一種死亡谷芽胞桿菌nbif-001及發(fā)酵方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種死亡谷芽胞桿菌NBIF-001及發(fā) 酵方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 西瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型（Fusarium oxysporum f. sp. Niveum)病 原菌引起的，在土中存活時(shí)間較長(zhǎng)（8~10年）。該病害在我國(guó)的發(fā)生面積約為總栽培面 積的42%，造成減產(chǎn)15%，重者達(dá)85 %甚至絕收，導(dǎo)致西瓜品質(zhì)降低（含糖量下降等），是 危害最為嚴(yán)重、造成經(jīng)濟(jì)損失最大的病害之一。該病從苗期到坐果期均可發(fā)生，以坐果初期 發(fā)病最為嚴(yán)重。苗期的發(fā)病苗，莖、葉因失水而枯萎、倒伏，根部的根毛枯萎、脫落，莖基部出 現(xiàn)皺縮，呈現(xiàn)淡紫色或淺褐色。坐果初期發(fā)病，植株下部莖葉枯萎發(fā)黃，幾天后迅速擴(kuò)散到 整個(gè)植株，直至完全枯死。病情擴(kuò)展很快，幾天至十幾天便可蔓延全田。生產(chǎn)中采用多種方 法防治這種病害，如嫁接防治、抗病育種、農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治等。但由于目前西 瓜枯萎病防治手段不能高效殺菌，抗病品種選育難度大，病原菌生理小種的不斷分化，抗藥 性、致病力增強(qiáng)，農(nóng)耕技術(shù)水平低下等原因，對(duì)我國(guó)西瓜生產(chǎn)造成很大影響，嚴(yán)重挫傷了生 產(chǎn)者的積極性。尋找一種經(jīng)濟(jì)、安全、高效的防治方法是當(dāng)務(wù)之急。近年來(lái)，根際生防菌的 研究為西瓜枯萎病的生物防治提供了新途徑，許多根際有益微生物既能夠產(chǎn)生多種抗菌物 質(zhì)直接抑菌，又能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，使植物獲得廣譜抗病能力。因此根際生防菌誘 導(dǎo)植物產(chǎn)生的防護(hù)作用安全而有效，在植物病害生物防治中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 目前應(yīng)用于生物防治的芽胞桿菌種類(lèi)主要有蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis)、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)、多粘芽胞桿菌（Bacillus polymyxa)、錯(cuò)狀芽胞桿菌（Bacillus cereus)、地衣芽胞桿菌（Bacillus licheniformis)、巨大芽胞桿菌（Bacillus megaterium)、短小芽胞桿菌（Bacillus pumilis)等。通過(guò)同化作用產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，抑制有 害病原物的生長(zhǎng)或者直接殺滅病原物，是生防芽胞桿菌防治植物病害的重要機(jī)制之一。芽 胞桿菌產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)主要有抗生素、抗菌蛋白及揮發(fā)性抗菌物質(zhì)等，其中脂肽抗生素是 一個(gè)較大的類(lèi)群。它們易于繁殖，適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)，具有很大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種死亡谷芽胞桿菌（Bacillus vallismortis)，申請(qǐng)人 將其命名為死亡谷芽胞桿菌NBIF-001，該菌株于2015年3月6日送至中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏 中心（CCTCC)保藏，其保藏號(hào)為CCTCC NO :M2015087,分類(lèi)命名：死亡谷芽胞桿菌（Bacillus V allismortis)NBIF-001，地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)。
[0005] 本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供了死亡谷芽胞桿菌（Bacillus vallismortis) NBIF-001的發(fā)酵方法，方法簡(jiǎn)單，易行。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供死亡谷芽胞桿菌（Bacillus vallismortis) NBIF-OOl的應(yīng)用，包括在制備防治西瓜枯萎病藥物中的應(yīng)用；還包括在制備番茄枯萎病 菌、番茄早疫病菌、禾谷鐮刀菌、小麥赤霉病菌或水稻紋枯病菌抑制劑中的應(yīng)用；還包括在 制備防治黃瓜灰霉病藥物、或防治水稻紋枯病藥物中的應(yīng)用；還包括在制備抑螨藥物中的 應(yīng)用。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下
[0008] 死亡谷芽胞桿菌NBIF-001菌株的分離與培養(yǎng)：
[0009] 申請(qǐng)人自云南香格里拉的土壤樣品，通過(guò)高溫篩選，獲得了一株死亡谷芽胞桿菌， 該菌株已于2015年3月6日送至中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)保藏，其保藏號(hào)為CCTCC NO :M2015087,分類(lèi)命名：死亡谷芽胞桿菌（Bacillus vallismortis)NBIF-001，地址：中國(guó) 武漢武漢大學(xué)。
[0010] 生物學(xué)特性：該菌株在LB瓊脂平板上繁殖生長(zhǎng)形成的菌落圓形，邊緣有褶狀突 起，乳白色，直徑3~5mm，通過(guò)鏡檢觀察，細(xì)胞形態(tài)呈桿狀。生理生化鑒定結(jié)果如下表1所 示：
[0011] 表1死亡谷芽胞桿菌NBIF-001菌株生理生化鑒定



[0016] 死亡谷芽胞桿菌（Bacillus vallismortis)NBIF_001的發(fā)酵方法：將死亡谷芽 胞桿菌（Bacillus vallismortis) NBIF-001種子液按L 5%的接種量轉(zhuǎn)接至200L發(fā)酵罐 中，發(fā)酵培養(yǎng)基為NT培養(yǎng)基，進(jìn)行發(fā)酵罐大量發(fā)酵。發(fā)酵條件：30°C，溶氧量4m3/h，通氣量 1: 0· 75，轉(zhuǎn)速 200rpm，pH7. 0，發(fā)酵 36h。
[0017] 死亡谷芽胞桿菌（Bacillus vallismortis)NBIF-001的應(yīng)用，包括在制備防治西 瓜枯萎病藥物中的應(yīng)用，包括利用該菌株的菌液對(duì)西瓜進(jìn)行灌根或蘸根處理，即可達(dá)到防 治西瓜枯萎病的作用；或與其他生防菌混合，制備成混合菌劑，用于防治西瓜枯萎??；包括 在制備番茄枯萎病菌、番茄早疫病菌、禾谷鐮刀菌、小麥赤霉病菌或水稻紋枯病菌抑制劑中 的應(yīng)用；還包括在制備防治黃瓜灰霉病藥物、或防治水稻紋枯病藥物中的應(yīng)用；還包括在 制備抑螨藥物中的應(yīng)用。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0019] 1.本發(fā)明提供的是一種從植物根際土壤中篩選獲得對(duì)西瓜枯萎病具有拮抗作用 的生防細(xì)菌菌株，低濃度下能夠有效抑制西瓜枯萎病菌的生長(zhǎng)，對(duì)西瓜枯萎病的防治具有 重要意義。
[0020] 2.利用本發(fā)明的死亡谷芽胞桿菌（Bacillus vallismortis)NBIF-001 (10億個(gè)/ ml)對(duì)西瓜進(jìn)行灌根處理后，防效高達(dá)88. 5%，進(jìn)行蘸根處理后，其防效也達(dá)到了 65.7%， 因此是一株對(duì)西瓜枯萎病病原菌具備特異性效果的生防菌。
[0021] 3.本發(fā)明提供的死亡谷芽胞桿菌（Bacillus vallismortis)NBIF_001同時(shí)對(duì)番 茄枯萎病菌、番茄早疫病菌、禾谷鐮刀菌、小麥赤霉病菌或水稻紋枯病菌均有抑制作用。同 時(shí)對(duì)黃瓜灰霉病和水稻紋枯病具有良好的防效，可與其他化學(xué)抑菌劑聯(lián)合施用，以減少化 學(xué)抑菌劑對(duì)環(huán)境的影響。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1是本發(fā)明的死亡谷芽胞桿菌NBIF-001菌株的形態(tài)圖。
[0023] A :死亡谷芽胞桿菌NBIF-001菌株的菌落形態(tài)圖；B :死亡谷芽胞桿菌NBIF-001菌 株的顯微鏡觀察圖。
[0024] 圖2是本發(fā)明的死亡谷芽胞桿菌NBIF-001菌株對(duì)西瓜枯萎病菌的抑制效果圖。
[0025] 圖3是本發(fā)明的死亡谷芽胞桿菌NBIF-001菌株及3種芽胞桿菌菌株對(duì)西瓜枯萎 病菌的抑制效果圖。
[0026] 其中：圖3中A :死亡谷芽胞桿菌NBIF-001 (10億個(gè)/ml);圖3中B :多粘芽胞桿菌 (10億個(gè)/ml);圖3中C :地衣芽胞桿菌（10億個(gè)/ml);圖3中D :枯草芽胞桿菌（10億個(gè)/ m 1) 〇
[0027] 圖4是本發(fā)明的死亡谷芽胞桿菌NBIF-001菌株對(duì)西瓜枯萎病的盆栽灌根防治效 果圖。
[0028] 其中：圖4中A :接種了西瓜枯萎病菌且僅用培養(yǎng)基灌根的西瓜苗對(duì)照；圖4中B : 接種了西瓜枯萎病菌且用NBIF-001菌株發(fā)酵液灌根的西瓜苗。
[0029] 圖5是本發(fā)明的死亡谷芽胞桿菌NBIF-001菌株對(duì)西瓜枯萎病的盆栽蘸根防治效 果圖。
[0030] 其中：圖5中A :接種了西瓜枯萎病菌且僅用培養(yǎng)基蘸根的西瓜苗對(duì)照；圖5中B : 接種了西瓜枯萎病菌且用NBIF-001菌株發(fā)酵液蘸根的西瓜苗。圖5中C :接種了西瓜枯萎 病菌且用地衣芽胞桿菌菌株發(fā)酵液蘸根的西瓜苗。圖5中D :接種了西瓜枯萎病菌且用多 粘芽胞桿菌菌株發(fā)酵液蘸根的西瓜苗。圖5中E :接種了西瓜枯萎病菌且用枯草芽胞桿菌 菌株發(fā)酵液蘸根的西瓜苗。圖5中F :接種了西瓜枯萎病菌且用咪鮮胺溶液（500ppm)蘸根 的西瓜苗。圖6是本發(fā)明的死亡谷芽胞桿菌NBIF-001菌株對(duì)番茄枯萎病菌的抑制效果圖。
[0031] 圖7是本發(fā)明的死亡谷芽胞桿菌NBIF-001菌株對(duì)黃瓜灰霉病的離體葉片防治效 果圖。
[0032] 圖8是本發(fā)明的死亡谷芽胞桿菌NBIF-001菌株對(duì)水稻紋枯病的離體葉片防治效 果圖。 具體實(shí)施方案
[0033] 本發(fā)明實(shí)施例所述技術(shù)方案，如未特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方案，所述試劑或 菌劑，如未特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域公知或來(lái)源于商業(yè)渠道。
[0034] 實(shí)施例1 :
[0035] 死亡谷芽胞桿菌NBIF-001菌株的分離與培養(yǎng)
[0036] 1.細(xì)菌的分離與保存
[0037] 將采自云南香格里拉的土壤樣品，進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)與保存。
[0038] 具體方法是：稱(chēng)取0.1 g 土樣，分別加入滅菌去離子水至總體積為10ml，混勻后放 于70°C水浴鍋中加熱30min，再依次取Iml繼續(xù)稀釋10倍、100倍、1000倍、10000倍，取稀 釋后的菌液2ml涂布LB (配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，瓊脂粉20g，補(bǔ)充水分1L， pH 7. 2，121°C滅菌30min)平板，30°C培養(yǎng)過(guò)夜。
[0039] 分別挑取單菌落，轉(zhuǎn)接入5ml LB液體培