一株巨大芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物防治植物病害領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一株能夠高效防治植 物病害的芽孢桿菌及其用途，以及采用該芽孢桿菌制備的生物防治制劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物病害嚴(yán)重影響農(nóng)林作物生長，甚至引起作物死亡，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。對于 植物病害的防治，常規(guī)采用的方法包括傳統(tǒng)的化學(xué)防治、培育抗病品種以及生物防治?？共?品種周期長，抗性單一?；瘜W(xué)防治使用藥劑時間長、使用量大，造成農(nóng)藥殘留，環(huán)境污染；同 時，化學(xué)農(nóng)藥的長期使用，使得病原菌對其產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致防效下降甚至失敗。利用有益 微生物防治植物病害具有廣闊的前景。
[0003] 芽孢桿菌是一種廣泛分布于各種不同生活環(huán)境中的腐生細(xì)菌，是一群好氧兼厭氧 的產(chǎn)芽孢革蘭氏陽性桿菌的總稱，可以產(chǎn)生內(nèi)生耐熱抗逆的芽孢。芽孢不僅對熱有抗逆性， 還對紫外線、電磁輻射及一些化學(xué)藥品有很強(qiáng)的抗逆性，它可以忍受各種不良環(huán)境。由于具 有如此強(qiáng)的抗逆性，使得它有利于生防菌劑的生產(chǎn)和劑型加工，也利于其在環(huán)境中的存活、 定殖與繁殖。由于它們生長快、營養(yǎng)簡單、能夠形成具有較強(qiáng)抗逆性能力的芽孢，在產(chǎn)品開 發(fā)中較非芽孢桿菌有效活菌數(shù)量高、性能穩(wěn)定等優(yōu)勢而備受矚目。芽孢桿菌是植物病害生 防微生物的重要組成部分，可用于防治多種植物病害。芽孢桿菌作為生防菌防治植物病害 的機(jī)制主要有：抗生作用、營養(yǎng)競爭、空間競爭、重寄生作用以及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等機(jī)制， 芽孢桿菌的生防機(jī)制主要是以產(chǎn)生拮抗物質(zhì)抑制有害病菌的生長或殺死病原菌。這些物質(zhì) 絕大多數(shù)為肽類抗生素，具有高效、低殘留、與環(huán)境友好等優(yōu)點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種用于高效防治多種植物病害的新的細(xì)菌一一巨大芽孢 桿菌菌株STY006。本發(fā)明的菌株具有生長速度快、產(chǎn)孢量大、作用譜廣、抗逆性強(qiáng)，在植物根 際能夠快速大量定殖等特點，因此具有良好的應(yīng)用前景。
[0005] 本發(fā)明所提供的菌株為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium) STY006,是從土壤 中分離獲得的，已于2015年7月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心（簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所），保 藏編號為CGMCC No. 11053。其具有以下生物學(xué)特性：在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基或LB培 養(yǎng)基上菌落形態(tài)為圓形或不規(guī)則形，乳白偏黃色，表面粗糙起褶皺，在牛肉膏蛋白胨瓊脂培 養(yǎng)基上，28°C下培養(yǎng)兩天后，鏡檢，菌體細(xì)胞呈桿狀，能運動。經(jīng)革蘭氏染色呈陽性（以大腸 桿菌為對照）。經(jīng)芽孢染色后觀察芽孢呈橢圓形或柱狀。
[0006] 本發(fā)明巨大芽孢桿菌（Bacillus magaterium)菌株STY006的培養(yǎng)方法或繁殖方 法包括：
[0007] (1)普通培養(yǎng)保存采用LB培養(yǎng)基，配方為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉 l〇g，瓊脂 15_20g，蒸餾水 lOOOmL，pH 調(diào)至 7. 0-7. 2 ;
[0008] (2)實驗室液體培養(yǎng)采用LB液體培養(yǎng)基，配方為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g， 氯化鈉 l〇g，蒸餾水lOOOmL，pH調(diào)至7. 0-7. 2 ;
[0009] (3)固體培養(yǎng)基配方：固料和無機(jī)鹽溶液，按質(zhì)量比I :1. 8的比例配制。其中所述 固料由質(zhì)量比為65 :35的玉米粉和麩皮組成；按質(zhì)量百分比計，所述無機(jī)鹽溶液的組分及 含量為：3. 5%磷酸二氫鉀，0. 04%硫酸鎂，4%硫酸銨，剩余為水。
[0010] (4)大量發(fā)酵培養(yǎng)基配方：同（3)中固體培養(yǎng)基配方。
[0011] 本發(fā)明還公開了一種包括所述的巨大芽孢桿菌菌株STY006的生物防治制劑。
[0012] 本發(fā)明所述的生物防治制劑的制備方法包括以下步驟：
[0013] (1)制備巨大芽孢桿菌菌株STY006的種子液；
[0014] (2)將步驟（1)制備的種子液接種到固體培養(yǎng)基中，28_30°C下恒溫培養(yǎng)3~5d ;
[0015] (3)將步驟（2)培養(yǎng)的培養(yǎng)物加入無菌水混合，過濾，將濾液接種至大量發(fā)酵培養(yǎng) 基，在室溫28-30°C、相對濕度85%以上的發(fā)酵室中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0016] 其中，步驟（2)中的固體培養(yǎng)基由固料和無機(jī)鹽溶液組成，其中所述固料由質(zhì) 量比為65 :35的玉米粉和麩皮組成；按質(zhì)量百分比計，所述無機(jī)鹽溶液的組分及含量為： 3. 5%磷酸二氫鉀，0. 04%硫酸鎂，4%硫酸銨，剩余為水。
[0017] 并且，步驟（3)中的大量發(fā)酵培養(yǎng)基同固體培養(yǎng)基。
[0018] 在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述制備方法包括以下步驟：
[0019] (1)將巨大芽孢桿菌菌株STY006的孢子移植到LB液體培養(yǎng)基中，28-30 °C搖床振 蕩培養(yǎng)3~5d得到種子液；
[0020] (2)將步驟（1)制備的種子液按質(zhì)量比10%的比例接種到固體培養(yǎng)基中，28_30°C 下振蕩培養(yǎng)3~5d ;
[0021] (3)將步驟⑵培養(yǎng)的培養(yǎng)物加入無菌水按質(zhì)量比I :15的比例混合，過濾，將濾 液按體積比1 :6的比例接種至大量發(fā)酵培養(yǎng)基，室溫28-30°C、相對濕度85%以上的發(fā)酵室 中發(fā)酵培養(yǎng)8~9d。
[0022] 本發(fā)明還提供了上述巨大芽孢桿菌菌株STY006或者上述生物防治制劑在防治植 物土傳病害中的用途；所述植物土傳病害可以選自棉花枯萎病、大白菜軟腐病、生姜姜瘟 病、核桃細(xì)菌性褐斑病等的一種或幾種。
[0023] 并且，本發(fā)明還提供了一種用于防治植物土傳病害的生物防治方法，包括向具有 土傳病害的植物施用上述巨大芽孢桿菌菌株STY006或者上述生物防治制劑。
[0024] 實驗表明，本發(fā)明的巨大芽孢桿菌菌株具有生長速度快、產(chǎn)孢量大、作用譜廣、抗 逆性強(qiáng)，在植物根際能夠快速大量定殖等特點，因此具有良好的應(yīng)用前景。由該巨大芽孢桿 菌菌株制備的生物防治制劑，可以作為生物農(nóng)藥或生物肥料，防治多種土傳植物細(xì)菌性病 害，包括棉花枯萎病、大白菜軟腐病、生姜姜瘟病、核桃細(xì)菌性褐斑病等。
【具體實施方式】
[0025] 下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是示例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0026] 實施例1
[0027] 1、巨大芽孢桿菌菌株STY006的分離與純化
[0028] 本發(fā)明的巨大芽孢桿菌菌株STY006是從土壤中采用稀釋平板法和平板劃線法分 離獲得的，分離方法為：
[0029] ⑴芽孢桿菌的分離：土樣的采集，在全國不同地區(qū)選取種植不同作物類型的地塊， 采用5點取樣法，分別采集地塊四周和中央深度在10-20cm范圍內(nèi)的土壤適量，等量混勻。 標(biāo)明采集地點、時間和采集人。稱取Ig 土樣于IOOmL無菌水中，置于30°C搖床中150rpm震 蕩lOmin，然后置于60°C水浴鍋中孵育30min，取100 μ L 10 2、10 3、10 4稀釋液涂布于LB培 養(yǎng)基平板上，每個梯度涂布三個平行，在30Γ培養(yǎng)2d后挑取LB培養(yǎng)基上的不同形態(tài)的微生 物菌落于LB培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線，定時觀察菌落生長情況。然后采用平板劃線法，純化 芽孢桿菌菌株，分別編號保存。
[0030] ⑵棉花枯萎病高效拮抗芽孢桿菌的篩選
[0031] ①初篩：采用對峙培養(yǎng)法，制備LB平板，用打孔器在芽孢桿菌、棉花枯萎病邊緣打 取直徑為5_的菌餅，分別移植在平板相對的兩側(cè)中央，25°C恒溫培養(yǎng)，逐日觀察芽孢桿菌 對病原菌的抑制作用。
[0032] ②復(fù)篩：將篩選到的具有高效拮抗活性的芽孢桿菌菌株進(jìn)行復(fù)篩，主要是經(jīng)過耐 溫性、耐酸堿性、耐藥性試驗，篩選到耐性較好的芽孢桿菌菌株，進(jìn)行盆栽防治試驗和田間 試驗。
[0033] 本發(fā)明人通過大量篩選工作得到一株能夠高效防治多種植物病害的巨大芽孢桿 菌菌株STY006。實驗證明，該巨大芽孢桿菌原粉在防治棉花枯萎病顯示出非常高效的防治 效果，使得農(nóng)作物顯著增產(chǎn)。因而，本發(fā)明的巨大芽孢桿菌是具有廣泛應(yīng)用前景的巨大芽孢 桿菌新菌株，可以用于制備防治多種植物病害的生物防治制劑。
[0034] 2、菌株鑒定
[0035] (1)微生物學(xué)特性：在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)