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具核梭桿菌滅活疫苗和制備方法

文檔序號:9513345閱讀:1282來源:國知局
具核梭桿菌滅活疫苗和制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及疫苗技術領域,具體涉及具核梭桿菌滅活疫苗的制備方法及其疫苗。
【背景技術】
[0002] 具核梭桿菌(Fusobacterium nuleatum,F(xiàn)n)是革蘭氏專性厭氧桿菌,廣泛存在于 人體及多種動物體內的無芽胞厭氧菌屬。典型的具核梭桿菌外觀呈紡錘形,有銳利的尖端, 偶爾中間膨脹。過去一直把該菌視為人體的正常菌群之一,近年來,由于從臨床標本中不斷 分離出該菌,具核梭桿菌引起國內外學者的關注,被視為臨床上不可忽視的細菌。大量研究 證實該菌為條件致病菌,且具有較強的致病力,在口腔乃至全身感染性疾病中檢出率極高, 廣泛存在于感染的牙髓、牙周和其他炎癥性病灶中。作為優(yōu)勢菌種,具核梭桿菌與臨床厭氧 菌感染的關系十分密切,并與結腸癌等消化道腫瘤發(fā)病相關。經(jīng)過檢索發(fā)現(xiàn),具核梭桿菌的 疫苗尚未制備,通過本文所述的制備方法將可以彌補這個空白。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種安全有效,工藝簡單,生產(chǎn)成本低的具核梭桿菌滅活 疫苗的制備方法。
[0004] 本發(fā)明提供的這種具核梭桿菌滅活疫苗的制備方法包括以下步驟:具核梭桿菌的 分離和培養(yǎng);收集;滅活;乳化制劑;無活菌檢測;抗體效價檢驗。
[0005] a、通過購買的標準株或者從臨床分離得到的細菌株經(jīng)過連續(xù)傳代接種于適宜平 板上,分離鑒定得到菌種后;
[0006] b、將菌種通過適宜平板上增殖細菌,用PBS稀釋液洗滌,或者將菌種接種于含適 宜培養(yǎng)基的厭氧瓶中增殖細菌,通過離心培養(yǎng)基收集細菌,直至最終菌液濃度達到本行業(yè) 標準。如果上述最終菌液低于本行業(yè)標準可進行濃縮直至最終菌液達到本行業(yè)標準;
[0007] C、菌體滅活;
[0008] d、將滅活菌體加入佐劑,通過物理混合方法制備成疫苗;
[0009] e、將步驟d制備的滅活疫苗進行細菌培養(yǎng),結果為無菌生長,即可判定疫苗合格:
[0010] f、將步驟e判定合格的滅活疫苗接種于小白鼠,設置實驗組和對照組,用步驟d制 備的疫苗進行接種,接種療程結束后可進行取血檢測抗體效價。
[0011] 本發(fā)明的有益效果:
[0012] a、本發(fā)明的制備工藝簡單,通過制備得到了具核梭桿菌滅活疫苗,彌補了當前的 空白,有長期的健康保障作用。
[0013] b、本方法制備得到的滅活疫苗的免疫原性很強,抗體效價很高。
【附圖說明】
[0014] 圖1示出了具核梭桿菌疫苗的一種免疫方法。
[0015] 圖2示出了具核梭桿菌疫苗免疫小鼠后,小鼠血清中抗體滴度變化。
【具體實施方式】
[0016] 以下結合具體實施例,進一步闡明本發(fā)明。應理解,這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規(guī)條 件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0017] 實施例1 :具核梭桿菌的增殖培養(yǎng)
[0018] 將具核梭桿菌ATCC25586復蘇后連續(xù)3次傳代接種于厭氧血平板上,挑取菌落進 行革蘭染色鏡檢觀察其形態(tài)及染色性初步驗證菌株,通過對菌落進行脫氧核糖核酸提取后 進行PCR鑒定和全基因測序進行菌株的最終驗證。經(jīng)鑒定正確的菌種接種于含有BHI培養(yǎng) 基的厭氧瓶,待細菌增值到一定量后,將培養(yǎng)基離心獲得細菌,按照部頒標準進行培養(yǎng)物細 菌總數(shù)測定。
[0019] 實施例2 :具核梭桿菌的滅活
[0020] 取含菌量IOwCFUAiI以上的具核梭桿菌培養(yǎng)液經(jīng)過離心測到菌體沉淀后用生理 鹽水洗滌細菌3-4次,用PBS重懸細菌,加入福爾馬林(終含量為1 % ),置于30-40°C滅活 16-30小時,取滅活菌種接種于BHI培養(yǎng)基分別在無氧和有氧條件下培養(yǎng)48小時,均無細菌 生長方視為合格。
[0021] 實施例3 :具核梭桿菌疫苗的制備
[0022] 取滅菌液與弗氏完全佐劑比例為I : 1制備初次和末次接種疫苗;取滅菌液與弗 氏不完全佐劑比例為1:1制備中間接種疫苗。乳化方法為取細菌佐劑混合物用注射器乳 化法經(jīng)抽提60次乳化完成。
[0023] 實施例4 :抗體效價檢測
[0024] 疫苗制備成功后,選取30只8周齡昆明鼠通過皮下注射進行疫苗接種,注射劑量 為100 μ 1,每隔2周免疫一次,總共免疫4次,初次免疫后每隔兩周進行小鼠尾靜脈取血,通 過離心獲取小鼠血清進行ELISA夾心檢測法測定抗體效價。免疫過程如圖1所示。4次免 疫完成后小鼠血清抗體效價在3萬以上,抗體滴度變化圖如圖2所示。
[0025] 實施例5 :具核梭桿菌攻毒實驗
[0026] 選用20只前期實驗中進行疫苗免疫的小鼠,在末次免疫后14天,提前24小時斷 食、斷水,灌喂具核梭桿菌菌液(2X 10sCfu/ml),每只灌喂0. 5ml,上下午各一次,間隔6小 時,末次灌喂后2小時進食。
[0027] 選擇20只并未進行疫苗免疫的小鼠,提前24小時斷食、斷水,灌喂具核梭桿菌菌 液(2X IO8CfVml),每只灌喂0. 5ml,上下午各一次,間隔6小時,末次灌喂后2小時進食。
[0028] 實施例6 :具核梭桿菌疫苗的保護作用
[0029] 攻毒2周后,脫頸椎處死昆明鼠,75%酒精消毒,無菌取食管、胃、小腸組織標本分 別進行具核梭桿菌分離培養(yǎng)、直接涂片染色鏡檢、和PCR檢測。
[0030] 以培養(yǎng)陽性或PCR檢測陽性任意一項檢測結果陽性判定為具核梭桿菌陽性感染, 小鼠食管、胃、小腸有一次為陽性則認定為具核梭桿菌陽性。免疫保護效果評價以未免疫接 種對照組的感染率> 80%為前提條件,根據(jù)公式計算各組保護率。
[0031]
[0032] 在該實驗中,未免疫接種對照組感染率為85%,免疫接種組感染率15%,計算得 到保護率為82%。
【主權項】
1. 一種具核梭桿菌滅活疫苗的制備方法,其特征在于包括以下步驟:具核梭桿菌的分 離和培養(yǎng);收集;滅活;乳化制劑;無活菌檢測;抗體效價檢驗。 a、 通過購買的標準株或者從臨床分離得到的細菌株經(jīng)過連續(xù)傳代接種于適宜平板上, 分離鑒定得到菌種; b、 將菌種通過適宜平板上增殖細菌,用稀釋液洗下,或者將菌種接種于含適宜培養(yǎng)基 的厭氧瓶中增殖細菌,通過離心培養(yǎng)基收集細菌,直至最終菌液濃度達到本行業(yè)標準。如果 上述最終菌液低于本行業(yè)標準可進行濃縮直至最終菌液達到本行業(yè)標準; c、 菌體滅活; d、 將滅活菌體加入佐劑,通過物理混合方法制備成疫苗; e、 將步驟d制備的滅活疫苗進行細菌培養(yǎng),結果為無菌生長,即可判定疫苗合格; f、 將步驟e判定合格的滅活疫苗接種于小白鼠,設置實驗組和對照組,用步驟d制備的 疫苗進行接種,接種療程結束后可進行取血檢測抗體效價。2. 如權利要求1所述,其特征在于所述具核梭桿菌菌株為標準菌株不僅限于編號為 ATCC25586或者臨床分離到的具核梭桿菌菌株。3. 如權利要求1所述,其特征在于使用了固體平板和液體培養(yǎng)瓶在無氧條件下培養(yǎng)。 菌液濃縮的方法為進行高速離心進行菌體和液體分離。4. 如權利要求1所述的制備方法,其特征在于所述滅活步驟中,處理方法為以下幾種: 1 :加入福爾馬林(終含量為1% ),置于30-40°C滅活16-30小時;2 :50-80°C滅活2-30分 鐘;3 :取細菌懸液用超聲粉碎儀粉碎20-40分鐘。5. 如權利要求1所述的制備方法,其特征為乳相為弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑、月旨 質體、鋁佐劑、粘膜佐劑,乳化過程可以為旋渦振蕩器乳化,組織搗碎器乳化、注射器乳化。6. 如權利要求1所述的制備方法,其特征在于所述無活菌檢驗為在無菌條件下,去lml 滅活疫苗用PBS稀釋10倍,吸取0. 2ml接種于平板上,在37°C下培養(yǎng)48h,均應無菌生長。 反之則不合格。7. 如權利要求1所述的制備方法,其特征在于所述滅活疫苗每毫升含菌量為20 億-300億。8. 如權利要求1所述的制備方法,其特征在于所述疫苗可應用于人體口腔、食管、胃、 大腸、小腸、結腸、直腸方面的感染及身體不適。9. 如權利要求任一項所述制備方法所制備的具核梭桿菌滅活疫苗。
【專利摘要】本發(fā)明名稱為具核梭桿菌疫苗和制備方法。本發(fā)明涉及生物制藥技術領域,具體涉及具核梭桿菌滅活疫苗的制備方法,包括以下步驟:具核梭桿菌的分離和培養(yǎng);收集;滅活;乳化制劑;無活菌檢測;抗體效價檢驗。本發(fā)明方法工藝簡單,制造成本低,容易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
【IPC分類】A61P31/04, A61K39/114
【公開號】CN105267959
【申請?zhí)枴緾N201510608634
【發(fā)明人】張革, 柯宏朋, 肖晗, 薛瑩
【申請人】中山大學
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年9月11日
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