一種鴨腸炎病毒細(xì)菌人工染色體的構(gòu)建及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于動物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種鴨腸炎病毒人工染色體的構(gòu)建及應(yīng)用。本發(fā)明克隆得到一種鴨腸炎病毒人工染色體pBAC-C-KCE質(zhì)粒，該質(zhì)粒保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），其保藏號為CCTCC?NO：M2013377。本發(fā)明還公開了鴨腸炎病毒人工染色體pBAC-C-KCE在重組鴨腸炎病毒包裝上的應(yīng)用。
【專利說明】—種鴨腸炎病毒細(xì)菌人工染色體的構(gòu)建及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種鴨腸炎病毒細(xì)菌人工染色體的構(gòu)建及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]鴨病毒性腸炎(DuckVirus Enteritis, DEV)又名鴨瘟(Duck Plague, DP)，是由鴨腸炎病毒(Duck Enteritis Virus, DEV)引起的鴨、鵝等雁形目禽類的一種急性、接觸性傳染病，各年齡的禽類均可發(fā)病。鴨病毒性腸炎在很多國家都有該病的報道，在我國也廣泛流行。由于其傳播迅速，并且發(fā)病和死亡率高，能達(dá)50-100%，成鴨甚至在90%以上，已經(jīng)成為危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要疫病之一。近幾年，陸續(xù)有關(guān)于鴨腸炎病毒基因組的研究報道；2009年，鴨腸炎病毒基因組序列已經(jīng)公布并登陸在Genbank (Li Y et al.，2009)，為研究DEV的基因和蛋白功能提供了有力的參考數(shù)據(jù)。其基因組大小約為150kb，編碼78個蛋白質(zhì)，其中有67個蛋白與α -皰疫病毒有同源性，I個蛋白與Y -皰疫病毒同源,5個與禽皰疫病毒同源。將皰疹病毒的整個基因組克隆到BAC質(zhì)粒中，然后在細(xì)菌中重組其他病毒的具有免疫源性的外源基因，從而構(gòu)建二價疫苗。
[0003]對于皰疹病毒這樣的大基因組病毒(大于lOOkb)，體外操作的難度很大，常規(guī)的體外酶切和連接的方法不適合。構(gòu)建重組病毒的經(jīng)典方法是將帶有目的基因的轉(zhuǎn)移載體與病毒基因組共轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)同源重組獲得重組病毒。由于存在野生型病毒的干擾，一般需要經(jīng)過多輪空斑純化才能篩選得到純的重組病毒(Domi A etal., 2005; Horsburgh B C et al.，1999)，這是一項極為繁瑣的工作，有時還會遇到重組病毒傳代不穩(wěn)定的問題。為了克服這種方法的局限，研究人員嘗試在大腸桿菌中直接對病毒基因組進(jìn)行修飾。首先嘗試的 是大腸桿菌Cosmid載體。由于病毒基因很大，而此載體容量有限(約40kb)，必須將病毒基因組分成幾段，構(gòu)成一套重疊的載體，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的多次同源重組組裝成完整的病毒基因組，產(chǎn)生重組毒。Cosmid載體在大腸桿菌中不穩(wěn)定，共轉(zhuǎn)染的效率低，此外，這些載體在細(xì)胞內(nèi)要經(jīng)過多次同源重組，其精確性很難保證，發(fā)生缺失突變的較高，因而對分離到的重組病毒尚需進(jìn)一步分析鑒定，不是一種很好的方法。
[0004]在基因組學(xué)研究工作的需要下，研究人員開發(fā)了一系列適用于大片段克隆的載體和宿主系統(tǒng)，如酵母人工染色體載體(YAC)、大腸桿菌的F因子衍生的細(xì)菌人工染色體載體(BAC)和以噬菌體復(fù)制子為基礎(chǔ)的載體(PAC)。BAC載體可以克隆大至300kb的片段，而且可以在大腸桿菌中穩(wěn)定的復(fù)制(McGeoch D J et al.，1994)。近年來,一系列大的雙鏈病毒基因組陸續(xù)被 BAC 化(Adler H et al., 2000; Borst E M et al., 1999; Azab W etal., 2002; Smith B N et al.，2000)。這些BAC化的病毒基因組轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在細(xì)胞中能產(chǎn)生感染性病毒粒子，這使得利用細(xì)菌的遺傳工具操作病毒成為可能。但是，由于某些未知原因，位于基因組中BAC載體部分不太穩(wěn)定，BAC化的病毒基因組轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，載體及其兩側(cè)病毒基因組序列會發(fā)生不同程度的缺失。為了解決這個問題，BAC載體兩側(cè)各引入了一個1xP位點,該載體轉(zhuǎn)入表達(dá)Cre重組酶的動物細(xì)胞中，Cre酶會催化在兩個位點之間的重組反應(yīng)，從而使原核來源的載體骨架部分從病毒基因組上去除，僅留下34bp的1xP的序列，保證了基因組的保真性和完整性，盡可能的避免了原核來源對插入位鉻鄰近的病毒基因表達(dá)的影響，這樣利用BAC克隆的細(xì)菌遺傳工具操作大基因組病毒更趨完善，該方法成功的用于偽狂犬病毒的BAC克隆(Smith G A et al.，2000)。同源重組和位點特異性重組是廣泛被用于修飾BAC克隆的方法。RecA同源重組系統(tǒng)是最早為人們熟知的大腸桿菌同源重組系統(tǒng)。然而，由RecA介導(dǎo)的同源重組所需同源區(qū)長達(dá)1000bp左右，操作的難度大，相對耗時費(fèi)力，從而使其應(yīng)用受到很大程度的限制。RecE/RecT同源重組系統(tǒng)可以催化同源反應(yīng)在20_25bp的同源區(qū)間發(fā)生，同源重組效率較高(Muyrers J P et al., 2000;MuyrersJ P et al.，2000a)。Red-gam 系統(tǒng)與 RecE/RecT 類似，且重組效率更高(Muyrers J P etal., 2000b; Jamsai D et al.，2003)。至此,人們把這兩種重組技術(shù)結(jié)合起來(Red/ET)實現(xiàn)了直接以PCR產(chǎn)物作為供體分子對目的序列的打靶修飾，可以有效地對BAC克隆上的任意基因進(jìn)行點突變、插入和缺失等修飾。位點特異性重組是由位點特異性重組酶介導(dǎo)特定位點間的發(fā)生位點特異性重組。通用的系統(tǒng)有Pl噬菌體的Cre-1oxP系統(tǒng)(Smith G A etal.，2000)，入噬菌體的 Int-att 系統(tǒng)(Suzuki Y et al.，2005)，和酵母的 Flp-FRT 系統(tǒng)(Cherepanov P P et al.，1995)。位點特異性重組技術(shù)祀向性強(qiáng)、重組效率高,也是修飾BAC克隆的有效工具。這整個過程都是在細(xì)菌體內(nèi)進(jìn)行的，在很大程度上能避免了離體操作對大分子的損傷。2005年，Li M Z et al.開發(fā)了一個有效的方法，用于同源重組方法在體內(nèi)構(gòu)建重組DNA分子——交配輔助遺傳整合克隆(MAGIC) (Li M Z et al.，2005)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，構(gòu)建一種鴨腸炎病毒細(xì)菌人工染色體質(zhì)粒，該鴨病毒性腸炎(DEV)疫苗株(C-KCE)的細(xì)菌人工染色體質(zhì)粒，可以利用大腸桿(例如DH10B)以及雞胚成纖維細(xì)胞(CEF細(xì)胞)重新快速拯救出DEV。將外源基因克隆入載體PRThGA后，利用交配輔助遺傳整合克隆(即MAGIC方法)重組，即可獲得含有外源基因的重組鴨腸炎病毒。
[0006]實現(xiàn)本發(fā)明的主要技術(shù)方案和步驟如下所述:
[0007](I)將BAC骨架質(zhì)粒由低拷貝變成多拷貝，以方便后期的操作。
[0008](2)將鴨病毒性腸炎(DEV)的全基因組通過同源重組的方法插入到BAC質(zhì)粒上。
[0009](3)運(yùn)用MAGIC的方法將鴨其他病原的免疫源性基因快速穩(wěn)定的插入DEV中。從而得到一個表達(dá)該外源基因的DEV病毒。
[0010](4)利用表達(dá)外源基因的DEV病毒控制鴨群中其他病毒和鴨瘟感染的問題。
[0011]更詳細(xì)的技術(shù)方案參見《【具體實施方式】》。
[0012]本發(fā)明優(yōu)點在于:
[0013]1利用本發(fā)明中的鴨腸炎病毒細(xì)菌人工染色體大大縮短了獲得重組病毒的周期。[0014]2本發(fā)明中的鴨腸炎病毒細(xì)菌人工染色體重組外源基因后對載體進(jìn)行了剔除，無功能性外源序列插入，對基因組亦無影響，不存在遺傳物質(zhì)發(fā)生跨物種轉(zhuǎn)移的可能。
[0015]3利用本發(fā)明中的鴨腸炎病毒細(xì)菌人工染色體重組外源基因可以達(dá)到一針同時防兩病甚至多種疾病的目的?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0016]序列表SEQ ID NO:1是pBlue_Lox空載體序列，序列長度為8284bp。
[0017]序列表SEQ ID NO:2 是 pBlue-UL27-UL26 序列，長度為 12557bp。
[0018]序列表SEQ ID NO:3 是 pCAGGS 的 chicken β -actin promotor-rabbit β -globinPloyA的表達(dá)框和同源臂序列，長度為2380bp。
[0019]序列表SEQ ID NO:4是Loxp序列，長度為644bp,從第485_518bp是切除BAC骨架后僅留下一個34bpLoxp位點的序列。
[0020]序列表SEQ ID NO:5是序列表SEQ ID NO:4中切除BAC骨架后僅留下一個Loxp位點的序列，序列長度為34bp。
[0021]序列表SEQ ID NO:6是Pacl酶切線性化的rBAC同源臂載體序列，長度為10717bp
[0022]圖1:是本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pBlue-UL27-UL26的構(gòu)建流程。其中:圖1中的左圖中的CMV Promoter是CMV啟動子；圖1中的下圖的CMV Promoter是CMV啟動子。
[0023]圖2:是本發(fā)明鴨腸炎病毒細(xì)菌人工染色體的構(gòu)建的流程示意圖。
[0024]圖3:是本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體pBlue-UL27-UL26重組到鴨腸炎病毒上在雞的成纖維細(xì)胞上增殖的示意圖。其中:圖3A為轉(zhuǎn)移載體pBlue-UL27-UL26重組到鴨腸炎病毒上在雞的成纖維細(xì)胞上單獨(dú)形成空斑的照片；
[0025]圖3B為轉(zhuǎn)移載體pBlue-UL27_UL26重組到鴨腸炎病毒上，并且經(jīng)過多次空斑純化后在雞的成纖維細(xì)胞增殖的示意圖。
[0026]圖4:是本發(fā)明pRThGA 載體改造成重組質(zhì)粒pRTHGAl的示意圖。其中:圖中左上圖中的CMV Promoter是CMV啟動子；右上圖及下中圖中的Chicken beta-actin promoter是 Chicken beta-actin 啟動子，CMV.1E enhancer 是 CMV.1E 增強(qiáng)子。
[0027]圖5:是本發(fā)明構(gòu)建的重組質(zhì)粒PRTHGA-HA的示例圖。其中，圖中的Chickenbeta-actin promoter 是 Chicken beta-actin 的啟動子,CMV.1E enhancer 是 CMV.1E 增強(qiáng)子；質(zhì)粒帶有Amp (氨節(jié)青霉素)抗性。
[0028]圖6:是本發(fā)明中所的應(yīng)用MAGIC方法的示意圖。圖中供體菌A為Amp (氨芐青霉素)抗性；受體菌B為Kna (卡那霉素)抗體、Cam (氯霉素)抗性和Ara (阿拉伯糖)抗性。
[0029]圖7:是運(yùn)用Western Blot檢測DEV-HA表達(dá)HA的結(jié)果。下圖中DEV-HA重組毒株與DEV毒株與內(nèi)參GAPDH的單抗都發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生明顯的條帶呈陽性，證明該實驗有效。圖7的上圖中DEV-HA重組毒株與抗HA的單抗發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生明顯的條帶呈陽性，而DEV毒株則呈陰性，證明DEV-HA重組毒株構(gòu)建成功。
【具體實施方式】
[0030]實施例1BAC同源臂的構(gòu)建和多拷貝的形成
[0031]1、鴨病毒性腸炎(DEV)病毒基因組的提取
[0032]將凍存的鴨腸炎病毒疫苗株C-KCE (購自中國獸醫(yī)藥監(jiān)察所，該疫苗株C-KCE的基因組 DNA 序列已提交(登錄)，登錄號為 temporary gene bank accession N0.KF263690)的病變細(xì)胞連續(xù)凍融3次，4°C 8000rpm離心20min沉淀細(xì)胞碎片。收集上清，30% (w/w)蔗糖溶液墊底，4°C 16000rpm離心60min沉淀病毒粒子。棄掉上清，加入雙蒸水將病毒粒子懸浮。加入蛋白酶K至終濃度500 μ g/rnL，十二烷基硫酸鈉(SDS)至終濃度1%。置56°C水浴lh。將消化后產(chǎn)物用等體積的V(苯酚):V(氯仿)=體積比為1:1和氯仿各抽提一次，16000rpm離心15min。取上清液向其中加入有加入等體積的異丙醇輕輕混勻，_20°C沉淀核酸2h。4°C 16000rpm離心20min沉淀DNA, 70%冷乙醇洗漆一次，回收核酸沉淀,重懸于TER (含有RNA酶的TE)室溫作用lOmin，充分消化RNA，消化完畢后用作模板使用。
[0033]2.在UL26和UL27 (UL26和UL27是鴨腸炎病毒的部分基因組序列，GenBank:EU082088.2)之間插入BAC載體:UL26兩端引入NOTI和PACI的酶切位點(上下游引物分別為UL26-F和UL26-R，引物具體序列見表1)，UL27兩端分別引入Sal I和Pac I的酶切位點(上下游引物分別為UL27-F和UL27-R，引物具體序列見表1)。以C-KCE的基因組為模板將同源臂用PCR擴(kuò)增下來(UL27的終止子位于正中間)。以ρ⑶NA3.1(湖北大學(xué)生命科學(xué)院馬立新教授贈送)為模板擴(kuò)增AMP的復(fù)制子，并且在兩端引入Pac I的酶切位點(上下游引物分別為Amp-F和Amp-R，引物具體序列見表1)。PCR擴(kuò)增體系=Easy-Taq0.25 μ L ；IOxbuf fer2.5 μ L，dNTP2 μ L，模板2 μ L，上下游引物各I μ L，ddH20補(bǔ)齊25 μ L，混勻后按以下程序進(jìn)行反應(yīng):95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，按各引物退火溫度，40s，延伸lmin，30個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。
[0034]采用重疊PCR 方法(PCR 擴(kuò)增體系:Easy_Taq0.25 μ L ； IOxbuffer2.5 μ L,dNTP2 μ L，模板2 μ L，三對上下游引物各I μ L，ddH20補(bǔ)齊25 μ L，混勻后按以下程序進(jìn)行反應(yīng):95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，52°C退火，40s，72°C延伸5min，30個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin)將三者連接在一起，然后克隆到Sal I，Not I酶切的pBlue_lox載體(湖北大學(xué)生命科學(xué)院馬立新教授贈送)上，獲得用于重組的BAC載體，將其命名為rBAC載體(上述過程見圖1)。
[0035]表1PCR及重疊PCR弓丨物
[0036]
【權(quán)利要求】
1.一種包含重組鴨腸炎病毒人工染色體pBAC-C-KCE質(zhì)粒的大腸桿菌DHlOB-1S2/BAC-C-KCE，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:M2013377。
2.權(quán)利要求1所述的包含重組鴨腸炎病毒人工染色體pBAC-C-KCE質(zhì)粒的大腸桿菌DH10B-1S2/BAC-C-KCE在重組鴨腸炎病毒包裝上的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N7/01GK103497967SQ201310374703
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年8月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月26日
【發(fā)明者】金梅林, 李淑云, 鄒忠 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)