一株產(chǎn)角蛋白酶的魯特介斯鏈霉菌lt-2及其應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及到一種產(chǎn)角蛋白酶的新型菌株魯特介斯鏈霉菌 LT-2及其應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 角蛋白可分為α角蛋白和β角蛋白兩種，α角蛋白主要存在于哺乳動(dòng)物的毛發(fā)、 羽毛、獸角、指/趾甲、爪子和獸蹄中。更硬的β角蛋白存在于爬行動(dòng)物的趾甲、殼、鱗、鳥 喙、爪子及剛毛中。其粗蛋白含量在80%以上，各種氨基酸總量在70%以上，同時(shí)含有較多 大量元素、微量元素和未知生長(zhǎng)因子，是一種良好的飼料蛋白及肥料來源，對(duì)它的開發(fā)利用 具有重要的應(yīng)用前景。
[0003] 近年來，隨著大規(guī)模養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，產(chǎn)生了大量畜禽廢棄物，主要以毛發(fā)、羽 毛、角、蹄等主要形式存在。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年羽毛等產(chǎn)量達(dá)數(shù)百萬噸。這些廢棄物除少 量用于羽絨制品和制備氨基酸外，絕大部分未得到合理利用，不僅造成大量的資源浪費(fèi)，而 且造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。
[0004] 傳統(tǒng)的角蛋白處理工藝主要包括物理法、化學(xué)法和生物法。物理或化學(xué)方法，存在 能耗高、環(huán)境污染嚴(yán)重、產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)易被破壞和三廢不易處理等問題。利用微生物降解 等生物技術(shù)途徑解決角蛋白分解利用越來越受到重視。但角蛋白結(jié)構(gòu)中的二硫鍵使其具有 抗降解性，不為多數(shù)蛋白酶如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶等降解。因此，從自然界中 篩選高效降解角蛋白的微生物以及研究和開發(fā)微生物源角蛋白酶制劑，并建立切實(shí)可行的 生產(chǎn)工藝，將蛋白廢棄物轉(zhuǎn)化為蛋白飼料或肥料，這項(xiàng)工作對(duì)我國(guó)環(huán)境保護(hù)和飼料加工均 有著積極的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種新型產(chǎn)角蛋白酶的魯特介斯鏈霉菌及其應(yīng)用，是以含角 蛋白的豬毛為原料進(jìn)行篩選得到的，與其它降解角蛋白的菌株相比，本發(fā)明的菌株不僅可 用于豬毛角蛋白的降解，還可應(yīng)用于其它多種角蛋白廢棄物的降解，菌株的發(fā)酵條件溫和， 應(yīng)用方便，且該菌所產(chǎn)角蛋白酶的酶活較高，并較穩(wěn)定。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] -株產(chǎn)角蛋白酶的魯特介斯鏈霉菌（Streptomyces rutgersensis)LT_2保藏號(hào) 為：CCTCC NO:M 2015440。
[0008] 所述囷株應(yīng)用于降解c[角蛋白或者β角蛋白。
[0009] α角蛋白包括人和動(dòng)物的毛發(fā)、蹄、爪、角、甲；β角蛋白包括羽毛、鳥P彖、爬行動(dòng) 物的趾甲及鱗和爪子。
[0010] 所述菌株的應(yīng)用方法，用于制備菌劑產(chǎn)品：從活化好的斜面上刮取孢子，用無菌水 制成均勻的孢子懸液，再將孢子懸液接種至產(chǎn)孢子培養(yǎng)基，搖床震蕩培養(yǎng)，所得搖瓶培養(yǎng)菌 液為種子液；然后進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)，最后進(jìn)行固體吸附，即為菌劑產(chǎn)品。 toon] 具體是從活化好的斜面上刮取孢子，用無菌水制成均勻的孢子懸液，再將孢子懸 液接種至產(chǎn)孢子培養(yǎng)基，30-35°C，100-300rpm搖床震蕩培養(yǎng)3-5d，所得搖瓶培養(yǎng)菌液為種 子液；然后進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)，發(fā)酵終點(diǎn)為孢子數(shù)不低于總菌數(shù)的90%，且發(fā)酵液的活菌數(shù) 在2. OX 101(]-3. OX K^cfu/ml之間，最后進(jìn)行固體吸附，即為菌劑產(chǎn)品。
[0012] 更具體是從活化好的斜面上刮取孢子，用無菌水制成均勻的孢子懸液，再將孢子 懸液接種至產(chǎn)孢子培養(yǎng)基30-35 °C，100-300rpm搖床震蕩培養(yǎng)3-5d，所得搖瓶培養(yǎng)菌液為 種子液；然后進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)；發(fā)酵罐中培養(yǎng)基裝量為總體積的50-70%，接種量占培養(yǎng)基 體積的1-3 %，發(fā)酵溫度30-35 °C，通入無菌空氣，180-200rpm攪拌培養(yǎng)，通氣體積與發(fā)酵 液體積的比值〇. 9:1-1:1，罐壓0. 03-0. 05Mpa ;發(fā)酵終點(diǎn)為孢子數(shù)不低于總菌數(shù)的90%， 且發(fā)酵液的活菌數(shù)在2. OX 101(]-3. OX lO^fu/ml之間，發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成為：每1000毫 升中酵母抽提物4. 0-6. 0克、可溶性淀粉3. 0-5. 0克、麥芽糖8. 0~12. 0克、六水氯化鈷 4. 0-6. 0毫克、pH 7. 2-7. 4、余量為水；最后進(jìn)行固體吸附：將粉粹的草炭進(jìn)行滅菌，然后和 發(fā)酵液混合均勻，即為菌劑產(chǎn)品；菌劑產(chǎn)品含菌量在2. OX 109-5. OX lO^fu/g之間，粉末 粒徑< 0. 2_。
[0013] 本發(fā)明本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果：
[0014] 1、本發(fā)明所述的菌株LT-2是魯特介斯鏈霉菌中首次報(bào)道能降解豬毛等角蛋白材 料的菌株，且其降解豬毛角蛋白的速率也為最快的一種。在菌株最適發(fā)酵條件（溫度30°C， pH7. 5-8. 0, 200rpm)下IOd能將完整豬毛降解70%以上，且在3d內(nèi)能將完整羽毛幾乎完全 降解，從而為屠宰場(chǎng)禽羽、畜毛等多種含角蛋白廢棄物的降解提供了優(yōu)良的天然微生物菌 種資源，擴(kuò)展了角蛋白廢棄物的生物降解范圍。
[0015] 2、本發(fā)明所述的菌株LT-2產(chǎn)角蛋白酶所需的發(fā)酵周期短，降解條件溫和（溫度條 件和pH比較適中），角蛋白酶活高。操作過程簡(jiǎn)便，發(fā)酵成本低，后處理步驟簡(jiǎn)單，本發(fā)明還 提供了角蛋白降解菌LT-2的擴(kuò)大培養(yǎng)方法，菌劑產(chǎn)品中的菌體數(shù)量達(dá)到lOlfu/g以上。
[0016] 3、本發(fā)明所述的菌株LT-2產(chǎn)生的角蛋白酶切割活性較廣，降解譜廣，既可用于畜 禽屠宰廢棄羽毛資源的開發(fā)利用，產(chǎn)量巨大的畜禽屠宰禽羽、畜毛等多種含角蛋白廢棄物 用高效菌株發(fā)酵后轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇艿鞍踪|(zhì)、多肽或者氨基酸，用作醫(yī)藥原料，動(dòng)物飼料等，變廢 為寶，保護(hù)環(huán)境，還可以促進(jìn)可持續(xù)發(fā)展，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0017] 圖1 :菌株LT-2的孢子絲及孢子形狀；
[0018] 圖2 :菌株LT-2系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0019] 圖3 :菌株LT-2發(fā)酵不同角蛋白底物測(cè)得的最高角蛋白酶酶活和最大降解率。
【具體實(shí)施方式】：
[0020] 以下將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，而不會(huì)形成對(duì)本發(fā)明的限制。
[0021] 實(shí)施例1角蛋白酶產(chǎn)生菌株的篩選與鑒定
[0022] 1、培養(yǎng)基配方
[0023] ⑴初篩固體培養(yǎng)基：每1000毫升中含豬毛粉10~15克、K2HPO4 I. 0~L 4克、 KH2PO4 0· 5 ~L 0 克、NaCl 0· 1 ~0· 5 克、MgSO4 0· 05 ~0· 1 克，瓊脂 15 ~20 克，余量為 水。pH 7· 5 ~8· O0
[0024] 篩選培養(yǎng)基豬毛粉的制作：將豬毛去豬皮后洗凈，烘干至恒重，再用剪刀將豬毛剪 碎約Icm左右，然后用粉碎機(jī)粉碎，過100目篩。
[0025] (2)斜面保藏培養(yǎng)基
[0026] 高氏培養(yǎng)基：每1000毫升中含可溶性淀粉15~20克、KNO3 0.8~1. 2克、 NaClO. 5 ~I. 0 克、K2HPO4 0· 5 ~I. 0 克、MgSO4 0· 5 ~I. 0 克、FeSO4 · 7Η20 0· 005 ~0· 01 克.ρΗ7. 2~7. 5、瓊脂15~20克、余量為水。
[0027] LB固體培養(yǎng)基：每1000毫升中蛋白陳8~12克，酵母粉3~7克，NaCl 8~12 克、pH 7. 0~7. 5、瓊脂15~20克、余量為水。
[0028] (3)種子液體培養(yǎng)基：
[0029] 高氏培養(yǎng)基：每1000毫升中含可溶性淀粉15~20克、KNO3 0.8~1. 2克、 NaClO. 5 ~1.克、，K2HPO4 0· 5 ~I. 0 克、MgSO4 0· 5 ~I. 0 克、FeSO4 · 7H20 0· 005 ~0· 01 克、pH7. 2~7. 5、余量為水。
[0030] LB液體培養(yǎng)基：每1000毫升中蛋白陳8~12克，酵母粉3~7，NaCl 8~12克、 pH 7. 0~7. 5、余量為水。
[0031] (4)復(fù)篩培養(yǎng)基：每1000毫升中含完整豬毛10~15克、K2HPO 4 I. 0~1. 4克、 KH2PO4 0· 5 ~I. 0 克、NaCl 0· 1 ~0· 5 克、MgSO4 0· 05 ~0· 1 克，pH 7. 5 ~8. 0、余量為水。
[0032] (5)產(chǎn)孢子培養(yǎng)基：每1000毫升中酵母抽提物4. 0-6. 0克、可溶性淀粉3. 0-5. 0 克、麥芽糖8. 0~12. 0克、六水氯化鈷4. 0-6. 0毫克、pH 7. 2-7. 4、余量為水。
[0033] 2、高效角蛋白降解菌株的分離純化
[0034] 從湖南某屠宰場(chǎng)廢棄豬毛長(zhǎng)期堆積的土壤及污泥中取樣（土壤和污泥中有大量 未降解的豬毛），將所采集的樣品混勻埋于室外較濕潤(rùn)的土壤中富集，直至豬毛有明顯的降 解。取上述富集樣10克添加到90ml含玻璃珠的無菌水中，搖床振蕩15min，待樣品分散后， 靜置5min，吸取Iml 土壤懸液至9ml無菌水，得到10 2稀釋度懸液，依次按10倍稀釋法稀 釋至10 7,取10 5, 10 6, 10 7三個(gè)梯度分別吸取0.1 ml至初篩培養(yǎng)基平板