固體型微生物肥料中有效活菌的菌體洗脫液及其洗脫方法
【專利摘要】固體型微生物肥料中有效活菌的菌體洗脫液及其洗脫方法，它涉及一種固體肥料中有效活菌的菌體洗脫液及其洗脫方法。它解決了固體型微生物肥料中因固體載體與解磷細(xì)菌之間存在著復(fù)雜的吸附作用，導(dǎo)致菌體回收率一直嚴(yán)重偏低的問題。菌體洗脫液由吐溫80和pH值7.2～8.0的加NaCl磷酸鹽緩沖液組成。洗脫方法：取固體型微生物肥料加入帶玻璃珠并盛有本發(fā)明菌體洗脫液的容器中靜置，然后在轉(zhuǎn)速為220rpm的條件下震蕩培養(yǎng)，即完成固體型微生物肥料中有效活菌的洗脫。本發(fā)明方法與現(xiàn)有洗脫方法相比有效活菌的洗脫率提高了36.1％以上，誤差更小，更為接近真實(shí)情況。
【專利說明】
固體型微生物肥料中有效活菌的菌體洗脫液及其洗脫方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種固體肥料中有效活菌的菌體洗脫液及其洗脫方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 為了實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，改良土壤環(huán)境、增加產(chǎn)量、提高作物品質(zhì)，微生物肥 料已經(jīng)成為關(guān)注的熱點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。與其他劑型微生物肥料相比，固體型微 生物肥料具有易儲(chǔ)存和運(yùn)輸、施用方法簡單及節(jié)約勞動(dòng)成本等優(yōu)點(diǎn)，受到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者的青 睞。
[0003] 有效活菌的數(shù)量是評(píng)價(jià)微生物肥料質(zhì)量的關(guān)鍵因素。目前測定微生物肥料中的有 效活菌數(shù)的方法依然采用平板計(jì)數(shù)法。褐煤是目前固體型微生物肥料中最為主要和常見的 載體，巨大芽孢桿菌為固體型微生物肥料中具有代表性解磷微生物菌體，因此需要將固體 型微生物肥料中的解磷細(xì)菌洗脫下來。但由于固體型微生物肥料中固體載體與解磷細(xì)菌之 間存在著復(fù)雜的吸附作用，包括分子間力、靜電力、疏水作用力、氫鍵和空間位阻效應(yīng)等多 種作用力。所以，參照現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)GB 20287-2006進(jìn)行固體型微生物肥料中細(xì)菌的洗脫， 回收率一直嚴(yán)重偏低、誤差較大，不利于固體型微生物肥料的后續(xù)的研究和利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了解決固體型微生物肥料中固體載體與解磷細(xì)菌之間存在著 復(fù)雜的吸附作用，導(dǎo)致細(xì)菌洗脫率一直嚴(yán)重偏低的問題，而提供的一種固體型微生物肥料 中有效活菌的菌體洗脫液及其洗脫方法。
[0005] 本發(fā)明固體型微生物肥料中有效活菌的菌體洗脫液由5ml的吐溫80和95ml的pH值 7.2~8.0的加 NaCl磷酸鹽緩沖液組成;95ml的pH值7.2~8.0的加 NaCl磷酸鹽緩沖液由85ml 濃度是0.2mol/L的Na2HP04溶液和l〇ml濃度是0.3mol/L的NaH 2P04溶液組成；菌體洗脫液中 NaCl的濃度為18~22mmol/L。
[0006] 利用上述菌體洗脫液洗脫固體型微生物肥料中有效活菌的方法按以下步驟進(jìn)行：
[0007] 取固體型微生物肥料加入帶玻璃珠并盛有本發(fā)明上述菌體洗脫液的容器中靜置， 然后在轉(zhuǎn)速為220rpm的條件下震蕩培養(yǎng)，即完成固體型微生物肥料中有效活菌的洗脫。 [0008]細(xì)菌在載體粘粒表面的吸附是熱力學(xué)自發(fā)過程，與微生物和載體的表面性質(zhì)如表 面電荷、疏水性以及所處的環(huán)境條件如PH、電解質(zhì)濃度、溫度等都有著密切的關(guān)系。本發(fā)明 通過改變洗脫過程中固體型微生物肥料的微環(huán)境，從而減弱細(xì)菌與載體之間的吸附作用， 增強(qiáng)菌體由載體表面的釋放，進(jìn)而提高固體型微生物肥料中有效活菌的洗脫效率，更為真 實(shí)的反映固體型微生物肥料的質(zhì)量。
[0009]本發(fā)明方法與現(xiàn)有洗脫方法相比有效活菌的洗脫率提高了30%以上，誤差更小， 更為接近真實(shí)情況。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的 任意組合。
【具體實(shí)施方式】 [0011] 一:本實(shí)施方式洗脫固體型微生物肥料中有效活菌的方法按以下步 驟進(jìn)行：
[0012] 取固體型微生物肥料加入帶玻璃珠并盛有菌體洗脫液的容器中靜置，然后在轉(zhuǎn)速 為220rpm的條件下震蕩培養(yǎng)，即完成固體型微生物肥料中有效活菌的洗脫；
[0013] 其中，菌體洗脫液由5ml的吐溫80和95ml的pH值7.2~8.0的加 NaCl磷酸鹽緩沖液 組成;95ml的pH值7.2~8.0的加 NaCl磷酸鹽緩沖液由85ml濃度是0.2mol/L的Na2HP〇4溶液和 10ml濃度是0.3mol/L的NaH2P〇4溶液組成;菌體洗脫液中NaCl的濃度為18~22mmol/L。
【具體實(shí)施方式】 [0014] 二:本實(shí)施方式與一的不同點(diǎn)是：固體型微生物肥料 與菌體洗脫液的比例為l〇g: l〇〇ml。其它與實(shí)施方式一相同。
【具體實(shí)施方式】 [0015] 三：本實(shí)施方式與一或二的不同點(diǎn)是：靜置時(shí)間為 20min。其它與實(shí)施方式一或二相同。
【具體實(shí)施方式】 [0016] 四：本實(shí)施方式與一至三之一的不同點(diǎn)是:震蕩培養(yǎng) 時(shí)間為30min。其它與實(shí)施方式一至三之一相同。
【具體實(shí)施方式】 [0017] 五:本實(shí)施方式與一至四之一的不同點(diǎn)是：固體型微 生物肥料是以褐煤為載體的固體型微生物肥料。其它與實(shí)施方式一至四之一相同。
[0018] 褐煤是目前固體型微生物肥料中最為主要和常見的載體。
【具體實(shí)施方式】 [0019] 六:本實(shí)施方式與一至五之一的不同點(diǎn)是：固體型微 生物肥料是以巨大芽孢桿菌為堆肥發(fā)酵菌的固體型微生物肥料。其它與實(shí)施方式一至五之 一相同。
[0020] 巨大芽孢桿菌為固體型微生物肥料中具有代表性微生物菌體。
[0021] 對(duì)比試驗(yàn)
[0022] -、菌液的制備:活化巨大芽孢桿菌，然后接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，置于 30 °C、120r/min環(huán)境中培養(yǎng)48h，保存?zhèn)溆谩?br>[0023]二、載體的處理:褐煤來自雞西，腐殖酸含量43.5%;將褐煤pH值調(diào)節(jié)至7.0、高壓 121°C蒸汽滅菌lh，檢查無菌后備用。
[0024]三、吸附：按1.8 X 108cfu/g的接菌數(shù)將巨大芽孢桿菌與經(jīng)高壓蒸汽滅菌的褐煤載 體均勻混合，再用無菌水調(diào)水分為30%~35%，密封室溫放置。
[0025]四、洗脫：
[0026] 方法1、參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 20287-2006,稱取步驟三吸附有巨大芽孢桿菌的褐煤10g 加入帶玻璃珠并盛有l(wèi)〇〇ml無菌水的三角瓶中靜置20min，然后200rpm震蕩培養(yǎng)30min后進(jìn) 行洗脫。
[0027]方法2、采用本發(fā)明方法，稱取步驟三吸附有巨大芽孢桿菌的褐煤10g加入帶玻璃 珠并盛有l(wèi)〇〇ml菌體洗脫液的三角瓶中靜置20min，然后220rpm震蕩培養(yǎng)30min;其中，菌體 洗脫液為pH值7.6的加 NaCl及吐溫80的磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液由85ml濃度是0.2mol/ L的Na2HP〇4和10ml濃度是0.3mol/L的NaH2P〇4組成；菌體洗脫液中NaCl的濃度為20mmol/L， 每100ml菌體洗脫液中表面活性劑吐溫80的加入量為5ml。
[0028] 五、稀釋平板法計(jì)數(shù)，每組測定重復(fù)10次，結(jié)果如表1所示。
[0029] 方法1測定本實(shí)驗(yàn)固體型微生物肥料樣品的有效活菌數(shù)為7.2X107cfu/g。
[0030] 方法2測定本實(shí)驗(yàn)固體型微生物肥料樣品的有效活菌數(shù)平均值為1.37 X 108cfu/ g°
[0031] 本發(fā)明固體型微生物肥料中有效活菌的洗脫方法顯著提高了載體褐煤上巨大芽 孢桿菌的菌體洗脫率，有效活菌的菌體洗脫率在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上提高了36.1%，與原有 洗脫方法相比，具有顯著性差異(P〈〇.05)。
[0032] 表1固體型微生物肥料中有效活菌數(shù)洗脫測定結(jié)果
[0033]
[0034] 有效活菌數(shù)單位107cfu/g
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 固體型微生物肥料中有效活菌的菌體洗脫液，其特征在于該菌體洗脫液由5ml的吐 溫80和95ml的pH值7.2~8.0的加 NaCl磷酸鹽緩沖液組成;95ml的pH值7.2~8.0的加 NaCl磷 酸鹽緩沖液由85ml濃度是0.2mol/L的Na2HPO4溶液和IOml濃度是0.3mol/L的NaH 2PO4溶液組 成;菌體洗脫液中NaC 1的濃度為18~2 2mmo I /L。2. 固體型微生物肥料中有效活菌的洗脫方法，其特征在于洗脫固體型微生物肥料中有 效活菌的方法按以下步驟進(jìn)行： 取固體型微生物肥料加入帶玻璃珠并盛有權(quán)利要求1所述菌體洗脫液的容器中靜置， 然后在轉(zhuǎn)速為220rpm的條件下震蕩培養(yǎng)，即完成固體型微生物肥料中有效活菌的洗脫。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的固體型微生物肥料中有效活菌的洗脫方法，其特征在于固體 型微生物肥料與菌體洗脫液的比例為I Og: I OOml。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的固體型微生物肥料中有效活菌的洗脫方法，其特征在于靜置 時(shí)間為20min。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的固體型微生物肥料中有效活菌的洗脫方法，其特征在于震蕩 培養(yǎng)時(shí)間為30min。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的固體型微生物肥料中有效活菌的洗脫方法，其特征在于固體 型微生物肥料是以褐煤為載體的固體型微生物肥料。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的固體型微生物肥料中有效活菌的洗脫方法，其特征在于固體 型微生物肥料是以巨大芽孢桿菌為堆肥發(fā)酵菌的固體型微生物肥料。
【文檔編號(hào)】C12N1/02GK105950470SQ201610373523
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月31日
【發(fā)明人】安琦, 殷博, 曹亞彬, 郭立姝, 樊川, 張欣, 牛彥波, 吳皓瓊, 王笑庸
【申請(qǐng)人】黑龍江省科學(xué)院微生物研究所