專利名稱：：體外培養(yǎng)的植物組織的包裝方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及體外培養(yǎng)的植物組織的新包裝方法，該方法使得可以增強所述組織的保藏，特別適于植物材料的運輸。體外培養(yǎng)的植物組織的運輸需要適宜的包裝。例如植物組織可以通過將植物組織置于液體培養(yǎng)基中或半固體瓊脂培養(yǎng)基上，將這些培養(yǎng)基裝入體外培養(yǎng)的常規(guī)容器內(諸如陪替氏培養(yǎng)皿或瓶之類)來進行包裝。不幸地是，該類型的包裝不適應郵包在運輸期間可能經歷的危險，即(1)在液體培養(yǎng)基的情況下由于缺乏攪拌引起組織的窒息；(2)由于過度搖動，用瓊脂覆蓋組織會引起組織的窒息；(3)因培養(yǎng)基與容器外部之間的接觸而引起的污染；(4)在某些物種中組織的過度生長。也可以在油層下在冷凍溫度包裝體外培養(yǎng)的植物組織。EP408922(SocietedesProduitsNestle)實際描述了一個方法，其中將胚浸入油層之下保持在低氧中，然后冷卻并在高于所考慮的胚的冷敏感閾的溫度下保藏。盡管如此保藏的胚在保藏幾天后表現(xiàn)出令人滿意的生存能力，但該方法仍會遇到運輸期間冷凍溫度變化的危險。當植物組織用藻酸鹽和蔗糖的混合物覆蓋時，也可以運輸體外培養(yǎng)的植物組織(Hasanetal.，PlantGeneticResourcesNewsletter，103，32-35，1995)。也可以冷凍體外培養(yǎng)的植物組織。通過實例，Chen等人提出了在有山梨醇(脫水劑)和二甲亞砜(低溫防護劑)的情況下培養(yǎng)愈傷組織，將它們緩慢地在-40℃冷凍，然后冷凍在液氮中(PlantPhysoil.，75，726-731，1984)。同樣地，Delvallee等人提出，在有蔗糖(脫水劑)和二甲亞砜的情況下培養(yǎng)未成熟的合子胚，然后將其冷凍在液氮中(PlantScience，60，129-136，1989)。最后EP399158(SocietedesProduitsNestle)描述了一個方法，其中體細胞胚在含有滲透壓試劑的培養(yǎng)基中預處理，然后將其冷卻，然后在-15℃至-40℃冷凍。不幸地是，由于導致組織死亡的溫度危險，冷凍不總適于植物組織的運輸。而且，在不同的
技術領域：
中，保藏植物切片或種子的方法是已知的。EP66581(Piquepaille等人)提出了例如由一容器構成的、使種子發(fā)芽或保藏植物切片的裝置，在容器中，生物學材料置于第一粘性載體和浸漬了液體組合物的第二柔軟載體之間，由第一載體的粘性表面使兩個載體保持牢固地粘附，兩個載體通過粘合劑粘附在容器的壁上。可以注意到，由于存在粘合劑，該裝置不能滅菌。而且第一載體的粘性表面能夠損傷柔軟的組織(諸如體外培養(yǎng)的植物組織之類)，這進一步限制了該裝置在本發(fā)明結構中的吸引力。因此，迄今還不知道既使用簡單，又可以令人滿意地保護所述植物組織的體外培養(yǎng)的植物組織的包裝裝置。因此本發(fā)明的目的是提供一個非常簡單的包裝體外培養(yǎng)的植物組織的新方法，該方法特別適于體細胞胚的運輸，并且只需要非常少的技術設備和安裝時間。為此，本發(fā)明涉及體外培養(yǎng)的植物組織的新包裝方法，其中在無菌容器中，將體外培養(yǎng)的植物組織置于兩個浸漬有液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的固體載體表面之間，所述的植物組織通過毛細作用牢固地粘附在載體的至少一面上，載體的其它表面中的至少一面也通過毛細作用牢固地粘附在容器的一面上，將組織照原樣保藏。本發(fā)明也涉及包含體外培養(yǎng)的植物組織的包裝裝置，所述裝置由可封閉的無菌容器構成，其中將體外培養(yǎng)的植物組織置于兩個浸漬有液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的固體載體表面之間，所述的植物組織通過毛細作用牢固地粘附在載體的至少一面上，載體的其它表面中的至少一面也通過毛細作用牢固地粘附在容器的一面上。盡管先前的工藝推薦相當復雜的技術，但我們觀察到體外培養(yǎng)的植物組織在本發(fā)明的包裝條件下，可在1-100天的運輸期間內完好地存活。因為本方法易于安裝，污染的風險降低，組織不用冒完全浸入營養(yǎng)培養(yǎng)基的風險，由于組織插入載體之間，保護組織不受振動，并且由于組織必須簡單地置于例如半固體瓊脂或液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中，它們在保藏后非常易于培養(yǎng)，因此本方法避免了先有技術的缺點。令人驚訝的是，可以觀察到大多數(shù)生長緩慢的植物種(諸如例如木本植物之類)，其生長被這類包裝條件可逆地抑制。另一方面，如果需要限制生長較快的植物(諸如豆類等)的生長，它們也可以在包裝前進行例如脫水。令人驚訝的是，我們觀察到本發(fā)明的包裝條件甚至可以增強體細胞胚發(fā)育成小植株的能力。因此為了實施本發(fā)明，使用由體外培養(yǎng)衍生的植物組織，即可以由例如愈傷組織、體細胞胚和根發(fā)育的愈傷組織、芽。然而本發(fā)明最好是用于已知對它們的環(huán)境特別敏感的植物體細胞胚的保藏。使用的容器可以是可滅菌并可以例如可逆封閉的任何容器。本領域技術人員已知的并大量市售的容器是陪替氏培養(yǎng)皿，它可以用例如塑料膜、蠟或本領域技術人員已知的另一適宜的材料封閉。所用的固體載體最好由柔軟材料構成，該材料可以(但不必須)呈植物組織塊形狀，并且在整個期間不分解。為此，該材料可以是部分纖維性或完全纖維性的，可以包括能夠保留液體的材料，所述纖維也能夠完成例如該功能。因此這些載體可以單獨或混合由纖維素(吸水紙)、二氧化硅、玻璃、葡聚糖聚合物或幾丁質、諸如絲之類的蛋白質、或聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、乙烯聚合物和聚酰胺的合成聚合物(諸如尼龍等)。此外保持水分并能夠包括在纖維中的材料可以由吸收含水液體以形成水凝膠有機化合物或無機化合物(諸如聚丙烯酰胺或諸如瓊脂之類的多糖等)構成。然而，該材料應該不能從載體流出。載體應該能夠浸漬包含組織存活所必須的營養(yǎng)元素。在本領域技術人員已知的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，可以作為實例提到的是Skoog或Linsmayer的添加維生素Murashige和Skoog培養(yǎng)基(Physiol.Plant.，1962，Vol.15，第473頁；Physiol.Plant.，1965，Vol.18，第100頁)。至少其中一個載體最好可以浸漬高至載體水保留閾(此后可能不再保留液體)的營養(yǎng)液體。浸漬液體的量最好使得確保容器內的相對濕度在至少1-5天內至少為95-100％，最好至少為98％。將植物組織置于干載體和第二浸漬的載體之間的作用，使得能夠獲得組織緩慢控制的脫水，所述干載體實際上變?yōu)榫徛n從浸漬的載體向干載體遷移的液體。最好使用厚度小、重量輕的載體，以便不損傷組織，也以便促進氧氣很好地散布，也使得載體通過毛細作用相互附著以及使得載體附著于容器的表面。作為實例，例如可以使用重0.03-1g，例如0.03-0.1g、能夠吸收多于2-10倍其原始重量的營養(yǎng)液體的濾紙。植物組織可以作為組織塊或單獨置于載體之間，而不因此影響組織生存能力。放置組織前，不必將殘余的培養(yǎng)基從由其培養(yǎng)基中取出的植物組織上分離下來，例如通過濾器真空抽吸。然而，如果需要確保組織更出色的脫水，如上所述，也可以分離殘余的培養(yǎng)基。最后，每cm2載體放置1-100個體外培養(yǎng)的植物組織，已知組織可能長0.05-1cm，例如在從“魚雷(torpedo)”發(fā)育階段取出的體細胞胚的情況下長0.05-0.3cm?？赡苄枰_保載體通過毛細作用同樣好地保持牢固附著。為此，可以在載體上、在放置植物組織區(qū)域的外周提供一個環(huán)繞組織至少大約1cm左右的足夠寬的圓形區(qū)域，這將保持沒有任何組織，以確保載體之間的良好黏附。最后，將兩個載體(包括體外培養(yǎng)的植物組織)置于適當?shù)娜萜鲀?，至少一個載體通過毛細作用，由一個載體的一個表面附著在容器的一個表面上。本發(fā)明可以用于體積小的物體，它使得大數(shù)量的運輸容易，因此適合商業(yè)分發(fā)。例如，如果需要分發(fā)大量的給定植物種的體細胞胚，可以按照本發(fā)明方法，在標準的陪替氏培養(yǎng)皿(直徑5.5cm，高1cm)中放置大約100個長度為0.05-0.2cm的胚。因此1m3的包裝箱將含有3,280個培養(yǎng)皿，也就是說含有例如大約328,000個胚。作為對比，具有根和1對葉子的多葉小植株一般每m3含有例如5,000-10,000個小植株。本發(fā)明方法可用于所有植物種，特別是木本植物(諸如咖啡樹、可可樹、橡膠樹、香蕉樹、椰子樹和油棕櫚樹等)以及特別是諸如番茄、蘿卜、豌豆、芹菜和茴香等的豆類。本領域技術人員有許多獲得體外培養(yǎng)的植物組織的技術，并可以甚至將其用于每一植物種，關于獲得某些類型的組織(諸如例如胚、芽或根等)，可能需要具體的條件。作為指導，可可樹、咖啡樹、油棕櫚樹和蘿卜的體細胞胚胎發(fā)生可以分別按照US5,312,801、Zamarripa(CafeCacaoetThe，35，233-244，1991)、Engelmann等人(Oleagineux，41，169-172，1986)和EP399158中描述的步驟得到。具體地說，本發(fā)明方法適用于所有植物種，特別是在體外培養(yǎng)中生長緩慢(特征為增殖速率低于每星期10，也就是說低于例如每星期10倍的較新鮮的材料)的木本植物。作為指導，生長緩慢的胚例如在1-2個月內從1mm生長至10mm(已考慮到最大長度)。生長緩慢的植物組織在運輸期間(1-100天)最好保藏在黑暗中和/或10-35℃，特別是15-30℃下。如果組織已脫水，也可以將組織按照本發(fā)明保藏在黑暗中和/或冰箱或甚至冷凍溫度(例如-4℃)至30-35℃下。然而，注意不要將含有葉綠素的組織脫水，因為這一處理易于不可逆地損傷組織。除上述技術外，將組織脫水例如足以在常規(guī)培養(yǎng)基上培養(yǎng)組織，將滲透壓試劑加入其中，某些有機物質(諸如維生素B1、煙酸或腺嘌呤等)也可以加入其中。該試劑可以由本領域技術人員從能夠滲透組織并確保適當?shù)臐B透壓、以獲得滿意的細胞脫水作用、不影響組織膜的通透性的物質中進行選擇。該試劑可以是諸如蔗糖或海藻糖之類的糖或已知可完成同樣功能的任何其它物質。滲透壓試劑在培養(yǎng)基中的濃度最好不要太低，以便確保滿意的細胞脫水作用。該濃度也不應該太高，以便不損傷組織或在保藏后不防止組織再生長。作為指導，組織可以在含有50-190g/l、特別是100-150g/l蔗糖的培養(yǎng)基上脫水。當本發(fā)明方法不足以足夠地抑制所述組織的生長時，組織的脫水也可以是可逆抑制組織生長的手段。為此，增殖速率高于每星期10(10倍較新鮮的材料)的組織最好例如按上述進行脫水。作為指導，例如快速生長的胚在4-6天內從1mm生長為10mm(已考慮最大長度)。在體外培養(yǎng)中生長快速的植物可以提到的是例如蘿卜、芹菜和茴香。運輸后，打開組織的包裝非常容易，因為搖動培養(yǎng)基上的載體使得從培養(yǎng)基上分離組織就足夠了。它們也可以用本領域技術人員已知的儀器單個進行移植。在下面所示的申請實施例中參考唯一的圖1(圖示本發(fā)明的裝置)詳細地描述本發(fā)明。不用說，本發(fā)明方法的特征不受下述具體實施例的限制，它可以由本領域技術人員適用于任何植物種和組織。圖1中，浸漬營養(yǎng)液體的載體1的表面(由玻璃纖維構成的濾紙)，通過毛細作用可逆地附著在陪替氏培養(yǎng)皿的底部2上，所示載體的另一面接受體外培養(yǎng)的植物組織3?？梢越n營養(yǎng)液體的第二載體4(由玻璃纖維構成的濾紙)與組織3和第一載體1接觸。最后，陪替氏培養(yǎng)皿的蓋5使得能夠關上容器，可以用例如塑料膜進行最后的密封。實施例1按照Zamarripa等人的步驟(CafeCacaoetThe，35，233-244，1991)在魚雷階段獲得的100個Robusta咖啡樹(Coffeacanephora)的體細胞胚一個接一個地置于兩張由玻璃纖維制成的、浸漬Murashige和Shoog液體培養(yǎng)基的濾紙(WahtmanGFC，直徑為5cm，干重為0.01g)之間?？梢宰⒁獾?，浸漬的濾紙不釋放任何液體。將濾紙置于陪替氏培養(yǎng)皿中。以相同方式制備幾個含有咖啡樹胚的陪替氏培養(yǎng)皿，將它們保藏在20℃，然后定期將胚置于培養(yǎng)皿的半固體培養(yǎng)基上，測定存活胚數(shù)(生存能力)和能夠發(fā)育成小植株(轉化)的胚數(shù)。示于下表的結果表明，在保藏的15天所有胚都完好地存活，保藏1-30天的胚向植株的轉化比在魚雷階段取出并且不經過包裝的胚的轉化好得多。</tables>實施例2按照Zamarripa等人的步驟(CafeCacaoetThe，35，233-244，1991)在魚雷階段獲得的1gRobusta咖啡樹(Coffeacanephora)的體細胞胚作為組織塊置于兩張由玻璃纖維制成的、浸漬Murashige和Shoog液體培養(yǎng)基的濾紙(WahtmanGFC，直徑為5cm，干重為0.01g)之間?？梢宰⒁獾剑n的濾紙不釋放任何液體。然后將濾紙置于陪替氏培養(yǎng)皿中。以相同方式制備幾個含有咖啡樹胚的陪替氏培養(yǎng)皿，將它們保藏在20℃4星期，然后將2,450個胚置于半固體培養(yǎng)基上，測定能夠發(fā)育成小植株(轉化)的胚數(shù)。結果表明，在5個月內發(fā)育出794個小植株。因此包裝的胚表現(xiàn)出的轉化率為32％，與未包裝的咖啡樹胚通常表現(xiàn)出的轉化率相似(參見表)。實施例3以與實施例2相似的方式，每個陪替氏培養(yǎng)皿包裝0.1gRobusta咖啡樹(Coffeacanephora)的愈傷組織，愈傷組織在20℃保藏1個月，將它們置于半固體培養(yǎng)基上1個月，然后測量如此獲得的植物材料的重量(0.55±0.23g新鮮材料)，將其與來自未包裝的1個月的對照培養(yǎng)物(接種0.1g新鮮愈傷組織)的植物材料的重量(0.59±0.18g新鮮材料)比較。結果表明，咖啡樹愈傷組織經過包裝可完好地存活。實施例4在魚雷階段取出的體細胞胚在含有滲透壓試劑的培養(yǎng)基上進行預處理(按EP399158中描述的)，然后將其按照實施例2描述的進行包裝。如此包裝幾天的蘿卜胚保持的生存能力以及發(fā)育成小植株的能力，比得上未包裝的蘿卜胚。實施例5在魚雷階段取出的體細胞胚按照實施例2描述的進行包裝，唯一的差別載在于，這些胚預先在含有100g/l蔗糖的培養(yǎng)基中脫水，然后將它們置于浸入了營養(yǎng)液體、由玻璃纖維制成的1張濾紙和另一張干濾紙之間。如此包裝幾天的蘿卜胚保持的生存能力以及發(fā)育成小植株的能力，比得上未包裝的蘿卜胚。權利要求1.體外培養(yǎng)的植物組織的包裝方法，其中在無菌容器中，將體外培養(yǎng)的植物組織置于兩個浸漬有液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的固體載體表面之間，所述的植物組織通過毛細作用牢固地粘附在載體的至少一面上，載體的其它表面中的至少一面也通過毛細作用牢固地粘附在容器的一面上，將組織保藏。2.按照權利要求1的方法，其中載體部分地或完全地由包含能夠保留液體的材料的纖維狀材料構成，或者由能夠保留液體的材料構成。3.按照權利要求1的方法，其中浸漬到至少一個載體的液體的量使得可以確保容器內的相對濕度在至少1-5天內至少為至少95％。4.按照權利要求1的方法，其中使用增殖速率低于每星期10的胚。5.按照權利要求1的方法，其中兩個載體中的一個在開始時是干燥的。6.按照權利要求1-5中任意一項權利要求的方法，其中使用脫水的胚。7.按照權利要求5或6中至少一項權利要求的方法，其中使用增殖速率高于每星期10的胚。8.按照權利要求7的方法，其中胚保藏在-4℃至35℃下。9.包含體外培養(yǎng)的植物組織的包裝裝置，所述裝置由可封閉的無菌容器構成，其中將體外培養(yǎng)的植物組織置于兩個浸漬有液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的固體載體表面之間，所述的植物組織通過毛細作用牢固地粘附在載體的至少一面上，載體的其它表面中的至少一面也通過毛細作用牢固地粘附在容器的一面上。全文摘要體外培養(yǎng)的植物組織的包裝方法,其中在無菌容器中,將體外培養(yǎng)的植物組織置于兩個浸漬有液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的固體載體表面之間,所述的植物組織通過毛細作用牢固地粘附在載體的至少一面上,載體的其它表面中的至少一面也通過毛細作用牢固地粘附在容器的一面上,將組織照原樣保藏。本發(fā)明也涉及實施本方法的包裝裝置。文檔編號C12N5/04GK1170759SQ9711388公開日1998年1月21日申請日期1997年6月25日優(yōu)先權日1996年6月25日發(fā)明者V·佩蒂亞德,B·弗羅林,J·P·迪科申請人:雀巢制品公司