gè)細(xì)胞與其相鄰細(xì)胞接觸時(shí)，即細(xì)胞密度大約4×104-6×104細(xì)胞/cm2時(shí)，傳染性病毒開始在FC126-OCL細(xì)胞系中產(chǎn)生。CPE的發(fā)展和傳染性病毒的產(chǎn)生非?？?，在細(xì)胞接觸的兩天內(nèi)完成。另一方面，SB1-OCL細(xì)胞系和MDV-OU2細(xì)胞系直到單層細(xì)胞的細(xì)胞密度達(dá)到大約6×104-1×105細(xì)胞/cm2時(shí)，才產(chǎn)生PCE和傳染性病毒。細(xì)胞系培養(yǎng)到一定的細(xì)胞密度并且發(fā)生50％融合時(shí)，F(xiàn)C126病毒和SB1病毒的表達(dá)才能檢測到。感染MDV的細(xì)胞系可以用來生產(chǎn)疫苗。感染MDV的細(xì)胞系也可以用來試驗(yàn)抑制或增強(qiáng)細(xì)胞反應(yīng)(諸如刺激第1類主要組織相容性復(fù)合物分子的產(chǎn)生，并藉此刺激細(xì)胞介導(dǎo)的對MDV的反應(yīng))的不同試劑和條件。推薦的MDV病毒選自血清型1、2和3。血清型3稱為火雞皰疹病毒(HVT)。MDV可以是含有外源基因或缺失突變體、用作疫苗或其它用途的重組病毒。MDV也可以是包含復(fù)制原點(diǎn)和外源DNA順序的缺陷病毒。本發(fā)明特別涉及穩(wěn)定感染HVT菌株FC126的可傳代雞細(xì)胞系(FC126-OCL)和穩(wěn)定感染血清型2MDV菌株BS1的可傳代雞細(xì)胞系(SB1-OCL)。FC126-OCL細(xì)胞系和SB1-OCL細(xì)胞系在培養(yǎng)中連續(xù)生長，一旦融合，顯示MDV感染的空斑特征。FC126-OCL和SB1-OCL可以分別或一起用作疫苗，以提供鳥類對MDV病原菌株的免疫。FC126-OCL和SB1-OCL細(xì)胞保持著生命力，在低溫儲藏和連續(xù)培養(yǎng)后繼續(xù)產(chǎn)生MDV。如實(shí)施例所示，細(xì)胞系感染MDV。在融合單層中清楚的空斑的存在與溶細(xì)胞的限制性復(fù)制感染一致，與在原代CEF中觀察的相似。當(dāng)在每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)世代后融合增加時(shí)，由細(xì)胞系產(chǎn)生的傳染性病毒的效價(jià)如由保留MDV的細(xì)胞系的復(fù)制所預(yù)期的。細(xì)胞系能夠?qū)DV感染轉(zhuǎn)移至原代CEF、未感染的CHCC-OU2細(xì)胞和鳥類。最后，細(xì)胞系能夠使鳥類抵抗MDV病原菌株(諸如血清型1MDV菌株GA第8代和Md11p15)。從感染可傳代MDV疫苗細(xì)胞系的培養(yǎng)物或MDV感染的CEF的CHCC-OU2多次大容量培養(yǎng)中建立可傳代MDV疫苗細(xì)胞系的原代細(xì)胞株。當(dāng)病毒空斑變得清楚時(shí)，通過胰蛋白酶作用或從培養(yǎng)容器刮下來收集這些培養(yǎng)物，并將感染MDV的細(xì)胞接種到新培養(yǎng)器中。重復(fù)這些傳代培養(yǎng)，直至培養(yǎng)物中大多數(shù)CHCC-OU2細(xì)胞是被MDV疫苗感染的，這樣，制造出可以用作MDV疫苗生產(chǎn)的原代細(xì)胞株(masterseedstock)。這些原代細(xì)胞株通過美國農(nóng)業(yè)部對MDV疫苗的使用進(jìn)行了驗(yàn)證。當(dāng)感染MDV疫苗的CEF用作原材料時(shí)，必須增加傳代數(shù)，使得細(xì)胞培養(yǎng)了3星期以確保所有的CEF(壽命大約為2星期)已死亡。制造可傳代MDV疫苗原代細(xì)胞株的另一方法是，用包含疫苗病毒基因組的DNA轉(zhuǎn)染CHCC-OU2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的方法包括J.Sambrook，等人在“molecularcloningalaboratorymanual”，2ndEd.，ColdSpimgHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，N.Y.(1989)第16.30-16.55頁中描述的用來用DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的任何技術(shù)，諸如磷酸鈣沉淀、聚凝胺、DEAE-葡聚糖、LIPOFECTIN、電擊或原生質(zhì)體融合等。DNA轉(zhuǎn)染在基因工程的病毒載體或缺陷病毒載體的原代細(xì)胞株的制備中特別有用。制造可傳代MDV疫苗的原代細(xì)胞株還有一個(gè)方法是通過感染的細(xì)胞群體的細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)張。培養(yǎng)CHCC-OU2細(xì)胞的用本文描述的方法以低劑量重復(fù)感染來感染MDV。當(dāng)空斑變得清楚時(shí)，從感染的CHCC-OU2培養(yǎng)物上取出1個(gè)空斑，并轉(zhuǎn)移至不含任何細(xì)胞的組織培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)細(xì)胞直至細(xì)胞接近融合，通過胰蛋白酶作用收集培養(yǎng)物，通過低速離心濃縮感染MDV的細(xì)胞，并接種到較大的組織培養(yǎng)皿中。再培養(yǎng)細(xì)胞直至細(xì)胞接近融合。通過這種方式，大多數(shù)細(xì)胞被感染，而且所有感染的細(xì)胞都來自一個(gè)MDV空斑。通過使感染MDV的細(xì)胞系的細(xì)胞達(dá)到融合，在細(xì)胞擴(kuò)大規(guī)模培養(yǎng)的任何階段內(nèi)均可完成傳染性MDV的生產(chǎn)。使用MDV-OCL細(xì)胞系來生產(chǎn)MDV疫苗的方法如下。以亞融合密度培養(yǎng)MDV-OCL細(xì)胞系的原代細(xì)胞株。MDV以潛伏狀態(tài)保留在分裂的細(xì)胞中，直至培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到融合水平，此時(shí)病毒感染進(jìn)入復(fù)制期。當(dāng)感染發(fā)展為可見時(shí)，通常是融合后2天，用MDV疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域技術(shù)人員常用的技術(shù)收集這些細(xì)胞(A.E.Churchill，“Marek’sDiseasesScientificBasisandMethodsofControlProductionofVaccines.”(L.N.Pyane，Ed.)，MartinusNijoffPublishing，Boston，MA，第251-266頁，(1985))。用于MDV疫苗的感染細(xì)胞的制備一般涉及以下步驟，1)細(xì)胞用胰蛋白酶處理，或從培養(yǎng)載體上刮下，2)復(fù)制感染的細(xì)胞通過低速離心濃縮，3)將已濃縮的感染細(xì)胞再懸浮于適當(dāng)體積的稀釋液中，以生產(chǎn)疫苗，濃度定義為每毫升MDV空斑生成單位(PFU/ml)。連續(xù)MDV疫苗生產(chǎn)最好通過安排MDV-OCL細(xì)胞系由原代細(xì)胞株進(jìn)行系列多次培養(yǎng)來獲得，在系列培養(yǎng)中每一連續(xù)培養(yǎng)為低于先前培養(yǎng)的亞融合水平。例如，將培養(yǎng)物建立在90％、80％、70％、60％和50％的亞融合水平。當(dāng)90％的培養(yǎng)物達(dá)到融合時(shí)，MDV感染在復(fù)制期，然后收集培養(yǎng)物用于MDV疫苗，由原代細(xì)胞株建立新的50％融合的培養(yǎng)細(xì)胞。這樣，可以得到MDV疫苗的連續(xù)生產(chǎn)。另一方法，也是生產(chǎn)MDV疫苗的有效方法是保持未感染CHCC-OCL細(xì)胞的培養(yǎng)物。這些培養(yǎng)物被MDV-OCL細(xì)胞系的原代細(xì)胞株。該方法類似于當(dāng)前用來由CEF生產(chǎn)疫苗的方法(A.E.Churchill，“Marek’sDiseasesScientificBasisandMethodsofControlProductionofVaccines.”(L.N.Pyane，Ed.)，MartinusNijoffPublishing，Boston，MA，第251-266頁，(1985))。實(shí)施例1細(xì)胞和病毒CEF細(xì)胞的制備、繁殖以及HVT的感染按先前描述的方法進(jìn)行(C.Glaubigeretal.，J.Virol.451228-1234(1983)；P.M.CoussensandL.F.Velicer，J.Vriol.622373-2379(1988))。用于該研究的HVT疫苗菌株FC126的細(xì)胞傳代到第10代(FC126p10)。用于該研究的血清型2疫苗菌株SB1的細(xì)胞傳代到第29代(SB1p29)。CHCC-OU2細(xì)胞(H.OguraandT.Fuiiwara，ActaMed.Okayama41141-143(1987))從美國農(nóng)業(yè)部(USDA)鳥類疾病與癌實(shí)驗(yàn)室(ADOL)的Dr.DoaldSalter(EastLansing，Michigan)處獲得，在37℃含有5％CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)在添加10％小牛血清和2％磷酸胰蛋白胨肉湯(TPB)的LeibovitzL15-McCoy5A(LM)(Gibco，GrandIsland，NY)培養(yǎng)基中。實(shí)施例2MDV-OU2血清型1細(xì)胞系用Md11p15感染CHCC-OU2細(xì)胞如在申請No.08/549,045中所示，將5.0×107CHCC-OU2細(xì)胞與2.0×107感染MD11p15的CEF混合，使CHCC-OU2被MDV菌株MD11的第15代培養(yǎng)細(xì)胞(MD11p15)感染，然后，培養(yǎng)在添加4％小牛血清(CS)的LM培養(yǎng)基中。CHCC-OU2細(xì)胞與感染的CEF細(xì)胞繼續(xù)共培養(yǎng)四代。每一代的細(xì)胞保藏在-135℃冷凍的培養(yǎng)基中(添加20％CS和10％二甲亞砜的LM培養(yǎng)基(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD))。在感染后的四代，觀察到大量的空斑(每個(gè)150mm培養(yǎng)皿大約100個(gè)空斑)-CEF細(xì)胞感染MDV的特征。其中兩個(gè)空斑用無菌克隆柱形分離器(cloningcylinder)分離。將克隆柱形分離器置于單個(gè)空斑之上，細(xì)胞用胰蛋白酶處理，并從克隆柱形分離器抽吸。抽吸出的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有添加4％CS的LM培養(yǎng)基的35mm培養(yǎng)皿中擴(kuò)大培養(yǎng)。在擴(kuò)大培養(yǎng)期間，不讓細(xì)胞融合，每48小時(shí)或72小時(shí)更換培養(yǎng)基。擴(kuò)大培養(yǎng)的克隆命名為MDVOU2.1和MDVOU2.2。在MDVOU2.1和MDVOU2.2純化過程中，慢慢地形成CPE。完全發(fā)展的空斑含合胞體呈圓形擴(kuò)張區(qū)域、松散粘附，直至感染后四星期時(shí)才可見細(xì)胞。我們料想不到感染后14天出現(xiàn)可見的空斑而空斑的形成依賴于達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)融合和接觸抑制的層度。通過比較，感染MDV菌株Md11p15的典型CEF單層細(xì)胞在感染后5-7天內(nèi)將迅速形成可見的空斑，單層細(xì)胞在10-14天內(nèi)完全破壞。CEF中空斑的形成與細(xì)胞單層的融合無關(guān)。在共培養(yǎng)4星期后，將細(xì)胞在-135℃下低溫保藏兩星期。冷凍的細(xì)胞通過將感染的(Md11p15/OU2)與未感染的CHC-OU2細(xì)胞混合，再建立細(xì)胞培養(yǎng)物。與MDV感染一致的空斑直到細(xì)胞達(dá)到融合-大約倒平板后14天才能觀察到。實(shí)施例3FC126-OCL細(xì)胞系對于FC126-OCL.1，第0代來自培養(yǎng)在100mm組織培養(yǎng)皿中融合CHCC-OU2被2.5×106PFU第0代FC126(FC126p10)感染的CEF所感染。當(dāng)CPE變得清楚時(shí)，收集感染的細(xì)胞，保存在含有10％DMSO、20％小牛血清的5％LM的儲藏緩沖液(FSB)(第0代)中冷凍于-135℃。感染的冷凍細(xì)胞的10-2稀釋液用來感染在24孔組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的1孔融合的CHCC-OU2。CPE接近100％后，將細(xì)胞于-135℃冷凍在FSB中(第1代)。在-135℃儲藏后，將細(xì)胞復(fù)蘇，用來感染在24孔組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的3孔稀釋度分別是為10-1、10-2和10-3的融合CHCC-OU2(第2代)。合并三個(gè)稀釋度，再倒入12孔組織培養(yǎng)平板的1個(gè)孔中(第3代)。當(dāng)細(xì)胞融合、CPE變得清楚時(shí)，收集感染的細(xì)胞，并分別在12孔組織培養(yǎng)皿中的2個(gè)孔培養(yǎng)(第4代)。當(dāng)CPE變得清楚時(shí)，從兩個(gè)孔中收集細(xì)胞并合。取出0.1ml，在12孔組織培養(yǎng)皿中的1孔培養(yǎng)(第5代)。當(dāng)CPE清楚時(shí)，收集細(xì)胞并冷凍在-135℃的FSB中。然后冷凍的細(xì)胞用來感染100mm組織培養(yǎng)皿中融合的CHCC-OU2(第6代)。當(dāng)CPE清楚時(shí)，收集細(xì)胞，取出1/10樣品以測定第6代的PFU/ml，其余的感染細(xì)胞再在100mm組織培養(yǎng)皿中倒平板(第7代)。當(dāng)CPE清楚時(shí)，收集細(xì)胞，取出1/10樣品以測定第7代的PFU/ml，其余的感染細(xì)胞再在100mm組織培養(yǎng)皿中倒平板(第8代)。當(dāng)CPE清楚時(shí)，收集細(xì)胞，取出1/10樣品以測定第8代的PFU/ml，其余的感染細(xì)胞作為FC126-OCL.1在-135℃冷凍在FSB中。對于FC126-OCL.2，第0代來自在24孔組織培養(yǎng)皿的1孔中培養(yǎng)的與2.5×106感染FC126p10的CEF融合的CHCC-OU2。當(dāng)CPE變?yōu)?00％后，將細(xì)胞凍存在-135℃的FSB中。在-135℃儲藏后，將細(xì)胞復(fù)蘇，用來感染在24孔組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的3孔稀釋度分別為10-1、10-2和10-3的融合CHCC-OU2(第1代)。合并三個(gè)稀釋度，在12孔組織培養(yǎng)平板的1孔中培養(yǎng)(第2代)。當(dāng)細(xì)胞融合時(shí)，CPE變得清楚，計(jì)數(shù)為55個(gè)空斑。收集感染的細(xì)胞，并分別在12孔組織培養(yǎng)皿中的2個(gè)孔中培養(yǎng)(第3代)。當(dāng)CPE變得清楚時(shí)，從兩個(gè)孔中收集細(xì)胞合并。效價(jià)大約為5.5×103PFU/ml。取出0.1ml，在12孔組織培養(yǎng)皿中的1孔中培養(yǎng)(第4代)。當(dāng)CPE清楚時(shí)，收集細(xì)胞并冷凍在-135℃的FSB中。然后冷凍的細(xì)胞用來感染100mm組織培養(yǎng)皿中的融合CHCC-OU2(第5代)。當(dāng)CPE清楚時(shí)，收集細(xì)胞，取出1/10樣品以測定第5代的PFU/ml，其余的感染細(xì)胞再在100mm組織培養(yǎng)皿中倒平板(第6代)。當(dāng)CPE清楚時(shí)，收集細(xì)胞，取出1/10樣品以測定第6代的PFU/ml，其余的感染細(xì)胞再在100mm組織培養(yǎng)皿中倒平板(第7代)。當(dāng)CPE清楚時(shí)，收集細(xì)胞，取出1/10樣品以測定第7代的PFU/ml，其余的感染細(xì)胞作為FC126-OCL.2于-135℃冷凍在FSB中。產(chǎn)生感染HVT的CHCC-OU2細(xì)胞(FC126-OCL.3)的方法。在150mm組織培養(yǎng)皿中含有2.5×106CHCC-OU2細(xì)胞的單層融合細(xì)胞用2.0×106PFU的FC126p10感染的CEF進(jìn)行感染。培養(yǎng)3天后，觀察到大量空斑-病毒感染的特征。感染的細(xì)胞用胰蛋白酶處理，并轉(zhuǎn)移到無菌150mm培養(yǎng)皿中。保存1/10樣品以測定PFU數(shù)值。命名為第1代的感染細(xì)胞再培養(yǎng)兩天，然后用胰蛋白酶處理，并轉(zhuǎn)移到無菌150mm組織培養(yǎng)皿中，同時(shí)保存1/10樣品以測定PFU數(shù)值。第2代的感染細(xì)胞再培養(yǎng)1天，然后用胰蛋白酶處理，并等份轉(zhuǎn)移到無菌150mm培養(yǎng)皿中的兩個(gè)孔中。保留1/10樣品以測定PFU數(shù)值，1/10樣品保存在-135℃的FSB中。以先前描述的方式進(jìn)行感染細(xì)胞的系列傳代增加感染細(xì)胞的比例(或PFU)。盡管已描述了三種產(chǎn)生FC126-OCL的不同方法，并且由三種方法中分別產(chǎn)生的細(xì)胞分別命名為FC126-OCL.1、FC126-OCL.2和FC126-OCL.3，但由于所有三種都是用感染FC126p10的CEF的相同的原代細(xì)胞株建立的，因此三種細(xì)胞系基本上是相同的。只是傳代水平和培養(yǎng)計(jì)數(shù)稍微不同。三種細(xì)胞系之間培養(yǎng)中的微小變化不能賦予三個(gè)細(xì)胞系以差異。細(xì)胞系的命名只是為了便于追蹤實(shí)驗(yàn)，并不反映三個(gè)細(xì)胞系中FC126病毒生物學(xué)性質(zhì)的差異。三種方法說明，無論使用哪種方法，都可以構(gòu)建MDV細(xì)胞系。所有三種細(xì)胞都可以用一般名稱FC126-OCL來表示。實(shí)施例4SB1-OCL細(xì)胞系產(chǎn)生感染SB1的CHCC-OU2(SB1-OCL.1)的方法與產(chǎn)生FC126-OCL.3描述的方法相同。在150mm培養(yǎng)皿中含有20×106CHCC-OU2細(xì)胞的單層融合細(xì)胞用3×105PFU的第29代SB1(SB1p29)感染的CEF進(jìn)行感染。培養(yǎng)3天后，觀察到大量空斑-病毒感染的特征。感染的細(xì)胞用胰蛋白酶處理，并轉(zhuǎn)移到無菌150mm培養(yǎng)皿中。保存1/10樣品以測定PFU數(shù)值。命名為第1代的感染細(xì)胞再培養(yǎng)兩天，然后用胰蛋白酶處理，并轉(zhuǎn)移到無菌150mm培養(yǎng)皿中，同時(shí)保存1/10樣品以測定PFU數(shù)值。第2代的感染細(xì)胞再培養(yǎng)1天，然后用胰蛋白酶處理，并等份轉(zhuǎn)移到2個(gè)無菌150mm培養(yǎng)皿中。保留1/10樣品以測定PFU數(shù)值。以先前描述的方式進(jìn)行系列傳代增加感染細(xì)胞的比例(或PFU)。以先前描述的方式制成傳代水平為3、4以及多至20的SB1-OC1原代細(xì)胞株。實(shí)施例5HVT-OCL細(xì)胞系和SB1-OCL細(xì)胞系病毒效價(jià)的測定FC126-OCL細(xì)胞系.1、.2和.3以及SB1-OCL.1的PFU的測定是通過培養(yǎng)保存的1/10樣品(來自CEF的每次傳代3)的系列稀釋液來進(jìn)行。在含有4％小牛血清的LM中制成系列稀釋液，稀釋度以10倍遞增，范圍為10-1-10-7。表1表明，細(xì)胞系FC126-OCL.1和FC126-OCL.3組織培養(yǎng)第5、6、7和8代細(xì)胞以及細(xì)胞系FC126-OCL.2和SB1-OCL.1頭三代的效價(jià)增加。由于這些代的細(xì)胞是由感染細(xì)胞在空組織培養(yǎng)皿中再倒平板制成的，并不是簡單地感染組織培養(yǎng)皿中的未感染細(xì)胞，因此在每一培養(yǎng)傳代后效價(jià)的增加表示含有病毒的細(xì)胞系的富集。在用原始感染FC126的CEF的高效價(jià)原代細(xì)胞株感染后，由于幾個(gè)原因使得在細(xì)胞系純化的隨后傳代中沒有CEF能存活。1)CEF的壽命有限，在組織培養(yǎng)中存活不超過兩三個(gè)星期，因此在CHCC-OU2初始感染兩個(gè)星期以后，CEF就已死亡。2)CHCC-OU2是被接近100％CPE的感染CEF進(jìn)行初始感染的。在100％CPE時(shí)，每個(gè)細(xì)胞都被感染，并且感染的細(xì)胞開始與組織培養(yǎng)皿分離，在感染的此時(shí)將CEF例平板不能形成單層細(xì)胞3)CEF對冷凍-復(fù)蘇非常敏感，經(jīng)過幾輪冷凍-復(fù)蘇后通常不能存活。FC126-OCL.3細(xì)胞系的PFU/ml比在CEF上繁殖的FC126的PFU/ml高兩個(gè)數(shù)量級。SB1-OCL.1細(xì)胞系的PFU/ml比在CEF上繁殖的SB1的PFU/ml高兩個(gè)數(shù)量級。兩個(gè)細(xì)胞系的最大效價(jià)尚未測定。表1</tables>實(shí)施例6FC126-OC1.1與常規(guī)FC126疫苗的比較市售HVT疫苗菌株FC126(FC126-OCL)的可傳代細(xì)胞系保護(hù)雞抵抗MDV的能力與在CEF上繁殖的HVT疫苗菌株FC126(FC126-CEF)-當(dāng)前生產(chǎn)MDV疫苗的方法-的抗MDV能力進(jìn)行比較。該實(shí)驗(yàn)將FC126-OCL以當(dāng)前FC126疫苗推薦的相同劑量免疫1天大的雞，比較兩者的功效。四組1天大的雞(無特殊病原體，來自SPAFAS，Chicago，IL對MDV敏感的雞)接種以下疫苗1)2,000PFU第17代細(xì)胞培養(yǎng)的FC126-OCL(16只雞)，2)2,000PFU第10代細(xì)胞培養(yǎng)的FC126-CEF(16只雞)，3)與FC126-OCL相同細(xì)胞濃度的未感染OCL(10只雞)。第四組10只雞作為對照。接種疫苗后第7天，第1組和第2組的13只雞和第3組的8只雞以及對照組注射(challenge)2,000PFU的毒性MDV菌株GA。注射后第32天，這些雞作尸體解剖，以檢查MDV感染的病理學(xué)跡象。MDV病理學(xué)表達(dá)證實(shí)為外周神經(jīng)系統(tǒng)的肉眼損害、在多種器官(諸如生殖腺、肝、腎、心臟和脾之類)內(nèi)存在淋巴樣腫瘤以及腔上囊萎縮。接種未感染細(xì)胞系的雞和對照組雞都有大量MDV感染的病理特征。非常明顯，接種FC126-OCL細(xì)胞系并注射MDV的雞都沒有MDV感染的任何病理學(xué)證據(jù)。功效實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于表2中。實(shí)驗(yàn)證明，在使用FC126-CEF市推薦劑是相同的劑量水平下，F(xiàn)C126-OCL與FC126-CEF具有相同的免疫效果。表21雞在第1天接種2000PFU疫苗。2雞接種等于2000PFUFC126-OCL1p17中細(xì)胞數(shù)的OCL細(xì)胞。3所有雞在接種后第7天注射2000PFUMDV菌株GA。實(shí)驗(yàn)在注射后第32天結(jié)束。保護(hù)標(biāo)志為尸體解剖缺乏MDV的跡象。4保護(hù)指數(shù)對照中MD％-接種的MD％/對照MD％×100。實(shí)施例7MVD在細(xì)胞系中的穩(wěn)定性MDV-OU2細(xì)胞系傳代第31代后，通過PCR分析病毒DNAhet區(qū)域的擴(kuò)張。意想不到的是，沒有觀察到het區(qū)域的擴(kuò)張。因此，與MDV在CEf中的繁殖不同，MDV在本發(fā)明中穩(wěn)定化，因此使得MDV細(xì)胞系可以無限地繁殖，而沒有疫苗功效降低的風(fēng)險(xiǎn)。用在細(xì)胞培養(yǎng)中系列傳代后PCR分析以評估MDVOU2.2和OU2.1中的132bpDR順序的數(shù)目?？偧?xì)胞DNA用標(biāo)準(zhǔn)方法從第14代MD11細(xì)胞感染的CEF、第48代MD11細(xì)胞感染的CEF和第48代MDV-OU2.2細(xì)胞中提取(J.Sambrook，etal.，in“Molecularcloningalaboratorymanual”，2nded.，ColdSpimgHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，N.Y.(1989)第9.16-9.19頁)，并用作PCR擴(kuò)增132bpDR順序的模板。上游寡聚核苷酸引物為5’-TGCGATGAAAGTGCTATGGAGG-3’(SEQIDNO1)。下游寡聚核苷酸引物為5’-GAGAATCCCTATGAGAAAGCGC-3’(SEQIDNO2)。上游引物位于距DR順序的5’端3bp處。下游引物位于DR順序3’端下游6bp處。兩個(gè)引物在兩個(gè)拷貝DR順序的情況下擴(kuò)增317bp片斷(R.F.Silva，AvianDis.36521-528(1992))。PCR的條件由原來的條件稍微作些修改(R.F.Silva，AvianDis.36521-528(1992))。簡單地說，將500ng總細(xì)胞DNA與每種dNTP20mM、每對寡聚核苷酸引物20μM、10μl10×PCR反應(yīng)緩沖液(GIBCOBRL，LifeTechnologies，Gathersburg，MD)、1.5mMMgCl2和1.0UTaq聚合酶(GIBCOBRL，LifeTechnologies，Gathersburg，MD)混合。使用GeneAmp9600擴(kuò)增儀(PerkinElmerCetus，Norwalk，CT)進(jìn)行PCR反應(yīng)。按照最初在95℃變性5分鐘的步驟，在95℃45秒、67℃45秒和72℃45秒進(jìn)行25個(gè)周期的擴(kuò)增。通過在72℃10分鐘的最后伸長步驟完成PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物在用溴化乙錠染色的6％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分析，在紫外光下拍照。通過比較1kbDNA梯式標(biāo)記(GIBCOBRL，LfieTechnologies，Gathersburg，MD)測定擴(kuò)增片斷的大小。在所有反應(yīng)中，都可以見到185kb的擴(kuò)增片斷-相當(dāng)于1個(gè)拷貝的132bpDR(圖2)。然而，病原MD11的特征-相當(dāng)于2個(gè)拷貝的132bpDR的317kb片斷在第14代MD11中占優(yōu)勢(圖2，第1列)。該317bp片斷到第48代時(shí)在MD11中減弱，不再存在(圖2，第2列)。很明顯，第48代的MDVOU2.2仍保留病原MD11特征的317bp片斷(圖2，第3列)。PCR分析結(jié)果顯示出，在MDVOU2.2和OU2.1(未顯示)細(xì)胞系中的MDV在體內(nèi)系列傳代48代后不減弱。相反，正如所預(yù)期的，MD11在CEF上體內(nèi)系列傳代48代后減弱。這些結(jié)果顯示出，MDV在體內(nèi)繁殖期間穩(wěn)定地保留在CHCC-OU2細(xì)胞中。這一未預(yù)期的結(jié)果對MDV疫苗生產(chǎn)商非常重要，因?yàn)楸景l(fā)明使得疫苗病毒能在體內(nèi)無限繁殖或至少繁殖48個(gè)細(xì)胞世代。這與在CEF上MDV疫苗菌株的繁殖相反，后者的體內(nèi)傳代導(dǎo)致保護(hù)功效的喪失。通常的MDV疫苗菌株只可以在CEF上從原代細(xì)胞株繁殖5代。5代后的每一代在得到美國農(nóng)業(yè)部的許可證之前，必須證明功效與第5代相同。一旦向美國農(nóng)業(yè)部證明，本發(fā)明則能夠使疫苗菌株從原代細(xì)胞株后無限繁殖，在第5代后不用每代再取得資格。以下實(shí)施例表明CHCC-OU2細(xì)胞的特征。感染MDV細(xì)胞的這些特征是相同的。實(shí)施例8B.F.Benkel等人的技術(shù)(PoultryScience711520-1526(1992))用來證明CHCC-OU2細(xì)胞是ev1純合的?？偧?xì)胞DNA用標(biāo)準(zhǔn)方法(J.Sambrook，etal.，in“Molecularcloningalaboratorymanual”，2nded.，ColdSpirngHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，N.Y.(1989)第9.16-9.19頁)從CHCC-OU2細(xì)胞和含有ev1、ev1和ev6、或ev15的鳥類細(xì)胞中提取?？偧?xì)胞DNA用作PCR擴(kuò)增的模板，使用的引物組含有引物PR-A(5’-GCACCAAACAATCTAGTCTGTGC)(SEQIDNO3)、PR-B(5’-AAGTACTCACTTCTCTGAAC)(SEQIDNO4)和PR-C(5’-GCCAAGCTTCAATGAAGCAGAAGGCTTC)(SEQDNO5)。引物PR-A對ev1插入的上游基因組區(qū)域是特異性的。引物PR-B對ev1插入的下游基因組區(qū)域是特異性的，而引物PR-A對ev1的長末端重復(fù)是特異性的。用這些引物，來自ev1純合的鳥類DNA的PCR將產(chǎn)生長度為300bp的DNA片斷。用這些引物，來自ev1雜合的鳥類DNA的PCR將產(chǎn)生300bp和510bp的DNA片斷，而來自缺乏ev1的鳥類DNA的PCR將產(chǎn)生510bp的DNA片斷。使用GeneAmp9600擴(kuò)增儀(PerkinElmerCetus，Norwalk，CT)按B.F.Benkel等人描述的進(jìn)行PCR反應(yīng)(PoultryScience711520-1526(1992))。PCR產(chǎn)物在用溴化乙錠染色的1％瓊脂糖凝膠來進(jìn)行分析，并在紫外光下拍照(J.Sambrook，etal.，in“Molecularcloningalaboratorymanual”，2nded.，ColdSpirngHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，N.Y.(1989)第6.2-6.19頁)。通過比較1kbDNA梯式標(biāo)記(GIBCOBRL，LifeTechnologies，Gathersburg，MD)測定擴(kuò)增片斷的大小。圖3中，CHCC-OU2細(xì)胞產(chǎn)生300bp的單一產(chǎn)物，顯示CHCC-OU2細(xì)胞是ev1純合的。雜合ev1以及ev1和ev6、陽性對照DNA產(chǎn)生300bp和510bp兩個(gè)產(chǎn)物。陰性對照ev15DNA只產(chǎn)生510bp產(chǎn)物，預(yù)計(jì)該DNA不含ev1。B.F.Benkel和E.J.Smith的技術(shù)(PoultryScience721601-1605(1993))用來證明CHCC-OU2細(xì)胞是ev15純合的。來自CHCC-OU2細(xì)胞和含ev1或ev15的鳥類細(xì)胞的總細(xì)胞DNA用作PCR擴(kuò)增的模板，使用的引物組含有引物15-1(5’-CAAATGAGGGTAATAAGGGAG)(SEQIDNO6)和15-2(5’-CACTACCAAATATAATTCTGTAG)(SEQIDNO7)。引物15-1對ev15插入的上游基因組區(qū)域是特異性的，而引物PR-B對ev15插入的下游基因組區(qū)域是特異性的。用這些引物，來自ev15純合的鳥類DNA的PCR將產(chǎn)生長度為434bp的DNA片斷。用這些引物，來自ev15雜合的鳥類DNA的PCR將產(chǎn)生434bp和181bp的DNA片斷，而來自缺乏ev15的鳥類DNA的PCR將產(chǎn)生181bp的DNA片斷。使用GeneAmp9600擴(kuò)增儀(PerkinElmerCetus，Norwalk，CT)按B.F.Benkel等人描述的進(jìn)行PCR反應(yīng)(PoultryScience711520-1526(1992))。PCR產(chǎn)物在用溴化乙錠染色的1％瓊脂糖凝膠來進(jìn)行分析，并在紫外光下拍照(J.Sambrook，etal.，in“Molecularcloningalaboratorymanual”，2nded.，ColdSpirngHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，N.Y.(1989)第6.2-6.19頁)。通過比較1kbDNA梯式標(biāo)記(GIBCOBRL，LifeTechnologies，Gathersburg，MD)測定擴(kuò)增片斷的大小。圖4中，CHCC-OU2細(xì)胞產(chǎn)生434bp的單一產(chǎn)物，顯示CHCC-OU2細(xì)胞是ev15純合的。雜合ev15以及陽性對照DNA產(chǎn)生434bp和181bp兩個(gè)產(chǎn)物。陰性對照ev1DNA只產(chǎn)生181bp產(chǎn)物，預(yù)計(jì)該DNA不含ev15?？梢灾С諱DV復(fù)制并用來生產(chǎn)MDV疫苗的連續(xù)細(xì)胞系對家禽工業(yè)具有極大的經(jīng)濟(jì)意義。這一細(xì)胞系的優(yōu)點(diǎn)是1)由于消除了必須連續(xù)供應(yīng)能生育的SPF畜群的蛋這一環(huán)節(jié)，降低了由于SPF蛋供應(yīng)中斷引起的疫苗生產(chǎn)損失的風(fēng)險(xiǎn)，并消除了能生育的SPF蛋價(jià)格的影響，該細(xì)胞系實(shí)際上降低了與生產(chǎn)MDV疫苗有關(guān)的成本；2)原代細(xì)胞株可能合法化，藉此避免了與制備每批CEF細(xì)胞有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)；3)感染MDV疫苗菌株的CHCC-OU2細(xì)胞可以無限繁殖，病毒的生產(chǎn)可以讓感染的細(xì)胞達(dá)到融合來誘導(dǎo)；4)CHCC-OU2細(xì)胞可以使用由CEF細(xì)胞生產(chǎn)MDV疫苗所用的同樣生產(chǎn)技術(shù)；5)MDV被穩(wěn)定在細(xì)胞系中。降低的成本將使家禽生產(chǎn)商和消費(fèi)者受益。在本發(fā)明中，生產(chǎn)MDV并用作疫苗以保護(hù)鳥類抵抗馬立克氏病的可傳代細(xì)胞系進(jìn)行了權(quán)利要求。以上描述只是為了說明本發(fā)明，本發(fā)明僅受下文所附的權(quán)利要求所限制。附錄1(1)一般資料(i)申請者PaulM.Coussens，AminAbuioub，J.DavidReilly(ii)發(fā)明的題目用于馬立克氏病毒疫苗生產(chǎn)的可傳代細(xì)胞系的改進(jìn)(iii)順序數(shù)目7(iv)通訊地址(A)地址IanC.Mcleod(B)街道2190CommondParkway(C)城市Okemos(E)國家美國(F)郵政編碼48864(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容(C)操作系統(tǒng)MS-DOS(版本3.3)(D)軟件Wordperfect5.1(vi)當(dāng)前的申請資料(A)申請?zhí)?B)存檔日期(C)分類(vii)先前的申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)柎a08/549,045(B)存檔日期1995年10月27日(viii)委托人/代理人資料(A)姓名IanC.McLeiod(B)登記號碼20.931(ix)電訊資料(A)電話(517)347-4100(B)傳真(517)347-4103(2)SEQIDNO1的資料(i)順序特征(A)長度22個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型(A)說明合成DNA(iii)假說否(iv)反向否(vi)來源(A)有機(jī)體馬立克氏病毒(vii)IMMEDIATESOURCE(A)圖書館(xi)順序說明SEQIDNO1TGCGATGAAAGTGCTATGGAGG22(3)SEQIDNO2的資料(i)順序特征(A)長度22個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型(A)說明合成DNA(iii)假說否(iv)反向否(vi)來源(A)有機(jī)體馬立克氏病毒(vii)IMMEDIATESOURCE(A)圖書館(xi)順序說明SEQIDNO2GAGAATCCCTATGAGAAAGCGC22(4)SEQIDNO3的資料(i)順序特征(A)長度23個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型(A)說明合成DNA(iii)假說否(iv)反向否(vi)來源(A)有機(jī)體馬立克氏病毒(vii)IMMEDIATESOURCE(A)圖書館(xi)順序說明SEQIDNO3GCACCAAACAATCTAGTCTGTGC23(5)SEQIDNO4的資料(i)順序特征(A)長度20個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型(A)說明合成DNA(iii)假說否(iv)反向否(vi)來源(A)有機(jī)體鳥類逆轉(zhuǎn)錄病毒(vii)IMMEDIATESOURCE(A)圖書館N/A(xi)順序說明SEQIDNO4AAGTACTCACTTCTCTGAAC20(6)SEQIDNO5的資料(i)順序特征(A)長度28個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型(A)說明合成DNA(iii)假說否(iv)反向否(vi)來源(A)有機(jī)體鳥類逆轉(zhuǎn)錄病毒(vii)IMMEDIATESOURCE(A)圖書館N/A(xi)順序說明SEQIDNO5GCCAAGCTTCAATGAAGCAGAAGGCTTC28(7)SEQIDNO6的資料(i)順序特征(A)長度21個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型(A)說明合成DNA(iii)假說否(iv)反向否(vi)來源(A)有機(jī)體鳥類逆轉(zhuǎn)錄病毒(vii)IMMEDIATESOURCE(A)圖書館N/A(xi)順序說明SEQIDNO6CAAATGAGGGTAATAAGGGAG21(8)SEQIDNO7的資料(i)順序特征(A)長度23個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型(A)說明合成DNA(iii)假說否(iv)反向否(vi)來源(A)有機(jī)體鳥類逆轉(zhuǎn)錄病毒(vii)IMMEDIATESOURCE(A)圖書館N/A(xi)順序說明SEQIDNO7CACTACCAAATATAATTCTGTAG2權(quán)利要求1.在由雞胚細(xì)胞(CEC)(為雞輔助因子(CHf)陰性并不含病毒，用化學(xué)誘變劑處理，然后感染MDV)衍生的單層培養(yǎng)中可傳代的感染馬立克氏病毒的雞細(xì)胞系，該細(xì)胞系能夠體內(nèi)感染鳥類，其中MDV可以以溶源性或非溶源性感染保留在細(xì)胞系內(nèi)。2.權(quán)利要求1的細(xì)胞系，其中MDV用來制備病毒疫苗，以在鳥類中產(chǎn)生免疫。3.權(quán)利要求1或2中任何一項(xiàng)權(quán)利要求的細(xì)胞系，其中MDV是選自血清型1、血清型2或血清型3MDV的病毒，其中血清型3是火雞皰疹病毒(HVT)。4.權(quán)利要求1或2中任何一項(xiàng)權(quán)利要求的細(xì)胞系，其中MDV是包含插入MDV中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)外源基因的基因工程MDV。5.權(quán)利要求1或2中任何一項(xiàng)權(quán)利要求的細(xì)胞系，其中MDV是包含一個(gè)或多個(gè)缺失MDV的區(qū)域的基因工程MDV。6.權(quán)利要求1的細(xì)胞系，其中MDV選自火雞皰疹病毒(HVT)菌株FC126-OCL(以細(xì)胞系A(chǔ)TCCCRL12052保藏)和馬立克氏病毒(MDV)菌株SB1-OCL(以細(xì)胞系A(chǔ)TCCCRL12053保藏)。7.權(quán)利要求1、2或6中任何一項(xiàng)權(quán)利要求的細(xì)胞系，其中CEC為CHCC-OU2。8.權(quán)利要求1、2或6中任何一項(xiàng)權(quán)利要求的細(xì)胞系，其中MDV可以通過細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)或sescenence再活化為非溶源性感染。9.在非融合單層培養(yǎng)中生產(chǎn)被潛伏的馬立克氏病毒(MDV)感染的可傳代雞細(xì)胞系的方法，包括(a)將雞胚細(xì)胞(為雞輔助因子(CHf)陰性、不含病毒并用化學(xué)誘變劑處理過)與MDV在培養(yǎng)基中混合，使得CEC感染MDV；(b)從未感染的CEC中純化感染MDV的CEC；(c)繁殖感染MDV的CEC以在單層培養(yǎng)中生產(chǎn)細(xì)胞系，其中MDV可以以溶源性或非溶源性感染保留在細(xì)胞系內(nèi)。10.權(quán)利要求9的方法，其中MDV病毒選自由原代胚胎成纖維細(xì)胞衍生的與細(xì)胞相關(guān)的MDV病毒、無細(xì)胞MDV和轉(zhuǎn)染到CEC的MDVDNA。11.權(quán)利要求9或10中任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中MDV是用來制備病毒疫苗以在鳥類中產(chǎn)生免疫的病毒。12.權(quán)利要求9或10中任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中MDV選自血清型1、血清型2或血清型3MDV的病毒，其中血清型3是火雞皰疹病毒(HVT)。13.權(quán)利要求9或10中任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中MDV是包含插入MDV中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)外源基因的基因工程MDV。14.權(quán)利要求9或10中任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中MDV是包含一個(gè)或多個(gè)缺失的MDV基因的基因工程MDV。15.權(quán)利要求9或10中任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中MDV選自火雞皰疹病毒(HVT)菌株FC126-OCL(以細(xì)胞系A(chǔ)TCCCRL12052保藏)和馬立克氏病毒(MDV)菌株SB1-OCL(以細(xì)胞系A(chǔ)TCCCRL12053保藏)。16.權(quán)利要求9或10中任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中CEC為CHCC-OU2。17.用馬立克氏病毒(MDV)感染鳥類的方法，包括(a)提供由雞胚細(xì)胞(為雞輔助因子(CHf)陰性并不含病毒，用化學(xué)誘變劑處理，然后感染MDV)衍生的、作為單層培養(yǎng)保持的、感染馬立克氏病毒的可傳代雞細(xì)胞系，其中MDV可以以溶源性或非溶源性感染保留在細(xì)胞系內(nèi)，該細(xì)胞系能夠體內(nèi)感染鳥類；(b)用疫苗接種鳥類。18.權(quán)利要求17的方法，其中接種是通過注射或口服。19.權(quán)利要求17或18中任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中MDV是用來制備病毒疫苗以在鳥類中產(chǎn)生免疫的病毒。20.權(quán)利要求17或18中任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中MDV選自血清型1、血清型2或血清型3MDV的病毒，其中血清型3是火雞皰疹病毒(HVT)。21.權(quán)利要求17或18中任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中MDV是包含插入MDV中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)外源基因的基因工程MDV。22.權(quán)利要求17或18中任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中MDV是包含一個(gè)或多個(gè)缺失的MDV基因的基因工程MDV。23.權(quán)利要求17的方法，其中MDV選自火雞皰疹病毒(HVT)菌株FC126-OCL(以細(xì)胞系A(chǔ)TCCCRL12052保藏)和馬立克氏病毒(MDV)菌株SB1-OCL(以細(xì)胞系A(chǔ)TCCCRL12053保藏)。24.權(quán)利要求17、18或23的方法，其中細(xì)胞系含有為CEC成纖維細(xì)胞的CHCC-OU2。25.權(quán)利要求17的方法，其中疫苗含有細(xì)胞系。26.鳥類疫苗的劑量形式，含有由雞胚細(xì)胞(為雞輔助因子(CHf)陰性并不含病毒，用化學(xué)誘變劑處理，然后感染MDV)衍生的、作為單層培養(yǎng)保持的、感染馬立克氏病毒的可傳代雞細(xì)胞系，其中MDV可以以溶源性或非溶源性感染保留在細(xì)胞系內(nèi)。27.權(quán)利要求26的疫苗，其中MDV是用來制備病毒疫苗以在鳥類中產(chǎn)生免疫的病毒。28.權(quán)利要求26或27中任何一項(xiàng)權(quán)利要求的疫苗，其中MDV選自血清型1、血清型2或血清型3MDV的病毒，其中血清型3是火雞皰疹病毒(HVT)。29.權(quán)利要求26或27中任何一項(xiàng)權(quán)利要求的疫苗，其中MDV是包含插入MDV中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)外源基因的基因工程MDV。30.權(quán)利要求26或27中任何一項(xiàng)權(quán)利要求的疫苗，其中MDV是包含一個(gè)或多個(gè)缺失的MDV基因的基因工程MDV。31.權(quán)利要求26的疫苗，其中MDV選自火雞皰疹病毒(HVT)菌株FC126-OCL(以細(xì)胞系A(chǔ)TCCCRL12052保藏)和馬立克氏病毒(MDV)菌株SB1-OCL(以細(xì)胞系A(chǔ)TCCCRL12053保藏)。32.權(quán)利要求26、27或31中任何一項(xiàng)權(quán)利要求的疫苗，其中細(xì)胞系含有為CEC成纖維細(xì)胞的CHCC-OU2。33.以ATCCCRL12052保藏的、含有馬立克氏火雞皰疹病毒(HVT)菌株FC126-OCL的可無限繁殖的馬立克氏皰疹病毒細(xì)胞系。34.以ATCCCRL12053保藏的、含有馬立克氏血清型2病毒(MDV)菌株SB1-OCL的可無限繁殖的馬立克氏皰疹病毒細(xì)胞系。35.權(quán)利要求17的方法，其中疫苗含有由細(xì)胞系獲得的病毒。36.在由雞胚細(xì)胞(CEC)(為雞輔助因子(CHf)陰性以及非惡性的，含有來自鳥類逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA順序，并在細(xì)胞培養(yǎng)中連續(xù)生長)衍生的單層培養(yǎng)中可傳代的感染馬立克氏病毒的雞細(xì)胞系。37.權(quán)利要求36的細(xì)胞系，其中MDV用來制備病毒疫苗，以在鳥類中產(chǎn)生免疫。38.權(quán)利要求36或37中任何一項(xiàng)權(quán)利要求的細(xì)胞系，其中MDV是包含插入MDV中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)外源基因的基因工程MDV。39.權(quán)利要求36或37中任何一項(xiàng)權(quán)利要求的細(xì)胞系，其中MDV是包含一個(gè)或多個(gè)缺失MDV的區(qū)域的基因工程MDV。40.權(quán)利要求36或37中任何一項(xiàng)權(quán)利要求的細(xì)胞系，其中CEC為CHCC-OU2。41.權(quán)利要求36或37中任何一項(xiàng)權(quán)利要求的細(xì)胞系，其中MDV可以通過細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)或sescenence再活化為非溶源性感染。42.權(quán)利要求26的疫苗，其中MDV是火雞皰疹病毒(HVT)。43.權(quán)利要求26的疫苗，其中MDV是血清型2MDV。全文摘要描述了含有以溶源性或非溶源性感染存在于細(xì)胞系內(nèi)的馬立克氏病毒(MDV)的細(xì)胞系以及生產(chǎn)方法。也描述了由細(xì)胞系制備鳥類MDV的方法以及抗鳥類MDV的疫苗。文檔編號C12N5/10GK1170760SQ97113959公開日1998年1月21日申請日期1997年6月20日優(yōu)先權(quán)日1996年6月21日發(fā)明者P·M·科森斯,J·D·雷利,A·阿布喬伯申請人:密執(zhí)安州大學(xué)