一種利用端粒文庫獲得玉米染色體端粒的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用端粒文庫獲得玉米染色體端粒的方法。該端粒文庫利用單引物PCR擴增端粒序列,包含不同大小的染色體端粒片段的核苷酸序列。本發(fā)明提供了使用本文所公開的一種利用端粒文庫獲得玉米染色體端粒的方法在構建植物人工染色體中獲得天然端粒方面有著廣泛的應用前景。
【專利說明】一種利用端粒文庫獲得玉米染色體端粒的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于植物生物工程和植物改良基因工程【技術領域】,具體涉及一種利用玉米根尖細胞同步化及染色體的分選技術分離構建人工染色體載體的端粒技術。
【背景技術】
[0002]染色體是細胞中遺傳物質,呈線狀或棒狀,由DNA、蛋白質和少量RNA組成。每條染色體具有3種必需元件或結構:著絲粒、端粒和自主復制序列。染色體具備自主完整復制和將遺傳物質平均分配到子細胞的能力,在細胞傳代中穩(wěn)定存在。著絲粒是真核生物染色體的標志性結構,在有絲分裂和減數(shù)分裂中,著絲粒和特異性的蛋白結合在微管的牽引下染色單體向兩極運動。端粒位于真核生物染色體的末端,保證染色體的精確復制,維持染色體長度及穩(wěn)定性。自主復制序列(ARS)是能夠和特定起始蛋白結合開始DNA復制的序列,真核生物基因組很大,通常具有多個復制起點。 [0003]人工染色體通常指人工構建的含有天然染色體基本功能單位的載體系統(tǒng),包括酵母人工染色體、細菌人工染色體、植物人工染色體等。植物人工染色體的研究僅在玉米、水稻和擬南芥中有相關的報道。Preuss等以擬南芥著絲粒DNA為基礎,構建各種組合的微小染色體來確定具有著絲粒功能的最小區(qū)域。日本研究人員采用包含著絲粒區(qū)域的YAC克隆與含有端粒序列和ARS的YAC克隆進行同源重組,從而篩選有功能的水稻人工染色體。美國的密蘇里大學Birchler實驗室通過端粒截短法成功獲得了 PAC,具體構建利用一個帶有6個拷貝(約2.5kb)擬南芥端粒序列的載體通過農桿菌介導和基因槍轉化玉米幼胚然后利用除草劑篩選陽性轉基因植株。由于玉米具有一個額外的B染色體,幾個或少數(shù)B染色體的存在并不影響玉米植株的表型,這為玉米人工染色體的構建提供非常好的材料。在有絲分裂過程中截短的微小A染色體不會和其原始染色體進行配對,截短的B染色體能夠忠實地隨著細胞分裂傳遞,同時還可以在有正常B染色體存在的情況下發(fā)生劑量變化。這些獨立于正常染色體傳遞的現(xiàn)象暗示截短染色體可以作為非常好的轉基因載體,克服目前轉基因研究中所遇到的隨機插入和位置效應。
【發(fā)明內容】
[0004]本
【發(fā)明內容】
給出了本發(fā)明的一些實施方式,以及在多種情況中給出了這些實施方式的變動和變更。本
【發(fā)明內容】
只是很多的和不同的實施方式的示例。所提及的給定實施方式示例也是一個或多個代表性的特點。這樣一個實施方式通??梢跃哂谢虿痪哂兴峒暗奶攸c;同樣,這些特點也可以被施用于本發(fā)明的其他實施方式中。為了避免過多的重復,本
【發(fā)明內容】
沒有羅列或提及這些特點的所有可能的組合。
[0005]本發(fā)明提供了一種能在植物中獲得構建人工染色體的端粒的技術方法。本發(fā)明還提供了用于在植物中運用端粒構建人工染色體的技術。在一些實施方式中,方法包括(a)將得到的端粒與要表達的基因表達盒或DNA片段結合,以組合到人工染色體中;和6)生成包括此端粒的轉基因植物,由此在植物中,更具體地說,是在植物中利用人工染色體穩(wěn)定表達所述核苷酸。在一些實施方式中,所述“生成”包括用包含此端粒的人工染色體轉化植物細胞并從所轉化的植物細胞中再生出植物。
[0006]本發(fā)明所提供的植物端粒獲取方法,可以獲得所有植物端粒用于構建人工染色體的穩(wěn)定表達。
[0007]實施方案中的端粒核苷酸序列可用于從其它生物中分離相應序列,如其它植物(單子葉或雙子葉植物等)。根據這些相應序列與本文所列序列間的序列同源性,使用如PCR、雜交等技術來鑒別分離這些相應序列。因此,根據它們與本文所列的完整端粒序列(或其片段)間的序列相似性而分離的相應片段,也包括在實施方案中。實施方案的端粒區(qū)域可從任何植物中分離,包括(但不限于)玉米、水稻、蕓苔屬、小麥、高粱、兩節(jié)薺屬、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亞麻子、大豆、擬南芥屬、菜豆屬、花生等。
[0008]本文中“端?!币辉~指位于真核生物染色體的末端,保證染色體的精確復制,維持染色體長度及穩(wěn)定性。應認識到當鑒別了本文所公開的端粒獲取方法后,分離并鑒定位于本文所鑒別的特定端粒就屬于現(xiàn)有技術范圍了。高等植物中端粒重復序列是高度保守的,大多數(shù)植物的端粒中都含有的端粒序列5’ -TTTAGGG-3’。
[0009]本文中的“端粒獲取技術路線”是指包括引物設計合成、DNA制備、PCR擴增、端粒文庫建立、端粒篩選、功能鑒定、人工染色體構建、植物轉化的一系列過程。技術路線見附圖1o
[0010]通常人工染色體端粒是利用人工合成的方法合成6個重復序列用于人工染色體的構建。本發(fā)明利用PCR-文庫篩選技術獲取了植物天然的端粒序列,更加接近于植物天然染色體性質,有利于人工染色體的穩(wěn)定遺傳。該發(fā)明結合了端粒隨機擴增和文庫篩選技術,技術簡便易行,效率較高,效果比人工合成端粒更適于構建人工染色體。
[0011]本發(fā)明以玉米為材料,通過對玉米染色體端粒文庫的構建技術的研究,達到優(yōu)化玉米染色體端粒及人工染色體構建技術體系的目的。根據端體的特點,通過5’ -TTTAGGG-3’單引物擴增玉米染色體端粒的重復序列;利用分選純化2.5-3.5Kb的PCR產物,制備端粒DNA和后續(xù)的連接轉化驗證,優(yōu)化建庫`各實驗環(huán)節(jié),形成一套系統(tǒng)的玉米染色體端粒文庫構建技術,為玉米大片段轉化的基因工程研究奠定基礎。
[0012]本發(fā)明為轉化大片段DNA載體系統(tǒng)的發(fā)展和應用提供了技術支持,并在玉米育種中有潛在的應用前景。植物體細胞雜交技術能夠克服有性雜交不親和障礙,轉移有性雜交不能轉移的性狀,不僅能轉移異源植物的核基因,而且可轉移胞質基因。體細胞雜交可將控制數(shù)量性狀的多個基因同時轉入受體細胞,這是基因工程難以實現(xiàn)的。但由于玉米原生質體培養(yǎng)和融合很困難,該技術應用于玉米品種改良、增加玉米遺傳多樣性,在技術體系上還不成熟。另外,體細胞雜交也無法解決連鎖累贅和后代大量分離的問題。所以,通過細胞工程方法利用玉米野生型基因資源有其不可解決的局限性??赊D化大片段DNA載體中DNA插入片段長度可達IOOkb以上,有可能將控制某一性狀的基因簇包括在內,這一突破彌補了常規(guī)基因工程中單基因轉移所無法解決的數(shù)量性狀改良的難題。同時,實現(xiàn)了在對插入大片段中基因功能進行快速鑒定,獲得轉基因植株,創(chuàng)新種質資源。利用可轉化人工染色體載體系統(tǒng),建立優(yōu)良種種質基因組文庫,將大片段DNA導入栽培玉米基因組,可以在得到插入片段相關信息的同時得到轉基因植株,發(fā)揮基因簇的協(xié)同作用,克服傳統(tǒng)育種和單基因轉移的瓶頸,從而更好的挖掘優(yōu)質基因資源,創(chuàng)新玉米種質。[0013]本發(fā)明的實施案例中也包括DNA構建體,該構建體含有操作性連接于異源核苷酸序列上的端粒,該啟動子含有本發(fā)明技術獲取的端粒,并可在植物細胞中穩(wěn)定遺傳。本發(fā)明的實施方案還提供了人工染色體構建方案,以及在基因組中穩(wěn)定包含上述DNA構建體的植物或植物細胞。本文所公開的染色體端粒獲取技術可用于植物基因工程,例如制備人工染色體用于轉化或轉基因植物,以產生目的表型。“轉化植物”或“轉基因植物”指在基因組內含有異源核苷酸序列的植物。通常轉化植物或轉基因植物基因組穩(wěn)定含有這些異源核苷酸序列,可將該異源核苷酸序列穩(wěn)定地遺傳給下一代。這些異源核苷酸序列可單獨或與重組DNA構建體一起存在于基因組中。這里所述的“轉基因事件”包括任何細胞、細胞系、愈傷組織、組織、植物體部分或完整植物體,只要它們的基因型被外源核酸的存在而改變,包括通過轉基因操作而改變的起始宿主,以及通過這些起始宿主進行有性或無性繁殖所得的后代。這里所用的“轉基因事件”并不包括通過傳統(tǒng)植物種植方法或天然事件(例如隨機雜交、非重組病毒感染、非重組細菌轉化、非重組轉座或自發(fā)突變)改變了基因組(染色體或染色體外)的植物。
[0014]“轉基因事件”通過以下步驟獲得,使用人工染色體構建體(含有核酸表達盒,其中又含有所述端粒)轉化植物細胞,獲得大量植物體,根據插入的外源基因進行篩選獲得所需的陽性轉基因系。轉基因事件的典型表型特征是目的基因的表達和人工染色體的穩(wěn)定遺傳。本文的“植物”包括整株植物、植物組織器官(如葉、根、莖等)、種子、植物細胞,以及它們的后代。實施方案中轉基因植物的部分植株應理解為包括轉基因植物或其后代的植物細胞、原生質體、組織、愈傷組織、胚,及從轉基因植物或其后代長出的花、莖、果實、胚珠、葉或根等。
[0015]本文所公開的端粒獲取技術可在宿主植物中與任何異源核苷酸序列結合。因此,所述的異源核苷酸序列可以是操作性連接于本文所公開的端粒之上的結構基因(編碼目的蛋白)。實施方案中的目的基因包括參與信號傳導調控的基因如轉錄因子、激酶等,持家基因如熱休克蛋白基因。更具體地說,轉基因的種類包括如,所編碼蛋白賦予植物耐受非生物逆境的抗性基因,所述非生物逆境包括干旱、溫度、鹽和毒素(殺蟲劑和除草劑)等?;蚴撬幋a蛋白賦予植物耐受生物逆境的抗性基因,如真菌、病毒、細菌、昆蟲和線蟲的侵害,以及由這些脅迫引起的疾病。表型的編碼包括改變植物中某個基因的表達,從而改變植物對病原體或昆蟲等的防御機制,或是提高植物對除草劑的抗性,根據環(huán)境改變植物的生長發(fā)育過程等。這些改變可通過在植物體內表達外源基因或提高內源特定基因的表達來獲得。或者是通過降低植物體內一個或多個內源基因的表達產物,如酶、轉運蛋白、輔因子等,通過影響植物的代謝機制來獲得相應的表型。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1為端粒獲取技術路線。
[0017]圖2為同步化處理的染色體流式核型圖。玉米高質量的染色體懸浮液是實現(xiàn)提取染色體前提,玉米細胞周期同步化采用1.25mmol.L-1HU進行18h阻斷處理,可將50%以上的細胞阻斷在晚Gl期和早S期。左為未處理細胞,右為同步化處理細胞。
[0018]圖3是單引物端粒PCR擴增電泳圖。擴增片段集中在350bp到5Kb之間,回收
2.5-3.5Kb的DNA片段用于端粒鑒定。M =Marker ;1、2、3中模板DNA分別來自玉米根、葉、穗。
[0019]圖4是利用載體pBlueScript SK+進行端粒文庫構建。利用藍白篩選去除空載體,并對白斑進行插入片段大小和序列進行分析。文庫大小為3X103cfu。
[0020]圖5是本發(fā)明鑒定獲取的端粒功能的載體示意圖。
[0021]圖6是本發(fā)明獲取的端粒轉化水稻驗證功能中水稻轉化圖。
【具體實施方式】
[0022]下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法,所用引物均由上海英駿生物技術公司合成,測序由北京華大基因完成,PCR試劑盒、載體構建過程中的核酸內切酶購自寶生物工程有限公司,PEASY-Tl連接試劑盒購自北京全式金生物技術公司,T4DNA連接酶購自PiOmega公司,方法均參照試劑盒提供的方法進行。實驗中所用的載體pDLC由本實驗改造所得,基本骨架來自于CAMBIA公司的pCAMBIA1303。
[0023]1.端粒單引物PCR擴增端粒序列:
[0024]設計克隆端粒所需引物:
[0025]引物:5’-TTTAGGG-3’引物
[0026]利用端粒的引物,以玉米基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取的玉米同步化基因組DNA作為模板,進行擴增,反應條件是:95°C預變性5分鐘;94°C變性20秒;35°C退火30秒;70°C延伸5分鐘;30個循環(huán);72°C延伸10分鐘。反應結束后,PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收2.5-3.5Kb的DNA,產物連入pBlueScriptSK+載體,篩選插入片段大于2.5Kb的陽性克隆并進行測序驗證,結果表明:所擴增序列為預期的玉米端粒序列。
[0027]2.構建表達載體
[0028]將測序驗證已經插入端粒序列的質粒用HindIII和BamHI雙酶切,連入同樣用HindIII和BamHI雙酶切的載體pDLC,挑取菌落PCR結果為陽性的菌落進行測序,測序驗證正確后,提取相應陽性克隆質粒,命名為pDLC-ml。
[0029]菌落PCR檢測所需引物:
[0030]引物3: 5,-TCTCCGCTCATGACGATAAT-3,
[0031] 引物 4:5’ -GACGTAACATGGTGAAGGGG-3’
[0032]引物3和引物4為pDLC載體上引物,位于所克隆的啟動子片段兩側,擴增片段約為啟動子的長度,以菌液為模板,擴增檢測,PCR反應條件為:95°C預變性5分鐘;94°C變性30秒;55°C退火30秒;72°C延伸3分鐘;30個循環(huán);72°C延伸10分鐘。
[0033]所構建的表達載體的T-DNA區(qū)的圖譜如圖所示,其中:LB和RB分別為T-DNA的左邊界和右邊界;Bar表示PPT除草劑抗性基因;Pnos表示nos基因的啟動子;Tnos表示nos基因的終止子;DsRed表示紅色熒光蛋白基因;HindIII和BamHI分別表示內切HindIII和BamHI的酶切位點;端粒即為本發(fā)明通過PCR-文庫篩選克隆出的端粒序列。
[0034]3.農桿菌共轉化
[0035]利用熱激法將質粒pDLC-ml轉入農桿菌AGLO菌株,利用農桿菌介導法對水稻進行共轉化,同時利用農桿菌花序侵染法轉化擬南芥植株。
[0036]4.功能鑒定[0037]從轉基因植株中分離各組織器官,進行DsRed活性檢測,將各組織器官置于熒光顯微鏡下觀察。
[0038]5.遺傳穩(wěn)定性分析
[0039]取Tl代水稻種子進行插入片段拷貝數(shù)分析,對單拷貝插入的株系的T2和T3代苗進行遺傳分析。
【權利要求】
1.一種利用端粒文庫獲得玉米染色體端粒的方法,其特征是利用端粒保守序列進行單引物PCR擴增端粒序列、建立端粒文庫,從中篩選得到天然的用于人工染色體構建的端粒序列。
2.權利要求1所述的端粒,其中所含的端粒序列為天然植物端粒,大小為2.5-3.5Kb。
3.權利要求2所述天然植物端粒,其中所含的序列經PCR單引物擴增得到。
4.權利要求2所述天然植物端粒,其中所含的序列經篩選端粒PCR文庫得到。
5.權利要求1所述植物端粒,其用途為構建植物人工染色體。
6.權利要求5所述植物人工染色體,其包含用此技術得到的端粒。
7.權利要求5所述植物人工染色體,其中所述端粒來自禾本科植物,優(yōu)選為玉米。
8.權利要求5所述植物人工染色體,其目標是轉化大片段DNA(>30Kb)。
9.權利要求8所述大片段DNA,其可以來源于同源植物,也可來源于異源植物或其它生物。
10.一種利用端粒文庫獲得玉米染色體端粒的方法,所述方法包括向植物體導入DNA構建體,所述DNA構建體含有端粒及操作性連接于所述啟動子的目的異源核苷酸序列,其中所述端粒選自: a)利用單引物PCR擴增; b)利用端粒文庫篩選。``
11.一種載體,它含有權利要求10所述的核酸分子。
12.一種細胞,它含有權利要求11所述的載體。
13.權利要求12所述細胞,其中所述細胞包括細菌細胞,哺乳動物細胞,昆蟲細胞,植物細胞,或真菌細胞。
14.權利要求13所述細胞,其中所述細菌細胞來自根癌土壤桿菌或大腸桿菌。
【文檔編號】C40B50/00GK103571828SQ201310206556
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年5月29日 優(yōu)先權日:2013年5月29日
【發(fā)明者】湯賽君, 任海翠, 馬冉冉 申請人:中國農業(yè)大學