景天根際鎘抗性菌株芽孢桿菌，篩選方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株從景天根際分離的具有錦抗性的芽孢桿菌（Bacillus sp. )BCd5 及其在植物-微生物聯(lián)合修復(fù)鎘重金屬污染土壤中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 重金屬鎘是造成環(huán)境污染的重要金屬元素之一，它不僅會(huì)對(duì)植物造成傷害，而且 經(jīng)過(guò)食物鏈的傳輸，富集，對(duì)人體也會(huì)造成一定程度的傷害，日本的"痛痛病"就是由于鎘中 毒引起的。鎘主要來(lái)源于電鍍、合金、塑料、印刷、陶瓷等工業(yè)，因此對(duì)于含鎘污染處理的研 究在環(huán)保領(lǐng)域有著非常重要的意義。
[0003] 人類(lèi)活動(dòng)可使鎘以各種途徑進(jìn)入土壤，而鎘迀移轉(zhuǎn)化的最大特點(diǎn)是不能或不易被 生物體分解轉(zhuǎn)化后排出體外，不易隨水移動(dòng)，只能沿食物鏈逐級(jí)往上傳遞，在生物體內(nèi)濃縮 放大，當(dāng)累積到較高含量時(shí)就會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生毒性效應(yīng)，從而危害健康，影響其正常發(fā)育和 代謝平衡。
[0004] 土壤鎘污染的主要來(lái)源是采礦、冶煉、電鍍及基礎(chǔ)化工行業(yè)的廢水、廢氣和廢渣； 施用含鎘的化肥、農(nóng)藥以及農(nóng)用污泥也是土壤鎘污染的重要來(lái)源。另外，人類(lèi)對(duì)環(huán)境的破壞 導(dǎo)致的一系列相關(guān)問(wèn)題，如山體滑坡引起天然水的鎘污染等。研究發(fā)現(xiàn)，若源水鎘的含量達(dá) 0. 57~3. 88mg/L，下游水體、魚(yú)類(lèi)、土壤、農(nóng)作物就易受到嚴(yán)重污染，從而危害人類(lèi)健康。
[0005] 植物和微生物共存體系對(duì)重金屬超積累有重要的作用，植物根系-微生物系統(tǒng)的 相互促進(jìn)作用將大大提高對(duì)污染土壤的生物修復(fù)能力。通過(guò)添加微生物來(lái)強(qiáng)化植物修復(fù)技 術(shù)是提高植物-微生物聯(lián)合修復(fù)體系重金屬修復(fù)能力的有效措施之一。微生物是土壤的重 要組成部分，參與土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)與能量轉(zhuǎn)換過(guò)程，對(duì)提高土壤肥力和維持土壤 生態(tài)平衡具有重要意義。在污染土壤中接種微生物能夠促進(jìn)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素與重金屬的吸 收，同時(shí)微生物能夠分泌一些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和保護(hù)植物的抗生素、抑菌劑和螯合劑等，這些物 質(zhì)都能增強(qiáng)植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。
[0006] 因此，分離具有較強(qiáng)鎘耐受性和促進(jìn)植物修復(fù)鎘污染土壤的細(xì)菌對(duì)植物-微生物 聯(lián)合修復(fù)鎘重金屬污染土壤具有現(xiàn)實(shí)意義和重要的工程應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的技術(shù)目的在于篩選景天根際具有較強(qiáng)鎘耐受性的細(xì)菌。
[0008] 因此，本發(fā)明的第一方面涉及一株從景天根際分離的鎘抗性菌株一一芽孢桿菌 (Bacillus sp.)BCd5,其于2014年12月1日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通 微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 10077。
[0009] 優(yōu)選地，所述景天根際鎘抗性菌株Bacillus sp.BCd5的16S rDNA的基因序列如 SEQ ID NO :3所示，GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有與其一致的序列，且本菌株16S rDNA基因序列并 未提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。
[0010] 本發(fā)明的第二方面涉及上述的景天根際錦抗性菌株Bacillus sp. BCd5的篩選方 法，其包括步驟：
[0011] (1)選擇生長(zhǎng)狀況良好的景天植株進(jìn)行處理：取鎘（Cd)溶液母液2. 5mL，稀釋定容 至40mL，均勻澆灌在供試植物的土壤中，使土壤的鎘含量達(dá)到IOOmg *kg %在脅迫的條件下 繼續(xù)培養(yǎng)30d，每間隔4d澆水40mL ;
[0012] (2)菌種的分離、純化與篩選：在經(jīng)過(guò)處理的植物根際取IOg 土樣，置于90mL裝有 玻璃珠的細(xì)菌培養(yǎng)基中，在37°C恒溫振蕩器上150 X g振蕩20-30min后取下，靜止5min，使 土壤沉淀；在沉淀以上的各個(gè)層面進(jìn)行多次取樣，接入新的細(xì)菌培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h; 取富集后的菌懸液，用倍數(shù)稀釋法將其涂布于篩選培養(yǎng)基的平板上，倒置于37°C恒溫培養(yǎng) 箱中，培養(yǎng)48h ;肉眼觀察，分別挑選不同形態(tài)的典型單菌落，在培養(yǎng)皿底做好標(biāo)記，并挑取 單菌落在新的篩選培養(yǎng)基上劃線分離；反復(fù)進(jìn)行以上步驟，直至得到菌落特征一致的純菌 種；
[0013] (3)對(duì)于篩選出的已純化菌種進(jìn)行保存：將分離純化得到的菌種接種于細(xì)菌培養(yǎng) 基，培養(yǎng)后加入60% (v/v)甘油，使甘油的終濃度為10% (v/v)，置于_80°C進(jìn)行保存。
[0014] 其中所述細(xì)菌培養(yǎng)基為：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸餾水1000ml，pH7. 0。
[0015] 所述篩選培養(yǎng)基的配制方法如下：基礎(chǔ)培養(yǎng)基為細(xì)菌培養(yǎng)基1000ml，添加微量 元素液和維生素液各l〇ml，121°C滅菌20min，冷卻至70°C左右，加入鎘溶液母液，使培養(yǎng) 基中鎘含量為IOOmg · L ^其中微量元素液為：MnSO4 0· Olg，ZnSO4 0· 05g，H3BO3 0· Olg， CaCl2O. Olg，定容至1L，4°C避光保存。維生素液為：肌酸0. 025g，抗壞血酸0. 025g，核黃素 0. 025g，檸檬酸0. 02g，定容至1L，4°C避光保存。鎘溶液母液為：CdSO4配制成Cd2+濃度為 200mg · ml 1的母液，過(guò)濾除菌后，室溫保存。
[0016] 本發(fā)明的第三方面涉及含有上述的景天根際鎘抗性菌株Bacillus sp.BCd5的組 合物。
[0017] 優(yōu)選地，所述組合物具有較強(qiáng)的鎘耐受性。
[0018] 本發(fā)明的第四方面涉及上述的景天根際鎘抗性菌株Bacillus sp. BCd5及所述組 合物在植物-微生物聯(lián)合修復(fù)鎘重金屬污染土壤中的用途。
[0019] 本發(fā)明的第五方面涉及上述的景天根際鎘抗性菌株Bacillus sp. BCd5及所述組 合物在處理含重金屬鎘的污染物中的用途。優(yōu)選地，所述污染物為被污染的土壤。
[0020] 利用本發(fā)明的篩選方法從鎘脅迫的景天植物根際土壤中分離篩選出的鎘抗性菌 株Bacillus sp.BCd5,其于2014年12月1日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通 微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保 藏編號(hào)為：CGMCC No. 10077;其建議的分類(lèi)命名為芽孢桿菌屬Bacillus sp.;其為革蘭氏 陰性菌，需氧桿菌，有鞭毛和莢膜。該菌株對(duì)重金屬鎘有較強(qiáng)的耐性，對(duì)植物-微生物聯(lián)合 修復(fù)鎘重金屬污染土壤具有現(xiàn)實(shí)意義和重要的工程應(yīng)用價(jià)值。
[0021] 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在本發(fā)明所獲得的上述景天根際鎘抗性菌株Bacillus sp. BCd5新種的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)所述細(xì)菌進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼T變而繼續(xù)提高其耐 受重金屬鎘的能力，這樣的誘變后的基于本發(fā)明所述菌種的突變株也落入本發(fā)明保護(hù)的范 圍。所述誘變包括輻射、化學(xué)誘變等。同時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可能將本發(fā)明獲得的上述菌 株與其他植物共同使用，以達(dá)到最佳植物-微生物聯(lián)合修復(fù)重金屬鎘污染土壤的目的。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖 1 :菌株 Bacillus sp. BCd5 的 16S rDNA 序列。
[0023] 圖2 :菌株Bacillus sp. BCd5的透射電鏡照片。
[0024] 圖3 :菌株Bacillus sp. BCd5生長(zhǎng)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面將通過(guò)下述非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在不 背離本發(fā)明精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出許多修改，這樣的修改也落入本發(fā)明的范圍。
[0026] 下述實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法，所使用的實(shí)驗(yàn)材料如無(wú)特別說(shuō)明，均 可容易地從商業(yè)公司獲取。
[0027] 實(shí)施例
[0028] 實(shí)施例1錦抗性菌株Bacillus sp. BCd5的分離
[0029] 材料與方法
[0030] 1、培養(yǎng)基
[0031] 細(xì)菌培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸餾水lOOOmL，pH7. 0。
[0032] 配制篩選培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基為細(xì)菌培養(yǎng)基1000ml，添加微量元素液和維生素 液各10mL，121°C滅菌20min，冷卻至70°C左右，加入鎘溶液母液，使培養(yǎng)基中鎘含量為 IOmg · L 1C3 37°C培養(yǎng)。
[0033] 其中微量元素液為：MnSO4 O.Olg，ZnSO4 0.05g，H3BO3 O.Olg，CaCl2 O.Olg，定容 至1L，4°C避光保存。
[0034] 維生素液為：肌酸0. 025g，抗壞血酸0. 025g，核黃素0. 025g，檸檬酸0. 02g，定容至 1L，4°C避光保存。
[0035] 鎘溶液母液：CdSO4配制成Cd2+濃度為200mg ·πι1 1的母液，過(guò)濾除菌后，室溫保存。
[0036] 2、樣品采集和菌株分離
[0037] 選擇生長(zhǎng)狀況良好的景天植株進(jìn)行處理。取重金屬Cd溶液母液2. 5ml，稀釋定容 至40ml，均勻澆灌在供試植物的土壤中，使土壤的鎘含量達(dá)到IOOmg · kg ^在脅迫的條件 下繼續(xù)培養(yǎng)30d，每間隔4d澆水40ml。在經(jīng)過(guò)處理的植物根際取IOg 土樣，置于90ml裝有 玻璃珠的細(xì)菌培養(yǎng)基中，在37°C恒溫振蕩器上150 X g振蕩20-30min后取下，靜止5min，使 土壤沉淀。在沉淀以上的各個(gè)層面進(jìn)行多次取樣，接入新的細(xì)菌培養(yǎng)基中，37°C富集培養(yǎng) 24h。取富集培養(yǎng)后的菌懸液，用倍數(shù)稀釋法將其